Summary
ここでは、急性げっ歯類の脳スライスにおけるシナプス特異的な電気生理学的特性評価を可能にするために、光遺伝学的構築物を備えた個別の脳領域のウイルス形質導入を記述するプロトコルを提示します。
Abstract
脳内の特定のシナプスの生理学的特性と、それらがどのように可塑性変化を受けるかを研究することは、現代の神経科学における重要な課題です。従来の in vitro 電気生理学的手法は、電気刺激を使用してシナプス伝達を誘発します。この方法の主な欠点は、その非特異的な性質です。刺激電極の領域内のすべての軸索が活性化され、効果を特定の求心性結合に帰することを困難にする。この問題は、電気刺激を光遺伝学ベースの刺激に置き換えることで克服できます。オプトジェネティクスと in vitro パッチクランプ記録を組み合わせる方法について説明します。これは、解剖学的に定義された正確なシナプス接続の基礎シナプス伝達とシナプス可塑性の両方を研究するための強力なツールであり、脳内のほぼすべての経路に適用できます。ここでは、げっ歯類脳の目的のシナプス前領域(内側前頭前野)への外科的注射のためのチャネルロドプシンタンパク質をコードするウイルスベクターの調製と取り扱い、および下流の標的領域(外側嗅内皮質)の急性スライスの作成について説明します。パッチクランプ記録と光刺激によるシナプス活性化を組み合わせて、短期および長期のシナプス可塑性を研究するための詳細な手順も提示されます。光遺伝学とCre依存性細胞標識を組み合わせることで経路特異性や細胞特異性を実現する実験例について議論する。最後に、目的のシナプス前領域の組織学的確認は、シナプス後細胞のビオシチン標識と共に記載され、正確な位置および細胞型のさらなる同定を可能にする。
Introduction
シナプスの生理機能や可塑性変化を理解することは、健康な脳1で脳ネットワークがどのように機能し、脳障害でどのように機能不全になるかを理解するための基本です。急性 ex vivo 脳スライスの使用は、全細胞パッチクランプ記録を使用して、高い信号対雑音比で単一ニューロンからのシナプスの電気的活動の記録を可能にする。膜電位の制御と簡単な薬理学的操作により、受容体サブタイプの単離が可能になります。これらの記録は、層流および亜領域位置2、細胞形態3、分子マーカーの存在4、その求心性突起5、または最近活動的であった場合でも、シナプス後ニューロンを識別するための絶妙な特異性で行うことができます6。
しかし、シナプス前入力の特異性を達成することは、やや困難です。従来の方法では、刺激電極を使用して、特定の椎弓板を走る軸索を励起していました。この例は海馬で、放射状層の局所刺激がCA3からCA1サブフィールド7に投射するシナプスを活性化します。この場合、シナプス前特異性は、CA3入力がCA1錐体細胞8に突出する放射状層内に位置する唯一の興奮性入力を表すため、達成される。しかし、CA3-CA1軸索の従来の電気的シナプス前活性化で達成可能なこの高度な入力特異性は、このシナプスが受けてきた熱心な研究に反映されている例外です。他の脳領域では、複数の求心性経路からの軸索が同じ椎弓板、たとえば新皮質9の層1に共存しているため、従来の刺激電極では入力特異的なシナプス前刺激が不可能になります。異なるシナプス入力が異なる生理学的特性を有する可能性があるため、これは問題である。したがって、それらの共刺激はシナプス生理学の誤った特徴付けにつながる可能性があります。
チャネルロドプシン-2(ChR2)などの感光性膜タンパク質(オプシン)の遺伝的コードであるオプトジェネティクスの出現により、脳領域間の孤立したシナプス投影を研究する可能性が大幅に拡大しました10,11。ここでは、長距離シナプス生理学と可塑性を研究するための一般化可能で低コストのソリューションについて説明します。光遺伝学的構築物は、ウイルスベクターを使用して非常に特異的な方法で送達され、目的のシナプス前領域の非常に正確な制御を可能にします。遠心性突起は、ターゲット領域でこれらの繊維の活性化を可能にする光活性化チャネルを表現します。したがって、従来の非特異的な電気刺激では独立して活性化できない長距離の解剖学的に拡散した経路を研究することができます。
我々は、経路の例として、興奮性陽イオンチャネルオプシンをコードするアデノ随伴ウイルス(AAV)による内側前頭前野(mPFC)の形質導入について説明する。次に、外側嗅内皮質(LEC)からの急性スライスの調製、第5層のLEC錐体ニューロンからのパッチクランプ記録、およびグルタミン酸作動性mPFC-LEC突起の光誘発活性化について説明します(図1)。また、シナプス前関心領域の位置を確認するための注射部位の組織学的評価とシナプス後細胞の形態の同定についても説明します。
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Protocol
すべての動物の手順は、英国動物科学手順法(1986)および関連するガイドライン、および地域の機関ガイドラインに従って実施されました。
1.脳定位固定装置ウイルス注射
注:現在のプロトコルでは、解剖学的ですが、シナプス後細胞型の特異性は必要ありません。
- 適切な動物を選択してください。このプロトコルでは、雄の野生型リスターフード付きラットが使用されました(300〜350 g、約3か月齢)。
- 適切なウイルス構築物を選択してください。考慮すべきいくつかの要因があります(「ディスカッション」を参照)。現在のプロトコルでは、ウイルスを使用して光遺伝学的チャネルChETATC 12を発現し、興奮性ニューロン(AAV9 - CaMKIIa - ChR2(E123T/T159C) - mCherry;力価:3.3 x 10 13ウイルスゲノム/ mL)を形質導入します。
- 前述のように、脳アトラスを使用して注射の座標と量を確立します35。
- ウイルス製剤の定位固定装置注射
注:動物の使用と世話に関するすべての関連する国および機関のガイドラインに従う必要があります。ウイルスベクターは、前述のように定位固定性に注入されます。13 以下の変更を行います。- 動物の麻酔および調製中は、ウイルス調製物を氷上に保管してください。
- 4%イソフルランを含む麻酔導入室で麻酔を誘発する。通常の呼吸数(1 Hz)が遅く、ペダル反射と角膜反射がないことで示される麻酔レベルを監視します(つま先をつまんで目の隅に軽く触れてテストしますが、反応は検出されません)。
- 侵襲的処置の少なくとも30分前にメロキシカムなどの術前鎮痛薬を投与する。
- 動物が完全に麻酔をかけられたら、バリカンを使用して頭皮から毛皮を取り除きます。イソフルランの流れを脳定位固定装置フレームのノーズコーンに切り替え、ラットをフレームに取り付けます。処置中の乾燥を防ぐために、潤滑アイジェルを目に塗ります。
- 手術は無菌状態で行う必要があります。手順全体を通して滅菌手袋と器具を使用してください。4%w / vクロルヘキシジン溶液で頭皮を消毒する前に、リドカイン軟膏(5%w / w)を塗布してから、滅菌ドレープで体を覆います。メスを使用して、頭皮の長さ約15 mmの縦切開を行い、ブレグマを露出させます。
- ハミルトンシリンジを、定位固定装置フレームに取り付けられた可動アームに取り付けられたマイクロインジェクションシリンジポンプにロードします。
- 5 μLのウイルスアリコートを0.2 mLチューブに入れ、すべての容量がチューブの底に入るまで数秒間回転させます。2μLのウイルス製剤をチューブの蓋にピペットで入れます。
- 最初に手術用顕微鏡で針先を見てシリンジにウイルス製剤を満たし、次にウイルスのボーラスを針の先端に手動で置き、ポンプコントロールを使用してシリンジプランジャーを引き出します。
- ポンプ注入量を300nL、流量を100nL/minに設定します。ポンプを作動させ、針先のウイルスの飛沫を観察して適切な流れを確認します。綿棒でウイルスを吸収し、70%エタノールで針をやさしくきれいにします。
- 脳定位固定装置フレームのアジャスターネジを使用して、針先をブレグマ(冠状縫合糸と矢状縫合糸が出会う頭蓋骨上のポイント)に移動し、フレームの3つのバーニアスケールで観察された定位固定装置測定値をメモします。ラットmPFCのブレグマに対する座標は、前後+ 3.1 mm、中外側±0.7 mm、背腹側 - 4.5 mmです。ブレグマ座標からこれらの距離を(示されているように)加算/減算し、針を前後および中外側座標に移動し、針を頭蓋骨表面に静かに下げます。
注:上記のmPFC座標は、300〜350gのオスのリスターフード付きラットに適しています。ラット系統の変化、大きさは、これらの座標への変更を必要とする可能性がある( 考察を参照されたい)。 - 針を頭蓋骨の表面から持ち上げ、細い先端の永久マーカーペンでこのポイントに印を付けます。この時点で、脳定位固定装置アームに取り付けられたマイクロドリルを使用してバリ穴を開けます。
- 事前に決定された背腹座標で脳に針を挿入し、事前に決定された容量(mPFCの場合:300 nL)を注入します。ボーラスの拡散を可能にするために、針を その場で 10分間放置します。針を取り外したら、ポンプを動かして針が詰まっていないことを確認します。
注意: 針をゆっくりと(~3 mm / min)挿入および取り外して、脳組織への損傷と針管へのウイルスの逆流を最小限に抑えます。 - 加温した塩化ナトリウム(0.9%w / v)とグルコース(5%w / v)溶液2.5 mLを皮下投与して、水分補給を維持します。.
- 手順 1.4.12 を繰り返します。第二半球のために。
- 頭皮切開を縫合し、手順が完了したら、2.5 mLの塩化ナトリウムとブドウ糖溶液、および疼痛管理のための適切な制度的に推奨される鎮痛薬、例えばブプレノルフィンまたはメロキシカムを投与します。.意識不明の間、動物を放置しないでください。完全に意識を取り戻すまで、ラットを加熱された回復ボックスに入れます。完全に回復したら、他の動物と一緒に家のケージに戻ってください。
- ウイルストランスフェクトされたげっ歯類の術後ケアおよび収容手順に関する施設ガイドラインに従ってください。.実験を開始する前に、オプシン導入遺伝子が適切に発現するまで少なくとも2週間待ちます。
注:形質導入に必要な時間は、シナプス前領域とシナプス後領域間の接続の距離と強度に依存します。mPFCからLECの場合、4〜6週間かかります。
2.急性脳スライスの調製
注:ここでは、成体のマウスおよびラットから高品質の皮質、海馬、および視床スライスを達成するのに十分な脳スライスを調製するための簡単な方法について説明します。
- 解剖用の溶液を準備します。
- 250 mL ビーカーに、25 °Cで抵抗率 18.2 MΩ cm の超純水 (UPW) で製造された ~200 mL の氷冷スクロース切断溶液 (189 mM スクロース、26 mM NaHCO 3、10 mM D-グルコース、5 mM MgSO4、3 mM KCl、1.25 mM NaH 2 PO4、および 0.2 mM CaCl2) またはビブラトーム組織チャンバーを満たすのに十分な容量で充填します。 カルボゲン(95%O 2、5%CO2)で泡立て、氷上に保ちます。
- スライス収集チャンバーに人工脳脊髄液(aCSF;124 mM NaCl、26 mM NaHCO 3、10 mM D-グルコース、3 mM KCl、2 mM CaCl 2、1.25 mM NaH2PO 4、および1 mM MgSO4 UPW製)を室温で満たし、カルボゲンで泡立てます。スライス収集チャンバ14は、ナイロンメッシュのシート上に接着されたマイクロ遠心チューブラックからカスタムメイドされ、aCSFに沈められたビーカーに入れられる(図2A)。
- 50 mL チューブにリン酸バッファー (PB; 75.4 mM Na 2 HPO 4.7H2O および 24.6 mM NaH2PO 4) 中の4% パラホルムアルデヒド (PFA) を満たします。H2O)。
注意: PFAは有毒です。ドラフトで使用します。
- 脳の解剖。
- 呼吸が遅く規則的になるまで、5%イソフルランを使用して誘導チャンバーでラットを麻酔します(~1 Hz)。ペダル反射と角膜反射がないことについて十分なレベルの麻酔試験を確保するため。
- ギロチンを使用して動物を斬首します。
- 前述のように脳全体を速やかに解剖し15、ショ糖切断液に移す。断頭から90秒以内にステップを完了して、良好なスライス品質と全細胞記録の成功を実現します。
- 金属製のティースプーンを使用して、脳を拾い上げ、余分な切断液を捨て、ベンチトップのろ紙の上に置きます。
- メスまたはかみそりの刃を使用して、小脳をすばやく取り除き、冠状平面の大脳をその長さのほぼ半分まで切断します。後半分はLEC組織ブロックです。次のステップのためにスライスする領域に加えて、必ず余分な組織を含めてください。この組織ブロックと脳の残りの部分の両方をショ糖切断溶液に戻します。
- シアノアクリレート接着剤を一滴ビブラト組織ステージに置きます。前のステップで作成したティッシュブロックよりわずかに大きい面積の薄層に広げます。
- 小さじ1杯を使用してLEC組織ブロックをピックアップし、余分な溶液を廃棄し、前冠状切片が付着するように接着剤パッチに移します。
- ステージをビブラトーム組織チャンバーに設置し、組織を沈めるのに十分な量のスクロース切断溶液を素早く注ぎます。この溶液をカルボゲンで泡立てます。LEC組織ブロックを腹面でブレードに向けます。周囲の部屋の照明はオプシンをアクティブにするには不十分ですが、ビブラトームに存在する可能性のある追加の光源の使用は避けてください。
- 高いブレード振動速度(100 Hz)と遅いブレード前進速度(0.06 mm/s)を使用して、腹側から背側までの厚さ350 μmのスライスを切断します。典型的には、半球当たり7つのLECスライスを得ることができる。
- スライスをスライス収集チャンバーに移します。スライス採取が完了したら、回収チャンバーを34°Cの水浴に1時間移してから室温に戻します。カルボゲンで連続的に泡立てます。スライスは、少なくとも6時間記録するのに十分健康です。
- 注射部位の事後検査のために、脳の残りの部分をPFAに48時間入れます(セクション4を参照)。
3. 電気生理学と光遺伝学的刺激
- 標的細胞の同定。
- スライスを34°Cの水中記録チャンバーに入れ、蠕動ポンプで2 mL/minの速度でaCSFを灌流します。スライスアンカーを使用してスライスを固定します。
- 斜め赤外線照明を使用した広視野顕微鏡の低倍率(4倍)対物レンズの下で、LECレイヤー5に移動します。パイアル表面から必要な層までの距離を測定します。
注意: 斜め赤外線照明は、記録チャンバーカバースリップの約3 mm下に近赤外線LEDをカバースリップの平面に対して~55°の角度で配置することによって実現されました(図2B)。微分干渉コントラストは、スライス電気生理学のための代替的で一般的に使用されるイメージング技術です。 - 高倍率の水浸対物レンズ(40倍)に変更し、錐体ニューロンを特定します。コンピュータモニタ上のセルの位置をテープでマークします。
注:錐体ニューロンはほぼ三角形の形態をしており、スライスのパイアル表面に向かって突出した顕著な頂端樹状突起があります(図3A)。細胞の健康状態は、凝縮した目に見える核がないことと、滑らかに見えるはずの原形質膜の検査によって評価できます。広視野蛍光顕微鏡を使用した場合、オプシン-フルオロフォア融合タンパク質による軸索の明確な蛍光標識が見られる可能性は低いです。軸索投影を可視化するには、オプシンの蛍光色素に対する一次抗体を用いて免疫組織化学事後処理を行い、同波長または類似の波長の蛍光色素に結合した二次抗体を用いて増幅します。
- 全細胞パッチクランプの形成。
- ピペットプラーを使用してホウケイ酸ガラスマイクロピペットを作製し、ろ過した細胞内記録溶液(120 mM k-グルコン酸塩、40 mM HEPES、10 mM KCl、2 mM NaCl、2 mM MgATP、1 mM MgCl、0.3 mM NaGTP、0.2 mM EGTA、およびUPW製0.25%バイオシチン、pH 7.25、285-300 mOsm)を充填します。充填されたマイクロピペットをパッチクランプアンプヘッドステージの電極ホルダーに配置し、電極ワイヤーが細胞内溶液と接触していることを確認します。
- チューブで電極ホルダーのサイドポートに接続されたマウスピース(プランジャーを取り外した1 mLシリンジなど)に強く吹き込んで口から陽圧をかけ、インライン三方弁を閉じて圧力を維持します。メニスカスが形成されるように顕微鏡の対物レンズを持ち上げ、顕微鏡で見ることができるまで電極をメニスカスに挿入します。
- WinLTP16(または他のアクイジション・ソフトウェア/オシロスコープ)でシール・テスト・ウィンドウを開き、アンプを電圧クランプ・モードにして5mVの矩形パルスを印加し、ピペット抵抗が3〜6MΩかどうかを判定します。
- ピペットチップで識別されたセルに近づき、触れます。これにより、細胞膜にくぼみが生じ(図3A、右パネル)、ピペット抵抗がわずかに増加します(0.1MΩ)。
- マウスピースに適度な吸引を加えることにより、陽圧を解放し、負圧を適用します。これにより、ピペット抵抗が大幅に増加するはずです(>1000MΩ)。圧力を中立のままにすることができます。細胞膜が破裂してセル全体の静電容量トランジェントが発生するまで、徐々に増加するランプで負圧を適用します。
- 光遺伝学的に誘発されたシナプスイベントを記録します。
- 電流クランプ構成を入力します。
注:ほとんどの場合、長距離シナプス伝達はグルタミン酸作動性であるため、塩化物反転電位に近い膜電位で記録すると、AMPA受容体(AMPAR)を介した伝達を最もよく分離し、誘発されるフィードフォワード阻害(FFI)の測定を最小限に抑えます。塩化物反転は、細胞内記録溶液およびaCSFの組成に依存し、ゴールドマン-ホジキン-カッツ方程式を使用して計算できます。上記のソリューションでは、これは-61.3mVでした。第5層LEC錐体ニューロンの平均静止膜電位は-62mVであり、必要に応じて、定電流の注入によってこの電位に維持された。あるいは、セルを所望の電位に電圧クランプすることができる。長距離抑制投影16 を記録するか、FFIを記録するために、GABA作動性塩化物コンダクタンスを分離するために陽イオン反転電位で電圧クランプする。活動電位閾値を超える膜電位でニューロンを電圧クランプする場合、電位依存性ナトリウムチャネル遮断薬を含むセシウムベースの細胞内溶液を使用して、電圧クランプを改善し、活動電位の開始を防ぎます(130 mM CsMeSO 4、10 mM HEPES、8 mM NaCl、5 mM QX 314塩化物、4 mM MgATP、0.5 mM EGTA、0.3 mM NaGTP、0.25%バイオシチンはUPWで製造され、 pH 7.25, 285-300 mOsm)。 - データ・アクイジション・ソフトウェアを使用して、トランジスタ-トランジスタ・ロジック(TTL)信号をLEDドライバに送信し、実装された470nmLEDをアクティブにします。取り付けられたLEDは、フィルターキューブと適切な光学系(図2B)を使用して顕微鏡の光路に向けられ、40倍の対物レンズ を介して スライスに光パルスを適用し、光遺伝学的興奮性シナプス後電位(oEPSP)を誘発します。
注:光パルスは、樹状突起上/樹状突起上に適用することができ、軸索およびシナプス前ブトンのオプシンの活性化をもたらすか、研究者は、過剰ブートン刺激を避けるために、記録された細胞から軸索に対物レンズを移動させることができます( ディスカッションを参照)。最大oEPSP振幅は、シナプス投射の強さ、ウイルス注射の有効性、および使用されるオプシンに依存します。oEPSPは、光強度および/または持続時間を変化させることによって所望の振幅に滴定することができる18;光パルスの持続時間を変えると(最大LED出力で0.2〜5ミリ秒の典型的な持続時間、その結果、4.4mW / mmの光密度19になります)、LEDの電力出力を変更するよりも一貫したoEPSP振幅が得られます。 - 異なる刺激間間隔を持つ複数の光パルスの列を送達することにより、シナプス前放出特性(電圧の変化)を調査します(図3E)。光遺伝学的に誘発された伝播を解釈する際には注意が必要です( 議論を参照)。
- oEPSPs19を繰り返し誘発するか、配位子を適用することにより、長期的な可塑性を調査します。可塑性誘導前の安定性を確保するためにoEPSP振幅を5〜10分間監視し、安定した振幅に達するまで監視します(通常は30〜40分)。
注:現在のほとんどのオプシンは、LTPを誘導するために通常使用されるように、100Hzで配信される100刺激など、高周波で複数の活動電位を確実に呼び出すことができません。 - oEPSPがモノシナプスであることを確認するには、樹状突起アーバー上に対物レンズを配置し、0.5 μMテトロドトキシンおよび100 μMアミノピリジンの存在下で刺激することにより、形質導入経路のオーバーブートン活性化を実行します。応答が活動電位依存性である場合、テトロドトキシンの適用は伝達を廃止し、その後のアミノピリジンの包含は、oEPSPがモノシナプス的に生成される場合、伝達を部分的に回復させる19,20。
- バイオシチンがニューロンを満たすことを可能にするために、全細胞構成に入った後少なくとも15分間待つ。電圧クランプでは、膜の容量と入力抵抗を監視します。
- 細胞体細胞から離れるアプローチ角度に沿ってピペットをゆっくりと引き出し、細胞膜の再シールとピペットチップでのアウトサイドアウトパッチの形成を示す静電容量トランジェントと膜電流のゆっくりとした消失を観察します。スライスの向きとスライス内のセルの位置に注意してください。スライスを24ウェルプレートのPFAに入れ、4°Cで一晩インキュベートした後、0.1 M PBに移します。
注:スライスは最大1週間保存できます。より長い保管が必要な場合は、PBを定期的に交換するか、アジ化ナトリウム(アジ化ナトリウムの0.02%〜0.2%)を含むPBを使用してください。.
- 電流クランプ構成を入力します。
4.組織学
- スライス注入部位
- 固定後、組織が沈むまで(最初はスクロース溶液に浮遊する)、通常は室温で一晩、または4°Cで24〜48時間、PB中の30%スクロース(w / v)で組織を凍結保護します。
- 最適な切断温度(OCT)培地を使用して、組織のブロックをクライオスタット試料ディスクに取り付けます。手順4.1.3から4.1.4に従ってティッシュブロックを凍結します。
- イソペンタンを適切な容器に入れます。標本ディスクだけを沈め、組織がイソペンタンのレベルより上にあることを確認します。イソペンタンの容器を液体窒素(またはドライアイス)に下げ、組織を凍結させます。
- 完全に凍結したら(組織ブロック全体が青白く硬くなる)、組織ブロックをクライオスタットチャンバー内の-20°Cで30分間放置し、ブロックの温度を平衡化させます。
- 厚さ40 μmの切片をクライオスタットで-20°Cで切断します。 細かい絵筆を使用して、セクションをブレードから外します。凍結切片を室温、ポリL-リジンコーティング、ガラス顕微鏡スライドに接着し、スライドを切片に触れます。
- 各スライドに約150 μLの封入剤を加え、カバーガラスで覆います。カバーガラスを軽く押して気泡を取り除きます。光退色から保護するためにスライドを覆い、室温で少なくとも12時間(または一晩)風乾します。蛍光顕微鏡を用いて、ウイルス注入部位の位置を調べる。
- バイオシチン染色プロトコル
注:このプロトコルは厚いセクションに適用できます。スライスを再セクション化する必要はありません。- 脳スライスをリン酸緩衝生理食塩水(PBS;137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na 2 HPO 4、および1.8 mM KH2PO4)で6回、1回の洗浄で10分間洗浄します。トランスファーピペットを使用して、各ステップの後にウェルを空にします。
- スライスをPBS中の3%H 2 O2(w / v)中で30分間インキュベートして、内因性ペルオキシダーゼ活性をブロックします。これにより、酸素の泡が発生します。
- 脳スライスをPBSで6回、洗浄ごとに10分間、または酸素の泡が見えなくなるまで洗浄します。脳スライスを、0.1%(v/v)Triton X-100を含むPBS中の1%(v/v)アビジンビオチン化HRP複合体(ABC)溶液中で室温で3時間インキュベートします。
- 脳スライスをPBSで6回、洗浄ごとに10分間洗浄します。
- ニューロン構造のビオシチン染色が見えるようになるまで、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)溶液で各スライスを数分間インキュベートします(約5〜10分かかります)。
注意:DABは有毒です。ドラフトで使用します。
注:DABのインキュベーション時間は予測できない可能性があり、色が発達するにつれて組織を注意深く監視します。 - スライスを冷(4°C)PBSに移して反応を停止します。脳スライスをPBSで6回、洗浄ごとに10分間洗浄します。ブラシを使用して、脳スライスをポリL-リジンコーティングされたガラス顕微鏡スライドに取り付けます。
- きれいなティッシュで余分なPBSをすべて取り除きます。各スライスを約200 μLの封入剤で覆います。カバーガラスで覆い、カバーガラスを軽く押して気泡を押し出します。室温で少なくとも12時間(または一晩)風乾します。光学顕微鏡を使用して、細胞の位置と形態学的詳細を調べます。
注:Biocytinは、蛍光色素結合ストレプトアビジンを使用して視覚化することもできます。しかしながら、画像化は、切除または共焦点顕微鏡21の使用を必要とし得る。
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Representative Results
このプロトコルでは、光遺伝学的構築物のウイルス送達を使用して、長距離シナプス生理学と可塑性を研究する方法について説明します。このプロトコルは、脳内のほぼすべての長距離接続の研究に非常に簡単に適応できます。一例として、ラットmPFCへのオプシンをコードするAAVの注入、LECからの急性スライスの調製、第5層のLEC錐体ニューロンからのパッチクランプ記録、およびLECにおけるmPFC末端の光誘発活性化について説明します(図1)。
健康な錐体細胞が位置し、パッチを当てた(例えば、図3A)。本mPFCからLECの例では、シナプス後細胞は標識されていなかった。シナプス後細胞の同定が必要な場合は、蛍光マーカーを発現する細胞を広視野光学系を用いて局在化させる必要があります(例:図3B)。細胞の健康状態は、実験の前に赤外線光学系によって評価する必要があります。LECのmPFC軸索を活性化するために、顕微鏡対物レンズを介してLEDを第5層の細胞体細胞および近位樹状突起の上に直接配置し(図1)、2ミリ秒の単一光パルスで単純な波形oEPSP(図3C)をもたらしました。oEPSPのピーク振幅を測定することができます。シナプスの短期可塑性を調べるために、5、10、および20Hzの光刺激の列を適用しました(図3E)。長期可塑性を調べるために、ベースラインoEPSP振幅を10分間モニターした後、コリン作動性アゴニストであるカルバコールを循環aCSFに10分間添加した。これは、リガンドの除去後40分でも依然として明らかであった長期のうつ病を引き起こした(図3D)。
電気生理学的記録実験に続いて、ウイルス注射部位を含む脳組織を切片化し、注射部位の長さを調べた(図4A)。蛍光レポーターmCherryは、辺縁系前皮質および下皮質(げっ歯類mPFCの構成領域)のより深い層に局在しています。LECへの投影が主により深い皮質層22から生じることが示されているので、これらの層を標的とした。mCherry陽性繊維も白質路に結合しているのが見られます。ウイルス注射の配置を最適化するためのパイロット実験では、LECの40μmセクションを採取して調べました。mCherry陽性繊維はLECの層5に見られます(図4B)。最後に、バイオシチン充填細胞を染色し、その位置と形態を確認することができました(図4C、D)。
図1:実験の概要。 (A)内側前頭前野(mPFC)へのウイルスベクター注入、光遺伝学的構築物によるmPFC細胞の形質導入、および外側嗅内皮質(LEC)の末端への構築物の輸送の概略図。(B)急性LECスライスにおける第5層の錐体ニューロンからの全細胞記録と顕微鏡対物 レンズを介した mPFC末端の光活性化の模式図。略語:CA =コルヌアンモニス;PERI =鼻周囲皮質;TR = 遷移領域。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:視覚化された全細胞記録、光遺伝学的興奮、およびtdTomato陽性ニューロンの同定のためのスライス収集チャンバーと光学構成。 (A)スライス収集チャンバ14 は、ナイロンメッシュのシートに接着され、aCSF(B)ChR2(470 nm)およびtdTomato(565 nm)の励起用のLEDは、非球面集光レンズを通して光をコリメートし、565 nmの光はバンドパスフィルターを通してビームされ、tdTomato励起スペクトルと発光スペクトルのスペクトル分離を実現します。これらは、ロングパスダイクロイックミラーと組み合わされ、より長い波長の第2のロングパスダイクロイックミラーを有するスライスに向けられる。次に、対物レンズ を介して 光がスライスに集束されます。tdTomato標識ニューロンが存在する実験では、放出された蛍光灯はダイクロイックミラーと発光フィルターを通過し、無彩色レンズによってカメラセンサーに集束されます。スライスの非蛍光の特徴は、スライスチャンバーの下から加えられた斜め屈折近赤外線(NIR)光によって視覚化されます。この光は光学系をカメラに渡すため、蛍光イメージングとNIRイメージングの間でフィルターキューブを変更する必要がなくなります。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:NIR/蛍光イメージングによるニューロンの可視化とoEPSPの代表例 。 (A)左:NIR光で可視化した錐体形態のニューロンの例。右:パッチピペットからの陽圧によって引き起こされる凹状のくぼみの形成と同じニューロン。(B)単一ニューロンにおけるtdTomatoのクレリコンビナーゼ依存性発現。(C)錐体細胞におけるLEC層5由来の代表的なoEPSP。(D)10μmカルバコール(CCh)添加後の経時的なoEPSPモニタリングの長期塑性実験の例。点線は、薬物添加前のベースライン期間中の平均oEPSP振幅を示す。(E)5、10、および20Hzでの刺激列の代表的な痕跡。 青い矢印は光の活性化を示します。スケールバー= 20 μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:注射部位の組織学的検証とバイオシチン充填細胞の回収 。 (A)mPFCにおけるウイルス注入部位を示すコロナ顕微鏡写真、ブレグマから+3.00mm。(B)mCherry+繊維を示すLECの薄い冠状断面。(C)厚さ350 μmの急性スライスの低倍率画像、ブレグマから-6.2 mm、LECのバイオシチン充填錐体細胞。破線のボックスは、D.(D)LEC錐体セルでより高い倍率で示されています。頂端樹状突起は、レイヤー1に向かう画像の右側に見ることができます。破線は地域の境界を示します。略語:IL =下皮質;PL =大脳辺縁前皮質;WM =白質。スケールバー= 250μm。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ここで紹介するプロトコルは、光遺伝学的構築物をコードするAAVを送達する定位固定手術と急性脳スライスにおける電気生理学の組み合わせを使用して、高度に特異的な長距離シナプス投影を探索する方法を説明しています(図1)。これらの技術を組み合わせることで、従来の非特異的な電気刺激ではアクセスできなかった長距離および解剖学的に拡散した経路において、脳回路の生理学と可塑性を高精度で特徴付けるツールが提供されます。細胞特異的分子マーカーとの組み合わせは、ある脳領域から別の領域23における異なる規定された細胞集団への投影の特徴付けを可能にする。
この手法の高精度性を最大限に活かすためには、経路特異性の検証が不可欠です。これはいくつかのステップで行われます。記録中に、調査中のシナプスがモノシナプスであることを確認します(ステップ3.3.5)。これに続いて、注射部位を組織学的に調べて、ウイルスが目的のシナプス前領域に限定されていることを確認し、バイオシチン染色されたシナプス後細胞の位置と形態を評価して、予想どおりであることを確認します。
ウイルスの選択と細胞特異性の達成
この技術は適応性が高く、マウスとラットの両方での使用に適しています。解剖学的特異性を必要とする実験は、野生型げっ歯類を用いて行うことができる。シナプス後細胞型の特異性を必要とする実験では、細胞が形態または位置に基づいて識別できない場合、遺伝子組み換えげっ歯類株が必要になる場合があります。例えば、パルブアルブミン(PV)発現介在ニューロンを標的とするために、PV発現ニューロンにおいてCre-リコンビナーゼが発現するPV-Creノックイントランスジェニックマウス株を使用することができる。これらの細胞を可視化するために、PV-Creラインをレポーターマウス株と交差させて、Cre媒介組換えに続いて蛍光タンパク質を発現させることができます。あるいは、Cre依存性蛍光レポーター遺伝子をウイルス的に導入することもできる。ChR2-フルオロフォア融合タンパク質は細胞膜に限定されており、鋭角スライスの広視野顕微鏡で見るとニューロンの輪郭として現れる可能性があるため、細胞質蛍光色素を使用するよりも全細胞記録のための細胞の同定が困難です。ChR2が細胞の同定に使用されている場合、ChR2と蛍光色素の分離は、バイシストロニックベクター24を用いて達成することができる。蛍光レポーターを使用して全細胞記録の標的ニューロンを同定する場合、その励起波長は理想的にはオプシンの活性化波長と重複しないようにする必要があります。これにより、記録するニューロンを探している間に形質導入された求心性神経の長時間の活性化を回避できます。同様に、シナプス前とシナプス後のレポーターはスペクトル的に分離する必要があります。一般的なレポーターは、mCherry、緑色蛍光タンパク質(GFP)、および増強黄色蛍光タンパク質(eYFP)です。
使用されるウイルス構築物にはいくつかの異なる成分があり、それぞれが実験の成功に影響を与える可能性があるため、各要素を考慮する必要があります。オプシンの選択が最重要視されるべきです。シナプス前活性化の場合、理想的なオプシンは、大きな光電流(軸索を活動電位閾値に確実に到達させるため)、迅速なオンおよびオフキネティクス、および高周波の繰り返し刺激を可能にする遅い脱感作速度を有する。原則として、急速な動力学はしばしばより小さな光電流を犠牲にしてもたらされます25;しかし、分子スクリーニングと工学はオプシンに大きな光電流を提供してきました。現在のプロトコルはChR2(E123T/T159C) ChETATC12を使用していますが、Chronos 26、CheRiff 27、oChIEFAC28、およびChRmine 29も適しています。さらに、赤方偏移(ChrimsonR)26または紫シフト(CheRiff)活性化波長のいずれかを持つ興奮性オプシンが存在し、細胞同定に使用される蛍光色素の励起スペクトルとの重複を避けるために必要になる場合があります(上記参照)。
AAVの血清型は、異なる脳領域および細胞型を形質導入するベクターの能力、ならびに順行性方向および逆行性方向の両方における軸索輸送の程度に影響を及ぼし得る30。ニューロン形質導入に一般的に使用される血清型は、1、2、5、8、および9です。文献検索は、どの血清型が特定の地域でうまく使用されたかを示すことができる。例えば、AAV9は、皮質ニューロン31の伝達のために推奨されている。
プロモーターは、オプシンが発現される細胞タイプの指定を可能にする。プロモーターはいくつかのクラスに分類されます。CAGやEF1aなどの一般的なプロモーターは、ほとんどの細胞型で発現をもたらします。シナプシンなどのニューロン特異的なプロモーターは、すべてのニューロンタイプで発現を生成します。CaMKIIaは、興奮性ニューロンへの発現を制限するために一般的に使用されますが、漏れがあることが示されています–介在ニューロンでいくつかの発現が観察されています32。mDlxエンハンサー要素は、発現をGABA作動性介在ニューロン33に制限する。シナプス前細胞型特異性は、Cre−mouse株を用いて達成することができる(シナプス後細胞について上述したように)。この場合、オプシン発現をCre発現細胞に制限するために、Cre依存性遺伝子構築物が必要になります。
滴定は、ウイルス製剤中のウイルス粒子の数です。ここでも、文献検索は、特定の領域において十分な形質導入を生じさせた力価の指標を与え得る。Cre依存系を用いる場合、この力価は、高いウイルス力価が非Cre発現細胞34における発現を形質誘導することができるので特に重要であり得る。
ウイルス配信の最適化
関心領域への正確なウイルス送達は、このアプローチにとって非常に重要です。シナプス前領域の注入座標は、適切な種について文献および/または脳アトラスを参照することによって推定することができる35,36。その後、実験者は、ウイルス注射がシナプス前関心領域に制限されるように、使用される正確な注射座標と量を最適化および改良するために時間をかける必要があります。これは、近隣地域も記録サイトに投影する場合に特に重要です。これを行う効果的な方法として、少量のウイルスを使用することをお勧めします。特に小さな注入部位が必要とされる場合、注射器および針の代わりにガラスマイクロピペットを使用することが有利であり得る13。注射針を適切な期間その場に置き、注射針のゆっくりとした引き出しは、ウイルスが針管に逃げるのを防ぐために重要です。注射の精度を確認するには、可能な限り電気生理学によって使用した各動物の注射部位を組織学的に検証し、ウイルス形質導入がオフターゲットであるデータを除外することがベストプラクティスです。私たちの手の中では、上記のプロトコルは、腹側正中線視床核、海馬、中背視床、およびLECからPFCへの投影を含む、多くの異なる長距離接続に一般化可能であることが証明されています。PFCからLECおよび中背視床への予測;LECおよび腹側正中線視床核から海馬への投影(ブリストル大学ザファールバシール研究室、未発表の観察19)。これらの異なる経路の光遺伝学的標識は、注入座標と量の改良を必要としただけです。
プロトコルの制限
脳の迅速な解剖と慎重なスライスは、これらの実験の成功にとって非常に重要です。ここで説明するスライスプロトコルは、さまざまな脳領域に適応することなく、健康な急性スライスを生成します。しかしながら、他の箇所28 に記載されるスライス媒体およびスライス後のインキュベーション温度の変動は、スライス健康をさらに改善することが報告されている。さらに、1つの領域のウイルス形質導入後に2つの脳領域から急性スライスを採取することもでき、使用する動物の数を減らすことができました。解剖学的に密度の高い経路では、ウイルスの形質導入から記録までの7日間という短い期間で、全細胞パッチクランプ記録に適した大きさの堅牢なoEPSPを呼び起こすのに十分であることがわかりました。より長い範囲またはよりまばらな投影では、より長い遅延が有利です。
光遺伝学的に誘発された活動の結果を解釈するときは、特に短期的な可塑性に関して注意する必要があります。以前の結果は、光遺伝学的に誘発された伝達は、多くの要因によって生じる可能性のある電気刺激よりも、繰り返し刺激するとより顕著なシナプス抑制を経験する可能性があることを示しました。第一に、オプシン脱感作25は、シナプス前軸索スパイクの数の減少をもたらし、シナプス後反応の減少をもたらす可能性がある。最近発見されたオプシンと分子工学を受けたオプシン(上記参照)のチャネル動態の改善は、脱感作の影響を軽減するのにかなりの役割を果たしました。ただし、100 Hzの刺激は多くのオプシンの手の届かないところにとどまり、特定の長期的な可塑性誘導プロトコルの使用を妨げる可能性があります(ただし、37を参照)。第二に、オプシンの遅い動態は活動電位を広げる可能性があり18、伝達物質の放出の延長と小胞の枯渇につながる可能性があります。これはまた、興奮性オプシン11のカルシウム透過性に起因し得る。これらの問題は、オーバーブートン光活性化を避けることで軽減できます38。第三に、AAVベクターを使用したニューロンの形質導入は、特定のシナプスにおけるシナプス前放出特性の変化にもつながる可能性があります。ただし、これはAAV9血清型38を使用することで軽減できます。.これらの制限にもかかわらず、注意深く使用すれば、光遺伝学的活性化は電気刺激を模倣することができ19,38であり、したがって、未研究のシナプス経路の生理学を調査する上で非常に貴重なツールである。また、図3Eに示すデータは、電流クランプの短期可塑性を評価しているため、シナプス電位と固有の膜特性の相互作用の影響を受けるため、電圧クランプで同等の実験を行うことでこれを回避できることにも注意してください。
今後の方向性
拡大し続ける光遺伝学的ツールボックスは、発散励起スペクトルを持つ一対のオプシンを使用することにより、同じ調製中の2つのシナプス経路にこの技術を適用する可能性を高めました。これは、ChR2とは異なり、赤色波長光によって光活性化されるオプシンChrimsonR 26の使用によって可能になります。ChrimsonRは青色光に対する感度が低いため、クロスパスウェイの活性化を回避するために、バイオレットシフト(CheRiff 27)および/または青色光に対する感度が桁違いに高い赤色非感受性オプシン(Chronos26)と組み合わせて使用 できます。これにより、ChrimsonRを有意に活性化するには弱すぎる青色/紫色の光刺激の使用が可能になり、したがって、実験スループットを向上させ、収束経路相互作用の検査を可能にし、内因性ソースからの神経調節物質の放出を可能にする2つの経路39,40の活性化を可能にします41。
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Disclosures
著者は開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この作業は、Wellcome grant 206401/Z/17/Zによってサポートされています。Zafar Bashir 氏の専門家による指導と、技術支援と原稿へのコメントを提供してくれた Clair Booth 博士に感謝します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 mL tube | Fisher Scientific Ltd | 12134102 | |
| 10 µL pipette | Gilson | FD10001 | |
| 24 well plate | SARSTEDT | 83.3922 | |
| 3 way luer valve | Cole-Parmer | WZ-30600-02 | |
| 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) substrate | Vector Laboratories | SK-4105 | |
| 40x objective | Olympus | LUMPLFLN40XW | |
| 4-aminopyridine | Hello Bio | HB1073 | |
| 4x objective | Olympus | PLN4X/0.1 | |
| AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry | Addgene | 35512 | Viral titre: 3.3x1013 GC/ml |
| Achromatic lens | Edmund Optics | 49363 | Focusses visual spectrum and near-IR |
| Benchtop microcentrifuge | Benchmark Scientific | C1005* | |
| Biocytin | Sigma-Aldrich | B4261 | |
| Borosillicate glass capillary | Warner Instruments | G150F-6 | |
| Burr | Fine science tools | 19008-07 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| Camera - Qimaging Retiga Electro | Photometrics | 01-ELECTRO-M-14-C | |
| Carbachol | Tocris | 2810 | |
| Chlorhexidine surgical scrub | Vetasept | XHG008 | |
| Clippers | Andis | 22445 | AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper |
| Collimation condenser lens | ThorLabs | ACL2520-A | |
| Coverslips | Fisher Scientific Ltd | 10011913 | |
| Cryostat | Leica | CM3050 S | |
| CsMeSO4 | Sigma-Aldrich | C1426 | |
| Cyanoacrylate glue | Rapid Electronics Ltd | 84-4557 | |
| Data acquisition device | National Instruments | USB-6341 BNC | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Dichroic mirror 500 nm long-pass | Edmund Optics | 69899 | |
| Dichroic mirror 600 nm long-pass | Edmund Optics | 69901 | |
| Dichroic mirror cube | ThorLabs | CM1-DCH/M | |
| EGTA | Millpore | 324626 | |
| Electrode holder with side port | HEKA | 895150 | |
| Emission filter | Chroma | 59022m | |
| Excitation filter | Chroma | ET570/20x | |
| Eye gel | Dechra | Lubrithal | |
| Fine paint brush | Scientific Laboratory Supplies | BRU2052 | |
| Guillotine | World Precision Instruments | DCAP | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Hydrogen peroxide solution | Sigma-Aldrich | H1009 | 30% (w/w) |
| Isoflurane | Henry Schein | 988-3245 | |
| Isopentane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P3911 | |
| k-gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | |
| Kinematic fluorescence filter cube | ThorLabs | DFM1T1 | |
| LED driver | ThorLabs | LEDD1B | |
| Lidocaine ointment | Teva | 80007150 | |
| MgATP | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| MgCl | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | |
| Micro drill | Harvard Apparatus | 75-1887 | |
| Microelectrode puller | Sutter instruments | P-87 | |
| Microinjection syringe | Hamilton | 7634-01/00 | |
| Microinjection syringe needle | Hamilton | 7803-05 | Custom specification: gauge 33, length 15mm, point style 4 - 12° |
| Microinjection syringe pump | World Precision Instruments | UMP3T-1 | |
| Mounted blue LED | ThorLabs | M470L5 | |
| Mounted green LED | ThorLabs | M565L3 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sigma-Aldrich | S9390 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NaGTP | Sigma-Aldrich | G8877 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S0751 | |
| NaH2PO4.H2O | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| NIR LED | OSRAM | SFH4550 | Used for refracted IR imaging of slice, differential interference contrast (DIC) optics is another commonly used method |
| OCT medium | VWR International | RAYLLAMB/OCT | Optimal cutting temperature medium |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | 700A | |
| Peristaltic pump | World Precision Instruments | Ministar | |
| Poly-L-lysine coated microscope slides | Fisher Scientific Ltd | 23-769-310 | |
| Recording chamber | Warner Instruments | RC-26G | |
| Scalpel blade | Swann Morton | #24 | |
| Slice anchor | Warner Instruments | SHD-26-GH/15 | |
| Stereotaxic frame | Kopf | Model 902 | |
| Stereotaxic holder for micro drill | Harvard Apparatus | 75-1874 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Surgical Microscope | Carl Zeiss | OPMI 1 FR pro | |
| Suture | Ethicon | W577H | |
| Syringe filter for intracellular recording solution | Thermo Scientific Nalgene | 171-0020 | |
| Tetrodotoxin citrate | Hello Bio | HB1035 | |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific Ltd | 10458842 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Upright fluorescence microscope | Leica | DM6 B | |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200-10 | |
| VECTASTAIN ABC-HRP kit | Vector Laboratories | PK-4000 | |
| Vibratome | Campden Instruments | 7000smz-2 | |
| WinLTP | https://www.winltp.com/ | Version 2.32 | Data acquisition software |
| Solution | |||
| aCSF | |||
| sucrose cutting solution | |||
| PFA | |||
| Intracellular? |
References
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