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Cancer Research

उत्पादित ठोस ट्यूमर होमोजेनेट के माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का विश्लेषणात्मक निर्धारण

Published: August 6, 2021 doi: 10.3791/62875
Automatic Translation
1,2,3, 1, 2,4, 1,3
1Integrated Physiology and Molecular Medicine Laboratory, Pennington Biomedical Research Center, 2Clinical Oncology and Metabolism, Pennington Biomedical Research Center, 3Department of Nutrition, Case Western Reserve University, 4Department of Clinical Nutrition, University of Texas Southwestern Medical Center

Summary

हमने ताजा ट्यूमर समरूपता में माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन और इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण क्षमता का मूल्यांकन करने के लिए एक व्यावहारिक प्रोटोकॉल और विश्लेषणात्मक दृष्टिकोण विकसित किया है। इस प्रोटोकॉल को कैंसर दीक्षा, प्रगति और उपचार प्रतिक्रिया में योगदान देने वाले विभिन्न माइटोकॉन्ड्रियल कार्यों का सर्वेक्षण करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

Abstract

माइटोकॉन्ड्रिया ऊर्जा उत्पादन, प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के विनियमन, और मैक्रोमॉलिक्यूल संश्लेषण के माध्यम से कैंसर की शुरुआत और प्रगति के लिए आवश्यक हैं। ट्यूमर पर्यावरण के लिए माइटोकॉन्ड्रिया के आनुवंशिक और कार्यात्मक अनुकूलन प्रोलिफेरेटिव और मेटास्टैटिक क्षमता को चलाते हैं। डीएनए और आरएनए अनुक्रमण के आगमन ने ट्यूमरजीनेसिस के आनुवंशिक मध्यस्थों के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण बाधाओं को हटा दिया। हालांकि, आज तक, ट्यूमर माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए पद्धतिगत दृष्टिकोण मायावी बने हुए हैं और व्यवहार्यता को सीमित करने के लिए तकनीकी प्रवीणता की आवश्यकता होती है, अंततः प्रयोगात्मक और नैदानिक दोनों सेटिंग्स में नैदानिक और शकुन मूल्य कम हो जाता है। यहां, हम उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसन का उपयोग करके ताजा उत्पादित ठोस ट्यूमर समरूपता में ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन (ऑक्सीफोस) और इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर (ईटी) क्षमता की दरों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सरल और त्वरित विधि की रूपरेखा तैयार करते हैं। प्रोटोकॉल को प्रजातियों और ट्यूमर प्रकारों में पुन: लागू किया जा सकता है और साथ ही माइटोकॉन्ड्रियल ईटी रास्तों की विविधता का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, हम प्रदर्शित करते हैं कि एक चमकदार बी स्तन कैंसर वाले चूहों ने ऑक्सफोस के माध्यम से एडेनोसाइन ट्राइफोस्फेट उत्पन्न करने के लिए संक्षेप पर दोषपूर्ण निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड से जुड़े श्वसन और निर्भरता का प्रदर्शन किया।

Introduction

सभी कोशिकाओं को परिचित उत्पादन और adenosine triphosphate (एटीपी), आणविक ऊर्जा मुद्रा का उपभोग करने की आवश्यकता से जुड़े हुए हैं । चूंकि सेलुलर उत्परिवर्तन ट्यूमर के गठन को जन्म देते हैं, माइटोकॉन्ड्रिया ऊर्जा उत्पादन के विविधीकरण के माध्यम से अस्तित्व सुनिश्चित करते हैं जो अक्सर गैर-कैंसरऊतक1,2,3से अलग होता है। इस प्रकार, ट्यूमर प्रकार, कैंसर दीक्षा, प्रगति और उपचार प्रतिक्रिया के वर्गीकरण को सुविधाजनक बनाने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन कार्य की तेजी से और गहरी प्रोफाइलिंग की एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है।

उत्पादित ऊतक नमूनों के श्वसन कार्यों का मूल्यांकन बरकरार नहीं किया जा सकता क्योंकि ऑक्सफोस के लिए प्राथमिक सब्सट्रेट्स सेल-पारमेबल नहीं हैं। इस सीमा को दूर करने के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया को या तो अलगाव, रासायनिक पारमेबिलाइजेशन, या यांत्रिक समरूपता द्वारा तैयार किया जा सकता है। माइटोकॉन्ड्रियल अलगाव लंबे समय से श्वसन कार्य के मूल्यांकन के लिए एक स्वर्ण मानक माना जाता है। हालांकि, इसके लिए बड़ी मात्रा में ऊतक की आवश्यकता होती है, समय लेने वाला होता है, और माइटोकॉन्ड्रिया4के कुछ अंशों के लिए संभावित चयन पूर्वाग्रह के साथ कम उपज है। परिव्ययीकरण में यांत्रिक पृथक्करण होता है और ऊतक वर्गों या फाइबर बंडलों का एक हल्के डिटर्जेंट के संपर्क में जाता है जो प्लाज्मा झिल्ली को चुनिंदा रूप से कम कर देता है5. परिव्ययीकरण अक्सर कंकाल और हृदय की मांसपेशी जैसे स्ट्रेटेड ऊतकों में कार्यरत होता है क्योंकि व्यक्तिगत फाइबर बंडलों को अलग-अलग छेड़ा जा सकता है। अलगाव की तुलना में, पारमेबिलाइजेशन अपने मूल सेलुलर वातावरण और भौतिक रूप5में अधिक माइटोकॉन्ड्रिया पैदा करता है। ट्यूमर 6,7 और अपरा8जैसे अन्य ऊतकों मेंपरमीलाइजेशन सफलतापूर्वक लागू किया गया है । हालांकि, परमीबिलाइज्ड फाइबर तैयारी की प्रजनन क्षमता विच्छेदन और ऑक्सीजन आवश्यकताओं की स्थिरता के कारण मुश्किल हो सकता है प्रसार सीमाओं को दूर करने के लिए9. इसके अतिरिक्त, परमीबिलित फाइबर कुछ ट्यूमर प्रकारों में अनुपयुक्त हो सकते हैं जो घनी सेलुलर और अत्यधिक फाइब्रोटिक होते हैं। ऊतक समरूप प्लाज्मा झिल्ली के यांत्रिक व्यवधान के माध्यम से उत्पन्न होते हैं और माइटोकॉन्ड्रियल यील्ड और अखंडता10के संदर्भ में परमीबिलित फाइबर के समान होते हैं। ऊतक समरूपता ऑक्सीजन प्रसार की सीमाओं को भी कम करती है और यांत्रिक बल11 , 12के अनुकूलन के माध्यम से ऊतक प्रकारों में आसानी सेनियोजितकिया जा सकता है ।

यहां, हम ताजा उत्पादित ठोस ट्यूमर समरूपता में ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन (ऑक्सीफोस) और इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर (ईटी) क्षमता की दरों की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक सरल और तेजी से विधि की रूपरेखा तैयार करते हैं। प्रोटोकॉल को ऑक्सीग्राफ-2k (O2k) उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसन का उपयोग करके ताजा ऊतक का मूल्यांकन करने के लिए बेहतर ढंग से डिज़ाइन किया गया है, जिसके लिए वाद्य सेटअप और अंशांकन के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता होती है, लेकिन इसी तरह किसी भी क्लार्क-प्रकार के इलेक्ट्रोड, सीहॉर्स एनालाइजर या प्लेट रीडर का उपयोग करके अनुकूलित किया जा सकता है। प्रोटोकॉल को प्रजातियों और ट्यूमर प्रकारों में पुन: लागू किया जा सकता है और साथ ही माइटोकॉन्ड्रियल ईटी रास्तों की विविधता का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

Protocol

जानवरों से जुड़े सभी प्रयोगों और प्रक्रियाओं को पेनिंगटन बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी ने मंजूरी दी थी ।

1. रिएजेंट तैयारी।

  1. 10 एमएम एचईपीई, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस), 1% पेनिसिलिन-स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 यू/एमएल) और 0.2% एम्फोटेरिसिन बी के साथ EO771 सेल ग्रोथ मीडिया तैयार करें।
  2. 1000 एमएल ग्लास बीकर में बायोप्सी प्रिजर्वेशन (बायोप्स) समाधान के 1 एल तैयार करें।
    1. एनए2एटीपी (5.77 m अंतिम एकाग्रता) के 3.180 ग्राम जोड़ें।
    2. एमजीसीएल 2 ·6एच2ओ (6.56 एमएमएम अंतिम एकाग्रता) के 1.334 ग्राम जोड़ें।
    3. 2.502 ग्राम टॉरिन (20 एमएमएम अंतिम एकाग्रता) जोड़ें।
    4. एनए 2 फॉस्फोक्रेटिन(15 एमएम अंतिम एकाग्रता) के 3.827 ग्राम जोड़ें।
    5. इमिडाजोल (20 एमएमएम अंतिम एकाग्रता) के 1.362 ग्राम जोड़ें।
    6. डिथिओथ्रेइटोल (.5 mm अंतिम एकाग्रता) का 0.077 ग्राम जोड़ें।
    7. एमईएस हाइड्रेट (50 एमएमएम अंतिम एकाग्रता) के 9.76 ग्राम जोड़ें।
    8. एच2ओ के 800 एमएल जोड़ें और 30 डिग्री सेल्सियस पर एक चुंबकीय रेस्टर का उपयोग करके घटकों को मिलाएं।
    9. 100 mM K2EGTA (7.23 m अंतिम एकाग्रता) के 72.3 एमएल जोड़ें।
      1. एच 2 ओ के 100 एमएल में 7.608 ग्राम ईजीटीए और2.3ग्राम कोह घोलें।
      2. पीएच को 5 एम कोह के साथ 7.0 पर समायोजित करें और एच 2 ओ के साथ200एमएल तक की मात्रा लाएं।
    10. 100 mM CaK 2 EGTA(2.77 m अंतिम एकाग्रता) के 27.7 एमएल जोड़ें।
      1. एच 2 ओ के 200 एमएल में ईजीटीएके 7.608 ग्राम और गर्मी को 80 डिग्री सेल्सियस (100 mm अंतिम एकाग्रता) में भंग करें।
      2. गर्म 100 m EGTA समाधान के 200 एमएल में CaCO3 के 2.002 ग्राम भंग।
      3. लगातार सरगर्मी करते हुए, कोह के 2.3 ग्राम जोड़ें और पीएच को 7.0 में समायोजित करें।
    11. पीएच को 5 एम कोह के साथ 23 डिग्री सेल्सियस (पीएच 7.1 एट 0 डिग्री सेल्सियस पर) पर 6.75 पर समायोजित करें। एच2ओ के साथ 980 एमएल तक वॉल्यूम लाएं और घोल को मिक्स करें। पीएच एक बार फिर देखें, यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें, और अंतिम मात्रा को पानी के साथ 1000 एमएल तक लाएं।
    12. एलिकोट बायोप्स को शंकु नलियों (15 एमएल या 50 एमएल) में और उपयोग होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। उपयोग से ठीक पहले केवल एक बार गल जाएं।
  3. 1000 एमएल ग्लास बीकर में माइटोकॉन्ड्रियल रीस्पिरेशन मीडियम (MiR05) के 1 एल तैयार करें।
    1. 0.190 ग्राम ईजीटीए (0.5 mM अंतिम एकाग्रता) जोड़ें।
    2. एमजीसीएल 2 ·6एच2ओ (3 एमएम अंतिम एकाग्रता) के 0.610 ग्राम जोड़ें।
    3. 2.502 ग्राम टॉरिन (20 एमएमएम अंतिम एकाग्रता) जोड़ें।
    4. केएच2पीओ4 (10 एमएमएम अंतिम एकाग्रता) के 1.361 ग्राम जोड़ें।
    5. 4.77 ग्राम हेपेट्स (20 एमएमएम अंतिम एकाग्रता) जोड़ें।
    6. डी-सुक्रोज (110 एमएमएम अंतिम एकाग्रता) के 37.65 ग्राम जोड़ें।
    7. एच2ओ के 800 एमएल जोड़ें और 30 डिग्री सेल्सियस पर एक चुंबकीय रेस्टर का उपयोग करके घटकों को मिलाएं।
    8. 0.5 एम लैक्टोबायोनिक एसिड (60 mm अंतिम एकाग्रता) के 120 एमएल जोड़ें।
      1. एच2ओ के 100 एमएल में 35.83 ग्राम लैक्टोबायोनिक एसिड घोलें।
      2. पीएच को 5 एम कोह के साथ 7.0 पर समायोजित करें और एच 2 ओ के साथ200एमएल तक वॉल्यूम लाएं।
    9. समाधान मिलाएं और पीएच को 5 एम कोह के साथ 7.1 पर समायोजित करें।
    10. बीएसए के 1 ग्राम वजन, अनिवार्य रूप से फैटी एसिड मुक्त (1 जी/एल अंतिम एकाग्रता), एक ५० एमएल शंकु नली में । चरण 9 से ट्यूब तक पीएच 7.1 समाधान के 40 एमएल जोड़ें, मिश्रण करने के लिए धीरे-धीरे उलटा करें, और फोमिंग से बचें। भंग बीएसए को शेष पीएच 7.1 समाधान में स्टेप 9 से स्थानांतरित करें और धीरे-धीरे और लगातार हिलाएं। एक बार फिर पीएच की जांच करें, यदि आवश्यक हो तो समायोजित करें, और एच2ओ के साथ 1000 एमएल तक अंतिम वॉल्यूम लाएं।
    11. MiR05 माध्यम को 50 एमएल शंकु ट्यूबों में अलीकोट करें और उपयोग होने तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। उपयोग से ठीक पहले केवल एक बार गल जाएं।
  4. सब्सट्रेट्स, अनकूप्लर और अवरोधक तैयार करें।
    1. तैयार करें 0.8 मीटर मालेट: एच2ओ के 4 एमएल में 536.4 मिलीग्राम एल-मैलिक एसिड घोलें। 5 एम कोह से पीएच 7 में बेअसर करें और एच 2 ओ के साथ5एमएल तक वॉल्यूम लाएं एलकोट में डिवाइड करें और फिर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. तैयार करें 1 एम पाइरुवेट: एच2ओ के 4 एमएल में 550 मिलीग्राम पायरुविक एसिड सोडियम नमक घोलें। 5 एम कोह से पीएच 7 में बेअसर करें और एच 2 ओ के साथ5एमएल तक की मात्रा को एलिकोट्स में विभाजित करें और फिर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    3. तैयार करें 0.5 एम एडीपी (एडेनोसाइन 5′-डिफॉस्फेट): एच2ओ के 4 एमएल में 1.068 ग्राम एडीपी सोडियम नमक घोलें। 5 एम कोह से पीएच 7 के साथ बेअसर हो जाएं और एच 2 ओ के साथ5एमएल तक वॉल्यूम लाएं।
    4. तैयार करें 2 एम ग्लूटामेट: एच 2 ओ के 8 एमएल में एल-ग्लूटामिक एसिड मोनोहाइड्रेट के3.7426ग्राम को भंग करें। 5 एम कोह से पीएच 7 के साथ बेअसर हो जाएं और एच2ओ के साथ 10 एमएल तक की मात्रा को एलकोट में डालें और फिर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    5. 4 एमएम साइटोक्रोम सीतैयार करें: एच2ओ के 1 एमसीएल में 50 मिलीग्राम साइटोक्रोम सी को भंग करें। aliquots में विभाजित करें और फिर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    6. तैयार करें 1 एम सुसिएट: एच 2 ओ के 8 एमएल में 2.701ग्राम Succinate डिसोडियम सॉल्ट हेक्साहाइड्रेट घोलें। 1 एन एचसीएल से पीएच 7 के साथ बेअसर हो जाएं और एच 2 ओ के साथ10एमएल तक की मात्रा लाएं।
    7. 1 एमएमएम एफसीसीपी (कार्बोनाइल सायनाइड-4-(ट्राइफ्लोरोमेथॉक्सी) फिनाइलहाइड्राजोन): शुद्ध इथेनॉल के 10 एमएल में 2.54 मिलीग्राम एफसीसीपी को भंग करें। एलिकोट्स में विभाजित करें और फिर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    8. 150 माइक्रोनएम रोटेनोन तैयार करें: पूरी तरह से भंग होने तक 1 एमएमएम स्टॉक, भंवर तैयार करने के लिए शुद्ध इथेनॉल के 10 मिलीलन में 3.94 मिलीग्राम रोटेनोन को भंग करें। 1.275 मिलील शुद्ध इथेनॉल के साथ 1 एमएम रोटेनोन स्टॉक एकाग्रता के 225 माइक्रोन 150 माइक्रोनवन के 1.5 मिलियन एलएल बनाने के लिए। प्रकाश से रक्षा करें, अलीकोट में विभाजित करें, और फिर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    9. 125 माइक्रोन एंटीमाइसिन ए तैयार करें: एंटीमाइसिन ए के 5 एमएमएम स्टॉक एकाग्रता को तैयार करने के लिए शुद्ध इथेनॉल के 4 मिलील में 11 मिलीग्राम एंटीमाइसिन ए को भंग करें। 5 एमएम एंटीमाइसिन के 25 माइक्रोन को 0.125 एमएम एंटीमाइसिन ए के 1 मिलियन 1 मिलियन एल बनाने के लिए शुद्ध इथेनॉल के 975 माइक्रोन के साथ स्टॉक एकाग्रता एलिकोट्स में विभाजित करें और फिर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    10. 0.8 मीटर Ascorbate तैयार करें: एच 2 ओ के 8 एमएल में 1.584 ग्राम एस्कॉर्बेट सोडियम नमक को भंग करें पीएच6में एस्कॉर्बिक एसिड के साथ पीएच को समायोजित करें और एच2ओ के साथ 10 मिलीएल तक की मात्रा लाएं प्रकाश से रक्षा करें, अलीकोट में विभाजित करें, और फिर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    11. 0.2 एम टीएमपीडी (टेट्रामेथिल-पी-फेनिलेनिडाइमाइन): डीएमएसओ के 987.5 माइक्रोन में 32.85 मिलीग्राम टीएमपीडी को भंग करें। 0.8 एम एस्कॉरबेट (10 एमएम अंतिम एकाग्रता ऑफ एस्कॉर्टबेट) का 12.5 माइक्रोल जोड़ें। प्रकाश से रक्षा करें, अलीकोट में विभाजित करें, और फिर -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    12. तैयार करें 4 मीटर सोडियम एजाइड: एच 2 ओ के 10 एमएल में2.6ग्राम सोडियम एजाइड को भंग करें। -20 डिग्री सेल्सियस पर एलिकोट्स में विभाजित करें और स्टोर करें।

2. ट्यूमर विकास

  1. आरपीएमआई 1640 ग्रोथ मीडिया में EO771 कोशिकाओं को बढ़ाएं और 5% सीओ2के साथ 37 डिग्री सेल्सियस आर्द्रीकृत इनक्यूबेटर में कोशिकाओं को बनाए रखें।
  2. एकल घर चार सप्ताह पुरानी महिला C57BL/6J चूहों, उन्हें एक 12 घंटे प्रकाश पर 21-22 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखने: अंधेरे चक्र । चूहों विज्ञापन लिबिटम भोजन और पानी के लिए उपयोग प्रदान करते हैं।
  3. एक बार जब चूहे 10 सप्ताह की उम्र तक पहुंच जाते हैं, तो कैंसर सेल प्रत्यारोपण के लिए कोशिकाओं और चूहों को तैयार करें।
    1. कोशिकाओं को ट्रिपसिनाइज करें, विकास मीडिया के साथ ट्राइपसिन को निष्क्रिय करें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र कोशिकाओं को निष्क्रिय करें। सुपरनेट और रिसिपेंड को एस्पिरेट करें और मीडिया में सेल छर्रों (आवश्यकतानुसार) को जोड़ें। ट्राइपैन ब्लू का उपयोग करके व्यवहार्य कोशिकाओं की गणना करें और 1 x 106 कोशिकाओं की कुल मात्रा में 1:1:1 मीडिया/बेसमेंट झिल्ली मैट्रिक्स/पीबीएस समाधान के साथ एक सेल कमजोर पड़ने तैयार करें । एक बार तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स जोड़ दिया जाता है, अच्छी तरह से मिश्रण और बर्फ पर सेल निलंबन रखने के लिए। सेल सस्पेंशन के 60 माइक्रोन के साथ सीरिंज भरें और उन्हें बर्फ पर रखें। कुशलता से काम करें और तैयारी के 1.5 घंटे के भीतर चूहों में कोशिकाओं को इंजेक्ट करें।
    2. आइसोफ्लुनेलैन साँस लेने से चूहों को एनेस्थेटाइज करें (प्रेरण के लिए 3%-5%और रखरखाव के लिए 1%-3%)। सही 4 और5 th inguinal स्तन ग्रंथियों के बीच दाढ़ी। ऑर्थोटोपिक रूप से एनेस्थेटाइज्ड चूहों को ईओ 771 सेल निलंबन के साथ इंजेक्ट करें।
  4. 4 सप्ताह के लिए सप्ताह में दो बार ट्यूमर के विकास की निगरानी और उपाय करने के लिए इलेक्ट्रॉनिक कैलिपर्स का उपयोग करें। नेक्रॉप्सी, एक्साइज, वजन में, और फिर ट्यूमर (या न्यूनतम 60 मिलीग्राम ट्यूमर सेक्शन) को तुरंत बर्फ-ठंडे बायोप्स के 10 मिलील में रखें। ट्यूब को गीली बर्फ पर रखें।

3. इंस्ट्रूमेंट सेटअप और अंशांकन

  1. 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में MiR05 माध्यम गर्म करें।
  2. ओरोब्रोरोस O2k सिस्टम चालू करें, DATLAB सॉफ्टवेयर खोलें, उपयोगकर्तादर्ज करें या चुनें। कनेक्ट टू O2kपर क्लिक करें । O2k विन्यास की जांच करें और यह सुनिश्चित करें कि सही उपकरण पावर-O2k के लिए लेबल किया गया है और प्रत्येक कक्ष सही ऑक्सीजन सेंसर से मेल खाता है; क्लिक करें ठीक है. एक बार O2k नियंत्रण खिड़की खुलता है, सिस्टम टैब के तहत, ब्लॉक तापमान को 37 डिग्री सेल्सियस तक सेट करें, दोनों कक्षों के लिए 750 आरपीएम तक स्टर्डर गति, ND डेटा रिकॉर्डिंग अंतराल 2.0 एस तक। चैंबर बॉक्स में स्टरर पावर और रोशनी दोनों की जांच करें। ऑक्सीजन में, O2 टैब, सेंसर के लिए लाभ सेट 1 V/μA (लाभ पुराने साधन मॉडल के लिए समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है), ध्रुवीकरण वोल्टेज ८०० mV के लिए, और फिर O2k से कनेक्टपर क्लिक करें । एक बार एक नया प्रयोग फ़ाइल खुलता है, फ़ाइल नाम और सेवपर क्लिक करें । प्रयोग सक्रिय होने के बाद, एक प्रोटोकॉल चयन विंडो खुलेगी; एक कस्टम सूट (सब्सट्रेट अनकूपलर अवरोधक टिटरेशन) चलाने के लिए कैंसिल पर क्लिक करें।
  3. प्रोटोकॉल चयन के बाद, लागू के रूप में प्रयोगात्मक कोड, नमूना प्रकार, पलटन, नमूना कोड, नमूना संख्या, और सबसंपल नंबर भरने के लिए एक नमूना विंडो खुलेगी। एमजी को इकाई असाइन करें और ट्यूमर को प्रति एमएल अनुरूप से एकाग्रता में प्रवेश करें (प्रति कक्ष राशि ऑटो-पॉप्युलेट होगी)। सुनिश्चित करें कि इंगित माध्यम MiR05 है और चैंबर वॉल्यूम 2.00 मिलीएल है। नीचे बॉक्स में जरूरत के रूप में टिप्पणी जोड़ें और ठीक परक्लिक करें ।
  4. स्टॉपर्स को हटा दें और कक्षों से 70% इथेनॉल को एस्पिरेट करें। कभी भी कक्ष के अंदर उजागर होने वाली झिल्ली के करीब न आइए। शुद्ध पानी के साथ चार बार कुल्ला और MiR05 के 2.25 एमएल के साथ कक्ष भरें।
  5. सेंसर परीक्षण: 30 एस के लिए stirrers स्विच करने के लिए F9 पर क्लिक करें । एक बार जब स्टरर बार वापस स्विच हो जाता है, तो सुनिश्चित करें कि ओ2 ढलान प्रत्येक कक्ष में तेजी से मोनोएक्सपोनेंशियल रूप से बढ़ जाता है। यदि कक्ष सेंसर परीक्षण में विफल रहता है, बिजली के कनेक्शन की जांच करें और साफ अगर लवण जमा कर दिया है; परीक्षण दोहराएं। यदि सेंसर परीक्षण में विफल रहता है, तो झिल्ली का निरीक्षण करने के लिए पोलरोग्राफिक ऑक्सीजन सेंसर (पीओएस) कनेक्टर को हटा दें। यदि झिल्ली, भारी ऑक्सीकरण, या महत्वपूर्ण बुलबुला संचय को दिखाई देने वाली क्षति देखी जाती है, तो प्रायोगिक प्रक्रियाओं को रोकें, और साधन सर्विसिंग के लिए आगे बढ़ें।
  6. ऑक्सीजन अंशांकन: सटीक श्वसन माप प्राप्त करने के लिए ऑक्सीजन अंशांकन करें।
    1. एक घुमावदार गति के साथ, स्टॉपर्स को धीरे-धीरे उनकी मात्रा-अंशांकित स्थिति में डालें। इंजेक्शन केशिका के माध्यम से निकाले गए अतिरिक्त माध्यम को साइफन करें जो डाट के कुएं में एकत्र होता है। एक घुमा गति के साथ, डाट बस को कसकर डाट-स्पेसर उपकरण अंतिम हवा संतुलन (30-45 मिनट) के लिए तरल चरण के ऊपर एक गैस की मात्रा छोड़ने फिट करने के लिए पर्याप्त लिफ्ट ।
    2. श्वसन के सटीक माप प्राप्त करने के लिए ऑक्सीजन सेंसर को जांचने के लिए इस अवधि में प्राप्त स्थिर-राज्य का उपयोग करें। ओ2 स्लोप नेग (ऑक्सीजन का निगेटिव स्लोप) 0 ± 2 पीएमओएल/एसवाईएल है। यदि मूल्य 2 pmol/s·mL से अधिक है, तो चैंबर को साफ करें और इसे हौसले से गल गया MiR05 के साथ भरें । यदि ढलान अस्थिर है, तो इंस्ट्रूमेंट सर्विसिंग के लिए आगे बढ़ें।
    3. एक स्थिर राज्य प्राप्त करने के बाद, ओ2 एकाग्रता वक्र का चयन करें और शिफ्ट कुंजी और बाएं क्लिक माउस बटन को नीचे रखकर वक्र के स्थिर क्षेत्र को उजागर करें। एक बार क्षेत्र का चयन हो जाने के बाद, F5पर क्लिक करें, ड्रॉप-डाउन तीर के साथ एयर कैलिब्रेशन के लिए निशान का चयन करें और कैलिब्रेट पर क्लिक करें और क्लिपबोर्ड पर कॉपी करें।
  7. वाद्य पृष्ठभूमि अंशांकन (वैकल्पिक)
    1. एयर अंशांकन के बाद, यह सुनिश्चित करें कि प्रवाह पृष्ठभूमि संतुलन (~ 15 मिनट) के लिए तरल चरण से ऊपर कोई गैस की मात्रा नहीं है और कक्षों को पूरी तरह से बंद करें।
      नोट: इस अवधि में प्राप्त स्थिर-राज्य दर वाद्य पृष्ठभूमि का प्रतिनिधित्व करता है और बढ़ी हुई विश्लेषणात्मक परिशुद्धता के लिए परिणामी डेटा से घटाया जा सकता है। ओ2 स्लोप नेग शुरू में 2 से 4 बजे के बीच थोड़ा और पठार ± 2 से 4 बजेएल/एसवाईएल के बीच होगा ।
    2. यदि मूल्य अधिक है (>6 pmol/s·ml), वहां संभावित जैविक संदूषण है । इस मामले में, चैंबर को साफ करें और इसे हौसले से गल गए MiR05 के साथ भरें। एक बार एक स्थिर राज्य प्राप्त हो जाने के बाद, ओ2 ढलान नेग वक्र का चयन करें और शिफ्ट कुंजी और बाएं क्लिक माउस बटन को दबाकर वक्र के स्थिर क्षेत्र को उजागर करें।
    3. इस क्षेत्र का चयन करने के बाद, F5पर क्लिक करें, बेसलाइन सुधार बॉक्स और ड्रॉप-डाउन तीर के साथ बेसलाइन के लिए निशान का चयन करें, और ठीकपर क्लिक करें।

4. ट्यूमर समरूप तैयारी

  1. एक ग्लास होमोजेनाइजर रखें जिसमें एमआईआर05 का 1 एमएल और गीली बर्फ पर कसकर फिटिंग ग्लास मूसल हो।
  2. अध्ययन के समय, ऊतक को बायोप्स के 1 एमसीएल में बर्फ से ठंडे पेट्री डिश में रखें।
  3. घुलनशील सामग्री को अधिकतम करने, परिगलित क्षेत्रों से बचने और सीमांत ट्यूमर ऊतक को हटाने के लिए ऊतक को साफ और विच्छेदन करें। विच्छेदन माइक्रोस्कोप, स्केलपेल और सर्जिकल चिमटी का उपयोग करके, किसी भी बाल, परिगलित ऊतक, परिधीय संयोजी और संवहनी ऊतक, और आसन्न वसा को लागू किया जाता है। विच्छेदन के दौरान बर्फ-ठंडे बायोप्स में ट्यूमर को रखने का ध्यान रखें।
  4. ट्यूमर को छोटे टुकड़ों (~ 5-10 मिलीग्राम प्रत्येक) में काट लें और शेष ट्यूमर के टुकड़ों को बर्फ पर रखे बायोप्स के 10 एमएल में वापस रखें। यदि आवश्यक हो तो अतिरिक्त तैयारी के लिए बाद में इस ऊतक का उपयोग करें।
    नोट: नमूने को बायोप्स में पूरी तरह से जलमग्न न होने के समय की मात्रा को कम करने के लिए निम्नलिखित कदम जल्दी से करें। एक बार नमूना MiR05 में रखा जाता है, समय सार का है । तैयार समरूप को जितनी जल्दी हो सके कैलिब्रेटेड चैंबर में सावधानी से ले जाएं।
  5. एक फिल्टर पेपर पर ऊतक वर्गों को ध्यान से दाग दें, उन्हें एक छोटे प्लास्टिक टार्गेट वजन नाव पर रखें, और प्रारंभिक गीले वजन को रिकॉर्ड करें। अप्रयुक्त टुकड़ों को निरंतर संरक्षण के लिए बायोप्स की 10 एमएल शंकु नली में वापस रखें।
  6. ऊतक वर्गों को एक बर्फ-ठंडे समरूपता में जलमग्न करें जिसमें MiR05 होता है और यदि लागू हो तो वजन नाव पर शेष वजन रिकॉर्ड करें।
  7. ग्लास मूसल (क्लीयरेंस रेंज 0.09-0.16 मिमी) का उपयोग करके, धीरे-धीरे 5-7 डाउन-एंड-अप स्ट्रोक को पूरा करके ट्यूमर ऊतक को बाधित करें। प्रत्येक स्ट्रोक के लिए, मूसल को मूसल को नीचे धकेलते समय 3 बार घड़ी के वार-काउंटर-क्लॉकवाइज मोशन में घुमाएं और मूसल को वापस ऊपर खींचते समय 3 अतिरिक्त बार। ऊतक को स्ट्रोक के बीच में समरूप के नीचे बसने की अनुमति देना सुनिश्चित करें लेकिन फोमिंग को रोकने के लिए मूसल को पूरी तरह से तरल पदार्थ की मात्रा से ऊपर लाने से बचें।
    नोट: जिसके परिणामस्वरूप समरूप न्यूनतम ठोस ऊतक अवशेष के साथ बादल दिखाई देना चाहिए।
  8. समरूप को 15 एमएल शंकु नली में डालकर बर्फ पर रखें।
  9. किसी भी शेष ऊतक समरूप को धोने के लिए मूसल पर और समरूप में ताजा MiR05 के पिपेट 1-3 एमएल। होमोजेनेट युक्त शंकु नली में MiR05 धोने डालो। समरूपता का पूर्ण हस्तांतरण सुनिश्चित करने के लिए मूसल और होमोजेनाइजर वॉश को 2-3 बार दोहराएं। लक्ष्य एकाग्रता और आवश्यक मात्रा को ध्यान में रखें कि धोने के चरणों के दौरान नमूने को पतला न करें।
  10. ऊतक समरूप एकाग्रता की सटीक गणना करने के लिए, शेष गैर-समरूप सामग्री (यानी, संयोजी ऊतक) के लिए समरूप और समरूपता का सावधानीपूर्वक निरीक्षण करें।
    1. चिमटी के साथ नहीं पहुंचा जा सकता है कि समरूप से गैर समरूप सामग्री को दूर करने के लिए, होमोजेनाइजर के लिए MiR05 जोड़ें, मात्रा (ऊतक सहित) एक पिपेट के साथ aspirate और सामग्री एक पेट्री पकवान के लिए ले जाते हैं ।
    2. समरूप से गैर-समरूप सामग्री को हटाने के लिए (शंकु नली के नीचे बड़े टुकड़ों में बसाया गया), बड़े टुकड़ों को पिपेट के साथ एस्पिरेट करें और उन्हें शंकुनी ट्यूब के ऊतक टोपी पर रखें।
    3. चिमटी के साथ पेट्री डिश या शंकु नली टोपी से ऊतक निकालें और फिल्टर पेपर पर दाग। शंकु नली टोपी से शेष समरूप को वापस शंकु नली में जोड़ें, इसे कैप करें, और फिर मिश्रण करने के लिए उलटा करें।
    4. किसी भी अतिरिक्त गैर-समरूप सामग्री के लिए समरूप और समरूप का फिर से निरीक्षण करें, और आवश्यकतानुसार सामग्री को हटाने के लिए 4.10.1-4.10.3 कदम दोहराएं।
  11. होमोजेनाइजर से बरामद गैर-समरूप सामग्री के द्रव्यमान का वजन और रिकॉर्ड करें। स्थानांतरित किसी भी घोर अक्षुण्ण ऊतक के लिए समरूप तैयारी का निरीक्षण करें। गैर-समरूप टुकड़ों को हटा दें और जितना आवश्यक हो वजन करें।
  12. अंतिम नमूना वजन की गणना करने के लिए प्रारंभिक गीले वजन से वजन नाव, समरूप और समरूप (यदि आवश्यक हो) से बरामद ऊतक वजन को घटाएं।
  13. अंतिम नमूना वजन का उपयोग करके, वांछित एकाग्रता में समरूप लाने के लिए अतिरिक्त MiR05 जोड़ें (अनुकूलन प्रयोगों के बारे में विवरण के लिए चरण 5 देखें)।
  14. एक बार समरूप तौला और तैयार हो जाने के बाद, जितनी जल्दी हो सके परख करने के लिए आगे बढ़ें। नमूना गीला बर्फ पर संग्रहीत रखें जब तक कि यह उपकरण को स्थानांतरित न कर ले।

5. सब्सट्रेट, अनकूपलर, अवरोधक टिटरेशन प्रोटोकॉल (सूट)

  1. एक बार जब उपकरण कैलिब्रेट हो जाता है, और नमूना तैयार हो जाता है, तो स्टॉपर्स को घुमाने की गति के साथ हटा दें और एमआईआर05 को कक्षों (कक्ष के अंदर उजागर झिल्ली से बचाएं)। समरूप को अच्छी तरह मिलाएं और कक्ष में समरूपता का 2.25 एमएल जोड़ें। यदि एक होमोजेनेट को कई कक्षों में जोड़ते हैं, तो समान ऊतक वितरण सुनिश्चित करने के लिए समरूप मिश्रण करते समय प्रत्येक कक्ष में एक समय में 1 मिलीएल पिपेट करें। घटना को नाम और समय पर स्टैंप करने के लिए F4 पर क्लिक करें और फिर ओकेपर क्लिक करें ।
  2. एक कुंद 18 जी सुई का उपयोग कर एक नियामक और गैस टयूबिंग के साथ एक ऑक्सीजन टैंक से ऑक्सीजन के साथ एक ५० मिलीएल सिरिंज भरें । हाइपरऑक्सीजेनेट कक्षों को ~ 500 माइक्रोनएम ऑक्सीजन के लिए। इसके लिए सीधे कोठियों में ऑक्सीजन इंजेक्ट करें। शिथिल डाट डालें और बंद करने के लिए इंतजार जब तक ऑक्सीजन ~ 480 μM तक पहुंचता है। एक घुमावदार गति के साथ, धीरे-धीरे कक्ष को बंद करें और श्वसन को समतुल्य (~ 15-20 मिनट) की अनुमति दें। यदि आवश्यक हो तो एमआईआर05 के साथ डाट केंद्रीय केशिका भरें।
  3. एन-लिंक्ड और एनएस-लिंक्ड और सीआईवी (कॉम्प्लेक्स IV) गतिविधि की ऑक्सफोस और ईटी (इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर स्टेट) क्षमता का विश्लेषणात्मक निर्धारण: पूरी तरह से बंद कक्षों में सब्सट्रेट्स, अनकपलर्स और अवरोधकों को इंजेक्ट करने के लिए समर्पित माइक्रोसिरिंग का उपयोग करें। वास्तविक समय में प्रत्येक कक्ष के लिए घटनाओं के नाम और समय स्टांप के लिए प्रत्येक इंजेक्शन के साथ F4 पर क्लिक करें । अध्ययन के दौरान, जरूरत के अनुसार ओ2 एकाग्रता और ओ2 ढलान नेग तराजू को समायोजित करने के लिए F6 का चयन करें। प्रत्येक इंजेक्शन के बाद, सीरिंज को पानी में 3 बार (पानी में घुलनशील यौगिकों के लिए) या 70% इथेनॉल (इथेनॉल या डीएमएसओ में भंग यौगिकों के लिए) धोएं।
    नोट: एन-लिंक्ड: ओ2 फ्लक्स परिभाषित NADH-जनित सब्सट्रेट संयोजनों द्वारा समर्थित, एनएस-लिंक्ड: ओ2 फ्लक्स परिभाषित NADH-उत्पन्न सब्सट्रेट संयोजनों और संक्षिप्त के अभिसरण द्वारा समर्थित।
    1. 0.8 एम मालेट (2 mm अंतिम एकाग्रता) के 5 माइक्रोन जोड़ें और अगले इंजेक्शन के लिए तुरंत आगे बढ़ें। इंजेक्शन सिरिंज को पानी में 3 बार धोएं।
    2. तुरंत 1 एम पायरुवेट (2.5 mm अंतिम एकाग्रता) के 5 माइक्रोन जोड़ें और श्वसन को स्थिर करने की प्रतीक्षा करें। इंजेक्शन सिरिंज को पानी में 3 बार धोएं।
    3. 0.5 एम एडीपी (2.5 m m अंतिम एकाग्रता) के 10 माइक्रोन जोड़ें और स्थिर करने के लिए एडीपी प्रतिक्रिया की प्रतीक्षा करें। इंजेक्शन सिरिंज को पानी में 3 बार धोएं।
      नोट: अतिरिक्त एडीपी (2.5-10 mM) को यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हो सकता है कि एडेनेलेट सांद्रता श्वसन प्रवाह तक सीमित नहीं है।
    4. 2 एम ग्लूटामेट (5 एमएम अंतिम एकाग्रता) के 5 माइक्रोन जोड़ें और श्वसन को स्थिर करने की प्रतीक्षा करें। इंजेक्शन सिरिंज को पानी में 3 बार धोएं।
    5. 4 m Cytochrome सी (10 μM अंतिम एकाग्रता) के 5 μL जोड़ें और श्वसन को स्थिर करने के लिए प्रतीक्षा करें। इंजेक्शन सिरिंज को पानी में 3 बार धोएं।
    6. 1 एम सुसिएट (10 एमएम अंतिम एकाग्रता) के 20 माइक्रोन जोड़ें और श्वसन को स्थिर करने की प्रतीक्षा करें। इंजेक्शन सिरिंज को पानी में 3 बार धोएं।
    7. 1 m fccP (2-20 μM अंतिम एकाग्रता) के टिट्रेट 0.5-1 माइक्रोन वेतन वृद्धि और प्रत्येक इंजेक्शन के बाद स्थिर करने के लिए श्वसन के लिए प्रतीक्षा करें, तब तक जारी रखें जब तक कि श्वसन में कोई अतिरिक्त वृद्धि न हो। इंजेक्शन सिरिंज को 70% इथेनॉल में 3 बार धोएं।
    8. 150 माइक्रोन रोटेनोन (150 एनएम-2 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) के 2 माइक्रोन जोड़ें और श्वसन को स्थिर करने की प्रतीक्षा करें। बीमा करने के लिए रोटेनोन का एक और 1 माइक्रोल जोड़ें आगे कोई अवरोध नहीं है। यदि श्वसन में कमी है, तो अतिरिक्त इंजेक्शन के साथ जारी रखें जब तक कि श्वसन में कोई कमी न हो। इंजेक्शन सिरिंज को 70% इथेनॉल में 3 बार धोएं।
    9. 125 माइक्रोन एंटीमाइसिन ए (125 एनएम-5 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता) के 2 माइक्रोन जोड़ें और श्वसन को स्थिर करने की प्रतीक्षा करें। बीमा करने के लिए एंटीमाइसिन ए का एक और 1 माइक्रोल जोड़ें आगे कोई अवरोध नहीं है। यदि श्वसन में कमी है, तो अतिरिक्त इंजेक्शन के साथ जारी रखें जब तक कि श्वसन में कोई कमी न हो। इंजेक्शन सिरिंज को 70% इथेनॉल में 3 बार धोएं।
    10. कक्ष की ऑक्सीजन एकाग्रता की जांच करें; यदि एकाग्रता 125 माइक्रोन से नीचे है, तो कमरे की हवा या हल्के हाइपरऑक्सीजेनेट के लिए फिर से करें ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि ऑक्सीजन श्वसन प्रवाह को सीमित नहीं करता है। 0.8 एम एस्कॉर्टबेट (2 mm अंतिम एकाग्रता) के 5 माइक्रोन जोड़ें। इंजेक्शन सिरिंज को 70% इथेनॉल में 3 बार धोएं।
    11. तुरंत 0.2 एम टीएमपीडी (1 m अंतिम एकाग्रता) के 10 माइक्रोल जोड़ें श्वसन धीमी गति से वृद्धि के लिए प्रतीक्षा करें। इंजेक्शन सिरिंज को 70% इथेनॉल में 3 बार धोएं।
    12. Ascorbate/TMPD पठारों के श्वसन प्रवाह पर तुरंत 4 एम सोडियम Azide (५० mm अंतिम एकाग्रता) के 25 μL जोड़ें । इंजेक्शन सिरिंज को 70% इथेनॉल में 3 बार धोएं।
    13. अध्ययन समाप्त करें- फ़ाइल, सेव और डिस्कनेक्टपर क्लिक करें। 9.2-9.3 चरणों के बाद कक्ष और सिरिंज को धोना जारी रखें।

6. एडीपी संवेदनशीलता प्रोटोकॉल

  1. एक बार जब उपकरण कैलिब्रेट हो जाता है और नमूना तैयार हो जाता है, तो एक घुमावदार गति के साथ डाट को हटा दें और कक्षों से एमआईआर05 को हटा दें (कक्ष के अंदर उजागर झिल्ली से बचें)। समरूप को अच्छी तरह मिलाएं और कक्ष में समरूपता का 2.25 एमएल जोड़ें। मान लीजिए कि समान ऊतक वितरण सुनिश्चित करने के लिए समरूप मिश्रण करते समय प्रत्येक कक्ष में एक समय में एक समरूप, पिपेट 1 एमएल। घटना को नाम और समय स्टांप करने के लिए F4 पर क्लिक करें और ओकेपर क्लिक करें ।
  2. डाट डालें, और एक घुमा गति के साथ, धीरे-धीरे कक्ष को बंद करें और श्वसन को समान (~ 15-20 मिनट) की अनुमति दें। यदि आवश्यक हो तो एमआईआर05 के साथ डाट केंद्रीय केशिका भरें।
  3. संक्षेप से जुड़े माइटोकॉन्ड्रियल एडीपी संवेदनशीलता का विश्लेषणात्मक निर्धारण: वास्तविक समय में प्रत्येक कक्ष के लिए घटनाओं के नाम और समय के लिए प्रत्येक इंजेक्शन के साथ F4 पर क्लिक करें। अध्ययन के दौरान, जरूरत के अनुसार ओ2 एकाग्रता और ओ2 ढलान नेग तराजू को समायोजित करने के लिए F6 का चयन करें।
    1. 150 माइक्रोन रोटेनोन (150 एनएम अंतिम एकाग्रता) के 2 माइक्रोन जोड़ें।
    2. तुरंत 1 एम सुसिएट (10 mm अंतिम एकाग्रता) के 20 μL जोड़ें और श्वसन को स्थिर करने के लिए प्रतीक्षा करें।
    3. अधिकतम प्रतिक्रिया दर (वीमैक्स;2.5-10 mm अंतिम एकाग्रता) तक पहुंचने तक उप-संतृप्त सांद्रता के स्टेपवार अतिरिक्त द्वारा टाइटेट एडीपी।
      नोट: दर ADP एकाग्रता में एक छोटे से परिवर्तन के कारण इंजेक्शन के बाद पठार हो सकता है, इस प्रकार प्रत्येक पठार के बाद इंजेक्शन एकाग्रता में वृद्धि और titration के साथ जारी रखने के लिए जब तक वहां श्वसन में कोई और वृद्धि भी ADP इंजेक्शन एकाग्रता में एक गुना वृद्धि के साथ है ।

7. अनुशंसित अनुकूलन प्रयोग

  1. प्रोटोकॉल के लिए इष्टतम समरूप और ऑक्सीजन एकाग्रता निर्धारित करें।
    1. सूट प्रोटोकॉल (कदम 5.1-5.3) कई ऊतक सांद्रता पर (जैसे, 30 मिलीग्राम/एमएल, 20 मिलीग्राम/एमएल, 10 मिलीग्राम/एमएल, 5 मिलीग्राम/एमएल, २.५ मिलीग्राम/एमएल, 1 मिलीग्राम/एमएल, और/या ०.५ मिलीग्राम/mL) पर प्रदर्शन करें ।
    2. एक एकाग्रता का चयन करें जो श्वसन प्रवाह को अधिकतम करती है, जबकि रीऑक्सिजनेशन (1-2 से अधिक नहीं)। यदि अधिक बार रिऑक्सिजन की आवश्यकता होती है, तो समरूप की एकाग्रता को कम करें।
  2. होमोजेनाइजर के साथ स्ट्रोक की इष्टतम संख्या निर्धारित करें।
    1. समरूपता के कई स्तरों पर सूट प्रोटोकॉल (चरण 5.1-5.3) (उदाहरण के लिए, 5 स्ट्रोक, 10 स्ट्रोक, 15 स्ट्रोक, 20 स्ट्रोक) करें।
    2. चूंकि ट्यूमर समरूप तैयारी के साथ साइटोक्रोम सी की प्रतिशत वृद्धि की सीमा निर्धारित करने के लिए साहित्य में अपर्याप्त डेटा हैं, इसलिए सीमित साइटोक्रोम सी प्रतिक्रिया के साथ तैयारी का चयन करें, लेकिन ब्याज की सब्सट्रेट (एस) द्वारा सक्रिय पर्याप्त श्वसन।
  3. मात्रात्मक और प्रजनन योग्य श्वसन प्रवाह के लिए आवश्यक इष्टतम सब्सट्रेट, एडीपी, अनकूपलर और अवरोधक सांद्रता का निर्धारण करें।
    1. चुने गए ऊतक एकाग्रता (चरण 7.1) पर सूट प्रोटोकॉल (चरण 5.1-5.3.9) करें। टिट्रेट प्रत्येक सब्सट्रेट, अनकूपलर, अवरोधक और एडीपी तब तक जब तक कोई और प्रतिक्रिया नहीं देखी जाती है। अलग-अलग प्रयोगों में सोडियम एजाइड के साथ अवरोध को कम करें।
      1. 0.8 एम मालेट (2 mm अंतिम एकाग्रता) के 5 माइक्रोन जोड़ें और अगले इंजेक्शन के लिए तुरंत आगे बढ़ें।
      2. 1 एम पायरुवेट की टिट्रेट 1 माइक्रोल वेतन वृद्धि और प्रत्येक इंजेक्शन के बाद श्वसन को स्थिर करने की प्रतीक्षा करें, तब तक जारी रखें जब तक कि श्वसन में कोई अतिरिक्त वृद्धि न हो।
      3. 0.5 एम एडीपी की टिट्रेट 2 माइक्रोल वेतन वृद्धि और प्रत्येक इंजेक्शन के बाद श्वसन को स्थिर करने की प्रतीक्षा करें, तब तक जारी रखें जब तक कि श्वसन में कोई अतिरिक्त वृद्धि न हो।
      4. 2 एम ग्लूटामेट के टिट्रेट 1 माइक्रोल वेतन वृद्धि और प्रत्येक इंजेक्शन के बाद श्वसन को स्थिर करने की प्रतीक्षा करें, तब तक जारी रखें जब तक कि श्वसन में कोई अतिरिक्त वृद्धि न हो।
      5. 4 m Cytochrome सी (10 μM अंतिम एकाग्रता) के 5 μL जोड़ें और श्वसन को स्थिर करने के लिए प्रतीक्षा करें।
      6. 1 एम Succinate के टिट्रेट 5 माइक्रोन वेतन वृद्धि और प्रत्येक इंजेक्शन के बाद स्थिर करने के लिए श्वसन के लिए प्रतीक्षा करें, तब तक जारी रखें जब तक कि श्वसन में कोई अतिरिक्त वृद्धि न हो।
      7. 0.5 एम एडीपी की टिट्रेट 5 माइक्रोन वेतन वृद्धि और प्रत्येक इंजेक्शन के बाद श्वसन को स्थिर करने की प्रतीक्षा करें, तब तक जारी रखें जब तक कि श्वसन में कोई अतिरिक्त वृद्धि न हो।
      8. 1 mm FCCP के टिट्रेट 0.5 माइक्रोन वेतन वृद्धि और प्रत्येक इंजेक्शन के बाद स्थिर करने के लिए श्वसन के लिए प्रतीक्षा करें, तब तक जारी रखें जब तक कि श्वसन में कोई अतिरिक्त वृद्धि न हो।
      9. 150 माइक्रोन रोटेनोन की टिट्रेट 1 माइक्रोन वेतन वृद्धि और प्रत्येक इंजेक्शन के बाद श्वसन को स्थिर करने की प्रतीक्षा करें, तब तक जारी रखें जब तक कि श्वसन में कोई कमी नहीं न हो।
      10. 125 माइक्रोन एंटीमाइसिन ए की टिट्रेट 1 माइक्रोन वेतन वृद्धि और प्रत्येक इंजेक्शन के बाद श्वसन को स्थिर करने की प्रतीक्षा करें, तब तक जारी रखें जब तक कि श्वसन में कोई अतिरिक्त कमी न हो।
      11. 0.8 एम एस्कॉर्टबेट (2 mm अंतिम एकाग्रता) के 5 माइक्रोन जोड़ें।
      12. श्वसन धीमी गति से वृद्धि के लिए तुरंत 0.2 एम TMPD (.5 m अंतिम एकाग्रता) के 5 μL जोड़ें। एक अलग प्रयोग में, 0.2 एम टीएमपीडी (1 mm अंतिम एकाग्रता) के 10 माइक्रोल जोड़ें।
      13. अलग-अलग प्रयोगों में क्रमशः 10 माइक्रोन, 25 माइक्रोन, 50 माइक्रोन, और 100 माइक्रोन 4 एम सोडियम एजाइड (20 एमएम, 50 एमएम, 100 एमएम, 200 एमएमएम अंतिम एकाग्रता, तुरंत तब जोड़ें जब एस्बेट/टीएमपीडी पठारों की श्वसन प्रवाह।
    2. प्रयोग के समय में सुधार करने के लिए पहले इंजेक्शन के भीतर संतृप्त कर रहे हैं कि सब्सट्रेट और अवरोधक सांद्रता चुनें। पारंपरिक सूट प्रोटोकॉल के साथ एडीपी संवेदनशीलता मूल्यांकन गठबंधन करने के लिए संतृप्त या उप-संतृप्त सांद्रता पर एडीपी का उपयोग करें।
    3. श्वसन प्रवाह के निषेध के बिना खुराक-जवाबदेही प्रदर्शित करने के लिए उप-अधिकतम अनकूपल सांद्रता का उपयोग करें।

8. डेटा विश्लेषण

  1. सूट विश्लेषण
    1. विश्लेषणात्मक कमी के लिए प्रत्येक टिटरेशन और निर्यात से स्थिर-राज्य या पीक दरों का चयन करें।
    2. डेटा को पीएमओएल ओ2 प्रति सेकंड प्रति मिलीग्राम टिश्यू (पीएमओएल/एस/एमजी) के रूप में व्यक्त करें ।
    3. संबंधित दर (यानी, एडीपी के अलावा प्राप्त स्थिर-राज्य दर) से एंटीमाइसिन ए असंवेदनशील दर को घटाकर पीएम-एल, पीएम-पी, पीएमजीएस-पी, पीएमजीएस-पी और पीएमजीएस-ई की विश्लेषणात्मक कमी हासिल करें।
      नोट: प्रधानमंत्री: Pyruvate + मालते; पीएमजी: पायरुवेट + मालेट + ग्लूटामेट; पीएमजीएस: पायरुवेट + मालेट + ग्लूटामेट + सुसिएट; -एल: रिसाव राज्य; -P: ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन स्टेट, -ई: इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर स्टेट।
    4. पीक एस्कॉर्बेट/टीएमपीडी दर से सोडियम एजाइड असंवेदनशील दर को घटाकर सीआईवी-ई की विश्लेषणात्मक कमी प्राप्त करें ।
    5. पीएमजीएस-ई दर से रोटेनोन असंवेदनशील दर को घटाकर पीएमजी-ई की विश्लेषणात्मक कमी हासिल करें।
    6. रोटेनोन असंवेदनशील दर से एंटीमाइसिन ए असंवेदनशील दर को घटाकर एस-ई की विश्लेषणात्मक कमी प्राप्त करें।
    7. निम्नलिखित समीकरण द्वारा साइटोक्रोम सी नियंत्रण दक्षता, बाहरी झिल्ली बरकरारता का एक मार्कर की विश्लेषणात्मक कमी प्राप्त करें:
      जम्मूc = ((जम्मूCHNOc-J CHNO)/JCHNO)x १००
      समीकरण में, जेसी साइटोक्रोम सीके अतिरिक्त पर% वृद्धि है, जेसीएनओसी साइटोक्रोम सीके अलावा ऑक्सीजन फ्लक्स है, और जेCHNO साइटोक्रोम सीके अलावा से पहले ऑक्सीजन प्रवाह है।
  2. एडीपी संवेदनशीलता विश्लेषण
    1. विश्लेषणात्मक रूप से संक्षिप्त + रोटेनोन (ऊतक समरूप की दर की दर नहीं) की रिसाव दर के सापेक्ष एडीपी संवेदनशीलता के लिए काइनेटिक्स निर्धारित करते हैं।
    2. रिश्तेदार एडीपी एकाग्रता (एक्स-एक्सिस) के खिलाफ ओ2 फ्लक्स (वाई-एक्सिस) प्लॉट करें। एडीपी टिटरेशन पर हासिल की गई पीक दर के रूप में अधिकतम श्वसन वेग (वीमैक्स)निर्धारित करें।
    3. एडीपी एकाग्रता को प्रकट करने के लिए एक वक्र फिटिंग सॉफ्टवेयर (चश्मे, संस्करण 10.1) का उपयोग करके माइकलिस-मेंटेन काइनेटिक्स का निर्धारण करें जिस पर 1/2 वीमैक्स हासिल किया गया है (स्पष्ट केएम)।

9. इंस्ट्रूमेंटल क्वालिटी कंट्रोल

  1. वांछित ऑक्सीजन एकाग्रता रेंज (0-600 माइक्रोन) और शून्य अंशांकन पर वाद्य ओ2 पृष्ठभूमि प्रदर्शन करें।
    1. पूरा कदम 3.1 और 3.2
    2. स्टॉपर्स को हटा दें और कक्षों से 70% इथेनॉल को एस्पिरेट करें (कक्ष के अंदर उजागर झिल्ली से बचें)। डबल आसुत एच 2 ओ के साथ4बार कुल्ला, और MiR05 के 2.25 एमएल के साथ चैंबर भरें
    3. हाइपरऑक्सीजेनेट कक्षों को ~ 600 माइक्रोनएम ऑक्सीजन के लिए।
    4. स्टॉपर्स को धीरे-धीरे अपनी पूरी तरह से बंद स्थिति में डालें। इंजेक्शन केशिका के माध्यम से निकाले गए अतिरिक्त माध्यम को साइफन करें और डाट के कुएं में एकत्र करें और ऑक्सीजन सिग्नल को स्थिर करने (30-45 मिनट) की अनुमति दें।
    5. ऑक्सीजन अंशांकन करने के लिए, उस क्षेत्र का चयन करें जहां ऑक्सीजन एकाग्रता और ढलान दोनों स्थिर हैं, संबंधित कक्ष के लिए अंशांकन खिड़की खोलें, और R1 निशान का चयन करें।
    6. 05 मिली लीटर पानी में 20 मिलीग्राम सोडियम हाइड्रोसल्फाइट घोल कर डायथोनाइट घोल तैयार करें। हवा के संपर्क को सीमित करें क्योंकि ऑक्सीजन के संपर्क में आने के साथ समय के साथ डायथोनाइट ऑक्सीकरण होता है।
    7. एक बार ऑक्सीजन सिग्नल स्थिर हो जाने के बाद, 1 माइक्रोन इंजेक्ट करें और ऑक्सीजन एकाग्रता में गिरावट का निरीक्षण करें। आवश्यकतानुसार डाइथियोनाइट समाधान की शक्ति को समायोजित करें।
    8. ऑक्सीजन एकाग्रता को कम करने के लिए पर्याप्त डायथोनाइट समाधान इंजेक्ट करें क्रमशः 450 माइक्रोन, 300 माइक्रोन, 225 माइक्रोन, 150 माइक्रोन, 75 माइक्रोन और 0 माइक्रोनएम। प्रत्येक इंजेक्शन पर, ऑक्सीजन को स्थिर करने और स्थिर-राज्य ढलान के लिए एक निशान का चयन करने की अनुमति दें। एक बार ऑक्सीजन एकाग्रता ~ 0 माइक्रोन है, ऑक्सीजन एकाग्रता को चिह्नित करें।
    9. इंस्ट्रूमेंटल ओ2 बैकग्राउंड करेक्शन करने के लिए, संबंधित चैंबर के लिए फ्लक्स/स्लोप विंडो का चयन करें, ओ2 बैकग्राउंड कैलिब्रेशनका चयन करें, और ब्याज के अंकों के लिए कैलिब्रेट पर क्लिक करें ।
    10. शून्य अंशांकन करने के लिए, संबंधित कक्ष के लिए अंशांकन खिड़की खोलें, और डायथिनाइट टिटरेशन के बाद प्राप्त आर0 मार्क का चयन करें।
  2. यंत्र की सफाई
    1. जल्दी से शुद्ध पानी के साथ प्रत्येक कक्ष तीन बार कुल्ला। पहले धोने के लिए, समरूप को एस्पिरेट करें, कक्ष को पूरी तरह से पानी से भरें, और फिर पानी को एस्पिरेट करें। दूसरे धोने के लिए, पानी से भरा कक्ष 3/4 भरें, इंजेक्शन केशिका के माध्यम से पानी को मजबूर करने के लिए स्टॉपर्स डालें, इंजेक्शन केशिका के माध्यम से कुछ पानी को एस्पिरेट करें और फिर डाट को पूरी तरह से धोने के लिए हटा दें।
    2. कक्षों को 5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल से धोएं।
    3. एक सिंक या बीकर पर, शुद्ध पानी, 70% इथेनॉल और 100% इथेनॉल के साथ स्टॉपर्स को साफ करें, एक वॉश बोतल का उपयोग करके इंजेक्शन केशिकाओं के माध्यम से तरल पदार्थ को मजबूर करें।
    4. जल्दी से शुद्ध पानी के साथ दो बार प्रत्येक कक्ष कुल्ला।
    5. पीबीएस के 2 मिलील के साथ कक्षों को इनक्यूबेट करें जिसमें ~ 2 मिलीग्राम जमे हुए माइटोकॉन्ड्रिया, सेल lysate, या 15 मिनट के लिए जीवित फाइब्रोब्लास्ट होते हैं।
    6. कोठियों को दो बार 5 मिनट तक शुद्ध पानी से धोएं।
    7. कक्षों को 5 मिनट दो बार 70% इथेनॉल से धोएं।
    8. कक्षों को 10 मिनट के लिए 100% इथेनॉल से धोएं।
    9. कक्षों को 70% इथेनॉल से भरें।
      1. यदि लगातार प्रयोग चला रहे हैं, तो कक्षों को 5 मिनट के लिए 70% इथेनॉल में छोड़ दें और फिर 3.3 चरण जारी रखें।
      2. यदि प्रयोग पूरे हो रहे हैं, तो स्टॉपर्स पर ढक्कन लगाएं और उपकरण को बंद कर दें।
  3. प्रत्येक उपयोग के बाद, इंजेक्शन सीरिंज को ठीक से साफ करें और कैरी-ओवर को रोकने के लिए विशिष्ट यौगिक उपयोग के लिए समर्पित सीरिंज रखें।
    1. वॉश फ्लूइड में सिरिंज डालें और इंजेक्शन सुई को पूरी तरह से जलमग्न कर दें।
    2. अधिकतम मात्रा के लिए सिरिंज में धोने तरल पदार्थ आकर्षित करें।
    3. वॉश कंटेनर से सिरिंज निकालें, वॉश फ्लूड को बीकर में बाहर निकालें और फिर सिरिंज को एक पेपर तौलिया पर दाग दें।
    4. प्रत्येक उपयोग के बाद जितनी जल्दी हो सके तीन बार चरण 9.3.1-9.3.3 दोहराएं।

Representative Results

प्रारंभिक अध्ययनों से पता चला है कि EO771 ट्यूमर नीच ऑक्सीडेटिव थे और इस प्रकार पर्याप्त ओ2 प्रवाह मूल्यांकन के लिए उच्च समरूप सांद्रता की आवश्यकता होती है। अध्ययन के लिए इष्टतम ऊतक समरूप एकाग्रता सीमा निर्धारित करने के लिए अनुकूलन प्रयोग किए गए थे। ट्यूमर समरूप शुरू में ४० मिलीग्राम/एमएल पर तैयार किया गया था और फिर रैखिक रूप से पतला । ऊतक द्रव्यमान के लिए सामान्यीकृत ओ2 प्रवाह सांद्रता(आंकड़े 1A-D)में संगत था। यह देखा गया कि 40 मिलीग्राम/एमएल के परिणामस्वरूप तेजी से ऑक्सीजन की कमी हुई और यह प्रयोग(चित्र 1 ए)के लिए उपयुक्त नहीं था। ऑक्सीजन की खपत 30 मिलीग्राम/एमएल और 20 मिलीग्राम/एमएल के साथ काफी धीमी हो गई लेकिन फिर भी सब्सट्रेट्स या एडीपी(चित्रा 1B,सी)के अभाव में कम समय में तेजी से कमी आई । 10 मिलीग्राम/एमएल एकाग्रता के परिणामस्वरूप इष्टतम ऑक्सीजन खपत दर(चित्रा 1D)हुई जो लंबे समय तक, ९०-मिनट सूट प्रोटोकॉल का समर्थन करेगी ।

एक सूट प्रोटोकॉल का उपयोग NADH-और संक्षिप्त-जुड़े ऑक्सफोस और ईटी के साथ-साथ सीवीआई गतिविधि(चित्रा 2 ए)का मूल्यांकन करने के लिए किया गया था। पायरुवेट और मैलेट को एडीपी की अनुपस्थिति में एनएचएच के माध्यम से रिसाव (एल) को चलाने के लिए ऊतक समरूप में जोड़ा गया था। इसके बाद संतृप्त एडीपी को अधिकतम NADH-लिंक्ड ऑक्सफोस (पी) को ड्राइव करने के लिए जोड़ा गया, जिसके बाद ग्लूटामेट को जोड़ा गया । इसके बाद बाहरी झिल्ली अखंडता सुनिश्चित करने के लिए साइटोक्रोम सी जोड़ा गया; श्वसन दर में वृद्धि सभी नमूनों(चित्रा 2B)में 20% से कम थी। NADH से जुड़े सब्सट्रेट्स के लिए बहुत कम प्रतिक्रिया को देखते हुए, साइटोक्रोम सी रिलीज का आकलन संक्षेप और रोटेनोन की उपस्थिति में भी किया गया था और न्यूनतम साइटोक्रोम सी उत्तेजना(चित्रा 2B)मनाया गया था। दिलचस्प बात यह है कि NADH से जुड़े OXPHOS EO771 ट्यूमर(चित्रा 2C)में नगण्य था । इसके बाद सुसिएट डिहाइड्रोजनेज़ के माध्यम से इलेक्ट्रॉन प्रवाह को प्रोत्साहित करने के लिए पाइरुवेट, मैलेट और ग्लूटामेट की उपस्थिति में संक्षेप जोड़ा गया। एफसीसीपी को तब अधिकतम इलेक्ट्रॉन प्रवाह (ई) को चलाने के लिए टिटैप किया गया था, जिससे पता चला कि EO771 ट्यूमर में ऑक्सीकरण के बजाय फॉस्फोरिलेशनश्वसन (चित्रा 2C)तक सीमित था। रोटेनोन और एंटीमाइसिन ए को बाद में क्रमशः जटिल I और जटिल III को बाधित करने के लिए टिटैरेटेड किया गया था। इसके बाद एस्पॉर्बेट और टीएमपीडी को सीआईवी के माध्यम से अधिकतम इलेक्ट्रॉन प्रवाह को चलाने के लिए जोड़ा गया, जो तब सोडियम एजाइड द्वारा बाधित होता है। तालिका 1 अंक2सीमें प्लॉट किए गए श्वसन मापदंडों की मात्रा निर्धारित करने के लिए कच्चे डेटा (तालिका 2)के विश्लेषणात्मक कमी समीकरणों को दर्शाता है। कुल मिलाकर, ट्यूमर समरूप श्वसन प्रोफाइल(चित्रा 2C)ट्यूमर में एन-और एस-लिंक्ड सब्सट्रेट्स द्वारा समर्थित कम मैक्सिमल इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर के अपवाद के साथ गैर-प्रत्यारोपित डिजॉनिन-परमीबिलाइज्ड EO771 कोशिकाओं(चित्रा 2D)के समान हैं।

चूंकि NADH से जुड़े श्वसन नगण्य था, इसलिए संक्षिप्त के श्वसन गतिज को उप-संतृप्त एडीपी के स्टेपवाइज टाइटेशन द्वारा आगे मूल्यांकन किया गया था जब तक कि अधिकतम दर (वीमैक्स)हासिल नहीं हो जाती(चित्रा 3 ए,3बी)। संक्षेप + रोटेनोन की उपस्थिति में एडीपी की आधी अधिकतम एकाग्रता (केएम)37.5 माइक्रोन एम थी, जबकि वीमैक्स ~ 10.5 पीएमओएल/एस/एमजी(चित्रा 3सी)थी। इस प्रकार, अपेक्षाकृत खराब ऑक्सीकरण दरों के बावजूद, EO771 ट्यूमर एडीपी के प्रति अत्यधिक संवेदनशील थे और अपेक्षाकृत कम एडीपी सांद्रता पर एटीपी संश्लेषण करते थे।

निष्कर्षण के लिए कच्चे डेटा के उपयुक्त क्षेत्रों का चयन प्रयोगों की प्रजनन क्षमता और सटीक मात्रा के लिए महत्वपूर्ण है। साइटोक्रोम सीके लिए, इंजेक्शन से तुरंत पहले स्थिर-राज्य में एक निशान का चयन किया जाना चाहिए(चित्रा 4A,मार्क 1)। अक्सर एक प्रारंभिक इंजेक्शन विरूपण साक्ष्य होता है जिसे समय की अवधि (लगभग 5-10 मिनट) के बाद किया जा सकता है जहां ओ2 प्रवाह स्थिर नहीं होता है। ओ2 फ्लक्स स्थिर हो जाने के बाद एक अतिरिक्त चयन करके साइटोक्रोम सी दक्षता का मूल्यांकन किया जाता है(चित्रा 4A,मार्क 2)। सब्सट्रेट्स, एडीपी या सबसे अवरोधकों के अलावा के बाद चयन भी इंजेक्शन विरूपण साक्ष्य के बाद किए जाते हैं और एक बार ओ2 फ्लक्स स्थिर हो गया है(चित्रा 4B)। अधिकतम अनकपल श्वसन निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाने वाला चयन एफसीसीपी के टिटरेशन के दौरान प्राप्त चरम वृद्धि पर किया जाता है, जो अक्सर अंतिम इंजेक्शन(चित्रा 4C) नहीं बनाया जाताहै। टीएमपीडी के लिए चयन एस्कॉर्बेट और टीएमपीडी दोनों को जोड़े जाने और श्वसन में चरम वृद्धि(चित्रा 4D,मार्क 1) के बाद किया गया है। बस इस चोटी के बाद, अवरोधक, सोडियम azide, जोड़ा जाता है, जो तेजी से श्वसन कम हो जाती है, लेकिन यह भी अक्सर एक इंजेक्शन विरूपण बाधित संकोच श्वसन दर(चित्रा 4D)से कम है । इंजेक्शन विरूपण साक्ष्य(चित्रा 4 डी,मार्क 2) के तुरंत बाद अवरोधक चिह्न बनाया जाता है। ओ2 प्रवाह आम तौर पर स्थिर नहीं होगा और कम करने के लिए जारी रहेगा ।

तालिका 1: श्वसन अंकन और विश्लेषणात्मक व्युत्पन्न। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

तालिका 2: ल्यूमिनल बी स्तन ट्यूमर समरूपता के नमूने और श्वसन विशेषताएं। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 1
चित्रा 1:ट्यूमर समरूप एकाग्रता का अनुकूलन। ओ2 फ्लक्स (लाल) और ओ2 एकाग्रता (नीला) में तैयार मैमेरी ट्यूमर समरूप(ए)40 मिलीग्राम/एमएल,(बी)30 मिलीग्राम/एमएल,(सी)20 मिलीग्राम/एमएल, और(डी)10 मिलीग्राम/एमएल । थॉम: ऊतक समरूप श्वसन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2:ताजा उत्पादित ट्यूमर समरूपता में उच्च-रिज़ॉल्यूशन श्वसन द्वारा ऑक्सीएफओ और ईटी क्षमता का मूल्यांकन। (एकसब्सट्रेट, अवरोधक, अनकूपलर प्रोटोकॉल के दौरान ऑक्सीजन खपत (लाल) और सांद्रता (नीला) का प्रतिनिधि भूखंड। प्रधानमंत्री: Pyruvate + मालेट, डी: ADP, जी: ग्लूटामेट, सी: साइटोक्रोम सी,एस: Succinate, एफ: एफसीसीपी, सड़ांध: रोटेनोन, अमा: एंटीमाइसिन ए, एएससी/टीएमपीडी: एस्कॉर्बेट/टेट्रामेथिल-पी-फेनिलेनिडाइमाइन । (ख) साइटोक्रोम सीके अतिरिक्त ओ2 प्रवाह में प्रतिशत वृद्धि . (सी-डी) श्वसन को एडीपी, एफसीसीपी, और एस्पॉर्बेट/टीएमपीडी इन(सी)EO771-व्युत्पन्न ट्यूमर समरूपता और(डी)गैर-प्रत्यारोपित EO771 डिजॉन-भगृस्मि कोशिकाओं की उपस्थिति में मैलेट, पाइरुवेट, ग्लूटामेट, और succinate द्वारा समर्थित। थॉम: ऊतक समरूप श्वसन; प्रधानमंत्री: Pyruvate + मालते; पीएमजी: पायरुवेट + मालेट + ग्लूटामेट; पीएमजीएस: पायरुवेट + मालेट + ग्लूटामेट + सुसिएट; CIV: कॉम्प्लेक्स चतुर्थ; -एल: रिसाव राज्य; -P: ऑक्सीडेटिव फॉस्फोरिलेशन स्टेट, -ई: इलेक्ट्रॉन ट्रांसफर स्टेट; एन-लिंक्ड: ओ2 फ्लक्स परिभाषित NADH-जनित सब्सट्रेट संयोजनों द्वारा समर्थित; एनएस-लिंक्ड: ओ2 फ्लक्स परिभाषित एनएचएच-उत्पन्न सब्सट्रेट संयोजनों और संक्षिप्त के अभिसरण द्वारा समर्थित है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3:EO771 स्तन ट्यूमर उच्च एडीपी (adenosine 5′-diphosphate) संवेदनशीलता प्रदर्शित किया । (A)एस-लिंक्ड एडीपी टिटरेशन प्रोटोकॉल के दौरान ऑक्सीजन की खपत (लाल) और सांद्रता (नीला) का प्रतिनिधि भूखंड। थॉम: ऊतक समरूप श्वसन; S/Rot: Succinate/Rotenone; डी: एडीपी। (ख)रोटेनोन की उपस्थिति में संक्षिप्त द्वारा समर्थित श्वसन और एडीपी की बढ़ती सांद्रता (0 μM ADP = S/Rot-L) । (C)मैक्सिमल रेट (वीमैक्स)और आधा अधिकतम एकाग्रता (केएम)Succinate + रोटेनोन की उपस्थिति में एडीपी की । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4:डेटा निष्कर्षण के लिए कच्चे ओ2 फ्लक्स के मार्क चयन का चित्रण करने वाला प्रतिनिधि ट्रेसिंग। (ए)साइटोक्रोम सी चयन: साइटोक्रोम सी इंजेक्शन से पहले चयन संख्या 1 और इंजेक्शन के बाद चयन संख्या 2 जब ओ2 फ्लक्स स्थिर हो गया है। c साइटोक्रोम सी. (ख)सब्सट्रेट, एडीपी, और अवरोधक चयन: इंजेक्शन के बाद चयन संख्या 1 (इस प्रतिनिधि भूखंड में संक्षिप्त) जहां ओ2 फ्लक्स स्थिर हो गया है। एस: संक्षेप। (ग)अनकूपलर चयन: चयन संख्या 1 पर श्वसन में चरम वृद्धि पर uncoupler titration के दौरान । इस प्रतिनिधि एफसीसीपी टिटरेशन प्लॉट में, तीसरा इंजेक्शन श्वसन को थोड़ा कम कर देता है और इस प्रकार चयन के लिए उपयोग नहीं किया जाता है। एफ: एसीसीपी। (घ)टीएमपीडी चयन: एस्कॉर्बेट और टीएमपीडी इंजेक्शन के बाद श्वसन की चरम वृद्धि पर चयन संख्या 1। सोडियम एजाइड चयन: तीव्र इंजेक्शन विरूपण के बाद चयन संख्या 2 जब श्वसन शुरू में कम हो जाता है। के रूप में/Tm: Ascorbate/TMPD; Azd: Azide । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

कैंसर में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का मूल्यांकन करने के दृष्टिकोण काफी हद तक इन विट्रो मॉडल 13 ,14,15,16तक सीमित रहे हैं । रासायनिक पारमेबिलाइजेशन6,7,17का उपयोग करके ट्यूमर में माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन को मापने में कुछ सफलता हासिल की गई है, लेकिन कोई समान, स्वर्ण-मानक दृष्टिकोण नहीं है जिसे सार्वभौमिक रूप से लागू किया जा सकता है और ट्यूमर प्रकारों की तुलना में। इसके अतिरिक्त, लगातार डेटा विश्लेषण और रिपोर्टिंग की कमी में सीमित डेटा सामान्यता और प्रजनन क्षमता है। यहां उल्लिखित विधि हौसले से उत्पादित ठोस ट्यूमर नमूनों से माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी में माइटोकॉन्ड्रियलश्वसन 18 को मापने के लिए एक सरल, अपेक्षाकृत त्वरित दृष्टिकोण प्रदान करती है। ट्यूमर ऑर्थोटोपिक रूप से प्रत्यारोपित मुरीन ल्यूमिनल बी, ERα-नकारात्मक EO771 स्तन कैंसर कोशिकाओं19से बड़े हो गए थे ।

ऊतक हैंडलिंग के साथ परिश्रम और देखभाल ऑक्सीजन खपत दरों की सटीकता और सामान्यीकरण में बहुत सुधार करेगी। ऊतक और माइटोकॉन्ड्रिया को आसानी से क्षतिग्रस्त किया जा सकता है यदि नमूना ठंडा नहीं रखा जाता है, तो संरक्षण मीडिया में लगातार जलमग्न नहीं होता है, या पीढ़ी-पीढ़ी संभाला जाता है, जिसके परिणामस्वरूप उप-इष्टतम दिनचर्या और ऑक्सीएफओस दरें होती हैं। इसके अतिरिक्त, समरूप ऊतक का सटीक गीला वजन महत्वपूर्ण महत्व का है क्योंकि यह प्राथमिक सामान्यीकरण विधि है। अन्य सामान्यीकरण विधियों पर विचार किया जा सकता है, जैसे कुल प्रोटीन या माइटोकॉन्ड्रियल विशिष्ट मार्कर, जैसे साइट्रेट सिंथेस गतिविधि20। इसके अतिरिक्त, ऊतक विषमता को संबोधित करने की आवश्यकता होगी, ट्यूमर क्षेत्रों के बारे में निर्णय के साथ प्रयोगों में शामिल करने के लिए एक प्राथमिकताओं बनाया । परिगलित, फाइब्रोटिक, और संयोजी ऊतक समरूप नहीं हो सकता है और/या अच्छी तरह से respire और जब तक जानबूझकर इन ट्यूमर क्षेत्रों परख से बचा जाना चाहिए । विशेष रूप से, ट्यूमर प्रकार और उत्तेजना क्षेत्र के आधार पर बहुत चिपचिपा हो सकता है, जिससे सटीक वजन और हस्तांतरण अधिक चुनौतीपूर्ण हो सकता है। बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को नुकसान को कम करते हुए माइटोकॉन्ड्रिया की पूरी तैयारी सुनिश्चित करने के लिए समरूपता के लिए उपयोग किए जाने वाले स्ट्रोक की संख्या को अनुकूलित किया जाना चाहिए।

बेहतर सटीकता और प्रजनन क्षमता के लिए, हम अनुकूलन प्रयोगों को समरूप तैयारी, ऊतक एकाग्रता, और सब्सट्रेट, अनकूपलर, अवरोधक सांद्रता के लिए स्ट्रोक की संख्या के लिए किए जाने की सलाह देते हैं। अध्ययन ों से स्ट्रोक की विभिन्न संख्याओं की तुलना की जा सकती है और वे अध्ययन के भीतर साइटोक्रोम सी के साथ - साथ अधिकतम माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन क्षमता 21के साथ - साथ के साथ - साथ अधिकतम माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन क्षमता के जवाब के अनुरूप कैसे होते हैं । यद्यपि एक सामान्य स्वीकृति है कि कम साइटोक्रोम सी प्रतिक्रिया बेहतर है, क्योंकि साइटोक्रोम सी के अतिरिक्त के बाद ऑक्सीजन की खपत में वृद्धि बाहरी माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली को नुकसान का संकेत दे सकती है, इस सीमा के लिए कोई स्वर्ण-मानक नहीं है और यह सुनिश्चित करने के लिए प्रायोगिक रूप से जांच की जानी चाहिए कि ऊतक को अधिक काम नहीं किया जा रहा है या कम तैयार नहीं किया जा रहा है। इस ट्यूमर ऊतक में, यह पाया गया कि ~ 30% के तहत एक साइटोक्रोम सी प्रतिक्रिया श्वसन कार्य ख़राब नहीं था। यदि परीक्षण सकारात्मक है तो साइटोक्रोम सी का उपयोग श्वसन क्षमता के सटीक मात्राकरण के लिए महत्वपूर्ण हो जाता है। इस मामले में, इसके अलावा अंतर्जात साइटोक्रोम सी को भर देता है, जो यदि समाप्त हो जाता है, तो श्वसन दरों का अनुमान देगा।

ऊतक एकाग्रता टिटरेशन प्रयोगों को व्यवहार्य सांद्रता की एक श्रृंखला पर किया जा सकता है और आदर्श रूप से, SUITs के साथ किया जाएगा जिसकी अध्ययन के दौरान जांच की जाएगी। श्वसन क्षमता ट्यूमर प्रकार और संरचना के अनुसार भिन्न होगी। इस प्रकार, माइटोकॉन्ड्रिया या उच्च श्वसन क्षमता के साथ घने ट्यूमर को कम सांद्रता (0.5-5 मिलीग्राम/एमएल) की आवश्यकता होगी। कुछ माइटोकॉन्ड्रिया या कम श्वसन क्षमता वाले ट्यूमर को उच्च सांद्रता (7-12 मिलीग्राम/एमएल) की आवश्यकता होगी। इसके अतिरिक्त, लंबे समय तक या अत्यधिक खपत वाले सब्सट्रेट्स वाले सूइट्स को चैंबर या एडीपी सीमा के पुनर्वजीनीकरण को रोकने के लिए कम ऊतक की आवश्यकता हो सकती है। कुछ ऊतकों में ऑक्सीजन की खपत में एक रैखिक संबंध होगा, जबकि अन्य कुछ एकाग्रता पर्वतमाला पर बेहतर संवेदनशीलता और अधिकतम ऑक्सीकरण दिखाएंगे। चुने हुए ऊतक एकाग्रता को ऑक्सीजन प्रवाह को अधिकतम करने के लिए अनुकूलित किया जाना चाहिए, जबकि पुनर्ऑक्सिजनिंग घटनाओं की संख्या को सीमित करना चाहिए। इसके अतिरिक्त, एकाग्रता सीमा के उच्च अंत के लिए आवश्यकता या लक्ष्य को अधिक आंकना अक्सर बेहतर होता है। माइटोकॉन्ड्रिया के बड़े पूल में उपयोग किए जाने पर अवरोधक, जो श्वसन प्रवाह के क्वांटिटेशन के लिए आवश्यक हैं, अधिक सटीक हैं।

एक अन्य आवश्यक विचार प्रोटोकॉल के दौरान उपयोग की जाने वाली दवाओं की एकाग्रता है। समरूप एकाग्रता में परिवर्तन अधिकतम प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक सब्सट्रेट्स, अनकूप्लर और अवरोधकों की सांद्रता को बदल सकता है। इस प्रकार, एक बार इष्टतम एकाग्रता सीमा चुनी जाती है, तो सूट प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक खुराक का परीक्षण करने वाला प्रयोग किया जाना चाहिए। अतिरिक्त एडीपी को यह सुनिश्चित करने के लिए जोड़ा जा सकता है कि एडेनेलेट सांद्रता श्वसन प्रवाह तक सीमित नहीं है। एफसीसीपी या सीसीसीपी जैसे रासायनिक अनकपलर्स उच्च सांद्रता22पर श्वसन को बाधित करेंगे । इस प्रकार, अधिकतम प्राप्त दर को प्रकट करने के लिए छोटी मात्रा में टिकेट करना आवश्यक है। रोटेनोन और एंटीमाइसिन ए जैसे अवरोधकों का सबसे अच्छा उपयोग किया जाता है जब पहले इंजेक्शन के भीतर संतृप्त होता है। जबकि प्रारंभिक प्रयोगों में इष्टतम सांद्रता निर्धारित की गई थी, हमने अवरोधकों के जवाब में उपचार से संबंधित मतभेदों को भी देखा है और इस प्रकार अक्सर अधिकतम अवरोध प्रदर्शित करने के लिए अवरोधकों का एक अतिरिक्त इंजेक्शन जोड़ते हैं क्योंकि परिणामी दरें मात्राकरण के आधार के रूप में काम करती हैं। सटीक विश्लेषणात्मक कमी के लिए अस्कोरबेट/टीपीएमडी का रासायनिक अवरोध आवश्यक है क्योंकि टीएमपीडी ऑटोऑक्सीडेशन23से गुजरता है । हमने सोडियम एजाइड, एक स्थापित सीआईवी अवरोधक के अलावा एस्कॉर्बेट/टीएमपीडी/साइटोक्रोम सी के ऑटो-ऑक्सीकरण के लिए नियंत्रित किया । किमी अध्ययनों के लिए, अकेले संक्षेप की उपस्थिति में रोटेनोन का जोड़ ऑक्सलोसिटेट संचय को रोकता है जो कम सांद्रता24पर संक्षेप डेहाइड्रोजनेज़ गतिविधि को रोक सकता है। एडीपी की मात्रा और एकाग्रता प्रचलित सब्सट्रेट संयोजन के लिए माइटोकॉन्ड्रिया की संवेदनशीलता पर अत्यधिक निर्भर हैं। माइटोकॉन्ड्रियल तैयारी जो एडीपी के प्रति अत्यधिक संवेदनशील हैं, कम शुरुआती सांद्रता की आवश्यकता होगी। इसके अतिरिक्त, पीएच पर ध्यान देने के साथ मान्य रसायन और उचित दवा तैयार करना, लागू होने पर प्रकाश के प्रति संवेदनशीलता, और सफल प्रयोगों के लिए भंडारण तापमान आवश्यक है।

इन प्रयोगों की सफलता के लिए इंस्ट्रूमेंट सेटअप और रूटीन केयर का महत्वपूर्ण महत्व है । जैविक, प्रोटीन, अवरोधक, या अनकूलर संदूषण की प्रजनन क्षमता और रोकथाम के लिए कक्षों की पर्याप्त और उचित सफाई आवश्यक है। क्लार्क-प्रकार के इलेक्ट्रोड और O2k सिस्टम ग्लास रिएक्शन कक्षों का उपयोग करते हैं जो प्लेट-आधारित प्रणालियों के लिए एक महत्वपूर्ण लागत लाभ है जो उपभोग्य सामग्रियों पर भरोसा करते हैं। हालांकि, कांच के कक्षों को सख्ती से साफ किया जाना चाहिए और बाद के अध्ययनों में अवरोधक संदूषण का स्रोत हो सकता है। धोने की प्रक्रिया (अलग दिल या जिगर माइटोकॉन्ड्रिया, उदाहरण के लिए) के दौरान माइटोकॉन्ड्रिया से भरपूर नमूनों के साथ इनक्यूबेशन प्रयोगात्मक संदूषण के जोखिम को कम कर सकते हैं और कमजोर पड़ने और शराब आधारित धोने की प्रक्रियाओं के अलावा सिफारिश की जाती है। यदि लगातार अध्ययन चलाए जाते हैं, तो इथेनॉल और माइटोकॉन्ड्रिया के साथ सफाई अवरोधक संदूषण की संभावना को कम करती है। ऑक्सीजन सेंसर के अंशांकन ऑक्सीजन के मौजूदा आंशिक दबाव के सापेक्ष श्वसन के सटीक माप प्राप्त करने के लिए प्रत्येक प्रयोग से पहले की सिफारिश की जाती है। यदि कई अंशांकन संभव नहीं हैं, तो एक दिन में एक अंशांकन पर्याप्त हो सकता है यदि धोने की प्रक्रिया के बाद ऑक्सीजन एकाग्रता स्थिर और सुसंगत बनी रहती है।

ऊपर उल्लिखित प्रक्रियाएं ट्यूमर के ऊतकों में ऑक्सीजन की खपत को मापने के लिए ओरोबोरोस O2k उपकरण का लाभ उठाएं , जो पहले से डिजाइन किए गए और अनुकूलित संरक्षण समाधान और श्वसन मीडिया25,26,27का उपयोग करके ट्यूमर उत्तेजना के4घंटे के भीतर है । इस प्रोटोकॉल में कई मापदंडों को बाद के अनुप्रयोगों के लिए संशोधित किया जा सकता है। उपकरण सेटअप और अंशांकन, ऊतक तैयार करने के लिए उपयोग किए जाने वाले समरूप, और इष्टतम समरूप और कक्ष ऑक्सीजन एकाग्रता सभी को ऑक्सीजन निगरानी क्षमता वाले अन्य उपकरणों पर उपयोग के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, होमोजेनेट जोड़ते समय कक्षों को थोड़ा भरा गया था, और इस प्रकार जब कक्ष पूरी तरह से बंद हो जाता है, तो कक्ष केशिका भरा रहता है। यह कक्ष में कुछ ऑक्सीजन की खपत करेगा, लेकिन नमूना एकाग्रता के अनुकूलन के साथ, हम यह निर्धारित करने में इस खपत के लिए खाते कर सकते हैं कि ऑक्सीजन का स्तर किस से शुरू करना है। वैकल्पिक रूप से, नमूना कक्ष बंद होने से पहले परिवेश ऑक्सीजन पर संतुलन करने की अनुमति दी जा सकती है, लेकिन यह अक्सर प्रयोग शुरू होने से पहले समय की मात्रा में वृद्धि होगी और सब्सट्रेट्स के अलावा देरी करेगा। जबकि इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले समरूप व्यापक रूप से सुलभ हैं, अन्य वाणिज्यिक समरूपता तकनीकों को नियोजित किया जा सकता है, जैसे कि ऊतक श्रेडर या स्वचालित होमोजेनाइजर28।

इसके अतिरिक्त, ऊतक तैयारी और साधन प्रक्रियाओं का उपयोग कई अलग-अलग सूती के साथ किया जा सकता है ताकि युग्मन और मार्ग नियंत्रण राज्यों की विविधता द्वाराश्वसननियंत्रण का अध्ययन किया जा सके। ये सूट प्रोटोकॉल कार्यात्मक क्षमता को मापने के लिए विकसित किए गए हैं, और इस प्रकार, संभावित अंतर्जात सब्सट्रेट्स के योगदान का क्षमता माप पर कोई प्रभाव नहीं पड़ता है। हम विश्लेषणात्मक रूप से अष्टावक्र ऑक्सीजन की खपत और/या अस्त्र-ाव की अवशिष्ट खपत के लिए अष्टावक्र ए-रोटेनोन, या सोडियम अज़ाइड असंवेदनशील दरों के घटाव के माध्यम से समरूप की खपत के लिए खाते हैं, के रूप में उपयुक्त है । माइटोकॉन्ड्रिया बायोप्स में व्यवहार्य रह सकता है या इसी तरह ऊतक प्रकार और बरकरारता30, 31के आधार पर समय की विस्तारित अवधि (>24 एच) के लिए संरक्षणसमाधानोंका निर्माण कर सकता है। अस्थायी भंडारण सीमा निर्धारित करने के लिए पहले से अध्ययन किए जा सकते हैं क्योंकि कुछ सब्सट्रेट्स की ऑक्सफोस की अलग-अलग सीमाएं हो सकती हैं। यह आवश्यक है यदि प्रयोग ऊतक उत्तेजना/बायोप्सी के कई घंटों के भीतर नहीं किया जा सकता है । 37 डिग्री सेल्सियस अधिकांश स्तनधारी प्रणालियों में श्वसन समारोह के मूल्यांकन के लिए एक इष्टतम और शारीरिक तापमान है। हालांकि, यदि परख तापमान मूल्यांकन32में हस्तक्षेप करता प्रतीत होता है, तो पर्याप्त जवाबदेही सुनिश्चित करने के लिए तुलनात्मक अध्ययन एक विस्तृत तापमान सीमा (25-40 डिग्री सेल्सियस) में आयोजित किया जा सकता है। वाद्य बाधाएं इस तरह के अध्ययन करने की क्षमता को सीमित कर सकती हैं।

उपर्युक्त विधि की प्रमुख सीमाएं 1 हैं) यांत्रिक समरूपता के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रिया को नुकसान की संभावना, 2) समरूप तैयारी में एटीपी या अन्य उप-सेलुलर बायोकेमिकल्स की उपस्थिति जो एटीपी या ब्याज के अन्य चरों के एक साथ निर्धारण में हस्तक्षेप कर सकती है और अतिरिक्त सुधार विधियों या अवरोधक उपयोग की आवश्यकता हो सकती है33 , और 3) प्रति नमूना कई नमूनों और/या कई SUITs का मूल्यांकन समय लेने वाला है क्योंकि एक उपकरण एक समय में दो प्रयोगों को समायोजित कर सकता है और सफाई की आवश्यकता होती है और लगातार प्रयोगों के बीच में स्थापित किया जाता है । अनुकूलन प्रयोग और नमूनों की लगातार तैयारी पर्याप्त माइटोकॉन्ड्रियल क्षति को कम कर सकती है जो असंगत डेटा में योगदान देगी।

मौजूदा/वैकल्पिक तरीकों के संबंध में विधि का महत्व प्रारंभिक सामग्री की मात्रा, माइटोकॉन्ड्रिया को अलग करने की चुनौती, या ऊतकों को पार करने में तकनीकी चुनौती की तुलना में व्यवहार्यता में सुधार है । समरूपता की तैयारी तेज है, ऑक्सीजन लगभग सीमित के रूप में नहीं है, और परमीबिलित ऊतक की तुलना में कर्मियों के बीच परिवर्तनशीलता के लिए कम संवेदनशील है। महत्वपूर्ण बात यह है कि लगभग सभी नमूना प्रकार समरूप तैयारी के लिए उपयुक्त हैं जो ऊतकों में तुलनात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है। हाई-रेजोल्यूशन श्वसन माइटोकॉन्ड्रियल ऑक्सफोस और ईटी का गोल्ड-स्टैंडर्ड मेजरमेंट है। पूर्व नैदानिक और नैदानिक कैंसर अनुसंधान में इस विधि के आवेदन पूर्व वीवो अध्ययन करने के लिए इन विट्रो जांच में वर्तमान का विस्तार करने की क्षमता है। इसके अलावा, यह नैदानिक और नैदानिक सेटिंग्स में संभावित अनुप्रयोगों प्रदान करता है।

Disclosures

लेखकों के पास इस कार्य से संबंधित हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

हम पशु देखभाल के लिए पेनिंगटन बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर तुलनात्मक जीव विज्ञान कोर स्टाफ का शुक्रिया अदा करते हैं । इस शोध को नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ ग्रांट U54GM104940 (JPK) और KL2TR003097 (LAG) द्वारा भाग में समर्थित किया गया था । जानवरों से जुड़े सभी प्रयोगों और प्रक्रियाओं को पेनिंगटन बायोमेडिकल रिसर्च सेंटर इंस्टीट्यूशनल एनिमल केयर एंड यूज कमेटी ने मंजूरी दी थी ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate Sigma-Aldrich M8250
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt Sigma-Aldrich A2754
Adenosine 5'-triphosphate disodium salt hydrate Sigma-Aldrich A2383
Amphotericin B Gibco 15290018
Antimycin A Sigma-Aldrich A8674
Ascorbate Sigma-Aldrich A4544
Bovine serum albumin, fraction V, heat shock, fatty acid free Sigma-Aldrich 3117057001 Roche
BD 50 mL Luer-Lok Syringe Fisher Scientific 13-689-8
BD Vacutainer General Use Syringe Needles Fisher Scientific 23-021-020
Calcium carbonate Sigma-Aldrich C4830
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone Sigma-Aldrich C2920
Cytochrome c from equine heart Sigma-Aldrich C2506
Datlab 7.4 software Oroboros Instruments
Dimethylsulfoxide Amresco N182
Dithiothreitol Sigma-Aldrich D0632
D-Sucrose Sigma-Aldrich S7903
Dumont # 5 Forceps Fine Science Tools 11251-30 Dumoxel, autoclavable
Dumont # 7 Forceps Fine Science Tools 11271-30 Dumoxel, autoclavable
Digital Calipers 150 mm/6 in World Precision Instruments 501601
EO771 cells CH3 BioSystems SKU: 94APV1-vial-prem Pathogen Tested
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid Sigma-Aldrich E4378
Female C57BL/6J mice  Jackson Laboratory Stock #000664
HEPES Sigma-Aldrich H4034
Imidazole Sigma-Aldrich 56750
Kimwipes Fisher Scientific 34120
L-(−)-Malic acid Sigma-Aldrich G1626
Lactobionic acid Sigma-Aldrich L2398
Malate Sigma-Aldrich M6413
Matrigel Matrix Corning 354248
MgCl·6H2O Sigma-Aldrich M2670
Microsyringes Hamilton 87919, 80383, 80521, 80665, 80765, 80865, 87943
N,N,N′,N′-Tetramethyl-p-phenylenediamine Sigma-Aldrich T7394
Oxygraph-2k Oroboros Instruments 10023-03
Oxygraph-2k FluoRespirometer Oroboros Instruments 10003-01
PBS Gibco 10010023
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140122
Phosphocreatine disodium salt hydrate Sigma-Aldrich P7936
Potassium hydroxide Sigma-Aldrich P1767
Potassium phosphate monobasic Sigma-Aldrich P5655
Rotenone Sigma-Aldrich R8875
RPMI 1640 Gibco 21875034
Sodium azide Sigma-Aldrich S2002
Sodium pyruvate Sigma-Aldrich P5280
Succinate (disodium) Sigma-Aldrich W327700
Taurine Sigma-Aldrich T0625
Whatman Filter Paper, grade 5 Sigma-Aldrich 1005-090
Wheaton Tenbroeck Tissue Grinder, 7 mL Duran Wheaton Kimble 357424
Straight Tip Micro Dissecting Scissors Roboz RS-5914SC
Non-Safety Scalpel No. 11 McKesson 1029065
BD Precision Glide Needle 27 G x 1/2 Becton, Dickinson and Company 305109
BD Precision Glide Needle 18 G x 1 Becton, Dickinson and Company 305195
BD 1mL Slip Tip Syringe Becton, Dickinson and Company 309659
Pyrex Reusable Petri Dish, 60 mm Thermo Fisher Scientific 316060
Rodent Very High Fat Diet,  60% kcal from fat, 20% kcal from protein, and 20% kcal from carbohydrate Research Diet D12492
Pyrex Watch Glass, 100 mm Thermo Fisher Scientific S34819

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References

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कैंसर अनुसंधान अंक 174
उत्पादित ठोस ट्यूमर होमोजेनेट के माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का विश्लेषणात्मक निर्धारण
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Zunica, E. R. M., Axelrod, C. L.,… More

Zunica, E. R. M., Axelrod, C. L., Gilmore, L. A., Kirwan, J. P. Analytical Determination of Mitochondrial Function of Excised Solid Tumor Homogenates. J. Vis. Exp. (174), e62875, doi:10.3791/62875 (2021).

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