Summary
我们提出了一种实验方案和数据分析工作流程，以执行活细胞双色荧光交叉相关光谱（FCCS）与Förster共振能量转移（FRET）相结合，以使用现代荧光标记技术研究活细胞中的膜受体动力学。
Abstract
我们提出了一种方案和工作流程，以执行活细胞双色荧光互相关光谱（FCCS）与Förster共振能量转移（FRET）相结合，以使用现代荧光标记技术研究活细胞中的膜受体动力学。在双色FCCS中，荧光强度的波动代表相应荧光生物分子的动态"指纹"，我们可以探测受体的共扩散或结合。FRET对分子距离具有高灵敏度，是一种众所周知的"纳米规则"来监测分子内的变化。综上所述，构象变化和关键参数（如局部受体浓度和迁移率常数）在细胞环境中变得可及。
由于高噪声水平和样品的脆弱性，定量荧光方法在细胞中具有挑战性。在这里，我们展示了如何执行该实验，包括使用双色标记的β 2-肾上腺素能受体（β 2 AR）标记eGFP和SNAP-tag-TAMRA的校准步骤。使用易于自定义的开源软件和模板提供分步数据分析过程。
我们的指南使研究人员能够在活细胞实验中信噪比水平有限的情况下 ，以高可靠性原位 解开活细胞中生物分子的分子相互作用。FRET，特别是低浓度FCCS的操作窗口允许在近生理条件下进行定量分析。
Introduction
荧光光谱是在细胞环境中以最小的扰动量化蛋白质动力学和蛋白质 - 蛋白质相互作用的主要方法之一。共聚焦荧光相关光谱（FCS）是分析分子动力学的强大方法之一，因为它具有单分子敏感性，高选择性和活细胞相容性1。与其他面向动力学的方法相比，FCS具有更广泛的可测量时间范围，从~ns到~s，最重要的是涵盖了基于成像的方法通常无法访问的快速时间尺度。此外，它还提供了空间选择性，因此可以很容易地区分膜，细胞质和细胞核分子动力学2。因此，分子闪烁，平均局部浓度和扩散系数可以用FCS定量分析。当在双色方法中探测荧光互相关光谱（FCCS）分析3，4，5中两种分子物种的共扩散时，诸如结合的分子间动力学变得容易获得。
相关光谱学的主要基本原理是对荧光标记的生物分子在激光焦点中扩散和扩散的强度波动进行统计分析（图1A）。然后，可以通过曲线拟合进进一步分析生成的自相关或互相关函数，以最终推导出感兴趣的速率常数。换句话说，FCS和FCCS的统计方法不像单粒子跟踪那样提供单分子迹线，而是提供具有高时间分辨率的探针标本的动态模式或"指纹"。当与Förster共振能量转移（FRET）结合使用时，可以在共同的共聚焦设置5，6中同时监测分子内动力学，例如构象变化。FRET探测两个荧光团的距离，通常被称为分子"纳米规则"。只有当分子靠近（<10nm）时，能量转移才会发生，供体的发射光谱与受体分子的吸收光谱显着重叠，并且供体和受体的偶极子方向（足够）平行。因此，FRET和FCCS的结合提供了一种具有非常高时空分辨率的技术。当需要空间选择性、灵敏度和活细胞相容性时，FRET-FCCS比其他方法（如等温滴定量热法（ITC）7、表面等离子体共振（SPR）8或核磁共振（NMR）9、10具有明显的优势，用于测量蛋白质动力学和相互作用。
尽管双色荧光互相关光谱（dc-FCCS）具有功能和前景，但由于通道之间的光谱渗漏或串扰，在活细胞中执行dc-FCCS在技术上具有挑战性3，4，由于光谱不同的激光线3，4，11，背景信号和样品的噪声或有限的光稳定性而导致的共聚焦体积差异12， 13，14，15 。在FCCS中引入脉冲交错激励（PIE）是一项重要的调整，以暂时解耦不同的激光激发，以减少通道16之间的光谱串扰。其他用于对抗光谱渗漏17、18、19和背景校正的校正方法也得到了很好的接受17、18、19。有关FCS，PIE或FRET的详细信息和基础知识，请参阅以下参考文献2，4，6，16，20，21，22，23，24。
在这里，提出了所有必要的校准实验和分析以及原型G蛋白偶联受体β 2-肾上腺素能受体（β 2 AR）的实验结果，用于三种不同的情况：（1）携带"绿色"（eGFP）或"红色"（基于SNAP标签的标记）的单标记分子25荧光团;（2）双标记结构，携带N端SNAP标签和细胞内eGFP（NT-SNAP）[在这种情况下，两个标签位于同一蛋白质。因此，预计100%共扩散];（3）双标记样品，其中两个荧光团位于细胞膜的同一侧（CT-SNAP）。它携带C端SNAP标签和细胞内eGFP。在这里，两个标签再次处于相同的蛋白质中，预计再次具有100%的共扩散。由于两个标记彼此非常接近，在细胞膜的同一侧，它显示出观察FRET和反相关行为的潜力。所有构建体均在中国仓鼠卵巢（CHO）细胞中转染，然后用红色荧光底物标记，该底物对于NT-SNAP构建体是膜不透水的，对于CT-SNAP构建体是膜通透的。最后， 仿真数据验证了实验参数对FRET诱导的反相关的影响， 以及蛋白质-蛋白质相互作用对共扩散幅度的影响.
因此，该协议为在活细胞中执行组合的FRET-FCCS提供了完整的指南，以了解蛋白质动力学和蛋白质 - 蛋白质相互作用，同时了解技术/物理伪影，挑战和可能的解决方案。
Protocol
1. 实验方案
- 样品制备
注意：在无菌条件下进行细胞接种和转染。- 将每孔清洁的盖玻片放入6孔培养板中，并用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤三次。
注：盖玻片清洁规程详见补充说明1。 - 向每个孔中加入2mL含有酚红的完整细胞培养基（补充10%胎牛血清（FBS），100μg/ mL青霉素和100μg/ mL链霉素），并将板放在一边。
- 在37°C和5%CO2 下将CHO细胞培养在含有酚红的同一培养基中。用5 mL PBS洗涤细胞以除去死细胞。
- 加入2毫升胰蛋白酶，在室温（RT）下孵育2分钟。
- 用8mL含有酚红的培养基稀释分离的细胞，并通过移液小心混合。
- 在Neubauer室中计数细胞，并在含有盖玻片的6孔细胞培养板中以1.5×105 个细胞/孔的密度接种（在步骤1.1.1-1.1.2中制备）。
- 让细胞在培养箱（37°C，5%CO2）中生长24小时，以达到约80%的汇合度。
- 将2μg所需载体DNA（例如CT-SNAP或NT-SNAP）和6μL转染试剂稀释在两个单独的管中，每个试管中每个试管含有500μL还原血清培养基，并在室温下孵育5分钟。
- 将两种溶液混合在一起以获得转染混合物，并在室温下孵育20分钟。
- 同时，用无菌PBS洗涤接种的CHO细胞一次。
- 用 1 mL/孔的酚类无红培养基代替 PBS，并补充 10% FBS，不含任何抗生素。
- 将整个1mL转染混合物滴加到每个孔中，并在37°C下在5%CO2中孵育细胞过夜。
- 为了标记SNAP构建体，将适当的SNAP底物储备溶液稀释在1 mL补充有10%FBS的培养基中，以获得1μM的最终浓度。
- 用PBS洗涤转染的细胞一次，每孔加入1mL的1μM SNAP底物溶液。将细胞在37°C下在5%CO 2中孵育20分钟。
- 用无酚红培养基洗涤细胞三次，每孔加入2mL无酚红培养基。将细胞在37°C下在5%CO2中孵育30分钟。
- 随后将所有样品的盖玻片转移到成像室中，并用500μL成像缓冲液洗涤。在移至FRET-FCS设置之前加入500 μL成像缓冲液。
- 将每孔清洁的盖玻片放入6孔培养板中，并用无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤三次。
- 校准测量
注：FRET-FCS装置配备了一个共聚焦显微镜水物镜、两条激光线、一个时间相关单光子计数（TCSPC）系统、两个混合光电倍增管（PMT）和两个用于光子采集和数据收集软件的雪崩光电二极管（APD）。在每次活细胞测量之前对齐设置非常重要。详细的设置说明可以在 补充说明2中找到。在测量过程中，激光器和所有探测器（两个PMT和两个APD）始终处于导通状态，因为所有测量都需要在相同的条件下进行。对于校准测量，使用来自细胞接种的同一批次的盖玻片，这可以减少衣领环校正的变化。- 要调整焦点、针孔和环环位置，请将 2 nM 绿色校准溶液放在玻璃盖玻片上，然后打开 485 nm 和 560 nm 激光器。在脉冲交错激发（PIE）模式下操作激光16。
- 专注于溶液并调整针孔和环的位置，以获得最高的计数率和最小的共聚焦体积，以获得最大的分子亮度。
- 使用10 nM红色校准溶液和两者（绿色和红色校准溶液）的混合物对红色通道重复此过程。
- 将10 nM DNA溶液放在玻璃盖玻片上，调整焦点、针孔和环位置，使绿色和红色检测通道之间的互相关最高，即显示最高振幅。
注意：可能需要来回重复步骤 1.2.1 和 1.2.4 才能找到最佳对齐方式。在对焦、针孔和环形位置针对绿色和红色检测通道以及共聚焦重叠体积进行最佳对齐后，从每个校准溶液中进行 3-5 次测量 30 秒 - 120 秒。 - 测量一滴ddH2O，成像培养基和未转染细胞3-5次，每次30秒 - 120秒，以确定背景计数率。
- 收集仪器响应功能，进行 30 s - 120 s 的 3-5 次测量。这是可选的，但强烈建议您这样做。
- 活细胞测量
- 通过用汞灯照明并通过目镜观察来找到合适的细胞。
注意：合适的细胞是活的，显示出各自贴壁细胞系的典型形态。目标蛋白质的荧光，这里是表面受体，在整个表面都是可见的。不太亮的细胞比较亮的细胞更适合，因为当少数分子聚焦时，FCS的对比度更好。 - 在 PIE 模式下打开两个激光器，并通过查看每秒的最大计数来聚焦膜。
注：可能需要降低细胞样品的激光功率（物镜下小于5 μW）。这取决于所使用的荧光团和设置。 - 在数据收集软件的在线预览中观察附着在β2AR上的eGFP或标记的SNAP标签的自相关曲线和互相关曲线，并收集几个短测量值（~2 -10），采集时间在60 -180 s之间。
注意：不要长时间连续激发细胞，因为荧光团可能会漂白。但是，这将取决于每个单元的亮度，测量可以多长时间以及总共可以执行多少次测量。
- 通过用汞灯照明并通过目镜观察来找到合适的细胞。
2. 数据分析
- 数据导出
- 从所有测量值中导出相关曲线 G（tc） 和计数率 CR。
- 注意正确定义"提示"和"延迟"时间窗口，并使用数据关联软件中的"微时间门控"选项。
注意：总共需要三种不同的相关性：（1）提示时间窗口中绿色通道的自相关（ACFgp），（2）延迟时间窗口中红色通道的自相关（ACFrd），最后（3）提示时间窗口中的绿色通道信号与延迟时间窗口中的红色通道信号（CCFPIE）的互相关。数据导出在补充说明3中分步显示不同软件。
- 校准测量
- 使用绿色（ACFgp） 和红色 （ACFrd）荧光团溶液的自相关函数，并将它们拟合到具有额外三重态项的 3D 扩散模型（等式 1）以校准两个所用颜色通道的共聚焦检测体积的形状和大小：
等式 1
这里，b是曲线的基线，N是聚焦中的分子数量，tD是扩散时间（以ms为单位），s = z0/w0是共聚焦体积元素的形状因子。三重态闪烁或其他光物理学由其振幅为R和弛豫时间tR来描述。
注：协议中使用的所有变量和符号均列于表 1 中。 - 使用绿色26的已知扩散系数D和红色校准标准27以及获得的形状因子s绿色和s 红色来确定共聚焦体积元件的尺寸（宽度 w0和高度 z0）和体积Veff（等式 2a-c）。
等式 2a
等式 2b
等式 2c
注：用于计算校准参数的模板作为补充文件 （S7） 提供。 - 计算绿色荧光信号（在通道0和2中收集）进入红色检测通道（通道1和3） 的光谱 串扰α作为背景校正（BG）信号（等3）的比率。
等式 3 - 通过"提示"时间窗口 （ 绿色激光激发）中红色校准测量值的背景校正计数率与"延迟"时间窗口（红色激光激发）中的背景校正计数速率之比（等式4），确定供体激发波长δ受体荧光团的直接激发。
等式 4 - 根据背景校正计数率和从3D扩散拟合（等式1）获得的聚焦分子数量N，计算绿色和红色荧光团的分子亮度B（等式5a-b）：
等式 5a
等式 5b - 将双标记DNA的 ACFgp 和 ACFrd 以及 CCFPIE拟合到3D扩散模型（等式1）。保持获得的形状因子 ，s绿色 和 s红色，分别对 ACFgp 和 ACFrd恒定。 CCFPIE的形状因子 sPIE 通常介于这两个值之间。
注意：在理想的设置中 ，Veff，绿色 和 Veff，红色 将具有相同的大小并完美地重叠。 - 确定零相关时间G0（tc）下的振幅，基于所发现的聚焦分子表观数量的值（N绿色，N红色和NPIE）。
- 计算绿色和红色荧光团100%共扩散的样品的振幅比r GR和rRG（等式6）。请注意，NPIE不反映聚焦中的双标记分子的数量，而仅反映1 /G0（tc）。
和 
等式 6
- 使用绿色（ACFgp） 和红色 （ACFrd）荧光团溶液的自相关函数，并将它们拟合到具有额外三重态项的 3D 扩散模型（等式 1）以校准两个所用颜色通道的共聚焦检测体积的形状和大小：
- 活细胞实验
- 对于单标记结构，将细胞样品拟合到适当的模型中。对于所示的膜受体，扩散以双峰方式发生，扩散时间短，扩散时间长。此外，必须考虑荧光团的光物理和闪烁：
等式 7
这里，td1和td2是两个必需的扩散时间，1是第一个扩散时间的分数。
注意：与校准测量相反，其中游离染料和DNA链向各个方向自由扩散，膜受体仅显示沿细胞膜的2D扩散。3D和2D扩散之间的这种差异通过修改后的扩散项（比较等式1）反映出来，其中2D情况下的tD不依赖于共聚焦体积元素的形状因子s。 - 使用基本数学（等式8）从各自的N和Veff中计算绿色或红色标记蛋白质的浓度c：
等式 8
其中NA = 阿伏伽德罗数 - 对于 N 端 SNAP 标记和细胞内 eGFP，使用与 ACF 的单标记构造（等式 7）和CCFPIE的单标记构造（等式 9）相同的模型拟合双标记样品的两个自相关（ACFgp和ACFrd）：
等式 9
注意：对于系统的全局描述，所有三条曲线必须共同拟合：所有三条曲线的扩散项相同，唯一的区别是 CCFPIE的弛豫项。由于两个荧光团的光物理学通常是不相关的，因此不需要相关项。这种松弛项的缺失导致 CCFPIE 在短时间内持平。然而，由于供体荧光团引起的受体串扰和直接激发可能显示假阳性幅度，应仔细检查是否使用校准测量。 - 使用等式8从各自的N和Veff中计算绿色或红色标记蛋白质的浓度c。
- 使用从DNA样品中获得的校正因子，细胞样品的振幅比rGR和r RG以及它们各自获得的浓度（等式10），估计细胞样品中相互作用的绿色和红色标记蛋白质的分数或浓度，c GR或c RG。
和 
等式 10 - 对于C端SNAP标记和细胞内eGFP，将FRET样品的两个自相关（ACFgp 和 ACFrd）拟合为单标记样品（等式7）和 CCFFRET 到包含反相关项（等式11）的双峰扩散模型
等式 11
其中f反映总反相关幅度，R和t R反映各自的振幅和弛豫时间。
注意：如果由于FRET导致反相关荧光变化，则可能需要一个或多个反相关项（等式11），导致CCFFRET在低相关时间的"下降"，与两个自相关（ACFgp和ACF rd）的上升相吻合。但是，请注意，光物理（如三重闪烁）可能会通过抑制 FRET 诱导的反相关来掩盖反相关项。补充过滤的FCS方法的联合分析可能有助于揭示反相关项。此外，应排除纳秒范围内计数电子设备中死区时间产生的技术伪影16。有关如何在ChiSurf28中执行分析的更详细的分步过程以及用于计算共聚焦体积或分子亮度的模板，可在Github存储库（https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS）和补充文件（补充注释4和补充注释6）中提供。此外，还可以在那里找到用于批量导出使用Symphotime软件以.ptu格式获取的数据的python脚本。
- 对于单标记结构，将细胞样品拟合到适当的模型中。对于所示的膜受体，扩散以双峰方式发生，扩散时间短，扩散时间长。此外，必须考虑荧光团的光物理和闪烁：
等式 1
等式 2a
等式 2b
等式 2c
等式 5a
等式 5b
和 
等式 6
等式 7
等式 8
等式 9
和 
等式 10
等式 11Representative Results
校准和活细胞测量的示例性结果将在下面讨论。此外，基于蛋白质 - 蛋白质 - 相互作用增加 CCFPIE 振幅的效应旁边的模拟数据，证明了FRET对互相关曲线的影响。
基于 PIE 的食品接触物质数据导出
在 PIE 实验中，数据以时间标记时间分辨模式 （TTTR）29，30 收集。图1B显示了在所述装置上测量双标记DNA链的PIE测量的光子到达时间直方图（补充注1）。该设置有四个检测通道。荧光发射首先通过"S"和"P"方向的偏振分裂（指光波的电场振荡的垂直和平行平面）。其次，在检测之前，将每个偏振方向分成两个颜色通道（绿色，红色），从而产生四个通道（S-绿色，S-红色，P-绿色，P-红色）。在"提示"时间窗口内，绿色荧光团被激发，并且由于FRET，信号在绿色和红色通道中被检测到。在延迟时间窗口中，只有红色荧光团（在红色通道中）可见。基于检测通道和"提示"与"延迟"时间窗口，可以获得至少五种不同的相关曲线（3条自相关曲线（ACF）和2条互相关曲线（CCF））：（1）提示时间窗口中的绿色信号（ACFgp），（2）提示时间窗口中的红色信号（在FRET，ACF rp的情况下）， 和（3）红色信号在延迟时间窗口（ACFrd）。这些ACF报告了蛋白质迁移率，光物理（例如，三重态闪烁）和荧光团中其他时间相关的亮度变化（例如，由于FRET）。（4）基于PIE的CCF PIE在提示时间窗口内的绿色信号与延迟时间窗口中的红色信号的互相关CCFPIE可以确定绿色和红色荧光团16的共扩散比例。（5）基于FRET的CCF FRET在提示时间窗口内绿色与红色信号的互相关与FRET诱导的、反相关的绿色和红色信号的亮度变化有关31、32、33。
图1：基于脉冲交错激发（PIE）的荧光（交叉）相关光谱（F（C）CS）。（A）在FCS中，荧光标记的分子自由地扩散进出（衍射极限）焦距体积，该焦点体积由聚焦激光束塑造，该激光束在此微小体积内诱导荧光。进入和离开体积的分子所产生的强度波动是相关的，并提供有关分子迁移率的信息。（B） 在PIE中，使用两条不同的激光线（"提示"和"延迟"）来激发用两种不同的荧光团（"绿色"和"红色"）标记的样品。两个激发脉冲之间的时间差适应了各自荧光团的荧光寿命，因此一个脉冲在另一个被激发之前已经衰变。在所示的双标记样品中，两个荧光团都足够接近，可以从"绿色"供体荧光团到"红色"受体荧光团进行Förster共振能量转移（FRET）。因此，在激发绿色供体时，可以在"提示"时间窗口内检测到红色荧光发射。在所使用的设置（补充注2）中，每种颜色使用两个探测器，一个平行于激发光束方向（表示"p"）和第二个垂直（表示"s"）。（C）在PIE实验中可以确定三种不同的自相关函数：i）提示时间窗口中的绿色通道信号（ACFgp），ii）提示时间窗口中的红色通道信号（ACFrp）和iii）延迟时间窗口中的红色通道信号（ACFrd）的相关性。（D）可以确定两种不同的互相关函数：iv）提示时间窗口中绿色通道信号的"PIE"互相关（CCFPIE）与延迟窗口中的红色通道信号相关，其中该曲线的幅度与荧光团的共扩散有关;和v）"FRET"互相关（CCFFRET）与提示时间窗口中的绿色通道信号与同一提示窗口中的红色通道信号相关;在这里，该曲线的形状有时比扩散快，与FRET诱导的强度变化有关。请点击此处查看此图的放大版本。
校准
图2A-B分别显示了单独扩散的绿色和红色荧光团的校准测量值。根据与等式1和已知扩散系数D绿色26和D红27的拟合，使用等式2a-c计算检测体积的形状（z 0和w0）和大小（Veff）。来自绿色荧光团的ACFgp和来自红色荧光团的ACFrd的拟合结果总结在图2C中。两种荧光团分别显示出8.6 μs（18%）和36 μs（15%）的额外弛豫时间常数。绿色和红色荧光团的分子亮度（等式5a-b）分别为每分子12.5 kHz和每分子2.7 kHz。
为了可靠地估计共聚焦体积大小和形状以及分子亮度，建议每个校准实验执行3-5次测量，并对所有重复进行联合（或全局）拟合。
对于该荧光团对，串扰α（图2D，等式3）和绿光激光δ对受体的直接激发（图2E，等式4）分别为~15%和~38%。
图2：自由扩散的绿色和红色校准标准的校准测量。（A-B）代表60 s测量2 nM绿色（A）和10 nM红色（B）校准标准测量，适合3D扩散模型，包括额外的弛豫时间（等式1）。图（C）中的表格显示了拟合结果和基于方程2a-c和等式5a-b的推导参数。*扩散系数取自文献26，27。（D） 确定串扰α绿色信号进入红色通道（等式3）。绿色标准的激励光谱以青色显示，发射光谱以绿色显示。485 nm（蓝色）和 561 nm（橙色）处的激发激光线显示为虚线。透明的绿色和洋红色框显示收集的发射范围（补充注2）。（E） 通过485 nm激光测定红色荧光团的直接激发δ（等式4）。颜色代码与（D）相同，浅橙色和深橙色分别表示红色标准的激发光谱和发射光谱。请点击此处查看此图的放大版本。
为了确定和校准绿色和红色激发体积的重叠，如上所述，使用了双标记的DNA双链（图3A）。在这里，荧光团间隔40 bp，使得附着在DNA双链末端的绿色和红色荧光团之间不会发生FRET。图3B显示了绿色荧光团（ACFgp）和洋红色（ACFrd）的自相关，以及青色的PIE互相关CCFPIE。请注意，对于CCFPIE，提示时间窗口中绿色通道中的信号与延迟时间窗口16中红色通道中的信号相关。
在这里，获得了D DNA的DNA链的平均扩散系数= 77μm² / s。有关计算的更多详细信息，请参阅分步协议，补充说明4。该值是通过将校准的绿色和红色检测体积大小（图2）以及DNA链的ACFgp和ACFrd的相应扩散时间（图3C）插入等式2a来获得的。接下来，使用获得的校正值r GR和rRG以及稍后使用等式6，可以从细胞样品中确定共扩散的量，即双标记分子（或在两种不同蛋白质共转染的情况下的蛋白质复合物）。
图3：使用DNA样品校准绿红色重叠体积（A）用于校准的DNA链携带绿色和红色校准荧光团，中间距离为40 bp。朔间距离必须足够大，以排除荧光团之间的FRET。（B） 10 nM DNA 溶液的代表性 60 秒测量。绿色荧光团（ACFgp，绿色标准）和洋红色（ACFrd，红色标准）的自相关以及蓝色的PIE交叉相关CCFPIE。图（C）中的表格显示了基于3D扩散模型的拟合结果，包括一个额外的弛豫项（等式1）和DNA的推导参数扩散系数，DDNA（等式2a），重叠体积的大小和形状（等式2a-c）以及校正比rGR和rRG（等式6）).请注意，绿色和红色检测体积（标有*）的值取自图2所示的单个荧光团的拟合。请点击此处查看此图的放大版本。
活细胞实验
在下一节中，介绍了对不同β 2AR构建体的活细胞实验的分析。由于β 2AR是膜蛋白，其扩散在很大程度上被限制在沿细胞膜的二维扩散（图4A）（除了运输或再循环过程进出膜 ）2。由于对2D扩散的限制，方程1中的形状因子 s = z0/w0 变得过时，导致简化的扩散模型（等式9）。
单标签结构：β 2个 AR-IL3-eGFP 和 NT-SNAP-β2个 AR
图4显示了单标签构建体β 2AR-IL3-eGFP的示例性测量（图4B），其中eGFP插入细胞内环路3，以及构建NT-SNAP-β 2 AR（图4C），其中SNAP标签与β 2 AR的N端偶联。SNAP标签标有膜不透水的SNAP表面基板。代表性曲线显示了4-6次重复测量的平均值，每次采集时间为120-200秒。eGFP 和 SNAP 信号的相应自相关ACFgp和ACFrd拟合到双峰二维扩散模型（等式 9）。在快速动力学方面，eGFP仅显示预期的三重态在tR1~9 μs处闪烁，而SNAP信号需要两个弛豫时间，一个在tR1~ 5 μs的典型三重态闪烁时间，另一个在tR2 ~ 180 μs处。
在给定的激发条件（等式5a-b）下，活细胞中荧光团的分子亮度为每分子0.8 KHz（eGFP）和1.7 kHz（SNAP）。掺入细胞膜中的标记β 2AR构建体的浓度应在纳米摩尔范围内，并且可以通过分子的平均数量（等式9， 图4C）和绿色和红色通道的相应共聚焦体积的大小（图2）使用方程8来确定。
图4：单标签结构的代表性测量（A）在本研究中，以膜受体β 2 AR为例。与用于校准的荧光团和DNA链相反，它们可以自由地漂浮在检测体积中，膜蛋白主要沿着膜横向扩散，称为二维扩散。（B， D）ACFgp和ACF rd的单标签结构β 2 AR-IL3-eGFP（B）和NT-SNAP-β 2AR（D）。图中显示了 4-6 次测量值的平均值，每次测量值为 120 - 200 秒。图（C）中的表格显示了数据与双峰二维扩散模型的拟合结果，包括额外的弛豫项（等式7）。请点击此处查看此图的放大版本。
双标签结构：NT-SNAP-β2AR-IL3-eGFP
在双标记结构NT-SNAP-β 2 AR-IL3-eGFP（短NT-SNAP）中，将eGFP插入细胞内环3中，并且，SNAP标签与β 2 AR的N端偶联（图5A）。在这种配置中，eGFP位于膜的内侧，SNAP位于外侧，距离太大，无法进行FRET。在理想情况下，这种结构将显示绿色和红色荧光团的100%共扩散，并且没有FRET信号。图5B-D显示了两个不同测量日在两个单元中NT-SNAP的两次测量。将图5B所示的"更好"测量值的ACF gp和ACF rd与等式7和CCFPIE与方程9拟合，显示ACFgp和ACF rd的焦点为50-60个分子，而Napp，因此CCFPIE为1/ G0（tc）〜114（图5C).标记受体的浓度在~100 nM范围内，如等式8确定的那样。为了确定双标记分子的平均浓度，首先，计算CCFPIE的G0（tc）（由1 /N（app）表示）分别与ACFgp和ACFrd的比率（等式6）。接下来，将这些值rGRcell= 0.43 和 rRGcell = 0.53 与从 DNA 测量中获得的值（在此测量日，rGR，DNA= 0.51 和 rRG，DNA = 0.79）进行比较。使用比例法则，来自eGFP信号的ACFgp的rGRcell= 0.43反映为0.84的共扩散（rGRcell/rGR，DNA）的一部分，其中对于SNAP底物信号的ACFrd的另一种情况，该值等于0.67。双标记NT-SNAP结构的平均浓度最终可以基于等式10计算。相反，在图5D所示的测量中，来自不同日期的受体浓度相当低，数据非常嘈杂，使得拟合范围限制为〜10μs。此外，仅观察到少量的共扩散（15-26%）。
图5：双标签NT-SNAP-β 2 AR-IL3-eGFP结构。（A）在双标记结构中， eGFP 入到细胞内环 3 中， SNAP 标签连接到β 2AR （ NT - SNAP ）的 N 端。（B， D）ACFgp、ACF rd和CCFPIE的两个测量值的双标记构造。数据拟合到双峰二维扩散模型（方程9，CCF PIE），并包括额外的弛豫项（方程7，ACF gp和ACFrd）。图（C）中的表格显示了拟合结果和推导的参数浓度（等式8），零相关时间（G0（tc））与共扩散分子分数（等10）的相关幅度之比。请注意，测量是在不同的日子获得的，因此使用了略有不同的幅度校正因子（B：r GR，DNA = 0.51和rRG，DNA = 0.79;D：rGR，DNA = 0.51 和rRG，DNA = 0.56）。请点击此处查看此图的放大版本。
经历 FRET 的双标签结构：β 2个 AR-IL3-eGFP-CT-SNAP
在双标记结构β 2AR - IL3 - eGFP - CT - SNAP （图 6A ）中， eGFP 入到与 NT - SNAP - β 2 AR - IL3 - eGFP 结构相同的细胞内环 3 中， SNAP 标签连接到 C 端。在这里，两个标记都位于细胞质膜的同一侧，因此荧光团靠近，因此FRET发生如淬灭的eGFP寿命所示（补充注5）。考虑到相对非结构化蛋白质区域（如C端34）和GPCRs35的至少两种不同蛋白质构象的灵活性，"高FRET"（HF）或"低FRET"（LF），由于eGFP-SNAP距离变化引起的FRET效率的动态变化可以通过CCFFRET中的反相关项进行观察和识别（图6B中的橙色曲线）).FRET波动已被证明是反相关的，因为受体一次只能处于一种状态，无论是HF还是LF。所有五条相关曲线的联合（或全局）拟合（图6B）显示约70%的缓慢扩散分子在~100 ms时，而其余分子以~1 ms扩散。所有自相关和CCFFRET在37 μs和3 μs处显示松弛项;那些以红色信号为主的相关性（ACFrp、ACF rd和CCFFRET）显示出一个额外的慢分量~50毫秒（图6C）。
FRET引起的在不同条件下CCFFRET的变化（图6D）通过一系列双态系统的模拟来证明，LF和HF状态之间的波动时间为70 μs。从低频切换到高频状态时，在提示时间窗口中观察到反相关信号的变化：绿色信号减小，红色信号增加（HF ->低频切换则相反）。如果HF-LF切换发生在比扩散时间更快的时间尺度上，换句话说，在焦点中分子停留期间，速率可以从CCFFRET6，31，36中的反相关推导出来。请注意，在FCS中无法观察到比扩散时间慢的动态过程。
在本演示中，假设了两种不同的FRET情景，表明两种状态之间FRET效率的适度或最大变化。使用Burbulator37进行模拟，并考虑不存在或存在三重态闪烁以及进入红色通道的供体串扰量增加。扩散项被建模为双峰分布，其中30%的快速扩散分子在tD1 = 1 ms时，其余分子在tD2 = 100 ms时缓慢扩散。总共在3D高斯形体积中模拟了10个7个光子，w 0 = 0.5μm，z 0 = 1.5μm，盒子尺寸为20，N FCS = 0.01。
图6E-F显示了在无（实线）和三重闪烁（虚线）的情况下，在中等（图6E）和最大FRET对比度（图6F）下，FRET诱导的互相关CCF FRET的仿真结果。FRET诱导的反相关可以很容易地在图6F中看到。增加一个额外的三重态时的"阻尼"效应降低了相关幅度（图6E-F）38，39。
图6：双标记样品的模拟，显示动态FRET.（A）双标记β 2 AR，将eGFP插入细胞内环3和C端SNAP标签。两个荧光团都足够接近以进行FRET，并且如果受体经历蛋白质动力学，则显示FRET效率的变化。（B）自相关（ACFgp，ACF rp和ACFrd，拟合方程7）和互相关曲线（CCFFRET（等式7）和CCFPIE（方程9））的示例测量。图（C）中的表格显示了拟合结果。（D-F）为了表明实验参数对预期的FRET诱导的反相关项的影响，进行了12次模拟，其中FRET效率的变化（小或大），不同量的供体串扰进入受体通道（0%，1%或10%）以及三重态闪烁的缺失和存在。假设两种FRET态的平衡分数为50：50，并且它们的汇率调整，使得获得的弛豫时间tR = 70 μs。有关模拟的更多详细信息，请参阅文本。（E）CCFFRET的仿真结果具有适度的FRET对比度，并且在没有串扰（深橙色），1%串扰（橙色）和10%串扰（浅橙色）的情况下。实线表示没有三元组的结果，虚线表示三元组存在的结果。（F） CCFFRET的仿真结果与最大FRET对比度。颜色代码与 （E） 相同。请点击此处查看此图的放大版本。
然而，在模拟中与实验条件最相似的（α=10%，15%的三重闪烁和适度的FRET对比度，图6E中的虚线黄线），反相关项几乎减弱。图7显示了使用光子到达时间直方图中编码的信息（即荧光寿命）通过荧光寿命相关光谱（FLCS）17，19或物种过滤FCS（fFCS）18分析该模拟数据的结果。在这里，已知HF和LF物种的荧光寿命（图7A）被用来产生砝码或"滤光片"（图7B），这些砝码或"滤光片"在相关过程中被应用。在得到的物种自相关曲线和互相关曲线（图7C-D）中，可以清楚地观察到反相关。
图7：终生滤波FCS可以帮助揭示基于蛋白质动力学的FRET效率波动，这些样品具有高串扰，显着的三重闪烁或其他光物理或实验特性，掩盖了 CCFFRET中FRET诱导的反相关。 在这里，该方法对于包含10%串扰和5%三重闪烁的仿真如图 6E 所示的数据的示例性显示。（A） 两种 FRET 物种（高和低 FRET 分别为浅绿色和深绿色）和 IRF（灰色）的归一化荧光强度衰变模式。平行检测通道的模式以实线显示，垂直检测通道的虚线显示。（B）加权函数或"过滤器"是根据（A）所示的图案生成的，颜色代码与（A）相同。请注意，这里只考虑绿色检测通道中的信号，因此是FRET诱导的供体淬灭。（C）获得了四种不同的物种选择性相关性：低FRET状态（sACFLF-LF，深绿色）和高FRET状态（sACFHF-HF，浅绿色）的物种自相关，以及低FRET与高FRET状态（sCCFLF-HF，深橙色）和反之亦然（sCCFHF-LF-LF）之间的两种互相关。、橙色）。sCCF清楚地显示了μs范围内的反相关。黑色虚线表示适合度。sACF与 等式9 拟合，sCCF与 等式11拟合。图（D）中的表格显示了拟合结果。 请点击此处查看此图的放大版本。
CCFPIE 振幅研究蛋白质 - 蛋白质相互作用（PPI）
最后，活细胞中基于PIE的FCS的常见用例是研究两种不同蛋白质之间的相互作用。在这里，读出参数是CCFPIE的振幅，或者更准确地说是自相关振幅ACFgp和ACFrd与CCF PIE振幅的比值。为了显示增加共扩散对CCFPIE的影响，基于两个单标记结构进行了仿真，β 2 AR-IL3-eGFP和NT-SNAP-β 2 AR（图8A）。图8B显示了当共扩散分子的比例从0%变为100%时，CCFPIE的振幅如何增加。请注意，在延迟时间窗口中，绿色信号与红色通道的1%串扰被添加，扩散分量以其他方式建模，如上所示。
图8：CCFPIE可用于研究两种蛋白质的相互作用（A）这里，模拟了β 2AR-IL3-eGFP与NT-SNAP-β 2 AR（携带"红色"SNAP标签）的共转染研究。（B）对于越来越多的共扩散分子（0%（深蓝色）->100%（浅蓝色）），振幅G（tc）增加。扩散项再次建模为双峰分布，其中30%的快速扩散分子在tD1 = 1 ms时，其余分子在tD2 = 100 ms时缓慢扩散。此外，还增加了1%的绿色信号串扰进入红色延迟时间窗口。请点击此处查看此图的放大版本。
| 象征 | 含义（通用单位） | |||
| α | 绿色激发后绿色荧光团串扰进入红色检测通道（%） | |||
| a1 | 膜受体双峰扩散模型中第一扩散组分的分数 | |||
| 一个f | 反相关项的总振幅 | |||
| 一个R | 光物理振幅/三重闪烁 | |||
| b | 相关曲线的基线/偏移量 | |||
| B | 荧光团的分子亮度（每分子和每秒的（千）计数） | |||
| 断续器 | 背景（例如来自适当的参考样品：ddH2O，缓冲液，未转染的细胞等） | |||
| c | 浓度 | |||
| 铬 | 计数速率（KHz 或（千克-）每秒计数） | |||
| δ | 绿色激发后红色荧光团的直接激发（%） | |||
| D | 扩散系数（μm²/s） | |||
| G（tc） | 相关函数 | |||
| N | 聚焦的分子数量 | |||
| NA | 阿伏伽德罗数（6.022*1023摩尔-1） | |||
| rGR， rRG | 绿色或红色自相关函数与基于 PIE 的互相关函数的振幅比 | |||
| s | 共聚焦体积元件的形状因子 | |||
| tc | 相关时间（通常以毫秒为单位） | |||
| tD | 扩散时间（通常以毫秒或微秒为单位） | |||
| tR | 光物理学的弛豫时间（通常以微秒为单位） | |||
| tT | 三重态闪烁的松弛时间（通常以微秒为单位） | |||
| w0 | 共聚焦体积元件的半宽（μm） | |||
| z0 | 共聚焦体积元件的半高度（μm） | |||
表 1：变量和缩写列表。 对于在荧光和FRET实验中使用符号和定义，建议使用FRET社区40 的指南。
补充文件：
SuppNote1_Coverslip清理.docx请单击此处下载此文件。
SuppNote2_Confocal设置.docx请单击此处下载此文件。
SuppNote3_Data导出.docx请点击这里下载此文件。
SuppNote4_FCCS使用ChiSurf进行校准分析.docx请单击此处下载此文件。
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Discussion
GPCR中的FCS技术允许评估活细胞内受体的迁移率和相互作用41。FRET-FCS技术的优点是，除了移动性外，还可以研究GPCR的构象动力学。然而，在活细胞中进行FRET-FCS具有挑战性，并且需要显示出目标荧光标记蛋白的低（或最大适中）表达的细胞，校准良好的设置和良好的分析数据管道。在这里，首先讨论样品制备和实验过程中的生物学，光谱学和技术观点的要点。
关键的实验步骤包括最小化背景和自发荧光（通过使用广泛清洁的盖玻片和无酚红培养基），优化转染条件（例如，质粒DNA的量和转染后的时间），以实现低表达水平和有效的标记。当然，确保标记蛋白质的功能不受阻碍也至关重要。因此，在活细胞实验中，标记策略和标记位置的决定通常有利于荧光蛋白或附着在柔性N-或C-末端42，43的SNAP / CLIP标签上。替代标记策略，例如插入具有反应性侧链的非天然氨基酸，用于用有机荧光团标记，在过去几年中已经出现44。
对于仅研究两个目标分子相互作用的双色PIE-FCS，可以从大量已建立的荧光蛋白或SNAP / CLIP底物中选择荧光团。在这里，光谱学方面的目标应该是选择一对，使得发生很少的串扰或直接受体激发。此外，所选的荧光团应具有光稳定性，并且在所选的实验条件下很少或没有漂白。建议选择红色光谱范围内的荧光团，因为（1）来自细胞的自发荧光背景减少，（2）激发光波长较长，因此光毒性较小14。光漂白可以通过首先进行所谓的"功率序列"来最小化，其中激光功率逐步增加，并观察到分子亮度。最佳激发强度范围在于结果45的线性范围。
如果这两个标签也应该通过FRET报告蛋白质构象动力学，那么可用荧光团的选择就更加有限。在这里，应事先估计两个荧光团之间可能的最小/最大距离，例如，基于可用的结构或分子大小，并且选择具有合理Förster半径 R0 的荧光团对，使得FRET实际上可以发生20。
在这里，选择eGFP和SNAP标签进行标记，并且SNAP标签用细胞内或膜不透水的表面基质标记。光谱与图2C-D所示的光谱相似。荧光团的这种组合显示，在提示时间窗口内，绿色激发将eGFP与红色检测通道和直接受体激发SNAP底物的高串扰，并在提示时间窗口中的红色通道中产生显着的"假"信号。理想情况下，相声和直接受体激励这两个值都不应超过5%5，6，38。然而，Förster半径为57 Å，非常适合探测β 2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP结构中标签之间的距离，这可以从淬灭的eGFP寿命进行评估（补充注5）。
从技术上讲，与任何荧光光谱实验一样，该装置应良好对齐，并应具有合适的激发源，发射滤光片和灵敏的探测器。为了避免探测器在μs时间尺度上发生后脉冲产生的伪影，每种颜色的探测器至少应存在两个可以交叉关联的探测器。在现代时间相关单光子计数电子学中，由于独立的路由通道，检测卡在ns时间范围内的死区时间几乎不起作用，但是，如果感兴趣的时间范围位于sub-μs/ns时间范围内，则可以按照Müller等人16的建议对其进行检查。此外，对于ps范围内更高的时间分辨率，每个检测通道应加倍，即每种颜色应使用四个探测器，以绕过探测器死区时间2，15，29，46。虽然可以使用非偏振荧光检测来估计平均荧光寿命，但为了分析荧光团之间的距离（~分布），发射必须收集偏振相关。这是因为FRET中能量传递的效率依赖于两个荧光团的方向。更详细的信息可以在这里找到20，28，47.最后，在PIE实验中，提示脉冲和延迟脉冲之间的距离至关重要，应该选择荧光团的荧光强度在很大程度上衰减（图1B）。一个常见的规则是将两个脉冲相隔荧光寿命的5倍，即对于荧光寿命为2.5 ns的eGFP，距离应为12.5 ns，至少为22。
在详细介绍了实验过程的所有考虑因素之后，将更详细地讨论数据及其分析。如实验方案部分所述，必须每天检查设置的对齐情况，包括对校准测量的分析。例如，图2A-C所示的数据显示了8-40 μs范围内的额外松弛分量。已知绿色校准荧光团的典型三重态闪烁发生在2-10μs范围内13，15，48。DNA样品的所有曲线中所需的慢弛豫组分（图3C）对于实际的三重态眨眼来说太慢，可能源于DNA与荧光团39的相互作用。然而，在CCFPIE中，这种成分是不会预期的，并且很可能源于残留的串扰。因此，强烈建议在进行细胞实验之前直接对校准样品进行分析，以判断当天的对准质量。
正确校准共聚焦重叠体积需要具有100%共扩散绿色和红色标签的样品。这里，使用荧光标记的双链DNA。两条DNA链都可以定制，以在彼此之间所需的距离处具有所需的荧光团。设计的股线可以退火，产量高。然而，良好实验室规范建议通过琼脂糖凝胶电泳和测量吸收光谱来检查DNA链的完整性和标记程度。此外，还应检查双股组件的产量，因为这种校准测量主要依赖于绿色与红色标签存在100%共扩散的假设。如果假设无效，则可能必须应用校正因子16，22。在图2和图3所示的校准测量中，绿色和红色通道的检测体积分别为1.4 fL和1.9 fL。对于具有几乎衍射极限激发体积的设置，预计会出现这种尺寸差异（补充注2）。在此条件下，激发体积的大小随激发波长成比例。这反过来又解释了图3B中观察到的不同相关幅度。推导的校正因子rGR = 0.56和rRG = 0.72校正了这种大小差异和两个激发体积的潜在非完美重叠3，4。
图4、图5、图6和图7展示了基于PIE-F（C）CS的研究的工作流程，旨在了解构象蛋白动力学。首先，β 2 AR-IL3-eGFP和NT-SNAP-β 2 AR的两种单标记构建体作为对照，以表征在没有各自其他荧光团的情况下细胞中的荧光团性质（图4）。接下来，双标记结构NT-SNAP-β 2 AR-IL3-eGFP携带面向细胞外部的SNAP标签，细胞质侧的eGFP作为"100%共扩散"对照（图5）。最后一个构建体β 2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP，在细胞质侧携带两个荧光团，并且足够接近以进行FRET。在这里，由于蛋白质动力学影响FRET效率31，32，33，在瞬态时间窗口内，即供体激发后，绿色和红色通道信号中的反相关强度波动将再次期望100%共扩散。这种动态可能会在CCFFRET中显示为反相关（图6-7）。
所有GPCR β 2AR构建体均显示细胞膜上的双峰扩散（图4A）。而β 2AR-IL3-eGFP仅显示预期的三重态闪烁（图5B），13，15，NT-SNAP-β 2 AR显示额外的慢弛豫时间（图5C-D）。tR2可能源于未结合的SNAP底物。这可以通过进一步的实验来阐明，例如，通过测量所用SNAP基板在水溶液中的扩散和光物理性质。值得注意的是，区分扩散和弛豫时间的直接实验是改变共聚焦设置的针孔，即增加有效体积：虽然扩散时间随着有效体积的增加而增加，但弛豫项保持不变13。当根据拟合结果确定荧光蛋白（FP）的浓度时，请注意FP通常经历一个成熟过程，其中最终形成发色团12。这个成熟时间可能因FP而异，除了取决于局部化学环境的光物理13，15。因此，食品接触物质报告的样品中存在的实际蛋白质浓度通常被低估，如果可以在实验中确定非荧光FP的分数，则可以校正。最后，如果需要，建议检查活细胞中的荧光团光谱以校正α和δ的值，因为大多数荧光团对其环境敏感反应13，15，48。减去的背景由在未转染细胞中收集的信号决定。此外，应检查相应其他颜色通道和CCFPIE的自相关，以便能够识别错误信号（补充注4 - 图30）。
来自NT-SNAP-β 2 AR-IL3-eGFP的两个测量结果（图5D），其中荧光团位于膜的不同侧面，是在不同的日子里获得的，并显示了时间分辨单分子荧光统计的重要性。在这里，不同的结果可能是由于标记程度的不同：在一个单元中，较高的标记度和测量平均值导致相对较低的噪声（图5B），而从另一个单元中，只能收集两个测量值（图5A）。除了收集足够的数据量外，及时评估结果并可能优化标签策略也至关重要。在设计实验时，重要的是要记住FRET是灵敏的，但仅限于10nm的距离，否则是"盲目的"。在我们的例子中，这种"失明"由未改变的eGFP荧光寿命表示（补充注5）。在β 2AR-IL3-eGFP-CT-SNAP结构（图6A）中，可以从淬灭的eGFP寿命中精确定位FRET（补充注5）。然而，没有观察到反相关项（图6B），这意味着FRET要么没有波动，要么在比扩散时间慢的时间尺度上。在ACFgp，ACF rp，ACF rd和CCFFRET中最多需要三个额外的松弛项（图6C）。ACFrp，ACF rd和CCF FRET中的慢分量可能是由于受体漂白，当然，会影响这些曲线中发现的慢速扩散的获得值（〜350 ms，而ACFgp中的117 ms）。红色通道中的t D应该比绿色通道中的D略大，因为共聚焦体积的大小不同（图2）- 但只有与大小差异相当的系数。3 μs的极快弛豫时间反映了荧光团13，15，48的三重闪烁，而37 μs的较慢弛豫时间可能是由于FRET：同样，由于FRET在CCFFRET中诱导反相关，因此自相关31，32，33预计正相关。该术语在CCFFRET中作为"阳性"存在及其在ACFrd中的存在可以用高串扰来解释，并应进一步阐明。请注意，CCFPIE在较短的相关时间内与预期持平。
另一方面，应该注意的是，在感兴趣的系统中发生FRET会导致相关曲线6的非线性效应。例如，分子的分子亮度缩放成相关幅度平方，并且每个FRET状态（以及始终存在的没有活性受体的分子）显示出不同的分子亮度。事实上，FRET降低了检测到的绿色分子的表观浓度（即，增加ACFgp振幅），并且红色分子的数量（从红色提示确定）被高估了5。这两种效应都会影响CCFFRET和CCF PIE的相互作用量。然而，如图所示的全局分析，例如对钙调蛋白31、32或Syntaxin33的分子内动力学可以揭示蛋白质动力学。当仔细校准时，可以从相对CCFPIE和ACF振幅22中提取平均FRET效率，而限制状态可以从分析供体荧光寿命分布33来确定。
考虑到在使用eGFP等大型荧光团的活细胞实验中，FRET对比度可能比图6所示模拟的假设更低，并且模拟中没有添加受体的直接激发，这也许可以解释为什么在活细胞实验中鉴定反相关是非常具有挑战性的。一种有前途的分析替代方案依赖于收集编码在光子到达时间直方图（图1B）中的信息，由于时间相关的单光子计数数据收集29，30。如果样品中两种（或多种）（FRET）物种的荧光寿命（~模式）已知（图7A），则可以选择在相关过程中应用的"滤光片"或砝码（图7B）17，18，19。由此获得的相关性曲线不再代表检测通道的相关性，而是两个不同（FRET）物种之间的自相关或互相关，因此更名为物种-ACF（sACF）或物种-CCF（sCCF）。将这种方法应用于具有中等FRET对比度，高串扰和三重闪烁的模拟数据，可以恢复反相关项（图7C-D）。但是，应该注意的是，可以获得松弛时间，但与振幅的关系丢失了18。这种方法以前已应用于活细胞实验中，例如用于研究EGFR与其拮抗剂49的相互作用，或将荧光从附着在具有极短和长荧光寿命的eGFP变体上的蛋白质中分离出来50。
虽然纯化蛋白质中基于PIE的FRET测量主要用于研究蛋白质动力学3622，但在活细胞中，它侧重于理解蛋白质 - 蛋白质相互作用。这种方法已被应用于研究酵母51 中MAP激酶活性的调节或解决膜蛋白与其胞质结合伴侣的相互作用，如最近的第52条所总结的那样。在这里，当绿色荧光团的显著串扰仍然存在于红色通道的延迟时间窗口中或红色信号在提示时间窗口中的绿色通道中时，可能会出现并发症。前者可能是由于红色脉冲相对于绿色脉冲的延迟不足引起的，而这两种效应都源于所选荧光团的激发和发射光谱重叠过强。建议仔细检查相应的单个标记结构，并纠正假阳性 CCFPIE 振幅，特别是在荧光寿命非常短的自发荧光可能是另一个复杂因素22的细胞中。
总而言之，这里描述的FRET-FCS方法具有巨大的潜力来理解接近生理浓度的活细胞中的蛋白质 - 蛋白质相互作用和蛋白质动力学。在该协议中，重点放在所需的校准测量和在活细胞测量期间进行的必要定量分析上。为此，展示了不同的活细胞测量，并辅以模拟。仿真提供了一般理解，因为参数可以通过定制的拟合模型系统地变化，这些模型描述了各自数据的特定移动性和光物理特性。分析是使用开源软件工具执行的，具有广泛的分步协议和易于调整的模板。最后，技术进步，以及即购即用的稳定PIE-FCS系统的可用性以及用于数据分析的开源软件的传播，将使这种技术越来越容易被更大的研究社区所接受，最终以最高的灵敏度揭示活细胞中的蛋白质相互作用和动力学。
Disclosures
作者没有冲突要声明。
Acknowledgments
该项目得到了德国联邦研究协会（SFB/TR 240，项目编号374031971，INF项目）对J.B和K.G.H.的支持。
我们感谢Rudolf Virchow中心的财政支持和Core Unit Fluorescence Imaging的技术支持。此外，我们感谢Ashwin Balakrishnan的彻底校对。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x Telescope in 4f configuration with five lenses | Qioptiq, Rhyl, UK | G063126000 | Optics |
| 2x Band pass filters Brightline | AHF, Tübingen, Germany | HC 525/50 and HC 600/52 | Filter |
| 2x Dichroic beam splitter | AHF, Tübingen, Germany | HC BS F38-573 | Filter |
| 6-well culture plate Nunc | Thermo Scientific (Waltham, USA) | 140675 | Reagent |
| Alexa Fluor 488 NHS Ester (green calibration standard) | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A20000 | Reagent |
| Alexa Fluor 568 NHS Eater (red calibration standard) | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A20003 | Reagent |
| ASI stage PZ-2000 XYZ | Visitron Systems GmbH, Puchheim, Germany | WK-XYB-PZ-IX71 | Microscope Parts |
| Attofluor Cell Chamber, 35 mm diameter for 25 mm round coverslips | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | A7816 | Glass coverslip holder |
| Avalanche photodiode Perkin Elmer (SPCM-AQR-14) | Laser Components GmbH, Olching, Germany | SPCM-AQR-14 | Single photon counting detector |
| Beamsplitter | Newport, Darmstadt, Germany | 10FC16PB.3 | Filter |
| Biorender (Software) | Science Suite Inc - o/a BioRender (Toronto, Canada) | --- | Software used to create GPCR sketch, https://app.biorender.com/ |
| Chinese hamster ovary (CHO) cell line | ATCC | CCL-61 | Cell lines |
| ChiSurf (Data analysis Software) | Thomas-Otavio Peulen, Department of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco, USA | --- | tttrlib-based software to analyze fluorescence correlation data and fluorescence decay histograms, https://github.com/Fluorescence-Tools/chisurf Tutorial: https://www.youtube.com/watch?v=k9NgYbyLyXk&t=2s Ref: Peulen et al. J Phys Chem B. 121 (35), 8211-8241, (2017) |
| Chloroform | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 472476-2.5L | Reagent |
| DMSO | AppliChem GmbH (Darmstadt, Germany) | A3672,0250 | Reagent |
| DNA strand (40 bp fluorophore distance) | IBA Lifesciences GmbH (Göttingen, Germany) | --- | Reagent, 5’ CGC ACT GAA CAG CAT ATG ACA CGC GAT AGG CTA TCC TGC AGT ACG CT(Alexa568)C AGG 3’, 3’ GCG TGA CT(Alexa488)T GTC GTA TAC TGT GCG CTA TCC GAT AGG ACG TCA TGC GAG TCC 5’ |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F12 (with and without phenol red) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | P04-41250, P04-41650 | Reagent |
| Ethanol (absolute) | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 34852-1L-M | Reagent |
| Erythrosin B,Dye content >=95 % | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 200964-5G | Reagent, Instrument Response function, solve in EtOH to 10 mg/mL |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biochrom (Berlin, Germany) | S 0615 | Reagent |
| Fluorescence Light Source X-Cite 120 Q | Excelitas Technologies, Ontario, Canada | XI120-Q-5060 | Microscope Parts |
| Fluorescent SNAP-substrate cell : SNAP Cell TMR- STAR | New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) | S9105S | Reagent |
| Fluorescent SNAP-substrate surface : DY-549 | New England BioLabs (Frankfurt am Main, Germany) | S9112S | Reagent |
| Glass coverslips (Dimensions: diameter 24 mm, thickness 0.13 - 0.16 mm) | Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) | 111640 | Reagent |
| Laser Controller | Picoquant, Berlin, Germany | 910020 (PDL 828-S "SEPIA II") | Optics |
| Laser lines (480 nm and 560 nm) | Picoquant, Berlin, Germany | 912485 (LDH-D-C-485), 912561 (LDH-D-TA-560) | Optics |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 11668-019 | Reagent |
| MFD suite (Software) | AG Seidel, Heinrich-Heine-University Duesseldorf, Germany | --- | Software package for analysis of single-molecule fluorescence experiments including e.g. Kristine (correlation of tttr data), Burbulator (simulation of single-molecule experiment), https://www.mpc.hhu.de/software/3-software-package-for-mfd-fcs-and-mfis |
| Mounted Achromatic Doublet, ARC: 400-700 nm, f=150 mm, D=25.4 mm | Thorlabs, Bergkirchen, Germany | AC254-150-A-ML | Second part of Beam expander |
| Neubauer Chamber (deepness 0.1 mm) | Marienfeld-Superior (Lauda-Königshofen, Germany) | 640110 | Reagent |
| Olympus IX 71 stand | Olympus, Hamburg, Germany | IX2-ILL100 | Microscope Parts |
| Opti-MEM (Reduced-Serum Medium) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 31985-047 | Reagent |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | 049M4857V | Reagent |
| Phosphate-buffered Saline (PBS) | GIBCO, Life Technologies (Carlsbad, USA) | 14190144 | Reagent |
| Pinhole (50 µM) | Newport, Darmstadt, Germany | PNH-50 | Pinhole |
| PMT Hybrid-40 | Picoquant, Berlin, Germany | 932200 (PMA Hybrid 40) | Single photon counting detector |
| Python scripts (Software) | Katherina Hemmen, Rudolf-Virchow Center for Integrative and Translational Imaging, University Wuerzburg, Germany | --- | Collection of self-written Python scripts based on tttrlib (https://github.com/Fluorescence-Tools/tttrlib) used to (1) determine the average count rates, (2) correlate the data and (3) build fluorescence decay histograms, https://github.com/HeinzeLab/JOVE-FCS |
| Quad band beamsplitter (zt405/473-488/561/640 rpc phase r uf1) | AHF, Tübingen, Germany | F73-421PH | Filter |
| Single mode fiber polarization keeping, NA = 0.08 with collimator | Picoquant, Berlin, Germany | 02126 | Optics |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Carl Roth (Karlsruhe, Germany) | 6771.1 | Reagent |
| SymPhotime x64 Software (Data collection and data export software) | Picoquant, Berlin, Germany | 931073 (SPT64-1+2 single user ) | Time-tag time-resolved (tttr) data collection at the self-built FCCS setup, data export |
| Time-Correlated Single Photon Counting (TCSPC) system Hydraharp 400 | Picoquant, Berlin, Germany | 930010 (Hydraharp 400) | Optics |
| Trypsin-EDTA | Sigma-Aldrich (St. Louis, USA) | T4299-100ml | Reagent |
| Unmounted Achromatic Doublets, ARC: 400 - 700 nm, D=12.7 mm, F=-20 mm | Thorlabs, Bergkirchen, Germany | ACN127-020-A | First part of Beam expander |
| Water immersion objective (UPlanSApo 60x/1.20 W) | Olympus, Hamburg, Germany | UPLSAPO60XW | Objective |
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