Summary
Un metodo non marcato, non radio-isotopico per analizzare l'attività della glicosilasi uracil-DNA, è stato sviluppato utilizzando la spettrometria di massa MALDI-TOF per l'analisi diretta del prodotto contenente sito apurinico/aprimidinico. Il test si è rivelato abbastanza semplice, specifico, rapido e facile da usare per la misurazione della glicosilasi del DNA.
Abstract
L'uracil-DNA glicosilasi (UDG) è un componente chiave nella via di riparazione dell'escissione di base per la correzione dell'uracile formato dalla deaminazione idrolitica della citosina. Pertanto, è fondamentale per il mantenimento dell'integrità del genoma. È stato sviluppato un metodo altamente specifico, non etichettato, non radio-isotopico per misurare l'attività UDG. Un duplex di DNA sintetico contenente un uracile sito-specifico è stato scisso da UDG e quindi sottoposto all'analisi di spettrometria di massa a tempo di volo (MALDI-TOF MS) laser assistita da matrice. È stato stabilito un protocollo per preservare il prodotto del sito apurinico/aprimidinico (AP) nel DNA senza rottura del filamento. La variazione del valore m/z dal substrato al prodotto è stata utilizzata per valutare l'idrolisi dell'uracile da parte dell'UDG. Un substrato G:U è stato utilizzato per l'analisi cinetica UDG producendo Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM/s e Kcat = 9,31 s-1. L'applicazione di questo metodo a un saggio inibitore della glicosilasi dell'uracile (UGI) ha prodotto un valore IC50 di 7,6 pM. La specificità UDG che utilizza l'uracile in varie posizioni all'interno di substrati di DNA a singolo filamento e doppio filamento ha dimostrato diverse efficienze di scissione. Pertanto, questo metodo MALDI-TOF MS semplice, rapido e versatile potrebbe essere un eccellente metodo di riferimento per varie glicosilasi monofunzionali del DNA. Ha anche il potenziale come strumento per lo screening degli inibitori della glicosilasi del DNA.
Introduction
Sebbene l'uracile sia una base normale nell'RNA, è una lesione comune e altamente mutagena nel DNA genomico. L'uracile può derivare dalla deaminazione idrolitica spontanea/enzimatica di una deossicitidina. In ogni cellula vivente, questa deaminazione avviene 100-500 volte al giorno in condizioni fisiologiche1,2. Se queste alterazioni non vengono riparate, ci può essere un cambiamento nella composizione della sequenza del DNA, causando mutazioni. Poiché l'uracile nel DNA preferisce accoppiarsi con dATP durante la replicazione, se la citosina si deamina in uracile, in due eventi di replicazione, ci sarà una nuova mutazione di transizione da G:C ad A:T in metà del DNA della progenie3.
Tra le strategie cellulari per mantenere la stabilità genetica, la riparazione dell'escissione di base (BER) è un meccanismo essenziale che ripara le basi danneggiate, come l'uracile, nel DNA4. BER è un processo altamente conservato evolutivamente. Esistono due vie BER generali: la via a patch corta che porta a un tratto di riparazione di un singolo nucleotide e la via a patch lunga che produce un tratto di riparazione di almeno due nucleotidi5. BER è un meccanismo coordinato che si verifica in più passaggi. Il primo passo nel BER è l'idrolisi enzimatica della base nucleotidica danneggiata da una glicosilasi del DNA specifica per il danno per generare un sito intermedio apurinico/aprimidinico (AP)6. Questo è seguito dalla scissione della spina dorsale zucchero-fosfato nel sito AP da un'endonucleasi, pulizia delle estremità del DNA da una liasi, riempimento del gap da una DNA polimerasi e sigillatura del nick finale da una ligasi5.
Uracil-DNA glycosylase (UDG) idrolizza l'uracile dal DNA contenente uracile per BER in Escherichia coli. I saggi UDG convenzionali che utilizzano DNA radiomarcato che coinvolgono diverse tecniche di separazione6,7,8,9,10,11,12,13 sono di solito dispendiosi in termini di tempo, laboriosità, con costosi reagenti di etichettatura, procedure complicate e che richiedono una formazione e una pratica intensive per ridurre i rischi di esposizione a materiali radioattivi. I saggi oligonucleotidici fluorometrici sono stati sviluppati in sostituzione dell'etichettatura dei radioisotopi14, oltre ai beacon molecolari e alla tecnologia di trasferimento dell'energia di risonanza di Förster15,16,17,18,19,20. Tuttavia, è richiesta un'etichettatura specifica per tutti i metodi di cui sopra. Recentemente sono stati sviluppati saggi di biosensori privi di etichette21,22,23 e metodi colorimetrici basati sulla formazione di un G-quadruplex24,25,26. Tuttavia, più coppie A:U o sequenze appositamente progettate nelle sonde complicano la definizione dell'unità enzimatica.
MALDI-TOF MS è una tecnologia che potrebbe essere di grande utilità nell'analisi del DNA. Le applicazioni sviluppate includono la genotipizzazione del polimorfismo a singolo nucleotide27,28, l'analisi nucleotidica modificata29 e l'identificazione intermedia di riparazione del DNA30,31,32,33,34. MALDI-TOF MS deve essere prontamente adottato per l'analisi della glicosilasi del DNA per rilevare prodotti a DNA contenenti sito AP. Tuttavia, i siti AP nel DNA sono soggetti a rottura del filamento in molte condizioni sperimentali33. Un test UDG viene presentato qui utilizzando MALDI-TOF MS per misurare direttamente la produzione del sito AP senza un significativo rumore di strand-break. Questo metodo senza etichette è facile da usare e ha un alto potenziale per l'applicazione farmaceutica dello screening degli inibitori della glicosilasi del DNA.
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Protocol
1. Preparazione del substrato/modello
- Progettare il substrato/modello duplex di uracile con un contenuto G+C bilanciato di ~50 ± 10% e una temperatura minima di fusione di 50 °C per la regione duplex.
NOTA: Una differenza nucleotidica tra 18 substrati nt e modelli 19 nt (Tabella 1 e Figura 1) aiuta a migliorare l'interpretazione del segnale MS e la ricottura appropriata. Il filamento modello funge da DNA complementare per generare discrepanze A-U o G-U (Tabella 1), ma può anche essere utilizzato come segnale di riferimento nelle misurazioni della SM. L'uso di oligonucleotidi sintetici purificati con HPLC è soddisfacente per questo studio. - Sciogliere il DNA in 1 mM EDTA e 10 mM Tris-HCl (pH 8,0 a 25 °C) (TE) ad una concentrazione di 100 μmol/L come stock e conservare a -20 °C. Diluire questo stock da 20 μL con TE fino a un volume finale di 800 μL (diluizione 25 volte a 4 μmol/L). Misurare l'assorbanza della soluzione di DNA in uno spettrofotometro UV-visibile a λ = 260 nm per garantire la concentrazione assegnata dal produttore. Ad esempio: A260 = 0,204 per 4 μmol/L di U+9 e A260 = 0,192 per 4 μmol/L di T1 (Tabella 1).
- Eseguire l'analisi MALDI-TOF MS (sezioni 4-6) per il controllo di qualità degli oligonucleotidi ispezionando segnali di picco univoci a valori m/z designati e controllando che il rapporto segnale-rumore sia >100 (Figura 1B e Figura 1D).
2. Saggio della dna glicosilasi
- Utilizzando un substrato G:U di T1/U+9 duplex (Tabella 1 e Figura 1A) per la reazione della glicosilasi, ad esempio, in un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 mL, aggiungere 70 μL di H2O, 10 μL di tampone di reazione UDG 10x, 5 μL di stock T1 e 5 μL di stock U+9 (fase 1.2.).
NOTA: scegliere il tipo corretto di micropipetta e seguire le istruzioni del produttore per gestire il volume richiesto. Ad esempio, utilizzare una pipetta da 2 μL per erogare 0,1-2 μL di liquido, utilizzare una pipetta da 10 μL per erogare 2-10 μL di liquido e utilizzare una pipetta da 100 μL per erogare 20-100 μL di liquido per garantire accuratezza e precisione dei risultati. Il volume descritto della miscela di reagenti è per 10 saggi; regolare il volume per il numero desiderato di reazioni. Il tampone di reazione 1x UDG contiene 1 mM di EDTA, 1 mM ditiotreitolo e 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 a 25 °C). Vedere la tabella dei materiali per la fonte del buffer di reazione UDG 10x. - Chiudere saldamente il tubo; incubare a bagnomaria per 30 minuti a 65 °C, poi per 30 minuti a 37 °C e infine su ghiaccio per 3 minuti per garantire una corretta ricottura del substrato/modello duplex.
- In un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 mL, aggiungere 49 μL di tampone di reazione UDG 1x ghiacciato e 1 μL di UDG (5.000 unità/mL; vedere la Tabella dei materiali), diluendo a 0,1 unità/μL. Effettuare diluizioni seriali con 1x tampone UDG alle concentrazioni enzimatiche desiderate di 0,05, 0,02 o 0,01 unità/μL. Tenere sempre l'UDG diluito sul ghiaccio.
NOTA: In una reazione di 10 μL, 0,1 unità di UDG possono scindere più di 30 pmol di uracile da un duplex T1/U+9 in 3 min. - In un tubo microcentrifuga sterile da 1,5 mL, aggiungere 9,0 μL di miscela di substrato dal punto 2.2 e preriscaldare il tubo a 37 °C. Aggiungere 1,0 μL dell'UDG diluito dal passaggio 2.3. Utilizzare un timer per cronometrare la reazione e far scorrere il tubo per mescolare il contenuto.
NOTA: per un test di definizione unitaria, il tempo di incubazione è di 30 min. Per un test cinetico, utilizzare un'analisi del corso temporale di 0,5, 1, 2, 3, 5 minuti per ottenere la velocità iniziale. Per un test di inibizione UGI, cronometrare la reazione per 15 minuti. - Centrifugare i tubi con la miscela di reazione per 3-5 s a 3.200 × g a temperatura ambiente. Quindi, trasferire immediatamente la reazione a 37 °C.
- Terminazione della reazione
- Preparare soluzioni da 0,25 M HCl e 0,23 M Tris base. In una provetta da 15 mL, aggiungere 10 mL di una soluzione di 1 mM EDTA e 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 a 25 °C) per imitare 1x tampone di reazione UDG. Acidificare con 1 mL di 0,25 M HCl e controllare con un pHmetro per assicurarsi che il pH sia ~ 2 ± 0,5. Neutralizzare con 1 mL di base Tris da 0,23 M e verificare con un pHmetro un pH finale di 6,5 ± 0,5.
NOTA: l'utilizzo di strisce reattive per pH è un modo semplice e veloce per riconfermare i livelli di pH della miscela di reagenti. - Aggiungere 1 μL di 0,25 M HCl per acidificare la miscela di reazione da 10 μL per inattivare l'enzima e metterlo sul ghiaccio per 6 min. Aggiungere 1 μL di 0,23 M di base Tris per neutralizzare i prodotti a DNA per evitare la rottura del sito AP dovuta all'esposizione prolungata all'acido. Aggiungere 13 μL di TE per aumentare il volume della miscela di prodotti per il trasferimento di trucioli di matrice e quindi posizionarla sul ghiaccio.
NOTA: Il prodotto AP è chimicamente instabile e deve essere analizzato da MALDI-TOF MS entro 2 giorni. Dopo una conservazione prolungata per più di una settimana, l'accumulo di una parte sostanziale delle rotture dei filamenti si verifica a causa di reazioni di eliminazione β/δ dei prodotti AP (Figura 1D-G).
- Preparare soluzioni da 0,25 M HCl e 0,23 M Tris base. In una provetta da 15 mL, aggiungere 10 mL di una soluzione di 1 mM EDTA e 20 mM Tris-HCl (pH 8,0 a 25 °C) per imitare 1x tampone di reazione UDG. Acidificare con 1 mL di 0,25 M HCl e controllare con un pHmetro per assicurarsi che il pH sia ~ 2 ± 0,5. Neutralizzare con 1 mL di base Tris da 0,23 M e verificare con un pHmetro un pH finale di 6,5 ± 0,5.
- Trasferire tutti i prodotti di reazione UDG da 25 μL dai tubi microcentrifuga a una piastra di microtitolazione a 384 pozzetti.
NOTA: Alte concentrazioni di cationi, come sodio o potassio nei tamponi, generano interferenze nell'analisi MALDI-TOF MS e quindi richiedono la desalinizzazione. Poiché il tampone di reazione UDG di E. coli contiene concentrazioni molto basse di cationi, la desalinizzazione non è necessaria. Tuttavia, modificare questo protocollo per misurare altre reazioni della glicosilasi del DNA contenenti cationi metallici che richiedono la desalinizzazione come descritto in precedenza35.
3. Trasferire i prodotti di reazione UDG a un chip a matrice
- Aprire la porta del distributore di nanolitri (vedere la tabella dei materiali) e caricare la piastra di microtitolazione a 384 pozzetti dal passaggio 2.7 sul supporto della piastra del ponte.
- Inserire l'array di chip a matrice nella posizione della piastra scout corrispondente. Posizionare la piastra di esplorazione caricata sul piano di lavorazione del distributore di nanolitri e chiudere la porta.
- Toccare il pulsante di esecuzione nella schermata di trasferimento e attendere che lo strumento inizi a erogare campioni dalla piastra di microtitolazione a 384 pozzetti al chip della matrice.
- Utilizzare l'opzione della scheda Visione per visualizzare l'immagine del chip e i volumi di erogazione per ciascun punto durante l'erogazione. Assicurarsi che il volume individuato sul chip sia compreso tra 5 e 10 nL.
4. Impostare i parametri di analisi sullo spettrometro di massa
- Utilizzare il programma applicativo (vedere la Tabella dei materiali) per preparare un file di .xlsx contenente il valore m/z del segnale previsto per l'importazione.
NOTA: le impostazioni in FILE I.xlsx (Tabella 2) sono impostazioni di esempio per il saggio UDG del substrato G:U nella sezione 2. - Utilizzare il programma applicativo per creare e definire un nuovo test UDG facendo clic con il pulsante destro del mouse sull'opzione Importa gruppo di analisi nel formato designer e selezionando il file .xlsx dall'elenco a discesa (ad esempio, FILE I.xlsx dal passaggio 4.1).
- Fare clic con il pulsante destro del mouse sul pulsante Customer:Project:Plate e fare clic sulla parte superiore dell'albero delle opzioni a discesa per stabilire una nuova piastra di analisi. Nella finestra di dialogo digitare un nome di file (ad esempio, CTT20210620 per il codice di laboratorio e la data del test), quindi nel menu a discesa del tipo di piastra selezionare il tipo di piastra a 384 pozzetti e premere OK. Cerca una piastra vuota da visualizzare sulla destra dello schermo.
- Fare clic sull'opzione Analisi ; selezionare il test (ad esempio, FILE I.xlsx) dall'elenco a discesa.
- Per assegnare il test selezionato (ad esempio, FILE I.xlsx) a ciascuna posizione del punto campione sulla piastra, spostare il cursore su ciascuna posizione della piastra vuota, fare clic per evidenziare il pozzetto e fare clic con il pulsante destro del mouse per selezionare Aggiungi plex.
- Utilizzare un computer desktop o portatile per preparare un elenco di lavoro in formato .xlsx senza intestazione (ad esempio, 0620.xlsx della tabella 3) per tutti i campioni sul chip dal passaggio 2.7. Fare clic sul pulsante Aggiungi nuovo progetto di esempio ; selezionare il file (ad esempio, 0620.xlsx) dall'elenco a discesa per importare l'elenco di lavoro.
- Cerca tutti i codici campione di test nell'elenco di lavoro (ad esempio, da 0620.xlsx) a sinistra dello schermo. Fare clic sul codice di esempio nell'elenco di lavoro e fare clic con il pulsante destro del mouse sulla posizione corrispondente della piastra per collegare i test a ciascuna posizione.
5. Funzionamento dello spettrometro di massa
- Utilizzare il programma applicativo per collegare lo spettrometro di massa (vedere la Tabella dei Materiali) al chip campione (dalla sezione 3) da analizzare.
- Fare clic sull'impostazione predefinita. Nella finestra di dialogo digitare un nome di file dal passaggio 4.3 (ad esempio, CTT20210620); nel Nome dell'esperimento, digitare l'ID del chip nel codice a barre del chip e salvare le impostazioni.
- Avviare il programma di controllo dello spettrometro di massa (vedere la Tabella dei materiali).
- Premere il pulsante In/Out dello spettrometro di massa e lasciare che il deck si estenda. Estrarre il supporto del chip e inserire il chip campione dal passaggio 3.4 nel supporto del chip. Posizionare il supporto del chip caricato sul ponte esteso e premere il pulsante In/Out affinché il chip campione entri nello strumento.
- Fare doppio clic sull'icona Acquisisci del programma applicativo. Nella finestra Acquisisci , fare clic sulla scheda Esecuzione automatica per avviare lo strumento e acquisire spettri di massa dai campioni sul chip.
6. Visualizzazione degli spettri di massa e analisi dei dati
- Eseguire il programma di analisi dei dati (vedere la Tabella dei materiali).
- Sfogliare l'albero del database e selezionare l'ID del chip dal passaggio 5.2. Fare clic per evidenziare un bersaglio bene sul chip e fare clic sull'icona dello spettro per mostrare lo spettro di massa.
- Fare clic con il pulsante destro del mouse per scegliere Finestra di dialogo Personalizzazione per ritagliare un intervallo specifico di spettro in una nuova finestra. Fare clic sull'asse X per digitare i limiti superiore e inferiore di m/z e premere OK per visualizzare lo spettro di intervallo specificato, inclusi i segnali di interesse.
NOTA: La quantità di DNA è proporzionale all'intensità di picco ad ogni unità di valore m/z. - Misurare l'altezza di picco dei valori m/z dei segnali corrispondenti al substrato U, al prodotto AP e al modello. Fai clic sul picco e visualizza l'altezza del picco nell'angolo in alto a sinistra dello schermo.
NOTA: uno spettro di 1.600 larghezza/1.200 unità è una dimensione ragionevole per l'ispezione sullo schermo di un computer e per la tenuta dei registri. - Per salvare lo spettro per la registrazione, fare clic con il pulsante destro del mouse su Esporta e selezionare il tipo di file JPEG nell'elenco a discesa. Fare clic su Destinazione e Sfoglia disco per selezionare il dispositivo di archiviazione nell'elenco a discesa (ad esempio, disco flash E:). Digitare il nome del file (ad esempio, 0620_1-2.jpg) e fare clic su Esporta.
- Se necessario, stampare un file JPEG esportato e misurare manualmente l'altezza del picco utilizzando un righello.
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Representative Results
Modelli e substrati
Prendendo oligonucleotidi sintetici con U al centro (U + 9) accoppiato con un modello G come esempio (Figura 1A), un controllo vuoto di quantità equimolari di modello e substrato contenente uracile può essere utilizzato per il controllo di qualità della purezza degli oligonucleotidi sintetici (Figura 1B; i segnali corrispondono al m / z designato e al basso rumore di fondo). Per l'analisi dei dati MS, sono state misurate le altezze dei picchi (Figura 2). Ci si aspettava che il DNA modello da 19 nt rimanesse invariato dopo l'idrolisi della glicosilasi; pertanto, il segnale potrebbe servire come riferimento per la quantificazione del prodotto AP (Figura 1C).
Condizione di reazione e spettri di massa
Questo test della DNA glicosilasi è semplice e facile da eseguire utilizzando un oligonucleotide non marcato per una reazione standard per ottenere risultati puliti e affidabili (Figura 1). La gamma di spettri MS dovrebbe coprire tutti i segnali generati da substrati, modelli e prodotti di reazione (Figura 1B). La differenza di 1 nt tra il substrato e il modello corrispondente ha prodotto un profilo di segnale ben separato sia per il modello che per il substrato (Figura 1B). I primer equimolari U+9 e T1 hanno mostrato intensità di picco simili senza differenze significative. Un'ampia digestione di UDG (0,5 unità per una reazione di 30 minuti) ha dimostrato una scissione completa dell'uracile. Il segnale del prodotto AP era anche ben separato da quello del substrato contenente uracile (Figura 1C d+9 PRODOTTO AP m/z = 5447,6 contro Figura 1B U+9 substrato m/z = 5541,6). La tecnica di ionizzazione MALDI relativamente lieve36 utilizzata in questo studio ha ridotto al minimo i segnali associati alle rotture dei filamenti indotte dalla reazione di eliminazione β nei siti AP37, che non erano significativi negli spettri di massa. Nel complesso, lo sfondo della reazione è molto pulito senza rumore evidente (Figura 1C).
In condizioni equimolari, l'intensità relativa del segnale del prodotto AP era paragonabile a quella del substrato U usando il modello T1 come riferimento (Figura 1B, U + 9 / T1 contro d + 9 / T1). Pertanto, il calcolo dell'attività UDG si basa sull'input esatto del substrato contenente U (50 pmol o 20 pmol) secondo Eq (1).
Attività UDG = (segnale di prodotto AP) / (Segnale di substrato U + segnale di prodotto AP) × [U] (1)
Parametri cinetici UDG determinati dal test MALDI-TOF MS
Come mostrato nella Figura 2, durante la reazione di 3 minuti, le reazioni UDG da 0,01 unità a 0,1 unità hanno dimostrato sia la dipendenza dalla dose che dal tempo. Per la determinazione dei parametri cinetici, Km e kcat, è stata utilizzata una concentrazione di 3,2 pM (0,1 unità per reazione da 100 μL) per un substrato G:U (Tabella 1). Le aliquote della reazione UDG sono state rimosse e spente per 30 s e 60 s. I dati cinetici sono stati ottenuti in condizioni in cui il substrato contenente uracile era digerito per meno del 50% e cinque concentrazioni di substrato comprese tra 10 e 200 nM sono state sottoposte ad analisi. Il corso temporale dello stato di prestella ha mostrato un'eccellente linearità per l'analisi dei tassi. Un esempio di grafico della velocità di reazione è mostrato nella Figura 3A, dove le intensità relative del segnale MS del prodotto e del substrato vengono convertite in concentrazione (nM). La velocità di reazione UDG (v) è presentata come nM del sito AP prodotto al secondo. Il Km e il Vmax sono stati calcolati da un grafico Lineweaver-Burk (Figura 3B). I parametri cinetici UDG derivati dal test MALDI-TOF MS sono stati quindi determinati come Km = 50 nM, Vmax = 0,98 nM s-1 e Kcat = 9,31 s-1. I valori sono paragonabili ai risultati dei precedenti saggi di rilascio di 3H-uracile in cui Km = 40 nM e Kcat = 13,3 s-138.
Il duplex G:U+9 è stato sottoposto a test di sensibilità UDG. L'unità misurata dal test MALDI-TOF MS è stata tracciata rispetto all'unità definita dal produttore con un metodo convenzionale di rilascio di 3H-uracile38. Come mostrato nella Figura 3C, l'unità misurata MALDI-TOF MS era proporzionale all'unità definita da 0,001 unità a 0,02 unità con l'equazione di correlazione di y = 0,933x + 0,0003 e il coefficiente di determinazione R2 = 0,9974. Il limite di rilevamento è di 0,001 unità come coefficiente di variazione = 9,2%, ~ 5 volte il rapporto segnale-rumore. Pertanto, questo test MALDI-TOF MS fornisce una sensibilità sufficiente poiché l'UDG viene utilizzato principalmente a livello di unità39.
Specificità del substrato di UDG
Una delle caratteristiche di questo test UDG MALDI-TOF MS è che è privo di etichette, il che rende un'elevata versatilità per la progettazione del substrato. Questa funzione è molto utile per analizzare la specificità del substrato di UDG. Come dimostrato nella Tabella 1, l'uracile potrebbe essere inserito in qualsiasi punto vicino all'estremità 5' o 3' del DNA a singolo filamento o a doppio filamento per un test di specificità. Per la specificità del substrato, è ben noto che uDG è molto attivo nella rimozione dell'uracile dal DNA a singolo filamento38. Infatti, come mostrato nella Tabella 1, l'escissione dell'uracile dal substrato a singolo filamento (ssU) è diminuita di 3,7 volte quando ricotto al filamento di DNA complementare, formando G:U duplex. Per il comunemente usato A:U duplex6,7,8, la velocità di reazione è stata ulteriormente abbassata di quasi 10 volte rispetto a ssU. L'UDG non ha agito su U al termine del DNA (Substrati della Tabella 1 di G:U+1, G:U-1 e G:U-2), il che è coerente con studi precedenti40,41. È interessante notare che U alla 2a e 3a posizione dal 5'-terminus ha mostrato un tasso catalitico UDG più elevato rispetto alla U al centro rispettivamente di 2 volte e 1,5 volte (Tabella 1, G:U+2 e G:U+3 rispetto a G:U). UDG ha escluso U 3-nt dall'estremità 3'-end con l'8% in meno di attività rispetto alla U al centro (Tabella 1, G:U-3 contro G:U).
Inibitore della glicosilasi uracile inibitore della reazione UDG
L'inibitore della glicosilasi dell'uracile (UGI) è una proteina batteriofago, che inibisce E. coli UDG legandosi alle proteine reversibili con una stechiometria di 1:142. L'inibizione dell'attività UDG da parte di UGI è mostrata nella Figura 4. In presenza di 0,05 unità (100 pM) di UGI, l'attività di 0,05 unità di UDG (8 pM) è stata inibita a un livello non rilevabile. L'IC50 era di 7,6 pM. Pertanto, il test UDG MALDI-TOF MS può essere facilmente modificato in un test di screening di massa per la scoperta di inibitori di altre dna glicosilasi.
Figura 1: Sistema modello per un saggio della glicosilasi del DNA. (A) Il filamento di lesione contenente una singola uridina (U + 9) è stato ricotto a un modello (T1), formando una discrepanza G: U (grassetto). La glicosilasi uracil-DNA rileva e rimuove l'uracile, formando un sito AP (d). Quando sottoposto a MALDI-TOF MS, la differenza nei valori m/z tra DNA contenente U e prodotti AP può essere risolta come mostrato in B. (B) Un DNA di 18 nt contenente una singola uridina (U+9) ricotto a un modello di 19 nt (T1) (Tabella 1) è stato testato come enzima bianco di 50 pmol di substrato in 40 μL di tampone di reazione e sottoposto ad analisi MS. (C) Una digestione enzimatica quasi completa di 50 pmol di substrato in una reazione di 10 μL utilizzando 0,5 unità di UDG a 37 °C per 30 min. (D) Un DNA da 18 nt contenente una singola uridina (U+3) ricotto all'enzima T1 blank di substrato di 50 pmol in tampone di reazione da 40 μL è stato sottoposto all'analisi della SM. (E) Una digestione enzimatica quasi completa di 50 pmol di substrato U+3 in una reazione da 10 μL utilizzando 0,5 unità di UDG a 37 °C per 30 minuti per produrre d+3 e sottoposta ad analisi MS entro 30 h. (F) La condizione di reazione era la stessa di E tranne che il prodotto d+3 era in 0,1 M NaOH a 95 °C per 30 minuti per innescare una reazione di beta-eliminazione producendo un prodotto frammentato B15 e sottoposti ad analisi della SM. G) La condizione di reazione era la stessa di cui al punto E , tranne che il prodotto d+3 è stato conservato a -20 °C per più di 7 giorni; una frazione di d+3 convertita in prodotti frammentati B15. Questa cifra è stata modificata da 43. Abbreviazioni: nt = nucleotide; MS = spettrometria di massa; MALDI-TOF MS = Ms a desorbimento/ionizzazione laser assistita da matrice; AP = apurinico/apirimidinico; UDG = Uracil-DNA glicosilasi; T1 = 19 nt modello contenente G; U+9 = 18 nt substrato contenente U; d+9 = 18 nt AP prodotto contenente sito; U+3 = 18 nt substrato contenente U; d+3 = 18 nt PRODOTTO AP contenente sito; B15 = 15 nt prodotto frammentato ad eliminazione beta. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Analisi del corso temporale per l'attività UDG a diverse concentrazioni enzimatiche. Il DNA del substrato, 50 pmol, contenente una lesione G:U è stato incubato con 0,01, 0,02, 0,05 e 0,1 unità di UDG a 37 °C. Le aliquote (10 μL) sono state prelevate dalla miscela di reazione a 0, 0,5, 1, 2 e 3 minuti e raffreddate con un volume uguale di fenolo/cloroformio. (A) Spettri di massa MALDI-TOF che illustrano la dipendenza dalla concentrazione dei substrati G:U di lavorazione da parte di UDG. (B) La quantità di prodotto è stata tracciata in funzione del tempo. UDG: 0,01 (triangoli chiusi con linea continua), 0,02 (triangolo aperto con linea tratteggiata), 0,05 (cerchio chiuso con linea continua) e 0,1 unità (cerchi aperti con linea continua). I dati sono le medie di tre determinazioni indipendenti e le barre di errore rappresentano 1 S.D. Questa cifra è stata modificata da 43. Abbreviazioni: nt = nucleotide; MALDI-TOF = Tempo di volo di desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice; AP = apurinico/apirimidinico; UDG = Uracil-DNA glicosilasi; T = 19 nt modello contenente G; U = 18 nt substrato contenente U; AP = 18 nt AP prodotto contenente sito. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Determinazione dei parametri cinetici di UDG mediante analisi MALDI-TOF. La curva di Michaelis-Menten e lineweaver-Burk tracciano per determinare il Km e il kcat per l'escissione catalizzata dall'enzima UDG di Uracil dal DNA. Il test della DNA glicosilasi MALDI-TOF MS è stato eseguito utilizzando 0,1 unità di UDG e diverse concentrazioni (10, 30, 60, 100, 200 nM) di substrati in reazione da 100 μL per 30 s e 60 s. (A) Curva di Michaelis-Menten generata da tre esperimenti indipendenti. Le barre di errore rappresentano 1 grafico SD. (B) Lineweaver-Burk per il test; le intercettazioni indicate consentono il calcolo Km e Vmax. (C) Saggio UDG mediante analisi MALDI-TOF MS rispetto all'unità assegnata dal produttore. L'attività enzimatica è stata misurata mediante la rimozione dell'uracile formando un sito AP in una reazione di 10 μL contenente 50 pmol (0,56 μg) di G:U all'interno di un dna duplex 18/19 nt per 30 minuti a 37 °C. L'UDG è stato diluito con tampone [50% glicerolo, 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 30 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 1 mM ditiotreitolo] sul ghiaccio. Un'unità è stata definita come la quantità di enzima che catalizzava il rilascio di 60 pmol di uracile al minuto. Le barre di errore mostrano la deviazione standard di sei esperimenti. Questa cifra è stata modificata da 43. Abbreviazioni: nt = nucleotide; MALDI-TOF = Tempo di volo di desorbimento/ionizzazione laser assistito da matrice; UDG = Uracil-DNA glicosilasi; AP = apurinico/apirimidinico; V, velocità di reazione nM/s. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Curva di inibizione dell'enzima UDG mediante aggiunta di UGI. La curva di inibizione è stata determinata utilizzando reazioni di 20 μL con 0,05 unità di UDG (8 pM) e 50 pmol di substrato per 15 min in presenza di UGI da 0,001 unità (5 pM) a 0,1 unità (200 pM). I dati sono le medie di tre determinazioni indipendenti e le barre di errore rappresentano 1 S.D. I dati si adattano a un calcolatore IC50 online (vedere la tabella dei materiali). Questa cifra è stata modificata da 43. Abbreviazioni: UDG = Uracil-DNA glicosilasi; UGI = inibitore della glicosilasi uracile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Substrati del DNA | Oligonucleotidesa | Sequenza di DNAb | Tasso iniziale | k gatto | |
| (pmol/sec) | (s-1) | ||||
| ssU+9 | U+9 · | 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3' | 0,560 ± 0,098 | 35 | |
| ssU+3 | U+3 · | 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3' | 0,756 ± 0,083 | 47.3 | |
| ssU-3 · | U-3 · | 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3' | 0,448 ± 0,087 | 28 | |
| G: U | T1 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | 0,149 ± 0,046 | 9.31 | |
| U+9 · | 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3' | ||||
| A:U | T2 · | 3'-CTGGTCAGACCTGCAACCG-5' | 0,053 ± 0,018 | 3.31 | |
| U+9 · | 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3' | ||||
| G:U5'+3 | T1 | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | 0,256 ± 0,044 | 16 | |
| U+3 · | 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3' | ||||
| G:U5'+2 | T3 · | 3'-CGGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | 0,567 ± 0,016 | 35.4 | |
| U+2 · | 5'-GUCCAGTCCGGACGTTGG-3' | ||||
| G:U5'+1 | T4 · | 3'-GTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' | NDD · | ND | |
| U+1 · | 5'-UACCAGTCCGGACGTTGG-3' | ||||
| G:U3'-3 | T5 · | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAGCCG-5' | 0,138 ± 0,015 | 8.63 | |
| U-3 · | 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3' | ||||
| G:U3'-2 | T6 · | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAAGC-5' | ND | ND | |
| U-2 · | 5'-GACCAGTCCGGACGTTUG-3' | ||||
| G:U3'-1 | T7 · | 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACGG-5' | ND | ND | |
| U-1 · | 5'-GACCAGTCCGGACGTTGU-3' | ||||
Tabella 1: Composizioni del substrato e specificità UDG. Questa tabella mostra il DNA contenente U di 18 nt designato da U±N. Il '+' indica il conteggio della posizione dell'uracile dal capolinea 5' e il '-' indica il conteggio della posizione dell'uracile dal capolinea 3'. Ad esempio, U + 9 è la 9a posizione dal capolinea 5', U-3 è la terza posizione dal capolinea 3'. Il modello complementare 19 nt da T1 a T7 sarebbe accoppiato con il DNA contenente U che forma disallineamenti G: U o A: U come indicato. Le basi uracili sono in grassetto. Le reazioni hanno utilizzato 50 pmol di substrati U, 0,05 unità di UDG, in 10 μL come descritto nella sezione 2 del protocollo. Questa tabella è stata modificata da 43. Abbreviazioni: UDG = uracil DNA glicosilasi; nt = nucleotide; ND, non rilevabile.
| 2° PCRP | 1° PCRP | AMP_LEN | UP_CONF | MP_CONF | Tm | PcGC · | PWARN · | UEP_DIR | UEP_MASS | UEP_SEQ | EXT1_ CHIAMA | massa EXT1_ |
| NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | F | 5789.8 | GCCAACGTCCGGACTGGTC | |||
| NA | NA | NA | NA | NA | NA | NA | F | 5541.6 | GACCAGTCUGGACGTTGG | |||
Tabella 2: FILE I.xlsx file. Le impostazioni sono state utilizzate per la Figura 1B, C e la Figura 2A; 0 min di voci. Il sistema MALDI-TOF MS utilizzato in questo studio è stato progettato specificamente per analizzare il polimorfismo a singolo nucleotide mediante una singola estensione nucleotidica del primer esteso nella regione di variazione della sequenza genica amplificata. Per il saggio UDG, sono stati utilizzati solo sei campi durante la preparazione del gruppo di saggi FILE I. Abbreviazioni: WELL = il numero di pozzo assegnato al test; TERM = mix di terminazione; SNP_ID = nome della sequenza di input del polimorfismo a singolo nucleotide; 2nd-PCRP = primer amplicon in avanti; 1st-PCRP = primer amplicon inverso; AMP_LEN = lunghezza dell'amplicon; UP_CONF = punteggio di amplificazione uniplex; MP_CONF = punteggio di amplificazione multiplex; Tm = temperatura di fusione; PcGC = percentuale di contenuto GC; PWARN = codici di avviso per la progettazione del test; UEP_DIR = direzione dell'estensione del primer; UEP_MASS = massa del primer non esteso; UEP_SEQ = sequenza di primer non estesa; EXT1_CALL = nome dato al picco di massa dell'analita 1; EXT1_MASS = massa dell'analita 1.
| 0620_1-2 |
| 0620_1-3 |
| 0620_1-4 |
| 0620_1-5 |
| 0620_1-6 |
| 0620_1-7 |
| 0620_1-8 |
Tabella 3: 0620.xlsx file. Queste impostazioni sono state utilizzate per le reazioni di inibizione UGI nella Figura 4A. Abbreviazione: UGI = inibitore della glicosilasi dell'uracile.
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Discussion
Questo documento fornisce una procedura dettagliata per l'utilizzo di un metodo di analisi UDG MALDI-TOF MS per rilevare direttamente i prodotti a DNA contenenti AP. I principali vantaggi di questo metodo sono che i substrati contenenti uracile sono privi di etichette, scalabili, facili da lavorare e offrono una maggiore flessibilità nella progettazione del substrato.
L'estrazione di fenolo/cloroformio raccomandata dal fornitore UDG consente l'inattivazione dell'enzima per prevenire la degradazione del DNA del prodotto. Tuttavia, il protocollo di estrazione del fenolo comporta una noiosa separazione di fase di sostanze chimiche pericolose. Un metodo alternativo di terminazione acida che utilizza HCl per abbassare il pH della reazione a 2 ± 0,5 ha anche inattivato efficacemente l'UDG. La successiva neutralizzazione con la base tris potrebbe prevenire danni al DNA. Quando il prodotto AP è stato sottoposto all'analisi MS entro 30 ore, non ci sono stati segni di perdita di base o modifica degli spettri di massa (Figura 1E). Il buffer Tris nelle reazioni è stato fornito con l'UDG commerciale. Tuttavia, varie ammine, tra cui Tris, possono incidere i siti AP tramite beta-eliminazione, anche se ad alte concentrazioni di reagenti44. Alcune alternative, come HEPES e tampone fosfato, possono essere prese in considerazione per evitare il rischio di scissione del sito AP mediante beta-eliminazione.
Come potenziale metodo di riferimento UDG, un duplex di substrato G:U centrato (Tabella 1, T1/U+9) è raccomandato come substrato standard per i seguenti motivi: 1. per rilevanza fisiologica, G:U è superiore ad A:U in quanto la deaminazione della citosina nelle coppie G:C provoca lesioni G:U. 2. Mentre E. coli UDG dimostra una maggiore specificità per idrolizzare U dal DNA a singolo filamento, la riparazione di una lesione U nel DNA a singolo filamento è rara. 3. Per tutti i substrati G: U testati, G: U + 2 e G : U + 3 hanno dimostrato velocità di reazione più elevate rispetto a G: U + 9. Tuttavia, una lesione di deaminazione del DNA adiacente a una rottura del filamento è rara. Per imitare le lesioni native, sarebbe più appropriato posizionare un G: U al centro del duplex del DNA.
È interessante notare che il metodo MALDI-TOF MS ha generato parametri cinetici UDG e le unità enzimatiche della reazione G: U (Figura 3A-C) erano molto simili ai risultati derivati convenzionalmente usando 3H-uracil38. Tuttavia, il singolo substrato G:U in questo studio è molto diverso dal DNA del batteriofago PBS1 precedentemente descritto con più A:U da errori di sintesi del DNA38. Inoltre, uDG ha mostrato un'attività 3 volte superiore con G:U rispetto al substrato A:U (Tabella 1, Km e Kcat di G:U contro A:U). Questo risultato apparentemente contraddittorio può essere attribuito alla sequenza di DNA del substrato PBS1 contenente il 36% di U sotto forma di lesioni A:U multiple45 rispetto a solo il 3% di U nel G: Substrato U (Tabella 1). Nel frattempo, l'UDG è un enzima molto "processivo", cioè un singolo evento di legame proteina-DNA provoca più scissioni dell'uracile12. La scoperta di una correlazione uno-a-uno quasi perfetta tra questi due metodi UDG rende questo metodo MS un'opzione interessante invece del tradizionale test dei radioisotopi.
Questo approccio è facilmente scalabile. Tutte le reazioni UDG in questo studio sono state eseguite manualmente utilizzando micropipette e tubi microcentrifuga, con ~ 30 test eseguiti in un dato giorno. Pertanto, è stata utilizzata meno di un decimo della capacità dell'array di chip in formato piastra a 384 pozzetti per il sistema MALDI-TOF MS (vedere la tabella dei materiali) descritta nelle sezioni 3-5. Al contrario, l'adattamento di un sistema di pipettaggio automatizzato per una micropiastra a 384 pozzetti potrebbe facilmente aumentare la produzione giornaliera di questo approccio utilizzando il metodo di terminazione acida. Pertanto, 300 reazioni UDG richiederebbero ~ 1 ora. Il sistema MALDI-TOF MS (vedi la Tabella dei materiali) potrebbe produrre dati di spettri di massa per un massimo di 300 reazioni in 1 ora. Pertanto, un processo semplificato richiederebbe 2 ore per completare 300 test UDG MALDI-TOF MS.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da divulgare.
Acknowledgments
Ringraziamo l'NCFPB Integrated Core Facility for Functional Genomics (Taipei, Taiwan) e l'NRPB Pharmacogenomics Lab (Taipei, Taiwan) per il loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero della Scienza e della Tecnologia, Taiwan, R.O.C. [numero di sovvenzione MOST109-2314-B-002 -186 a K.-Y.S., MOST 107-2320-B-002-016-MY3 a S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 a W.-h.F.]. H.-L.C. ha ricevuto una borsa di dottorato dalla National Taiwan University. Finanziamento per la tassa di accesso aperto: Ministero della Scienza e della Tecnologia, R.O.C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) | J.T baker | Protocol 1,2 | |
| Autoclaved deionized water | MILLIPORE | Protocol 1,2 | |
| EDTA | J.T Baker | Protocol 1,2 | |
| Gloves | AQUAGLOVE | Protocol 1,2,3 | |
| Hydrochloric acid (HCl) | SIGMA | Protocol 1,2 | |
| Ice bucket | Taiwan.Inc | Protocol 2 | |
| Low retention pipette tips(0.5-10 µL) | extra gene | Protocol 1,2 | |
| Low retention pipette tips(1,250 µL) | national scientific supply co, Inc. | Protocol 1,2 | |
| Low retention pipette tips(200 µL) | national scientific supply co, Inc. | Protocol 1,2 | |
| MassARRAY | Agena Bioscience, CA | Protocol 4, 5 Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process. |
|
| MassARRAY Nanodispenser | AAT Bioquest, Inc. | RS1000 | Protocol 3 |
| Microcentrifuge | Kubota | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge | Clubio | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge tube (1.5 mL) | National scientific supply co, Inc. | Protocol 2 | |
| Microcentrifuge tube rack | Taiwan.Inc | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P1000) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P2) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P10) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P100) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (P200) | Gilson | Protocol 1,2 | |
| Micropipette (SL2) | Rainin | Protocol 1,2 | |
| Oligonucleotides | Integrated DNA Technologies (Singapore) | Protocol 1,2 | |
| Quest Graph IC50 Calculator (v.1) | AAT Bioquest, Inc. | Fig. 4 https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1 |
|
| Sodium hydroxide (NaOH) | WAKO | Protocol 2 | |
| SpectroCHIP array | Agena Bioscience, CA | #01509 | Protocol 3, 5 |
| Timer | Taiwan.Inc | Protocol 2 | |
| Typer 4.0 software | Agena Bioscience, CA | #10145 | Protocol 6 Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer. |
| UDG Reaction Buffer (10x) | New England Biolabs, MA | B0280S | Protocol 2 |
| Uracil Glycosylase Inhibitor | New England Biolabs, MA | M0281S | Protocol 2 |
| Uracil-DNA Glycosylase | New England Biolabs, MA | M0280L | Protocol 2 |
| UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 | SHIMADZU | Protocol 1 | |
| Water bath | ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) | Protocol 2 |
References
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