Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

מתאים לסינתזת חלבונים ללא תאים תוך 24 שעות באמצעות זרימת עבודה של אינדוקציה אוטומטית ללא תאים

Published: July 22, 2021 doi: 10.3791/62866
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University San Luis Obispo, 2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University San Luis Obispo

ERRATUM NOTICE

Summary

עבודה זו מתארת את הכנת תמצית התאים מ-Escherichia coli (E. coli) ולאחר מכן תגובות של סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) תוך פחות מ-24 שעות. הסבר על פרוטוקול אוטו-אינדוקציה ללא תאים (CFAI) מפרט שיפורים שנעשו כדי להפחית את הפיקוח על החוקרים ולהגדיל את כמויות תמצית התאים המתקבלות.

Abstract

סינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) גדלה כפלטפורמה ביוטכנולוגית הלוכדת מכונות שעתוק ותרגום במבחנה. התפתחויות רבות הפכו את פלטפורמת CFPS לנגישה יותר למשתמשים חדשים והרחיבו את מגוון היישומים. עבור מערכות CFPS מבוססות ליסאט, ניתן להפיק תמציות תאים ממגוון אורגניזמים, ולרתום את הביוכימיה הייחודית של אותו פונדקאי כדי להגביר את סינתזת החלבונים. במהלך 20 השנים האחרונות, Escherichia coli (E. coli) הפך לאחד האורגניזמים הנפוצים ביותר לתמיכה ב- CFPS בשל יכולתו הכלכלית והרבגוניות שלו. למרות ההתקדמות העיקרית הרבה, זרימת העבודה להכנת תמצית תאי E. coli נותרה צוואר בקבוק מרכזי עבור משתמשים חדשים כדי ליישם CFPS עבור היישומים שלהם. זרימת העבודה של הכנת החילוץ היא עתירת זמן ודורשת מומחיות טכנית כדי להשיג תוצאות הניתנות לשחזור. כדי להתגבר על מחסומים אלה, דיווחנו בעבר על פיתוח של זרימת עבודה של אינדוקציה אוטומטית (CFAI) הפועלת 24 שעות ביממה ללא תאים, המפחיתה את קלט המשתמש ואת המומחיות הטכנית הנדרשת. זרימת העבודה של CFAI ממזערת את העבודה ואת המיומנות הטכנית הנדרשת ליצירת תמציות תאים תוך הגדלת הכמויות הכוללות של תמציות תאים המתקבלות. כאן אנו מתארים את זרימת העבודה הזו באופן שלב אחר שלב כדי לשפר את הגישה ולתמוך ביישום הרחב של CFPS מבוסס E. coli .

Introduction

השימוש בסינתזת חלבונים ללא תאים (CFPS) ליישומי ביוטכנולוגיה גדל משמעותית בשנים האחרונות 1,2,3. ניתן לייחס התפתחות זו בחלקה למאמצים מוגברים בהבנת התהליכים המתרחשים ב- CFPS ובתפקידו של כל רכיב 4,5. בנוסף, עלויות מופחתות המיוחסות לתפאורות ממוטבות ולמקורות אנרגיה חלופיים הפכו את הטכנולוגיה נטולת התאים לקלה יותר ליישום עבור משתמשים חדשים 6,7,8,9. על מנת ליישם את גורמי השעתוק והתרגום הדרושים לסינתזת חלבונים, תמצית התא משמשת לעתים קרובות להנעת תגובות ללא תאים10. מדריכי משתמשים שפורסמו לאחרונה סיפקו פרוטוקולים פשוטים להפקת תמצית פונקציונלית, מה שמקל על היישום עבור משתמשים חדשים ומנוסים כאחד 1,11,12,13,14. תמצית תאים מתקבלת בדרך כלל באמצעות תזה של תרבית תאים, אשר ניתן לגדל באמצעות אורגניזמים שונים בהתאם לשימוש הספציפי הרצוי 1,15,16.

Escherichia coli (E. coli) הפך במהירות לאחד האורגניזמים המארחים הנפוצים ביותר לייצור תמציות פונקציונליות17. זן BL21 Star (DE3) מועדף מכיוון שהוא מסיר את הפרוטאזות מהממברנה החיצונית (OmpT פרוטאז) והציטופלסמה (Lon protease), ומספק סביבה אופטימלית לביטוי החלבון הרקומביננטי. בנוסף, ה-DE3 מכיל את ה-λDE3 שנושא את הגן עבור T7 RNA פולימראז (T7 RNAP) תחת שליטתו של מקדם ה-lacUV5; רכיב הכוכב מכיל גן RNaseE שעבר מוטציה המונע ביקוע של mRNA 4,14,18,19. תחת מקדם lacUV5, אינדוקציה של איזופרופיל-תיוגלאקטופירנוזיד (IPTG) מאפשרת ביטוי של T7 RNAP20,21. זנים אלה משמשים לגידול וקציר תאים, אשר נותנים חומר גלם להכנת תמצית. ניתן לבצע ליזיס של תאים במגוון שיטות, כולל הכאת חרוזים, עיתונות צרפתית, הומוגניזציה, סוניקציה וקוויטציה של חנקן 1,11,12,22.

תהליך תרביות החיידקים והקציר עקבי ברוב הפלטפורמות בעת שימוש ב-E. coli, אך דורש מספר ימים ופיקוח אינטנסיבי של החוקריםעל 1,11,13. תהליך זה מתחיל בדרך כלל בתרבית זרעי לילה במרק LB, אשר עם צמיחת הלילה מחוסנת לתרבית גדולה יותר של 2xYTPG (שמרים, טריפטון, מאגר פוספטים, גלוקוז) למחרת. הצמיחה של תרבית גדולה יותר זו מנוטרת עד שהיא מגיעה לשלב הלוג המוקדם עד אמצע, בצפיפות אופטית (OD) של 2.514,20. נדרשת מדידה מתמדת מכיוון שמרכיבי התעתיק והתרגום הוכחו בעבר כפעילים מאוד בשלב הלוג המוקדם עד אמצע23,24. בעוד שתהליך זה יכול ליצור תמצית הניתנת לשחזור, המעבדה שלנו פיתחה לאחרונה שיטה חדשה באמצעות מדיה אוטו-אינדוקציה ללא תאים (CFAI), אשר מפחיתה את הפיקוח על החוקרים, מגדילה את התפוקה הכוללת של תמצית עבור ליטר נתון של תרבית תאים, ומשפרת את הגישה להכנת תמצית מבוססת E. coli עבור משתמשים מנוסים וחדשים כאחד (איור 1 ). כאן אנו מספקים את המדריך שלב אחר שלב ליישום זרימת העבודה של CFAI, כדי לעבור מלוח תאים מפוספס לתגובת CFPS שהושלמה תוך 24 שעות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. צמיחה במדיה

  1. הכן 960 מ"ל של מדיית CFAI כמתואר בטבלה 1 והתאם את ה- pH ל- 7.2 באמצעות KOH.
  2. העבר את מדיית התרבות לבקבוקון מבולבל של 2.5 ל' ואוטוקלב למשך 30 דקות ב-121 מעלות צלזיוס.
  3. הכינו תמיסת סוכר של 40 מ"ל כמתואר בטבלה 1. מסננים-מעקרים את התמיסה למיכל זכוכית אוטוקלבי נפרד.
    הערה: ניתן לאחסן את תמיסת הסוכר באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
  4. אפשרו למדיה להתקרר לחלוטין אל מתחת ל-40 מעלות צלזיוס לאחר האוטוקלבינג.
  5. לפני חיסון המדיה של CFAI, להוסיף את תמיסת הסוכר ישירות למדיה CFAI.
  6. כדי לחסן את התקשורת, החליקו לולאה של מושבות מצלחת E. coli BL21 Star (DE3) שהייתה מפוספסת בעבר והכנסו ישירות לתקשורת. סובבו את הלולאה לתוך המדיה אך הימנעו מלגעת בצידי המיכל. ודאו שצלחת הפסים טרייה, עם תאים בני קיימא.
  7. מניחים את הבקבוקון עם המדיה המחוסנת באינקובטור של 30 מעלות צלזיוס תוך כדי רעד ב-200 סל"ד. אפשרו לתרבות לצמוח בן לילה. אם התאים מחוסנים בערב, התרבית תגיע לצפיפות אופטית משוערת, הנמדדת ב-600 ננומטר (OD600), מתוך 10 בבוקר שלאחר מכן. ניתן להתאים את זמני החיסון והקציר לפי הצורך.

2. קציר תאים

  1. הכינו מראש את מאגר S30 ושמרו עליו קר. הכן את מאגר S30 לפי טבלה 2, ל- pH סופי של 8.2.
    הערה: ניתן להכין את מאגר S30 ימים לפני קצירת התאים. אם זה נעשה, להכין ללא dithiothreitol ולאחסן ב 4 °C (66 °F). הוסיפו את dithiothreitol רגע לפני השימוש.
  2. מנקודה זו והלאה, שמור את כל הפתרונות והחומרים על הקרח. העבר 1 ליטר של מדיה לתוך בקבוק צנטריפוגה 1 L וצנטריפוגה ב 5,000 x גרם בין 4-10 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. דקאנט וסילוק הסופרנאטנט. באמצעות מרית סטרילית, מעבירים את הכדור לצינור חרוטי מצונן מראש ומשקלו בעבר 50 מ"ל.
  3. יש לשטוף פעם אחת עם 30-40 מ"ל של חיץ S30 קר על ידי שימוש חוזר בכדור באמצעות מערבולות ב-30 שניות מתפרצות עם תקופות מנוחה על קרח.
    הערה: בשל נפח גבוה יותר של גלולה, פיצול גלולת התא לשני צינורות חרוטיים של 50 מ"ל יכול להיות מועיל לשלב הכביסה. אחסון תאים באליקוטים קטנים יותר מספק גם גמישות לעיבוד במורד הזרם.
  4. צנטריפוגה את החייאת התא ב 5000 x g בין 4-10 °C למשך 10 דקות.
  5. השליכו את הסופרנאטנט ונגבו כל עודף מהקירות הפנימיים של הצינור החרוטי 50 מ"ל באמצעות רקמה נקייה, הימנעו מלגעת בכדור עצמו. שוקלים ומהבהבים להקפיא את הכדור בחנקן נוזלי. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
    הערה: ייתכן שכדורים לא ידרשו הקפאת הבזק אם המשתמש מתכנן להמשיך בפרוטוקול הכנת החילוץ.

3. חילוץ הכנה

  1. שלבו את הכדור הקפוא עם 1 מ"ל של חיץ S30 עבור כל גרם אחד של גלולת התא ואפשרו להפשיר על הקרח למשך כ-30-60 דקות. כדור מופשר באמצעות מערבולת בהתפרצויות של 30 שניות עם תקופות מנוחה על הקרח. מערבולת עד שלא נותרו גושים נראים לעין של תאים.
    הערה: ניתן לבצע שימוש חוזר בגושים קטנים יותר על ידי ערבוב באמצעות פיפטה.
  2. העברת אליקוטים של 1.4 מ"ל של החייאת תאים לצינורות מיקרופוג' של 1.5 מ"ל לצורך תסיסת תאים. Sonicate כל צינור עם תדר של 20 kHz ו 50% משרעת עבור שלושה התפרצויות של 45 s עם 59 s של מנוחה בכל מחזור מוקף באמבט קרח. הפוך את הצינור בין המחזורים ומיד הוסף 4.5 μL של 1 M dithiothreitol לאחר מחזור הסוניקה האחרון.
    הערה: בשל החום המשתחרר מסוניקציה, חשוב מאוד לוודא שכל האליקוטים נשמרים על קרח כאשר הם לא נסתמים. אמבט הקרח צריך להיות כל הזמן מחודש או גדול מספיק כדי להישאר קריר לאורך כל תהליך sonication.
  3. צנטריפוגה כל צינור ב 18,000 x g ו 4 ° C במשך 10 דקות. שלפו את הסופרנאטנט ואת האליקוט לתוך צינורות מיקרופוג' של 1.5 מ"ל ב-600 μL aliquots. פלאש להקפיא aliquots ולאחסן ב -80 °C (80 °F) עד לשימוש נוסף. יש להקפיד על פיפטה רק על הסופרנאטנט.

4. סינתזת חלבונים ללא תאים

  1. להפשיר תמצית אחת מהשלב הקודם לביצוע 15 μL של תגובות סינתזת חלבונים ללא תאים בצינורות מיקרופוגה של 1.5 מ"ל ב-quadruplicate.
  2. הכינו כל תגובה על ידי שילוב של 240 ננוגרם של דנ"א (ריכוז סופי של 16 מיקרוגרם/מ"ל), 2.20 מיקרול"ל של תמיסה A, 2.10 μL של תמיסה B, 5.0 μL של תמצית, ונפח משתנה של מים ברמה מולקולרית כדי למלא את התגובה ל-15 μL. ניתן לשנות את קנה המידה של תגובה זו לנפחים גבוהים יותר. ראה טבלה 3 לקבלת יחסים.
    1. הכן את פתרון א' ו-ב' לפי לוח 4. ניתן להכין כל תמיסה בקבוצות של 100 μL עד 1 מ"ל, לדחוס אותה ולאחסן אותה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.
      הערה: כמות הדנ"א יכולה להשתנות בהתאם לחלבון המעניין. במקרה זה, הפלסמיד שבו נעשה שימוש, pJL1-sfGFP, עבר אופטימיזציה לביצועים של 16 מיקרוגרם/מ"ל, או 597 מיקרומטר.
  3. תנו לתגובות לרוץ לפחות 4 שעות ב-37 מעלות צלזיוס.

5. כימות של חלבון כתב, חלבון פלואורסצנטי ירוק סופר-תיקייה (sfGFP)

  1. באמצעות צלחת פוליסטירן שחורה בעלת חצי שטח של 96 בארות, שלב 2 μL של כל תוצר תגובת סינתזת חלבונים ללא תאים עם 48 μL של 0.05 M HEPES buffer ב- pH 7.2. שלושה עד ארבעה שכפולים של כל צינור תגובה מומלצים.
  2. לכמת את עוצמת הפלואורסצנציה של ה-sfGFP עם אורך גל עירור של 485 ננומטר ואורך גל פליטה של 528 ננומטר.
  3. להמרה של יחידות פלואורסצנטיות יחסיות לתפוקה נפחית (מיקרוגרם/מ"ל) של sfGFP, קבעו עקום סטנדרטי באמצעות pJL1-sfGFP מטוהר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

בעת הכנת מדיה CFAI, גלוקוז הוחלף לעלייה בלקטוז וגליצרול כמצע האנרגיה העיקרי בתקשורת. בנוסף, קיבולת האגירה של המדיה CFAI הוגדלה גם כן. רכיבים ספציפיים אלה מופיעים בטבלה 1.

לאחר מכן התאים גודלו הן ל-OD600 מתוך 10 והן ל-2.5 הסטנדרטי במדיית CFAI כדי להראות עקביות עם איכות החילוץ למרות כמויות החילוץ המשתנות. המדיה של 2.5 OD600 CFAI גדלה לאחר שהתחסנה מתרבות זרעים בציר LB ב-37 °C (74 °F), 200 סל"ד, בעוד שתרבות OD600 10 חוסנה ישירות מצלחת. כל אצווה של מדיה CFAI נוטרה לאחר מכן ונקטפה ב- OD600 המתאים לה. הצמיחה ל-OD600 מתוך 10 הובילה לעלייה בכמות גבוהה יותר של כדוריות תאים ותמצית כוללת שהתקבלה, שכן היא הפיקה 9.60 מ"ל של תמצית לעומת 2.10 מ"ל של תמצית שהתקבלה מהגידול ל-2.5 OD600 (איור 2). ניתוח נוסף של ריכוז החלבון הכולל לא הראה הבדל משמעותי בחלבון הכולל בכל תמצית (טבלה 5). אף על פי שהם גודלו לרמות שונות של צפיפות אופטית, שתי קבוצות החילוץ הדגימו תוצאות דומות בתגובות נטולות תאים באמצעות sfGFP (איור 3). זה מצביע על כך שהשילוב של יכולת האגירה המוגברת, השימוש בלקטוז ובגליצרול כמקור הפחמן העיקרי ויישום לקטוז במקום IPTG עבור אינדוקציה T7RNAP מסייעים לייצב את גידולי התמצית לכל OD600 מתחת ל-10.

CFAI מדיה אוטוקלאבית:
רכיבים כמות
נתרן כלורי 5.0 גרם
טריפטון 20.0 גרם
תמצית שמרים 5.0 גרם
אשלגן פוספט, מונובאסי 6.0 גרם
אשלגן פוספט, דיבאסיק 14.0 גרם
ננופורTM מים מלא עד לסך כולל של 960 מ"ל
תמיסת סוכר מעוקרת מסנן:
רכיבים כמות
D-גלוקוז 0.50 גרם
D-לקטוז 4.0 גרם
80% v/v גליצרול 7.5 מ"ל
ננופורTM מים 28.0 מ"ל

טבלה 1: רכיבי CFAI. רכיבים למדיה CFAI ותמיסות סוכר עם הכמויות שלהם בהתאמה. יש לערבב את המדיה לאורך כל התוספת של כל רכיב ומסנן תמיסת הסוכר מעוקר. יש להוסיף כל תמיסה למיכל סטרילי נפרד לפני החיסון.

מאגר S30
רכיבים ריכוז
טריס אצטט pH 8.2 בטמפרטורת החדר 10 mM
מגנזיום אצטט 14 mM
אשלגן אצטט 60 mM
Dithiothreitol 2 מ"מ

טבלה 2: רכיבי מאגר S30: רכיבים עבור חיץ S30 נוספו עם הכמויות שלהם בהתאמה לתוך צינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל.

רכיב כמות
פתרון א' 2.20 מיקרול
פתרון ב' 2.1 μL
תמצית 5 מיקרול
תבנית דנ"א נפח עבור 16 מיקרוגרם /מ"ל סופי
מים מילוי לסך כולל של 15 μL

טבלה 3: יחסי תגובה של CFPS: אחוזי נפח יחסיים עבור פתרון A, פתרון B ותמצית. נפח הדנ"א יכול להשתנות בהתאם לריכוז הפלסמיד הספציפי וייתכן שיהיה צורך להתאים אותו לפלסמיד הספציפי של המשתמש.

פתרון א' פתרון ב'
רכיבים ריכוז רכיבים ריכוז
ATP 1.2 מ"מ מגנזיום גלוטמט 10 mM
GTP 0.850 מ"מ אמוניום גלוטמט 10 mM
UTP 0.850 מ"מ אשלגן גלוטמט 130 mM
CTP 0.850 מ"מ פוספונולפירובט (PEP) 30 מ"מ
חומצה פולינית 31.50 מיקרוגרם/מ"ל ל-ואלין 2 מ"מ
tRNA 170.60 מיקרוגרם/מ"ל ל-טריפטופן 2 מ"מ
ניקוטינמיד אדנין דינוקלאוטיד (NAD) 0.40 מ"מ L-איזולאוצין 2 מ"מ
קו-אנזים א' 0.27 מ"מ ל-לאוצין 2 מ"מ
חומצה אוקסלית 4.00 מ"מ L-ציסטאין 2 מ"מ
פוטרסין 1.00 מ"מ ל-מתיונין 2 מ"מ
זרעונידין 1.50 מ"מ אל-אלנין 2 מ"מ
חיץ HEPES pH 7.5 57.33 מ"מ ל-ארגינין 2 מ"מ
ל-אספרג'ין 2 מ"מ
L-חומצה אספרטית 2 מ"מ
L-חומצה גלוטמית 2 מ"מ
ל-גליצין 2 מ"מ
L-גלוטמין 2 מ"מ
ל-היסטידין 2 מ"מ
ל-ליזין 2 מ"מ
ל-פרולין 2 מ"מ
ל-סרין 2 מ"מ
ל-תראונין 2 מ"מ
L-פנילאלנין 2 מ"מ
ל-טירוזין 2 מ"מ

טבלה 4: רכיבי פתרון A ו-B. ריכוזי מלאי עבור הרכיבים עבור פתרון A ו- B נוספו עם הכמויות שלהם בהתאמה, כל אחד בצינור מיקרופוגה של 1.5 מ"ל.

תמצית ריכוז החלבון הכולל (מיקרוגרם/מ"ל) סטיית תקן
2xYTPG 2.5 OD 30617 3745
CFAI 2.5 OD 30895 2254
CFAI 10.0 OD 27905 3582

טבלה 5: סך כל תפוקת חלבון התמצית. ניתוח של סך החלבון של גידולי תמצית תאים שונים. ריכוז החלבון הכולל נקבע באמצעות מבחן ברדפורד. כל ריכוז נקבע משלשונים באמצעות דילול של 1:40.

Figure 1
איור 1: השוואה בין CFAI וזרימת עבודה טיפוסית מתאים ל-CFPS: השוואה של ציר הזמן הכולל בין ציר הזמן הכולל מתאים ל-CFPS באמצעות זרימת העבודה (A) CFAI (שמאל, אדום) לעומת השיטה (B) שהוקמה קודם לכן (ירוק, מימין). ההשוואה מדגימה את צמצום הפיקוח על החוקרים ואת ציר הזמן בעת ביצוע CFPS באמצעות זרימת העבודה של CFAI. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 2
איור 2: השוואת גודל כדור CFAI. השוואה של כדורי מדיה CFAI לאחר קצירת תאים ב- OD600 שונה. המדיה שגדלה ל-OD600 מתוך 2.5 הפיקה גלולת תאים של 2.23 גרם (משמאל) והמדיה שגדלה ל-OD600 מתוך 10 הפיקה גלולת תאים באורך 9.49 גרם (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Figure 3
איור 3: השפעות הצמיחה על תשואות תגובת CFPS. (A) השוואה בין תשואות תגובת CFPS בין גידולים ל-2.5 OD600 ו-10 OD600, עם (B) תמונות של כל תגובת CFPS מעל התשואה המתאימה להן. תגובות נטולות תאים בוצעו בצינור מיקרופוג' של 1.5 מ"ל וכומתו לאחר 24 שעות של דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמצעות עקומה סטנדרטית כדי לקשר בין פלואורסצנציה לריכוז sfGFP. ה-"Negative" מתאים לקבוצה של תגובות בקרה שליליות שבהן לא נוסף דנ"א של תבנית. המדיה המסורתית של 2xYTPG (הבקרה החיובית) ותמציות ה- CFAI הן באיכות דומה לזו שהוכחה באמצעות תשואות ה- CFPS הגבוהות שלהן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פיקוח על חוקרים נחוץ באופן מסורתי לשתי פעולות מפתח במהלך גדילת התאים: אינדוקציה של T7 RNAP ותאי קצירת תאים ב-OD600 ספציפי. CFAI מייתר את שתי הדרישות הללו כדי להפחית את הזמן וההכשרה הטכנית הנדרשת לחוקר על מנת להכין תמציות תאים באיכות גבוהה. אינדוקציה אוטומטית של T7 RNAP מושגת על ידי החלפת גלוקוז בלקטוז כסוכר העיקרי בתקשורת, מה שמייתר את הצורך הקודם לעקוב באופן פעיל אחר הצמיחה ולאחר מכן לגרום עם IPTG בנקודה מדויקת במהלך צמיחת התא. הצורך לנטר באופן פעיל תרביות תאים כדי לקצור ב-OD600 מסוים מתבטל גם הוא, ומנתק את החוקר מתרבית התאים. זה מוסיף לעבודה האחרונה שהדגימה גם ייצור של תמציות איכותיות שנקטפו בזמנים לא מסורתיים 13,25,26. נוסחת המדיה החדשה משפרת את יכולת האגירה ואת מקורות הפחמן כדי לתמוך בחילוף חומרים פעיל של אנרגיה גם כאשר תרבית התאים מתקרבת לשלב נייח. היכולת להשיג תמציות תאים חזקות מתרביות OD600 גבוהות מאפשרת לחוקר לקצור את התרביות בזמן שנוח להם27. זרימת העבודה שאנחנו מעדיפים וממליצים עליה היא לחסן את התרבות בערב ולחזור לקצור למחרת בבוקר.

קצירת תאים ב-OD600 גבוה יותר גורמת גם לכמות גדולה משמעותית של תאים המתקבלת להכנת תמציות. עבור חוקרים מנוסים, ראוי לציין כי גלולת התאים היא הרבה יותר כהה בצבע בהשוואה לתאים שגדלו במדיה 2xYTPG, גם כאשר נקטף ב OD600 של 2.5. חשוב גם לציין שאם כל כדור התא מעובד בבת אחת, הכמות הגדולה של החייאה המתקבלת לכל כדור תא בעת ביצוע תזה באמצעות סוניקציה תיקח זמן מה. לפיכך, חשוב לשמור על כל האליקוטים קרים בתהליך זה 11,13,14. הגידול בנפח החילוץ לצמיחה מקטין את העלות באופן פרופורציונלי ותומך ביישומי ייצור ביולוגי. עם השיפורים שהוכחו, זרימת העבודה של CFAI מספקת פרוטוקול קל יותר למשתמשים חדשים ומנוסים של טכנולוגיה נטולת תאים כדי לייצר תמצית E. coli פונקציונלית הניתנת לשחזור.

למרות היתרונות של המדיה CFAI המסופקת, ישנן מגבלות לשיטה זו. האתגר העיקרי הוא האופי המתהווה של זרימת העבודה. בעוד שניתוח מטבוליקה שפך אור על ההבדלים בתמציות CFAI OD600 10 כמו גם במוצרי תגובה בהשוואה ל- 2xYTPG, ההשלכות של הבדלים אלה על יישומים ספציפיים נותרו לא אופייניות27. בנוסף, זרימת עבודה זו פותחה עבור BL21 E. coli מבוסס lysate. לא ברור אם ניסוח מחדש של המדיה יתמוך בהכנת תמצית חזקה מזני E. coli אחרים, כגון הזנים המקודדים מחדש מבחינה גנומית של E. coli28,29. ייתכן שגישת CFAI יכולה לשמש להפקת תמציות מאורגניזמים חיידקיים אחרים, אך לא סביר שהיא תתמוך בהכנת מיצוי עבור אורגניזמים אאוקריוטים כמו שחלת אוגר סיני או רטיקולוציט ארנב; עם זאת, לאלה יש שיטות מבוססות משלהם30,31. אנו צופים כי הפשטות של זרימת העבודה של CFAI תפחית את החסמים ותתמרץ את הקהילה נטולת התאים לאפיין ולהעריך את התועלת שלה עבור מגוון רחב של יישומים ש- CFPS תומך בהם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם ניגודי עניינים כספיים מתחרים.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות לד"ר ג'ניפר ונדרקלן ולאנדראה לובשר על התמיכה הטכנית. המחברים רוצים להודות גם לניקול גרגוריו, מקס לוין, אליסה מולין, ביונגצ'ול סו, אוגוסט ברוקוול, אליזבת (ליזי) וויבודה, לוגן ברינגטון וג'יליאן קסמן על דיונים מועילים. המחברים מכירים גם בתמיכת מימון מקרן ביל ולינדה פרוסט, המרכז ליישומים במענק המחקר היישומי של שברון ביוטכנולוגיה, Cal Poly Research, Scholarly והקרן הלאומית למדע (NSF-1708919).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL Microfuge Tubes Phenix MPC-425Q
1L Centrifuge Tube Beckman Coulter A99028
Avanti J-E Centrifuge Beckman Coulter 369001
CoA Sigma-Aldrich C3144-25MG
Cytation 5 Cell Imaging Multi-Mode Reader Biotek BTCYT5F
D-Glucose Fisher D16-3
D-Lactose Alfa Aesar J66376
DTT ThermoFisher 15508013
Folinic Acid Sigma-Aldrich F7878-100MG
Glycerol Fisher BP229-1
Glycine Sigma-Aldrich G7126-100G
HEPES ThermoFisher 11344041
IPTG Sigma-Aldrich I6758-1G
JLA-8.1000 Rotor Beckman Coulter 366754
K(Glu) Sigma-Aldrich G1501-500G
K(OAc) Sigma-Aldrich P1190-1KG
KOH Sigma-Aldrich P5958-500G
L-Alanine Sigma-Aldrich A7627-100G
L-Arginine Sigma-Aldrich A8094-25G
L-Asparagine Sigma-Aldrich A0884-25G
L-Aspartic Acid Sigma-Aldrich A7219-100G
L-Cysteine Sigma-Aldrich C7352-25G
L-Glutamic Acid Sigma-Aldrich G1501-500G
L-Glutamine Sigma-Aldrich G3126-250G
L-Histadine Sigma-Aldrich H8000-25G
L-Isoleucine Sigma-Aldrich I2752-25G
L-Leucine Sigma-Aldrich L8000-25G
L-Lysine Sigma-Aldrich L5501-25G
L-Methionine Sigma-Aldrich M9625-25G
L-Phenylalanine Sigma-Aldrich P2126-100G
L-Proline Sigma-Aldrich P0380-100G
L-Serine Sigma-Aldrich S4500-100G
L-Threonine Sigma-Aldrich T8625-25G
L-Tryptophan Sigma-Aldrich T0254-25G
L-Tyrosine Sigma-Aldrich T3754-100G
Luria Broth ThermoFisher 12795027
L-Valine Sigma-Aldrich V0500-25G
Mg(Glu)2 Sigma-Aldrich 49605-250G
Mg(OAc)2 Sigma-Aldrich M5661-250G
Microfuge 20 Beckman Coulter B30134
Molecular Grade Water Sigma-Aldrich 7732-18-5
NaCl Alfa Aesar A12313
NAD Sigma-Aldrich N8535-15VL
New Brunswick Innova 42/42R Incubator Eppendorf M1335-0000
NH4(Glu) Sigma-Aldrich 09689-250G
NTPs ThermoFisher R0481
Oxalic Acid Sigma-Aldrich P0963-100G
PEP Sigma-Aldrich 860077-250MG
Potassium Phosphate Dibasic Acros, Organics A0382124
Potassium Phosphate Monobasic Acros, Organics A0379904
PureLink HiPure Plasmid Prep Kit ThermoFisher K210007
Putrescine Sigma-Aldrich D13208-25G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-5G
Tris(OAc) Sigma-Aldrich T6066-500G
tRNA Sigma-Aldrich 10109541001
Tryptone Fisher Bioreagents 73049-73-7
Tunair 2.5L Baffled Shake Flask Sigma-Aldrich Z710822
Ultrasonic Processor QSonica Q125-230V/50HZ
Yeast Extract Fisher Bioreagents 1/2/8013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2 (1), 1-34 (2019).
  2. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews Genetics. 21 (3), (2020).
  3. Swartz, J. R. Expanding biological applications using cell-free metabolic engineering: An overview. Metabolic Engineering. 50, 156-172 (2018).
  4. Jared, B., Dopp, L., Tamiev, D. D., Reuel, N. F. Cell-free supplement mixtures: Elucidating the history and biochemical utility of additives used to support in vitro protein synthesis in E. coli extract. Biotechnology Advances. 37 (1), 246-258 (2019).
  5. Jewett, M. C., Swartz, J. R. Mimicking the Escherichia coli cytoplasmic environment activates long-lived and efficient cell-free protein synthesis. Biotechnology and Bioengineering. 86 (1), 19-26 (2004).
  6. Calhoun, K. A., Swartz, J. R. Energizing cell-free protein synthesis with glucose metabolism. Biotechnology and Bioengineering. 90 (5), 606-613 (2005).
  7. Levine, M. Z., Gregorio, N. E., Jewett, M. C., Watts, K. R., Oza, J. P. Escherichia coli-based cell-free protein synthesis: Protocols for a robust, flexible, and accessible platform technology. Journal of Visualized Experiments. (144), e58882 (2019).
  8. Sun, Z. Z., et al. Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression. System for Synthetic Biology. , 1-14 (2013).
  9. Pardee, K., et al. Portable, on-demand biomolecular manufacturing. Cell. 167, 248-254 (2016).
  10. Moore, S. J., Macdonald, J. T., Freemont, P. S. Cell-free synthetic biology for in vitro prototype engineering. Biochemical Society Transactions. 45 (3), 785-791 (2017).
  11. Cole, S. D., Miklos, A. E., Chiao, A. C., Sun, Z. Z., Lux, M. W. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
  12. Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
  13. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Process optimization for scalable E. coli extract preparation for cell-free protein synthesis. Biochemical Engineering Journal. 138, 21-28 (2018).
  14. Kwon, Y. C., Jewett, M. C. High-throughput preparation methods of crude extract for robust cell-free protein synthesis. Scientific Reports. 5, 8663 (2015).
  15. Endo, Y., Sawasaki, T. Cell-free expression systems for eukaryotic protein production. Current Opinion in Biotechnology. 17 (4), 373-380 (2006).
  16. Zemella, A., Thoring, L., Hoffmeister, C., Kubick, S. Cell-free protein synthesis: Pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems. ChemBioChem. 16 (17), 2420-2431 (2015).
  17. Laohakunakorn, N., Grasemann, L., Lavickova, B., Michielin, G. Bottom-up construction of complex biomolecular systems with cell-free synthetic biology. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, (2020).
  18. Ahn, J. H., et al. Cell-free synthesis of recombinant proteins from PCR-amplified genes at a comparable productivity to that of plasmid-based reactions. Biochemical and Biophysical Research Communications. 338 (3), 1346-1352 (2005).
  19. Kim, T. W., et al. Simple procedures for the construction of a robust and cost-effective cell-free protein synthesis system. Journal of Biotechnology. 126 (4), 554-561 (2006).
  20. Hunt, J. P., et al. Streamlining the preparation of "endotoxin-free" ClearColi cell extract with autoinduction media for cell-free protein synthesis of the therapeutic protein crisantaspase. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 220-224 (2019).
  21. Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures. Protein Expression and Purification. 41, 207-234 (2005).
  22. Shrestha, P., Holland, T. M., Bundy, B. C. Streamlined extract preparation for Escherichia coli-based cell-free protein synthesis by sonication or bead vortex mixing. BioTechniques. 53 (3), 163-174 (2012).
  23. Bosdriesz, E., Molenaar, D., Teusink, B., Bruggeman, F. J. How fast-growing bacteria robustly tune their ribosome concentration to approximate growth-rate maximization. FEBS Journal. 282 (10), 2029-2044 (2015).
  24. Zawada, J., Swartz, J. Maintaining rapid growth in moderate-density Escherichia coli fermentations. Biotechnology and Bioengineering. 89 (4), 407-415 (2005).
  25. Kim, J., Copeland, C. E., Padumane, S. R., Kwon, Y. C. A crude extract preparation and optimization from a genomically engineered Escherichia coli for the cell-free protein synthesis system: Practical laboratory guideline. Methods and Protocols. 2 (3), 1-15 (2019).
  26. Failmezger, J., Rauter, M., Nitschel, R., Kraml, M., Siemann-Herzberg, M. Cell-free protein synthesis from non-growing, stressed Escherichia coli. Scientific Reports. 7 (1), 1-10 (2017).
  27. Levine, M. Z., et al. Activation of energy metabolism through growth media reformulation enables a 24-h workflow for cell-free expression. ACS Synthetic Biology. 9 (10), 2765-2774 (2020).
  28. Martin, R. W., et al. Cell-free protein synthesis from genomically recoded bacteria enables multisite incorporation of noncanonical amino acids. Nature Communications. , 1-9 (2018).
  29. Soye, B. J. D., et al. Resource A highly productive, One-pot cell-free protein synthesis platform based on genomically recoded Escherichia coli resource. Cell Chemical Biology. 26 (12), 1743-1754 (2019).
  30. Ezure, T., Suzuki, T., Ando, E. A cell-free protein synthesis system from insect cells. Methods in Molecular Biology. , 285-296 (2014).
  31. Heide, C., et al. development and optimization of a functional mammalian cell-free protein synthesis platform. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 1-10 (2021).

Tags

ביו-הנדסה גיליון 173

Erratum

Formal Correction: Erratum: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow
Posted by JoVE Editors on 05/23/2022. Citeable Link.

An erratum was issued for: From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours using Cell-Free Autoinduction Workflow. The Authors section was updated.

The Authors section was updated from:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

to:

Philip E.J. Smith1,2, Taylor Slouka1,2, Mona Dabbas 1,2, Javin P. Oza1,2
1Department of Chemistry and Biochemistry, California Polytechnic State University
2Center for Application in Biotechnology, California Polytechnic State University

מתאים לסינתזת חלבונים ללא תאים תוך 24 שעות באמצעות זרימת עבודה של אינדוקציה אוטומטית ללא תאים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, … More

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, M., Oza, J. P. From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow. J. Vis. Exp. (173), e62866, doi:10.3791/62866 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter