Name: Ex Vivo Interrogazione optogenetica della trasmissione sinaptica a lungo raggio e della plasticità dalla corteccia prefrontale mediale alla corteccia entorinale laterale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-02-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 31 s
Description: Esplora l'interrogazione optogenetica ex vivo della trasmissione sinaptica a lungo raggio dalla corteccia prefrontale mediale alla corteccia entorinale laterale. Questo metodo consente la caratterizzazione elettrofisiologica selettiva delle sinapsi in fette cerebrali acute di roditori.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è sostenuto dalla sovvenzione Wellcome 206401/Z/17/Z. Vorremmo ringraziare Zafar Bashir per il suo tutoraggio esperto e il Dr. Clair Booth per l'assistenza tecnica e i commenti sul manoscritto.

<ol><li>Martin, S., Grimwood, P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+plasticity+and+memory%3A+an+evaluation+of+the+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Synaptic plasticity and memory: an evaluation of the hypothesis.</a> Annual Review of Neuroscience. 23, 649-711 (2000).</li>
<li>Poorthuis, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer-specific+modulation+of+the+prefrontal+cortex+by+nicotinic+acetylcholine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex%22%5BJournal%5D)">Layer-specific modulation of the prefrontal cortex by nicotinic acetylcholine receptors.</a> Cerebral Cortex. 23 (1), 148-161 (2013).</li>
<li>Scala, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Layer+4+of+mouse+neocortex+differs+in+cell+types+and+circuit+organization+between+sensory+areas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Layer 4 of mouse neocortex differs in cell types and circuit organization between sensory areas.</a> Nature Communications. 10 (1), 4174(2019).</li>
<li>Nassar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+and+overlap+of+parvalbumin+and+somatostatin+expressing+interneurons+in+mouse+presubiculum%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Diversity and overlap of parvalbumin and somatostatin expressing interneurons in mouse presubiculum.</a> Frontiers in Neural Circuits. 9, 20(2015).</li>
<li>Dembrow, N. C., Chitwood, R. A., Johnston, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection-specific+neuromodulation+of+medial+prefrontal+cortex+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Projection-specific neuromodulation of medial prefrontal cortex neurons.</a> Journal of Neuroscience. 30 (50), 16922-16937 (2010).</li>
<li>Whitaker, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bidirectional+modulation+of+intrinsic+excitability+in+rat+prelimbic+cortex+neuronal+ensembles+and+non-ensembles+after+operant+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Bidirectional modulation of intrinsic excitability in rat prelimbic cortex neuronal ensembles and non-ensembles after operant learning.</a> Journal of Neuroscience. 37 (36), 8845-8856 (2017).</li>
<li>Skrede, K. K., Westgaard, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transverse+hippocampal+slice%3A+a+well-defined+cortical+structure+maintained+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The transverse hippocampal slice: a well-defined cortical structure maintained in vitro.</a> Brain Research. 35 (2), 589-593 (1971).</li>
<li>van Strien, N. M., Cappaert, N. L., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+anatomy+of+memory%3A+an+interactive+overview+of+the+parahippocampal-hippocampal+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The anatomy of memory: an interactive overview of the parahippocampal-hippocampal network.</a> Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 272-282 (2009).</li>
<li>Cruikshank, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamic+control+of+layer+1+circuits+in+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Thalamic control of layer 1 circuits in prefrontal cortex.</a> Journal of Neuroscience. 32 (49), 17813-17823 (2012).</li>
<li>Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Millisecond-timescale%2C+genetically+targeted+optical+control+of+neural+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity.</a> Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).</li>
<li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Channelrhodopsin-2%2C+a+directly+light-gated+cation-selective+membrane+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 13940-13945 (2003).</li>
<li>Berndt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+channelrhodopsins+for+fast+neuronal+stimulation+at+low+light+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-efficiency channelrhodopsins for fast neuronal stimulation at low light levels.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7595-7600 (2011).</li>
<li>Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+gene+delivery+in+the+rodent+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic gene delivery in the rodent brain.</a> Nature Protocols. 1 (6), 3166-3173 (2006).</li>
<li>Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-cell+patch-clamp+recordings+in+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), (2016).</li>
<li>Booker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+acute+brain+slices+from+the+dorsal+pole+of+the+hippocampus+from+adult+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Preparing acute brain slices from the dorsal pole of the hippocampus from adult rodents.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (163), (2020).</li>
<li>Anderson, W. W., Collingridge, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capabilities+of+the+WinLTP+data+acquisition+program+extending+beyond+basic+LTP+experimental+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Capabilities of the WinLTP data acquisition program extending beyond basic LTP experimental functions.</a> Journal of Neuroscience Methods. 162 (1-2), 346-356 (2007).</li>
<li>Basu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+of+hippocampal+activity%2C+plasticity%2C+and+memory+by+entorhinal+cortex+long-range+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Gating of hippocampal activity, plasticity, and memory by entorhinal cortex long-range inhibition.</a> Science. 351 (6269), (2016).</li>
<li>Zhang, Y. P., Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+induction+of+synaptic+plasticity+using+a+light-sensitive+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Optical induction of synaptic plasticity using a light-sensitive channel.</a> Nature Methods. 4 (2), 139-141 (2007).</li>
<li>Banks, P. J., Warburton, E. C., Bashir, Z. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+prefrontal+cortex+induced+by+coordinated+synaptic+transmission+arising+from+reuniens%2Frhomboid+nuclei+and+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+Cortex+Communications%22%5BJournal%5D)">Plasticity in prefrontal cortex induced by coordinated synaptic transmission arising from reuniens/rhomboid nuclei and hippocampus.</a> Cerebral Cortex Communications. 2 (2), (2021).</li>
<li>Petreanu, L., Mao, T., Sternson, S. M., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+subcellular+organization+of+neocortical+excitatory+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The subcellular organization of neocortical excitatory connections.</a> Nature. 457 (7233), 1142-1145 (2009).</li>
<li>Swietek, B., Gupta, A., Proddutur, A., Santhakumar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunostaining+of+biocytin-filled+and+processed+sections+for+neurochemical+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Immunostaining of biocytin-filled and processed sections for neurochemical markers.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), (2016).</li>
<li>Jones, B. F., Witter, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cingulate+cortex+projections+to+the+parahippocampal+region+and+hippocampal+formation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Cingulate cortex projections to the parahippocampal region and hippocampal formation in the rat.</a> Hippocampus. 17 (10), 957-976 (2007).</li>
<li>Anastasiades, P. G., Collins, D. P., Carter, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mediodorsal+and+ventromedial+thalamus+engage+distinct+L1+circuits+in+the+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mediodorsal and ventromedial thalamus engage distinct L1 circuits in the prefrontal cortex.</a> Neuron. 109 (2), 314-330 (2021).</li>
<li>Prakash, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+optogenetic+toolbox+for+fast+inhibition%2C+excitation+and+bistable+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Two-photon optogenetic toolbox for fast inhibition, excitation and bistable modulation.</a> Nature Methods. 9 (12), 1171-1179 (2012).</li>
<li>Mattis, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+for+applying+optogenetic+tools+derived+from+direct+comparative+analysis+of+microbial+opsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Principles for applying optogenetic tools derived from direct comparative analysis of microbial opsins.</a> Nature Methods. 9 (2), 159-172 (2011).</li>
<li>Klapoetke, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independent+optical+excitation+of+distinct+neural+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Independent optical excitation of distinct neural populations.</a> Nature Methods. 11 (3), 338-346 (2014).</li>
<li>Hochbaum, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-optical+electrophysiology+in+mammalian+neurons+using+engineered+microbial+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">All-optical electrophysiology in mammalian neurons using engineered microbial rhodopsins.</a> Nature Methods. 11 (8), 825-833 (2014).</li>
<li>Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+brain+slice+methods+for+adult+and+aging+animals%3A+application+of+targeted+patch+clamp+analysis+and+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Acute brain slice methods for adult and aging animals: application of targeted patch clamp analysis and optogenetics.</a> Methods in Molecular Biology. 1183, 221-242 (2014).</li>
<li>Marshel, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+layer-specific+critical+dynamics+triggering+perception%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cortical layer-specific critical dynamics triggering perception.</a> Science. 365 (6453), (2019).</li>
<li>Castle, M. J., Gershenson, Z. T., Giles, A. R., Holzbaur, E. L., Wolfe, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+serotypes+1%2C+8%2C+and+9+share+conserved+mechanisms+for+anterograde+and+retrograde+axonal+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus serotypes 1, 8, and 9 share conserved mechanisms for anterograde and retrograde axonal transport.</a> Human Gene Therapy. 25 (8), 705-720 (2014).</li>
<li>Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+transduction+efficiency%2C+tropism+and+axonal+transport+of+AAV+serotypes+1%2C+2%2C+5%2C+6%2C+8+and+9+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of transduction efficiency, tropism and axonal transport of AAV serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the mouse brain.</a> PLoS One. 8 (9), 76310(2013).</li>
<li>Nathanson, J. L., Yanagawa, Y., Obata, K., Callaway, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+labeling+of+inhibitory+and+excitatory+cortical+neurons+by+endogenous+tropism+of+adeno-associated+virus+and+lentivirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Preferential labeling of inhibitory and excitatory cortical neurons by endogenous tropism of adeno-associated virus and lentivirus vectors.</a> Neuroscience. 161 (2), 441-450 (2009).</li>
<li>Dimidschstein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+viral+strategy+for+targeting+and+manipulating+interneurons+across+vertebrate+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A viral strategy for targeting and manipulating interneurons across vertebrate species.</a> Nature Neuroscience. 19 (12), 1743-1749 (2016).</li>
<li>Lavin, T. K., Jin, L., Lea, N. E., Wickersham, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monosynaptic+tracing+success+depends+critically+on+helper+virus+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Synaptic+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Monosynaptic tracing success depends critically on helper virus concentrations.</a> Frontiers in Synaptic Neuroscience. 12, 6(2020).</li>
<li>Paxinos, G., Watson, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+Rat+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates.+7th+edn%22">The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. 7th edn</a>. , Academic Press. (2013).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22Paxinos+and+Franklin%27s+the+Mouse+Brain+in+Stereotaxic+Coordinates%2C+Compact.+5th+edn%22">Paxinos and Franklin's the Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Compact. 5th edn</a>. , Academic Press. (2019).</li>
<li>Nabavi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+memory+with+LTD+and+LTP%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Engineering a memory with LTD and LTP.</a> Nature. 511 (7509), 348-352 (2014).</li>
<li>Jackman, S. L., Beneduce, B. M., Drew, I. R., Regehr, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Achieving+high-frequency+optical+control+of+synaptic+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Achieving high-frequency optical control of synaptic transmission.</a> Journal of Neuroscience. 34 (22), 7704-7714 (2014).</li>
<li>Xia, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+and+Thalamic+Interaction+with+Amygdala-to-Accumbens+Synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Cortical and Thalamic Interaction with Amygdala-to-Accumbens Synapses.</a> Journal of Neuroscience. 40 (37), 7119-7132 (2020).</li>
<li>Anisimova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spike-timing-dependent+plasticity+rewards+synchrony+rather+than+causality%5BTitle%5D)+AND+%22BioRxiv%22%5BJournal%5D)">Spike-timing-dependent plasticity rewards synchrony rather than causality.</a> BioRxiv. , (2021).</li>
<li>Takeuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Locus+coeruleus+and+dopaminergic+consolidation+of+everyday+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Locus coeruleus and dopaminergic consolidation of everyday memory.</a> Nature. 537 (7620), 357-362 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo qui presentato descrive un metodo per esplorare proiezioni sinaptiche a lungo raggio altamente specifiche utilizzando una combinazione di chirurgia stereotassica per fornire AAV che codificano costrutti optogenetici ed elettrofisiologia in fette di cervello acute (Figura 1). Insieme, queste tecniche offrono strumenti per caratterizzare la fisiologia e la plasticità dei circuiti cerebrali con alta precisione in percorsi a lungo raggio e anatomicamente diffusi che in precedenza e...

Comprendere la fisiologia delle sinapsi e come subiscono cambiamenti plastici è fondamentale per capire come funzionano le reti cerebrali nel cervello sano1 e come funzionano male nei disturbi cerebrali. L'uso di fette cerebrali acute ex vivo consente la registrazione dell'attività elettrica delle sinapsi da singoli neuroni con un elevato rapporto segnale-rumore utilizzando registrazioni patch-clamp a cellule intere. Il controllo del potenziale di membrana e la semplice manipolazione farmacologica consentono l'isolamento dei sottotipi recettoriali. Queste registrazioni possono essere fatte con squisita specificità per identificare il neurone post-sinaptico, compresa la posizione laminare e sub-regionale2, la morfologia cellulare3, la presenza di marcatori molecolari4, le sue proiezioni afferenti5, o anche se era recentemente attivo6.
Raggiungere la specificità degli input pre-sinaptici è, tuttavia, un po 'più impegnativo. Il metodo convenzionale ha utilizzato elettrodi di stimolazione per eccitare gli assoni che corrono in una particolare lamina. Un esempio di questo è nell'ippocampo dove la stimolazione locale nello strato radiato attiva sinapsi che proiettano dal CA3 al sottocampo CA17. In questo caso, la specificità presinaptica è raggiunta in quanto l'input CA3 rappresenta l'unico input eccitatorio situato all'interno dello strato radiato che proietta alle cellule piramidali CA18. Questo elevato grado di specificità di input ottenibile con l'attivazione presinaptica elettrica convenzionale degli assoni CA3-CA1 è, tuttavia, un'eccezione che si riflette nell'intenso studio a cui questa sinapsi è stata soggetta. In altre regioni del cervello, assoni provenienti da più vie afferenti coesistono nella stessa lamina, ad esempio nello strato 1 della neocorteccia9, rendendo così impossibile la stimolazione presinaptica specifica dell'input con elettrodi stimolanti convenzionali. Questo è problematico in quanto diversi input sinaptici possono avere proprietà fisiologiche divergenti; Pertanto, la loro co-stimolazione può portare a un'errata caratterizzazione della fisiologia sinaptica.
L'avvento dell'optogenetica, la codifica genetica delle proteine di membrana fotosensibili (opsine) come la channelrhodopsin-2 (ChR2), ha permesso una vasta espansione delle possibilità di studio delle proiezioni sinaptiche isolate tra le regioni cerebrali10,11. Qui descriviamo una soluzione generalizzabile e a basso costo per studiare la fisiologia sinaptica a lungo raggio e la plasticità. I costrutti optogenetici sono forniti in modo altamente specifico utilizzando vettori virali che consentono un controllo estremamente preciso della regione pre-sinaptica di interesse. Le proiezioni efferenti esprimeranno il canale attivato dalla luce consentendo l'attivazione di queste fibre in una regione target. Pertanto, possono essere studiati percorsi anatomicamente diffusi a lungo raggio che non possono essere attivati in modo indipendente dalla stimolazione elettrica tradizionale, non specifica.
Descriviamo, come percorso esemplificativo, la trasduzione della corteccia prefrontale mediale (mPFC) con virus adeno-associati (AAV) che codificano opsine eccitatorie dei canali cationici. Descriviamo quindi la preparazione di fette acute dalla corteccia entorinale laterale (LEC), registrazioni patch-clamp da neuroni piramidali LEC di livello 5 e attivazione evocata dalla luce delle proiezioni glutammatergiche mPFC-LEC (Figura 1). Descriviamo anche la valutazione istologica del sito di iniezione per confermare la posizione della regione pre-sinaptica di interesse e l'identificazione della morfologia cellulare post-sinaptica.

<table><tbody><tr><td>provetta da 0,2 mL</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>12134102</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; Pipetta a L</td><td>Gilson</td><td>FD10001</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 24 pozzetti</td><td>SARSTEDT</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>Valvola luer a 3 vie</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-30600-02</td><td></td></tr><tr><td>Substrato 3,3&prime;-Diaminobenzidina (DAB)</td><td>Vector Laboratories</td><td>SK-4105</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo 40x</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN40XW</td><td></td></tr><tr><td>4-aminopiridina</td><td>Hello Bio</td><td>HB1073</td><td></td></tr><tr><td>Obiettivo 4x</td><td>Olympus</td><td>PLN4X/0.1</td><td></td></tr><tr><td>AAV9-CaMKiia-hChR2(E123T/T159C)-mCherry</td><td>Addgene</td><td>35512</td><td>Titolo virale: 3.3x1013 GC/ml</td></tr><tr><td>Lente acromatica</td><td>Edmund Optics</td><td>49363</td><td>Focalizza lo spettro visivo e</td></tr><tr><td>la microcentrifuga da banco</td> nel vicino infrarosso <td>Benchmark Scientific</td><td>C1005*</td><td></td></tr><tr><td>Biocitina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4261</td><td></td></tr><tr><td>Capillare in vetro borosillicato</td><td>Warner Instruments</td><td>G150F-6</td><td></td></tr><tr><td>Burr</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>19008-07</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera - Qimaging Retiga Electro</td><td>Photometrics</td><td>01-ELECTRO-M-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Carbachol</td><td>Tocris</td><td>2810</td><td></td></tr><tr><td>Scrub chirurgico alla clorexidina</td><td>Vetasept</td><td>XHG008</td><td></td></tr><tr><td>Clippers</td><td>Andis</td><td>22445</td><td>AGC Super 2-Speed Detachable Blade Clipper</td></tr><tr><td>Collimazione Lente a condensatore</td><td>ThorLabs</td><td>ACL2520-A</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10011913</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>CsMeSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>Colla cianoacrilica</td><td>Rapid Electronics Ltd</td><td>84-4557</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo di acquisizione dati</td><td>National Instruments</td><td>USB-6341 BNC</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Specchio dicroico 500 nm passa-lungo</td><td>Edmund Optics</td><td>69899</td><td></td></tr><tr><td>Specchio dicroico 600 nm passa-lungo</td><td>Edmund Optics</td><td>69901</td><td></td></tr><tr><td>Cubo specchio dicroico</td><td>ThorLabs</td><td>CM1-DCH/M</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Millpore</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>Portaelettrodo con porta laterale</td><td>HEKA</td><td>895150</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di emissione</td><td>Chroma</td><td>59022m</td><td></td></tr><tr><td>Filtro di eccitazione</td><td>Chroma</td><td>ET570/20x</td><td></td></tr><tr><td>Gel per gli occhi</td><td>Dechra</td><td>Lubrithal</td><td></td></tr><tr><td>Pennello per vernice fine</td><td>Forniture per laboratorio scientifico</td><td>BRU2052</td><td></td></tr><tr><td>ghigliottina</td><td>World Precision Instruments</td><td>DCAP</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di perossido di idrogeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>30% (p/p)</td></tr> <tr><td>Isoflurano</td><td>Henry Schein</td><td>988-3245</td><td></td></tr><tr><td>Isopentano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>k-gluconato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>Cubo con filtro a fluorescenza cinematica</td><td>ThorLabs</td><td>DFM1T1</td><td></td></tr><tr><td>Driver LED</td><td>ThorLabs</td><td>LEDD1B</td><td></td></tr><tr><td>Unguento alla lidocaina</td><td>Teva</td><td>80007150</td><td></td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>MgCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Micro trapano</td><td>Harvard Apparatus</td><td>75-1887</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per microelettrodi</td><td>Strumenti Sutter</td><td>P-87</td><td></td></tr><tr><td>Siringa per microiniezione</td><td>Hamilton</td><td>7634-01/00</td><td></td></tr><tr><td>Ago per siringa per microiniezione</td><td>Hamilton</td><td>7803-05</td><td>Specifiche personalizzate: calibro 33, lunghezza 15 mm, stile punta 4 - 12 gradi;</td></tr><tr><td>Pompa a siringa per microiniezione</td><td>World Precision Instruments</td><td>UMP3T-1</td><td></td></tr><tr><td>Montato LED blu</td><td>ThorLabs</td><td>M470L5</td><td></td></tr><tr><td>Montato LED verde</td><td>ThorLabs</td><td>M565L3</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4.7H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NaGTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0751</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4.H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NIR LED</td><td>OSRAM</td><td></td> <td>SFH4550Utilizzato per l'imaging IR rifratto di fette, l'ottica a contrasto interferenziale differenziale (DIC) è un altro metodo comunemente usato</td></tr><tr><td>OCT medium</td><td>VWR International</td><td>RAYLLAMB/OCT</td><td>Temperatura di taglio ottimale media</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore patch clamp</td><td>Molecular Devices</td><td>700A</td><td></td></tr><tr><td>Pompa peristaltica</td><td>World Precision Instruments Ministar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio rivestiti in poli-L-lisina</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>23-769-310</td><td></td></tr><tr><td>Camera di registrazione</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td><td></td></tr><tr><td>Lama per bisturi</td><td>Swann Morton</td><td>#24</td><td></td></tr><tr><td>Ancoraggio a fetta</td><td>Warner Instruments</td><td>SHD-26-GH/15</td><td></td></tr><tr><td>Telaio stereotassico</td><td>Kopf</td><td>Modello 902</td><td></td></tr><tr><td>Supporto stereotassico per micro trapano</td><td>Harvard Apparatus</td><td>75-1874</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio operatorio</td><td>Carl Zeiss</td><td>OPMI 1 FR pro</td><td></td></tr><tr><td>Suture</td><td>Ethicon</td><td>W577H</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa per registrazione intracellulare soluzione</td><td>Thermo Scientific Nalgene</td><td>171-0020</td><td></td></tr><tr><td>Tetrodotossina citrato</td><td>Hello Bio</td><td>HB1035</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento</td><td>Fisher Scientific Ltd</td><td>10458842</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a fluorescenza verticale</td><td>Leica</td><td>DM6 B</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade Mezzo di montaggio con DAPI</td><td>Kit Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td></td></tr><tr><td>VECTASTAIN ABC-HRP</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-4000</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden Instruments</td><td>7000smz-2</td><td></td></tr><tr><td>WinLTP</td><td>https://www.winltp.com/</td> <td>Versione 2.32</td><td>Software di acquisizione dati</td></tr><tr><td>Solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>aCSF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>soluzione <td></td><td></td><td></td><td>di taglio del saccarosio</td></tr><tr><td>PFA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Intracellular?</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo interrogazione optogenetica della trasmissione sinaptica a lungo raggio e della plasticità dalla corteccia prefrontale mediale alla corteccia entorinale laterale

Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex

Studiare le proprietà fisiologiche di specifiche sinapsi nel cervello e come subiscono cambiamenti plastici è una sfida chiave nelle moderne neuroscienze. Le tradizionali tecniche elettrofisiologiche in vitro utilizzano la stimolazione elettrica per evocare la trasmissione sinaptica. Uno dei principali svantaggi di questo metodo è la sua natura non specifica; Tutti gli assoni nella regione dell'elettrodo stimolante saranno attivati, rendendo difficile attribuire un effetto a una particolare connessione afferente. Questo problema può essere superato sostituendo la stimolazione elettrica con la stimolazione basata sull'optogenetica. Descriviamo un metodo per combinare l'optogenetica con registrazioni di patch clamp in vitro . Questo è un potente strumento per lo studio sia della trasmissione sinaptica basale che della plasticità sinaptica di precise connessioni sinaptiche anatomicamente definite ed è applicabile a quasi tutti i percorsi nel cervello. Qui, descriviamo la preparazione e la gestione di un vettore virale che codifica la proteina channelrhodopsin per l'iniezione chirurgica in una regione pre-sinaptica di interesse (corteccia prefrontale mediale) nel cervello dei roditori e la produzione di fette acute di regioni bersaglio a valle (corteccia entorinale laterale). Viene inoltre presentata una procedura dettagliata per combinare le registrazioni patch-clamp con l'attivazione sinaptica mediante stimolazione luminosa per studiare la plasticità sinaptica a breve e lungo termine. Discutiamo esempi di esperimenti che raggiungono la specificità del percorso e della cellula combinando l'optogenetica e l'etichettatura cellulare Cre-dipendente. Infine, viene descritta la conferma istologica della regione pre-sinaptica di interesse insieme alla marcatura della biocitina della cellula post-sinaptica, per consentire un'ulteriore identificazione della posizione precisa e del tipo di cellula.

In questo protocollo, descriviamo come studiare la fisiologia sinaptica a lungo raggio e la plasticità utilizzando la consegna virale di costrutti optogenetici. Il protocollo può essere facilmente adattato allo studio di quasi tutte le connessioni a lungo raggio nel cervello. Ad esempio, descriviamo l'iniezione di AAV che codifica un'opsina in mPFC di ratto, la preparazione di fette acute da LEC, registrazioni patch-clamp da neuroni piramidali LEC di livello 5 e attivazione evocata dalla luce dei terminali mPFC in LEC (<...

Qui presentiamo un protocollo che descrive la trasduzione virale di regioni cerebrali discrete con costrutti optogenetici per consentire la caratterizzazione elettrofisiologica sinaptico-specifica in fette acute di cervello di roditori.

Ex Vivo Interrogazione optogenetica della trasmissione sinaptica a lungo raggio e della plasticità dalla corteccia prefrontale mediale alla corteccia entorinale laterale

Studying the physiological properties of specific synapses in the brain, and how they undergo plastic changes, is a key challenge in modern neuroscience. ...

I costrutti optogenetici consegnati viralmente consentono una caratterizzazione elettrofisiologica dettagliata della fisiologia e della plasticità di sinapsi specifiche in fette cerebrali acute. I principali vantaggi dell'attivazione delle sinapsi optogeneticamente è la capacità di studiare percorsi a lungo raggio e la stimolazione selettiva degli assoni che non sono anatomicamente separati. A dimostrare la procedura sarà la dott.ssa Lisa Kinnavane, ricercatrice associata del nostro laboratorio.Per iniziare, caricare una siringa Hamilton in una pompa a siringa a microiniezione collegata a un braccio mobile montato su un telaio stereotassico. Quindi mettere un'aliquota da cinque microlitri del virus in una microcentrifuga. Girare il tubo per alcuni secondi e pipettare due microlitri del preparato virale nel coperchio del tubo.Per riempire la siringa con la preparazione virale, visualizzare la punta dell'ago con un microscopio chirurgico. Quindi posizionare manualmente il bolo del virus sulla punta dell'ago e ritirare lo stantuffo della siringa utilizzando i comandi della pompa. Impostare il volume di iniezione della pompa su 300 nanolitri e la portata su 100 nanolitri al minuto.Eseguire la pompa e confermare il flusso corretto osservando la goccia del virus sulla punta dell'ago. Assorbire il virus su un batuffolo di cotone e pulire l'ago con etanolo al 70%. Successivamente, utilizzando le viti di regolazione sul telaio stereotassico, spostare la punta dell'ago verso il bregma e prendere nota delle misurazioni stereotassiche osservate sulle tre scale di vernier sul telaio.Aggiungere o sottrarre queste distanze dalle coordinate del bregma. Fai un foro di bava sulla superficie del cranio usando un micro-trapano montato sul braccio stereotassico. Inserire l'ago nel cervello alla coordinata dorsoventrale predeterminata e infondere un volume predeterminato della preparazione virale.Dopo l'infusione, lasciare l'ago in situ per 10 minuti per consentire la diffusione del bolo. Quindi rimuovere l'ago e far funzionare la pompa per assicurarsi che l'ago non sia bloccato. Due settimane dopo l'iniezione virale, eutanasia il ratto, sezionare rapidamente l'intero cervello e trasferirlo nella soluzione di taglio di saccarosio.Usando un cucchiaino di metallo, raccogli il cervello, scarta la soluzione in eccesso e mettila su una carta da filtro. Usando un bisturi, rimuovere il cervelletto e tagliare il cervello nel piano coronale circa a metà della sua lunghezza. La metà posteriore è il blocco di tessuto LEC.Riportare il blocco di tessuto e il cervello rimanente alla soluzione di taglio di saccarosio. Quindi, posizionare una goccia di colla cianoacrilica su uno stadio di vibratomo e distribuirlo in uno strato sottile. Quindi, usando un cucchiaino, raccogliere il blocco di tessuto LEC e trasferirlo sul cerotto di colla, in modo che il taglio coronale anteriore abbia aderito.Installare il palcoscenico nella camera del tessuto vibratomo e versare rapidamente una soluzione di taglio di saccarosio sufficiente per immergere il tessuto. Dopo aver orientato la superficie ventrale del blocco di tessuto verso la lama, tagliare fette spesse 350 micrometri da ventrali a dorsali usando una velocità di avanzamento della lama lenta. In genere, è possibile ottenere sette fette per emisfero.Trasferire le fette nella camera di raccolta delle fette. Quindi posizionare la camera di raccolta in un bagno d'acqua a 34 gradi Celsius per un'ora prima di tornare a temperatura ambiente. Metti il resto del cervello in paraformaldeide per 48 ore.Per l'identificazione della cella bersaglio, posizionare la fetta nella camera di registrazione e immobilizzarla utilizzando un'ancora di fetta. Con un basso ingrandimento, utilizzando l'illuminazione a infrarossi, passare al livello cinque LEC. Quindi passare all'obiettivo di immersione in acqua ad alto ingrandimento e identificare i neuroni piramidali.Contrassegnare la posizione della cella sul monitor con del nastro adesivo. Successivamente, per formare un morsetto per cerotti a cellule intere, fabbricare una micro-pipetta in vetro borosilicato e riempirla con una soluzione di registrazione intracellulare. Posizionare la micropipetta riempita nel supporto dell'elettrodo e applicare una pressione positiva soffiando con forza in un boccaglio collegato alla porta laterale del supporto dell'elettrodo.Sollevare l'obiettivo del microscopio in modo tale che si formi un menisco e inserire l'elettrodo nel menisco fino a quando non può essere visto sul microscopio. Aprire la finestra Seal Test e determinare se la resistenza della pipetta è compresa tra tre e cinque megaohm. Quindi toccare la cellula identificata con una punta di pipetta, con conseguente rientranza nella membrana cellulare.Quindi, applicare una pressione negativa mediante aspirazione al boccaglio, aumentando la resistenza della pipetta. Continuare ad applicare gradualmente la pressione negativa fino a quando la membrana cellulare si rompe, causando transitori di capacità dell'intera cellula. Per accedere alla configurazione corrente del morsetto, utilizzare un LED montato diretto nel percorso della luce del microscopio con cubi filtranti e ottiche appropriate e applicare impulsi luminosi alla fetta tramite l'obiettivo 40X.Fornire treni di impulsi luminosi multipli a cinque hertz, 10 hertz e 20 hertz per studiare le proprietà di rilascio presinaptico. Per consentire alla biocitina di riempire il neurone, attendere almeno 15 minuti dopo aver inserito l'intera configurazione cellulare. Nel morsetto di tensione, monitorare la capacità della membrana e la resistenza di ingresso.Quindi ritirare lentamente la pipetta lungo l'angolo di attacco lontano dal soma della cellula, osservando la lenta scomparsa dei transitori di capacità e della corrente di membrana, indicando la risigillatura della membrana cellulare e la formazione di una patch esterna-esterna sulla punta della pipetta. Mettere la fetta in paraformaldeide in una piastra da 24 pozzetti e incubare durante la notte. Utilizzando il mezzo OCT, attaccare un blocco di tessuto al disco del campione di criostato.Per congelare il tessuto, posizionare l'isopentano in un contenitore appropriato e immergere il disco del campione, assicurandosi che il tessuto sia al di sopra del livello dell'isopentano. Quindi abbassare il contenitore di isopentano in azoto liquido e lasciare congelare il tessuto. Una volta che il tessuto è completamente congelato, lasciare il blocco di tessuto nella camera del criostato a meno 20 gradi Celsius per 30 minuti per consentire alla temperatura del blocco di equilibrarsi.Dopo l'equilibrio, tagliare sezioni spesse 40 micrometri nel criostato e utilizzare un pennello fine per guidare le sezioni dalla lama. Far aderire queste sezioni congelate a un vetrino da microscopio rivestito di poli-L-lisina a temperatura ambiente toccando il vetrino sulle sezioni. Dopo aver aggiunto 150 microlitri di supporto di montaggio a ciascuna diapositiva, applicare il vetrino di copertura e rimuovere eventuali bolle d'aria premendo delicatamente sul vetrino di copertura.Coprire i vetrini per proteggerli dal fotosbiancamento e lasciarli asciugare all'aria per 12 ore. Quindi, utilizzando un microscopio a fluorescenza, esaminare la posizione del sito di iniezione virale. Per la colorazione della biocitina, incubare le fette in perossido di idrogeno al 3% in PBS per 30 minuti per bloccare qualsiasi attività endogena della perossidasi.Quindi lavare le fette di cervello con PBS fino a quando non sono visibili ulteriori bolle di ossigeno. Quindi, incubare le fette per tre ore in una soluzione complessa HRP all'1% avidina-biotinilata in PBS contenente lo 0,1% di Triton X-100. Dopo sei lavaggi PBS, incubare ogni fetta in soluzione DAB fino a quando la colorazione della biocitina delle strutture neuronali diventa visibile.Interrompere la reazione trasferendo le fette in PBS freddo. Quindi montare le fette sui vetrini del microscopio di vetro usando un pennello. Dopo aver rimosso il PBS in eccesso, aggiungere il mezzo di montaggio.Coprire le fette con dei foglietti di copertura e lasciarle asciugare all'aria, come dimostrato in precedenza. Una cellula piramidale sana è stata localizzata e rattoppata. Se è richiesta l'identificazione delle cellule post-sinaptiche, una cellula che esprime il marcatore fluorescente deve essere localizzata utilizzando l'ottica a campo largo.Singoli impulsi luminosi di due millisecondi hanno portato a semplici potenziali post-sinaptici eccitatori optogenetici della forma d'onda. La plasticità a breve termine della sinapsi viene esaminata applicando treni di stimolazione luminosa a cinque, 10 e 20 hertz. Durante lo studio della plasticità a lungo termine, l'aggiunta di carbacholo agonista colinergico all'aCSF circolante per 10 minuti ha causato una depressione a lungo termine che era ancora evidente 40 minuti dopo la rimozione del ligando.La lunghezza del sito di iniezione è stata esaminata istologicamente. Il reporter fluorescente mCherry è stato localizzato negli strati più profondi della corteccia prelimbica e infralimbica. Inoltre, la colorazione di una cellula piena di biocitina ha confermato la sua posizione e morfologia.I passaggi critici di questo protocollo sono la trasduzione accurata della regione afferente del cervello, che può essere verificata post hoc, e la rapida dissezione del cervello durante la preparazione di fette acute. Questa procedura è facilmente combinata con l'etichettatura fluorescente di un singolo tipo di cellula, come una particolare sottoclasse di interneuroni. Per fare questo, useremmo un animale transgenico che esprime una ricombinasi in quel particolare tipo di cellula.I costrutti optogenetici consegnati viralmente hanno permesso rapidi progressi nei campi delle neuroscienze dei sistemi e dei circuiti.

ex-vivo-optogenetic-interrogation-long-range-synaptic-transmission

Research

Ricerca

JoVE Journal

Neuroscience

Neuroscienze

Questo video dimostra la procedura per studiare l'efficienza sinaptica nella corteccia entorinale laterale (LEC) stimolando optogeneticamente gli assoni della corteccia prefrontale mediale (mPFC) e registrando le risposte dei neuroni piramidali nella LEC. Questo metodo combina le registrazioni patch-clamp con l'attivazione sinaptica mediante stimolazione luminosa per studiare la plasticità sinaptica.

Stimolazione optogenetica e registrazione elettrofisiologica di eventi sinaptici in fette di cervello di ratto

Cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni sono essenziali per la capacità del cervello di adattarsi in risposta alle sfide comportamentali.

In Vivo a due fotoni di imaging dei cambi molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni corticali

Descriviamo un metodo per caratterizzare la topografia funzionale e le proprietà sinaptiche dei circuiti del proencefalo utilizzando un approccio optogenetico per fotostimolare popolazioni neuronali in vitro.

Laser-scanning Fotostimolazione di circuiti prosencefalo Optogenetically mirati

Questo video mostra la procedura di craniotomia che consente l'imaging cronico dei neuroni nella corteccia retrospleniale del topo utilizzando la microscopia a due fotoni in vivo nella linea transgenica Thy1-GFP. Questo approccio è combinato con l'iniezione di virus adeno-associato che esprime mCherry nell'ippocampo dorsale. Queste tecniche consentono il monitoraggio a lungo termine della plasticità strutturale dipendente dall'esperienza in RSC.

Simultanea a due fotoni<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di Synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial

approcci optogenetic sono ampiamente utilizzati per manipolare l'attività neurale e valutare le conseguenze per le funzioni cerebrali. Qui, una tecnica è descritto che dopo espressione in vivo dell'attivatore ottica channelrhodopsin, consente ex vivo analisi delle proprietà sinaptici di specifici gittata e connessioni neurali locali in circuiti paura correlati.

Ex Vivo optogenetic dissezione di circuiti paura nel cervello fette

Questo protocollo descrive una serie di metodi per identificare la connettività funzionale specifica del tipo di cellula degli input a lungo raggio provenienti da regioni cerebrali lontane utilizzando stimolazioni optogenetiche in fette cerebrali ex vivo.

In Vivo Intracerebral Stereotaxic Iniezioni per la stimolazione optogenetica degli ingressi a lungo raggio nelle fette di cervello del topo

Questo metodo descrive una preparazione cronica che consente l'accesso ottico all'ippocampo di topi viventi. Questa preparazione può essere utilizzata per eseguire l'imaging ottico longitudinale della plasticità strutturale neuronale e della plasticità cellulare evocata dall'attività per un periodo di diverse settimane.

Imaging longitudinale a due fotoni dell'ippocampo dorsale CA1 in topi vivi

L'attuale protocollo dimostra un metodo semplice per tracciare le proiezioni del glutammato dell'area tegmentale ventrale (VTA) all'ippocampo. La fotostimolazione dei neuroni del glutammato VTA è stata combinata con la registrazione CA1 per dimostrare come i terminali del glutammato VTA modulano la presunta velocità di attivazione piramidale di CA1 in vivo.

Tracciato anatomico e funzionale combinato in vivo dei terminali del glutammato dell'area tegmentale ventrale nell'ippocampo

Abbiamo sviluppato un approccio semplificato ed economico per la fabbricazione di elettrodi e condotto registrazioni di segnali su più regioni in topi che si muovono liberamente. L'utilizzo dell'optogenetica, insieme all'elettrofisiologia multiregionale e alla registrazione del segnale del calcio, ha permesso la rivelazione delle attività neuronali in tutte le regioni nel modello di accensione delle crisi.

Un metodo integrato per la creazione di optrodi elettrofisiologici flessibili e convenienti per la registrazione in vivo multi-regione

Qui, presentiamo due protocolli per la registrazione della micro-elettrocorticografia ad alta densità (μEcoG) in ratti e topi, inclusi metodi chirurgici, di impianto e di registrazione. Le registrazioni μECoG vengono eseguite in combinazione con la registrazione di politrodi laminari nella corteccia uditiva del ratto o con la manipolazione optogenetica dell'attività neurale nella corteccia somatosensoriale del topo.

Indagini multiscala sull'elaborazione corticale integrando politrodi laminari e optogenetica con la microcorticografia nei roditori

Questo protocollo descrive un metodo chirurgico a due fasi per creare una grande finestra cranica richiudibile e conservatrice della durata nei topi. Questa tecnica consente registrazioni elettrofisiologiche croniche e multimodali da reti cerebrali profonde distribuite, come la Default Mode Network, nell'arco di diverse settimane.

Protocollo chirurgico per una grande finestra cranica richiudibile che consente registrazioni elettrofisiologiche longitudinali e multimodali della rete in modalità predefinita del mouse

Esplora l'interrogazione optogenetica ex vivo della trasmissione sinaptica a lungo raggio dalla corteccia prefrontale mediale alla corteccia entorinale laterale. Questo metodo consente la caratterizzazione elettrofisiologica selettiva delle sinapsi in fette cerebrali acute di roditori.

Ex Vivo Interrogazione optogenetica della trasmissione sinaptica a lungo raggio e della plasticità dalla corteccia prefrontale mediale alla corteccia entorinale laterale (Video) | JoVE Journal

Ex Vivo Interrogazione optogenetica della trasmissione sinaptica a lungo raggio e della plasticità dalla corteccia prefrontale mediale alla corteccia entorinale laterale

Esplora altri video