Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Matris Yardımlı Lazer Desorpsiyonu/İyonizasyon ile Urasil-DNA Glikozilaz Testi Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Analizi

Published: April 22, 2022 doi: 10.3791/63089
Automatic Translation
*1, *1,2, 3, 2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2
1Department of Clinical Laboratory Sciences and Medical Biotechnology, College of Medicine, National Taiwan University, 2Department of Laboratory Medicine, National Taiwan University Hospital, 3Center for Microbial Pathogenesis, Nationwide Children’s Hospital and the Department of Pediatrics, The Ohio State University
* These authors contributed equally

Summary

Urasil-DNA glikozilaz aktivitesini test etmek için etiketlenmemiş, radyo-izotopik olmayan bir yöntem, doğrudan apurinik / apirimidinik alan içeren ürün analizi için MALDI-TOF kütle spektrometresi kullanılarak geliştirilmiştir. Tahlil, DNA glikozilaz ölçümü için oldukça basit, spesifik, hızlı ve kullanımı kolay olduğunu kanıtladı.

Abstract

Urasil-DNA glikozilaz (UDG), sitozinin hidrolitik deaminasyonundan oluşan urasilin düzeltilmesi için baz eksizyon onarım yolunda önemli bir bileşendir. Bu nedenle, genom bütünlüğünün korunması için çok önemlidir. UDG aktivitesini ölçmek için oldukça spesifik, etiketsiz, radyo-izotopik olmayan bir yöntem geliştirilmiştir. Bölgeye özgü bir urasil içeren sentetik bir DNA dubleks, UDG tarafından bölündü ve daha sonra Matris destekli Lazer Desorpsiyon / İyonizasyon uçuş süresi kütle spektrometrisi (MALDI-TOF MS) analizine tabi tutuldu. DNA'daki apurinik / apirimidinik bölge (AP) ürününü iplik kopmadan korumak için bir protokol oluşturuldu. Substrattan ürüne m/z değerindeki değişim, urasil hidrolizini UDG ile değerlendirmek için kullanıldı. UDG kinetik analizi için Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM / s ve Kcat = 9.31 s-1 veren bir G: U substratı kullanıldı. Bu yöntemin urasil glikozilaz inhibitörü (UGI) testine uygulanması, 7.6 pM'lik bir IC50 değeri vermiştir. Tek sarmallı ve çift sarmallı DNA substratları içinde çeşitli pozisyonlarda urasil kullanan UDG özgüllüğü, farklı bölünme verimlilikleri göstermiştir. Bu nedenle, bu basit, hızlı ve çok yönlü MALDI-TOF MS yöntemi, çeşitli monofonksiyonel DNA glikozilazları için mükemmel bir referans yöntemi olabilir. Aynı zamanda DNA glikozilaz inhibitörü taraması için bir araç olarak potansiyele sahiptir.

Introduction

Urasil RNA'da normal bir baz olmasına rağmen, genomik DNA'da sık görülen ve oldukça mutajenik bir lezyondur. Urasil, bir deoksisitidinin spontan/enzimatik hidrolitik deaminasyonundan kaynaklanabilir. Her canlı hücrede, bu deaminasyon fizyolojik koşullar altında günde 100-500 kez gerçekleşir1,2. Bu değişiklikler onarılmazsa, DNA dizisi bileşiminde mutasyona neden olan bir değişiklik olabilir. DNA'daki urasil, replikasyon sırasında dATP ile eşleşmeyi tercih ettiğinden, sitozin urasil'e deaminasyon yaparsa, iki replikasyon olayında, döl DNA3'ün yarısında yeni bir G: C'den A: T'ye geçiş mutasyonu olacaktır.

Genetik stabiliteyi korumak için hücresel stratejiler arasında, baz eksizyon onarımı (BER), DNA4'teki urasil gibi hasarlı bazları onaran önemli bir mekanizmadır. BER, evrimsel olarak oldukça korunmuş bir süreçtir. İki genel BER yolu vardır: tek bir nükleotidin onarım yoluna giden kısa yama yolu ve en az iki nükleotidin onarım yolunu üreten uzun yama yolu5. BER, birkaç adımda gerçekleşen koordineli bir mekanizmadır. BER'deki ilk adım, hasarlı nükleotid bazının hasara özgü bir DNA glikozilaz tarafından enzimatik hidrolizidir ve bir apurinik / apirimididinik (AP) ara bölge oluşturur6. Bunu, AP bölgesindeki şeker-fosfat omurgasının bir endonükleaz tarafından bölünmesi, DNA uçlarının bir liyaz ile temizlenmesi, bir DNA polimeraz ile boşluk doldurulması ve son nickin bir ligaz ile kapatılması izler5.

Urasil-DNA glikozilaz (UDG), urasili Escherichia coli'deki BER için urasil içeren DNA'dan hidrolize eder. Farklı ayırma tekniklerini içeren radyo-etiketli DNA kullanan geleneksel UDG testleri6,7,8,9,10,11,12,13 genellikle zaman alıcı, emek yoğun, maliyetli etiketleme reaktifleri, karmaşık prosedürler ve radyoaktif maddelere maruz kalma risklerini azaltmak için yoğun eğitim ve uygulama gerektirir. Florometrik oligonükleotid testleri, moleküler işaretçilere ve Förster rezonans enerji transfer teknolojisine15,16,17,18,19,20 ek olarak radyoizotop etiketlemesinin14 yerine geliştirilmiştir. Bununla birlikte, yukarıda belirtilen tüm yöntemler için özel etiketleme gereklidir. Son zamanlarda etiketsiz biyosensör tahlilleri21,22,23 ve G-dörtlüx24,25,26 oluşumuna dayanan kolorimetrik yöntemler geliştirilmiştir. Bununla birlikte, problardaki çoklu A: U çiftleri veya özel olarak tasarlanmış diziler, enzim birimi tanımını zorlaştırır.

MALDI-TOF MS, DNA ANALIZINDE ÇOK FAYDALı OLABILECEK BIR TEKNOLOJIDIR. Geliştirilen uygulamalar arasında tek nükleotid polimorfizmi genotipleme27,28, modifiye nükleotid analizi29 ve DNA onarımı ara tanımlama30,31,32,33,34 bulunmaktadır. MALDI-TOF MS, AP bölgesi içeren DNA ürünlerini tespit etmek için DNA glikozilaz analizi için kolayca benimsenmelidir. Bununla birlikte, DNA'daki AP bölgeleri birçok deneysel koşulda iplikçik kopmasına eğilimlidir33. Burada, önemli bir iplik kopma gürültüsü olmadan AP saha üretimini doğrudan ölçmek için MALDI-TOF MS kullanılarak bir UDG testi sunulmaktadır. Bu etiketsiz yöntemle çalışmak kolaydır ve DNA glikozilaz inhibitörü taramasının farmasötik uygulaması için yüksek bir potansiyele sahiptir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Substrat/şablon hazırlama

  1. Dubleks bölge için ~50 ± %10 dengeli G + C içeriğine ve minimum 50 °C erime sıcaklığına sahip urasil substrat/şablon dubleks tasarlayın.
    NOT: 18 nt substratlar ve 19 nt şablonları arasındaki bir nükleotid farkı (Tablo 1 ve Şekil 1) daha iyi MS sinyali yorumlamasına ve uygun tavlamaya yardımcı olur. Şablon iplikçik, A-U veya G-U uyumsuzlukları üretmek için tamamlayıcı DNA görevi görür (Tablo 1), ancak MS ölçümlerinde referans sinyali olarak da kullanılabilir. HPLC saflaştırılmış sentetik oligonükleotidlerin kullanımı bu çalışma için tatmin edicidir.
  2. DNA'yı 1 mM EDTA ve 10 mM Tris-HCl'de (25 °C'de pH 8.0) (TE) 100 μmol / L konsantrasyonunda bir stok olarak çözün ve -20 °C'de saklayın. Bu 20 μL stoğu TE ile 800 μL'lik son bir hacme kadar seyreltin (4 μmol / L'ye 25 kat seyreltme). Üreticinin atanan konsantrasyonunu sağlamak için DNA çözeltisinin UV'yi görünür bir spektrofotometrede λ = 260 nm'de absorbansını ölçün. Örneğin: 4 μmol/L U+9 için A260 = 0,204 ve 4 μmol/L T1 için A260 = 0,192 (Tablo 1).
  3. Oligonükleotid kalite kontrolü için MALDI-TOF MS analizi (bölüm 4-6), belirlenmiş m/z değerlerinde benzersiz tepe sinyallerini inceleyerek ve sinyal-gürültü oranının >100 olduğunu kontrol ederek gerçekleştirin (Şekil 1B ve Şekil 1D).

2. DNA glikozilaz testi

  1. Glikozilaz reaksiyonu için T1/U+9 dubleks G:U substratı (Tablo 1 ve Şekil 1A) kullanarak, örneğin 1,5 mL steril mikrosantrifüj tüpünde, 70 μL H2O, 10 μL 10x UDG reaksiyon tamponu, 5 μL T1 stoğu ve 5 μL U+9 stoğu (adım 1.2) ekleyin.
    NOT: Doğru mikropipet tipini seçin ve gerekli hacmi işlemek için üreticilerin talimatlarını izleyin. Örneğin, 0,1-2 μL sıvı dağıtmak için 2 μL'lik bir pipet kullanın, 2-10 μL sıvı dağıtmak için 10 μL'lik bir pipet kullanın ve sonuçların doğruluğunu ve hassasiyetini sağlamak amacıyla 20-100 μL sıvı dağıtmak için 100 μL'lik bir pipet kullanın. Reaktif karışımının tarif edilen hacmi 10 tahlil içindir; istenen reaksiyon sayısı için ses seviyesini ayarlayın. 1x UDG reaksiyon tamponu 1 mM EDTA, 1 mM ditiyotreitol ve 20 mM Tris-HCl (25 °C'de pH 8,0) içerir. 10x UDG reaksiyon tamponunun kaynağı için Malzeme Tablosuna bakın.
  2. Tüpü güvenli bir şekilde kapatın; 65 ° C'de 30 dakika boyunca bir su banyosunda, daha sonra 37 ° C'de 30 dakika boyunca ve son olarak substrat / şablon dubleksin uygun şekilde tavlanmasını sağlamak için 3 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
  3. 1,5 mL'lik steril bir mikrosantrifüj tüpüne, 49 μL buz gibi soğuk 1x UDG reaksiyon tamponu ve 1 μL UDG (5.000 birim / mL; Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin, 0,1 birim / μL'ye seyreltin.
    NOT: 10 μL'lik bir reaksiyonda, 0,1 birim UDG, 3 dakika içinde bir T1/U+9 dubleksten 30 pmol'den fazla urasil parçalayabilir.
  4. 1,5 mL'lik steril bir mikrosantrifüj tüpünde, adım 2,2'den itibaren 9,0 μL substrat karışımı ekleyin ve tüpü 37 ° C'ye ısıtın. Adım 2.3'ten seyreltilmiş UDG'nin 1.0 μL'sini ekleyin. Reaksiyonu zamanlamak için bir zamanlayıcı kullanın ve içeriği karıştırmak için tüpe hafifçe vurun.
    NOT: Birim tanım testi için kuluçka süresi 30 dakikadır. Kinetik bir analiz için, başlangıç oranını elde etmek için 0.5, 1, 2, 3, 5 dakikalık bir zaman kursu analizi kullanın. Bir UGI inhibisyon testi için, reaksiyonu 15 dakika boyunca zamanlayın.
  5. Tüpleri, ortam sıcaklığında 3.200 × g'da 3-5 s reaksiyon karışımı ile santrifüj edin. Ardından, reaksiyonu hemen 37 ° C'ye aktarın.
  6. Reaksiyon sonlandırma
    1. 0,25 M HCl ve 0,23 M Tris tabanlı çözeltiler hazırlayın. 15 mL'lik bir test tüpünde, 1x UDG reaksiyon tamponunu taklit etmek için 10 mL'lik bir 1 mM EDTA ve 20 mM Tris-HCl (25 °C'de pH 8.0) çözeltisi ekleyin. 1 mL 0,25 M HCl ile asitleştirin ve pH'ın ~2 ± 0,5 olduğundan emin olmak için bir pH metre ile kontrol edin. 1 mL 0,23 M Tris baz ile nötralize edin ve 6,5 ± 0,5 nihai pH için bir pH metre ile kontrol edin.
      NOT: pH test şeritlerinin kullanılması, reaktif karışımının pH seviyelerini yeniden doğrulamanın hızlı ve kolay bir yoludur.
    2. Enzimi inaktive etmek üzere 10 μL reaksiyon karışımını asitleştirmek için 1 μL 0.25 M HCl ekleyin ve 6 dakika boyunca buz üzerine yerleştirin. Aside uzun süre maruz kalarak AP bölgesinin kırılmasını önlemek için DNA ürünlerini nötralize etmek için 1 μL 0.23 M Tris baz ekleyin. Matris talaş transferi için ürün karışımının hacmini artırmak üzere 13 μL TE ekleyin ve ardından buz üzerine yerleştirin.
      NOT: AP ürünü kimyasal olarak kararsızdır ve 2 gün içinde MALDI-TOF MS tarafından analiz edilmelidir. Bir haftadan uzun süre saklandıktan sonra, iplik kopmalarının önemli bir kısmının birikmesi, AP ürünlerinin β / δ eliminasyon reaksiyonları nedeniyle meydana gelir (Şekil 1D-G).
  7. Tüm 25 μL UDG reaksiyon ürünlerini mikrosantrifüj tüplerinden 384 delikli bir mikrotitre plakasına aktarın.
    NOT: Tamponlardaki sodyum veya potasyum gibi yüksek konsantrasyonlardaki katyonlar, MALDI-TOF MS analizinde parazit oluşturur ve bu nedenle tuzdan arındırma gerektirir. E. coli UDG reaksiyon tamponu çok düşük konsantrasyonlarda katyon içerdiğinden, tuzdan arındırma gerekli değildir. Bununla birlikte, daha önce açıklandığı gibi tuzdan arındırma gerektiren metal katyonları içeren diğer DNA glikozilaz reaksiyonlarını ölçmek için bu protokolü değiştirin35.

3. UDG reaksiyon ürünlerini bir matris çipine aktarın

  1. Nanolitre dağıtıcının kapısını açın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve 384 delikli mikrotiter plakasını adım 2.7'den güvertenin plaka tutucusuna yükleyin.
  2. Matris çip dizisini ilgili keşif plakası konumuna yerleştirin. Yüklü izci plakasını nanolitre dağıtıcının işleme güvertesine yerleştirin ve kapıyı kapatın.
  3. Aktarım ekranındaki çalıştır düğmesine dokunun ve cihazın 384 delikli mikrotitre plakasından matris çipine numune dağıtmaya başlamasını bekleyin.
  4. Dağıtım sırasında her bir nokta için çipin görüntüsünü ve dağıtım hacimlerini göstermek için Görüntü sekmesi seçeneğini kullanın. Çip üzerindeki lekeli hacmin 5-10 nL aralığında olduğundan emin olun.

4. Kütle spektrometresi üzerindeki tahlil parametrelerini ayarlayın

  1. İçe aktarma için tahmin edilen sinyal m/z değerini içeren bir .xlsx dosyası hazırlamak için uygulama programını kullanın ( Malzeme Tablosuna bakın).
    NOT: DOSYA I.xlsx (Tablo 2) içindeki ayarlar, bölüm 2'deki G:U alt tabakasının UDG tahlili için örnek ayarlardır.
  2. Tasarımcı Biçiminde Tahlil Grubu İçe Aktar seçeneğini sağ tıklatıp açılır listeden .xlsx dosyasını seçerek (örneğin, adım 4.1'den DOSYA I.xlsx) yeni bir UDG testi oluşturmak ve tanımlamak için uygulama programını kullanın.
  3. Müşteri:Proje:Plaka düğmesine sağ tıklayın ve yeni bir tahlil plakası oluşturmak için açılır seçenek ağacının üst kısmına tıklayın. İletişim kutusuna bir dosya adı yazın (örneğin, laboratuvar kodu ve tahlil tarihi için CTT20210620) ve plaka türü açılır menüsünde 384 delikli plaka türünü seçin ve Tamam düğmesine basın. Ekranın sağında boş bir plaka olup olmadığına bakın.
  4. Tıkla Tahlil seçeneği; açılır listeden tahlili seçin (örneğin, DOSYA I.xlsx).
  5. Seçilen tahlili (örneğin, DOSYA I.xlsx) plaka üzerindeki her örnek nokta konumuna atamak için, imleci boş plakanın her bir konumuna getirin, kuyuyu vurgulamak için tıklayın ve Plex Ekle'yi seçmek için sağ tıklayın.
  6. Adım 2.7'den itibaren çip üzerindeki tüm örnekler için üstbilgi içermeyen .xlsx biçiminde (örneğin, Tablo 3'ün 0620.xlsx) bir çalışma listesi hazırlamak için bir masaüstü veya dizüstü bilgisayar kullanın. Yeni Örnek Proje Ekle düğmesini tıklatın; çalışma listesini içe aktarmak için açılır listeden dosyayı seçin (örneğin, 0620.xlsx).
  7. Ekranın solundaki çalışma listesinde (örneğin, 0620.xlsx) tüm test numune kodlarını arayın. Çalışma listesindeki örnek kodu tıklatın ve testleri her bir konuma bağlamak için plakanın karşılık gelen konumuna sağ tıklayın.

5. Kütle spektrometresi çalışması

  1. Kütle spektrometresini ( Malzeme Tablosuna bakınız) analiz edilecek numune çipine (bölüm 3'ten) bağlamak için uygulama programını kullanın.
  2. Varsayılan ayara tıklayın. İletişim kutusunda, adım 4.3'ten bir dosya adı yazın (örneğin, CTT20210620); Deneme Adı'nda, Çip Barkodu'na çip kimliğini yazın ve ayarları kaydedin.
  3. Kütle spektrometresi kontrol programını başlatın ( Malzeme Tablosuna bakınız).
  4. Kütle spektrometresinin Giriş/Çıkış düğmesine basın ve güvertenin uzamasına izin verin. Talaş tutucuyu çıkarın ve numune çipini adım 3.4'ten talaş tutucuya yerleştirin. Yüklenen çip tutucuyu genişletilmiş güverteye yerleştirin ve numune çipinin cihaza girmesi için Giriş/Çıkış düğmesine basın.
  5. Uygulama programının Acquire simgesini çift tıklatın. Al penceresinde, cihazı başlatmak ve çip üzerindeki örneklerden kütle spektrumları elde etmek için otomatik çalıştırma sekmesine tıklayın.

6. Kütle spektrumlarını görüntüleme ve verileri analiz etme

  1. Veri analizi programını çalıştırın (bkz. Malzeme Tablosu).
  2. Veritabanı ağacına göz atın ve adım 5.2'den çip kimliğini seçin. Çip üzerinde iyi bir hedefi vurgulamak için tıklayın ve kütle spektrumunu göstermek için spektrum simgesine tıklayın.
  3. Yeni bir pencerede belirli bir spektrum aralığını kırpmak üzere Özelleştirme İletişim Kutusu'nu seçmek için sağ tıklayın. m / z'nin üst ve alt sınırlarını yazmak için X Ekseni'ne tıklayın ve ilgilenilen sinyaller de dahil olmak üzere belirtilen aralık spektrumunu göstermek için Tamam'a basın.
    NOT: DNA miktarı, her m/z değer birimindeki tepe yoğunluğu ile orantılıdır.
  4. Sinyallerin U substratı, AP ürünü ve şablona karşılık gelen m/z değerlerinin tepe yüksekliğini ölçün. Zirveye tıklayın ve ekranın sol üst köşesindeki tepe yüksekliğini görüntüleyin.
    NOT: 1.600 genişlik/1.200 birimlik bir spektrum, bilgisayar ekranında inceleme ve kayıt tutma için makul bir boyuttur.
  5. Kayıt tutma spektrumunu kaydetmek için, Dışa Aktar'ı sağ tıklatın ve açılır listeden JPEG dosya türünü seçin. Açılır listeden depolama aygıtını seçmek için Hedef ve Diske Gözat'a tıklayın (örneğin, flash disk E:). Dosya adını yazın (örneğin, 0620_1-2.jpg) ve Ver'i tıklatın.
  6. Gerekirse, dışa aktarılan bir JPEG dosyasını yazdırın ve bir cetvel kullanarak tepe yüksekliğini manuel olarak ölçün.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şablonlar ve alt tabakalar
Örnek olarak bir G şablonu ile eşleştirilmiş merkezde U ile sentetik oligonükleotidler (U + 9) alındığında (Şekil 1A), sentetik oligonükleotid saflığının kalite kontrolü için eşdeğer miktarda şablon ve urasil içeren substratın boş bir kontrolü kullanılabilir (Şekil 1B; sinyaller belirlenen m / z ve düşük arka plan gürültüsü ile eşleşir). MS veri analizi için tepe yükseklikleri ölçüldü (Şekil 2). 19 nt şablon DNA'sının glikozilaz hidrolizinden sonra değişmeden kalması bekleniyordu; bu nedenle, sinyal AP ürününün niceliği için bir referans görevi görebilir (Şekil 1C).

Reaksiyon durumu ve kütle spektrumları
Bu DNA glikozilaz testi, temiz ve güvenilir sonuçlar elde etmek için standart bir reaksiyon için etiketsiz bir oligonükleotid kullanılarak basit ve kolaydır (Şekil 1). MS spektrumlarının aralığı, substratlardan, şablonlardan ve reaksiyon ürünlerinden üretilen tüm sinyalleri kapsamalıdır (Şekil 1B). Substrat ve karşılık gelen şablon arasındaki 1 nt farkı, hem şablon hem de substrat için iyi ayrılmış bir sinyal profili üretti (Şekil 1B). Ekinolar primerler U + 9 ve T1, önemli farklılıklar olmaksızın benzer tepe yoğunlukları gösterdi. UDG'nin kapsamlı sindirimi (30 dakikalık bir reaksiyon için 0.5 ünite) tam urasil bölünmesi gösterdi. AP ürününün sinyali de urasil içeren substratınkinden iyi bir şekilde ayrılmıştı (Şekil 1C d+9 AP-ürünü m/z = 5447.6 ile Şekil 1B U+9 substrat m/z = 5541.6). Bu çalışmada kullanılan nispeten hafif MALDI iyonizasyon tekniği36 , kütle spektrumlarında anlamlı olmayan AP bölgelerinde37 β-eliminasyon reaksiyonunun neden olduğu iplik kırılmalarıyla ilişkili sinyalleri en aza indirmiştir. Genel olarak, reaksiyon arka planı gözle görülür bir gürültü olmadan çok temizdir (Şekil 1C).

Eşmolar koşullar altında, AP-ürününün nispi sinyal yoğunluğu, T1 şablonunu referans olarak kullanan U-substratınınkiyle karşılaştırılabilirdi (Şekil 1B, U+9/T1'e karşı d+9/T1). Bu nedenle, UDG aktivitesinin hesaplanması, Eq'ya (1) göre U içeren substratın (50 pmol veya 20 pmol) tam girişine dayanmaktadır.

UDG aktivitesi = (AP-ürününün sinyali) / (U substratının sinyali + AP-ürününün sinyali) × [U] (1)

MALDI-TOF MS testi ile belirlenen UDG kinetik parametreleri
Şekil 2'de gösterildiği gibi, 3 dakikalık reaksiyon boyunca, 0.01 üniteden 0.1 üniteye kadar UDG reaksiyonları hem doz hem de zaman bağımlılığını göstermiştir. Bir G:U substratı için kinetik parametrelerin, Km ve kcat'ın belirlenmesi için 3.2 pM'lik bir konsantrasyon (100 μL reaksiyon başına 0.1 birim) kullanılmıştır (Tablo 1). UDG reaksiyonunun alikotları çıkarıldı ve 30 s ve 60 s için söndürüldü. Kinetik veriler, urasil içeren substratın% 50'den az sindirildiği koşullar altında elde edildi ve 10 ila 200 nM arasında değişen beş substrat konsantrasyonu analize tabi tutuldu. Presteady-state zaman seyri, oran analizi için mükemmel doğrusallık gösterdi. Bir reaksiyon hızı grafiği örneği, ürünün ve substratın göreceli MS sinyal yoğunluklarının konsantrasyona (nM) dönüştürüldüğü Şekil 3A'da gösterilmiştir. UDG reaksiyon hızı (v), saniyede üretilen AP bölgesinin nM'si olarak sunulur. Km ve Vmax bir Lineweaver-Burk grafiğinden hesaplanmıştır (Şekil 3B). MALDI-TOF MS testinden türetilen UDG kinetik parametreleri böylece Km = 50 nM, Vmax = 0.98 nM s-1 ve Kcat = 9.31 s-1 olarak belirlenmiştir. Değerler, Km = 40 nM ve Kcat = 13.3 s-138'in bulunduğu önceki 3H-urasil serbest bırakma tahlillerinin sonuçlarıyla karşılaştırılabilir. 

G:U+9 dubleks UDG duyarlılık testlerine tabi tutuldu. MALDI-TOF MS testi ile ölçülen birim, üreticinin tanımladığı birime karşı, geleneksel bir 3H-urasil salınım yöntemiyle38 çizilmiştir. Şekil 3C'de gösterildiği gibi, MALDI-TOF MS-ölçülen birim, y = 0.933x + 0.0003 korelasyon denklemi ve R2 = 0.9974 belirleme katsayısı ile 0.001 birimden 0.02 birime kadar tanımlanan birimle orantılıydı. Algılama sınırı 0,001 birimdir, çünkü varyasyon katsayısı =% 9,2, sinyal-gürültü oranının ~ 5 katıdır. Bu nedenle, bu MALDI-TOF MS testi, UDG çoğunlukla birim düzeyinde39 kullanıldığından yeterli hassasiyet sağlar.

UDG'nin substrat özgüllüğü
Bu UDG MALDI-TOF MS testinin karakteristik özelliklerinden biri, substrat tasarımı için yüksek çok yönlülük sağlayan etiketsiz olmasıdır. Bu özellik, UDG'nin substrat özgüllüğünü analiz etmek için çok kullanışlıdır. Tablo 1'de gösterildiği gibi, urasil, özgüllük testi için tek sarmallı veya çift sarmallı DNA'nın 5' veya 3' ucuna yakın herhangi bir yere yerleştirilebilir. Substrat özgüllüğü için, UDG'nin urasilin tek sarmallı DNA38'den çıkarılmasında oldukça aktif olduğu iyi bilinmektedir. Gerçekten de, Tablo 1'de gösterildiği gibi, tek sarmallı substrattan (ssU) urasil eksizyonu, tamamlayıcı DNA ipliğine tavlandığında 3.7 kat azalmış ve G: U dubleksini oluşturmuştur. Yaygın olarak kullanılan A: U dubleks6,7,8 için, reaksiyon hızı ssU'ya göre yaklaşık 10 kat daha düşürüldü. UDG, DNA terminüsünde (G: U + 1, G: U-1 ve G: U-2'nin Tablo 1 substratları) U üzerinde hareket etmedi, bu da önceki çalışmalarla tutarlıdır40,41. İlginçtir ki, 5'-terminustan 2. ve 3. pozisyonlardaki U, merkezdeki U'dan sırasıyla 2 kat ve 1.5 kat daha yüksek bir UDG katalitik oranı sergilemiştir (Tablo 1, G: U + 2 ve G: U + 3'e karşı G: U). UDG, merkezdeki U'dan% 8 daha az aktivite ile 3'-uçtan U 3-nt'yi çıkardı (Tablo 1, G:U-3 ve G:U).

Urasil glikozilaz inhibitörü UDG reaksiyonunun inhibisyonu
Urasil glikozilaz inhibitörü (UGI), E. coli UDG'yi 1:142'lik bir stokiyometri ile geri dönüşümlü protein bağlanmasıyla inhibe eden bir bakteriyofaj proteinidir. UDG aktivitesinin UGI tarafından inhibisyonu Şekil 4'te gösterilmiştir. 0.05 birim (100 pM) UGI varlığında, 0.05 birim UDG'nin (8 pM) aktivitesi tespit edilemeyen bir seviyeye inhibe edildi. IC50 19.6 idi. Böylece, UDG MALDI-TOF MS testi, diğer DNA glikozilazlarının inhibitörlerinin keşfi için bir kitle tarama testine kolayca değiştirilebilir.

Figure 1
Şekil 1: DNA glikozilaz testi için model sistem. (A) Tek bir idrar (U + 9) içeren lezyon ipliği, bir şablona (T1) tavlanarak bir G: U uyumsuzluğu (kalın) oluşturdu. Urasil-DNA glikozilaz urasili tespit eder ve uzaklaştırarak bir AP bölgesi oluşturur (d). MALDI-TOF MS'ye maruz kalındığında, U içeren DNA ve AP ürünleri arasındaki m/z değerlerindeki fark, B'de gösterildiği gibi çözülebilir. (B) 19 nt'lik bir şablona (T1) (Tablo 1) tavlanmış tek bir idrar (U+9) içeren 18 nt'lik bir DNA, 40 μL reaksiyon tamponunda 50 pmol substrattan oluşan bir enzim boşluğu olarak test edilmiş ve MS analizine tabi tutulmuştur. (C) 30 dakika boyunca 37 °C'de 0.5 birim UDG kullanılarak 10 μL'lik bir reaksiyonda 50 pmol substratın neredeyse tamamlanmış bir enzim sindirimi. (D) 40 μL reaksiyon tamponunda 50 pmol substratın boş T1 enzimine tavlanmış tek bir idrar (U + 3) içeren 18 nt'lik bir DNA, MS analizine tabi tutuldu. (E) D+3 üretmek için 30 dakika boyunca 37 °C'de 0,5 birim UDG kullanılarak 10 μL'lik bir reaksiyonda 50 pmol U+3 substratının neredeyse tamamlanmış enzim sindirimi ve 30 saat içinde MS analizine tabi tutulması. (F) D+3 ürününün, B15 parçalanmış ürün üreten bir beta-eliminasyon reaksiyonunu tetiklemek için 30 dakika boyunca 95 °C'de 0,1 M NaOH'de olması dışında, reaksiyon koşulu E'deki ile aynıydı. ve MS analizine tabi tutulur. (G) D+3 ürününün -20 °C'de 7 günden fazla saklanması dışında reaksiyon koşulu E'deki ile aynıydı; d+3'ün bir kısmı B15 parçalanmış ürünlere dönüştürülür. Bu rakam 43'ten değiştirilmiştir. Kısaltmalar: nt = nükleotid; MS = kütle spektrometrisi; MALDI-TOF MS = Matris yardımlı Lazer Desorpsiyonu/İyonizasyon uçuş süresi MS; AP = apurinik / apirimidinik; UDG = Urasil-DNA glikozilaz; T1 = 19 nt G içeren şablon; U+9 = 18 nt U içeren substrat; d+9 = 18 nt AP saha içeren ürün; U+3 = 18 nt U içeren substrat; d+3 = 18 nt AP saha içeren ürün; B15 = 15 nt beta-eliminasyon parçalanmış ürün. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Farklı enzim konsantrasyonlarında UDG aktivitesi için zaman seyri analizi. G:U lezyonu içeren substrat DNA, 50 pmol, 37 °C'de 0.01, 0.02, 0.05 ve 0.1 ünite UDG ile inkübe edildi. Alikotlar (10 μL) reaksiyon karışımından 0, 0.5, 1, 2 ve 3 dakikada alındı ve eşit miktarda fenol / kloroform ile söndürüldü. (A) UDG ile G:U substratlarının işlenmesinin konsantrasyon bağımlılığını gösteren MALDI-TOF kütle spektrumları. (B) Ürün miktarı, zamanın bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. UDG: 0,01 (düz çizgili kapalı üçgenler), 0,02 (kesikli çizgili açık üçgen), 0,05 (düz çizgili kapalı daire) ve 0,1 birim (düz çizgili açık daireler). Veriler üç bağımsız belirlemenin ortalamasıdır ve hata çubukları 1 S.D.'yi temsil eder. Bu rakam 43'ten değiştirilmiştir. Kısaltmalar: nt = nükleotid; MALDI-TOF = Matris yardımlı Lazer Desorpsiyonu/İyonizasyon uçuş süresi; AP = apurinik / apirimidinik; UDG = Urasil-DNA glikozilaz; T = 19 nt G içeren şablon; U = 18 nt U içeren substrat; AP = 18 nt AP site içeren ürün. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: MALDI-TOF analizi kullanılarak UDG'nin kinetik parametrelerinin belirlenmesi. Michaelis-Menten eğrisi ve Lineweaver-Burk, Urasil'in DNA'dan UDG enzim katalizörlü eksizyonu için Km ve kcat'ı belirlemek için çizer. DNA glikozilaz MALDI-TOF MS testi, üç bağımsız deneyden üretilen 30 s ve 60 s için 100 μL reaksiyonunda 0.1 birim UDG ve farklı konsantrasyonlarda (10, 30, 60, 100, 200 nM) substratlar kullanılarak gerçekleştirildi. (A) Michaelis-Menten eğrisi. Hata çubukları 1 SD'yi temsil eder. (B) Tahlil için Lineweaver-Burk grafiği; belirtilen kesişmeler Km ve Vmax hesaplamasına izin verir. (C) MALDI-TOF MS analizi ile üretici tarafından atanan üniteye kıyasla UDG tahlili. Enzim aktivitesi, 37 ° C'de 30 dakika boyunca 18/19 nt DNA dubleks içinde 50 pmol (0.56 μg) G: U içeren 10 μL'lik bir reaksiyonda AP bölgesini oluşturan urasil çıkarılması ile ölçüldü. UDG, buz üzerinde tampon [% 50 gliserol, 20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 30 mM NaCl, 0.5 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol] ile seyreltildi. Bir birim, dakikada 60 pmol urasil salınımını katalize eden enzim miktarı olarak tanımlandı. Hata çubukları altı denemenin standart sapmasını gösterir. Bu rakam 43'ten değiştirilmiştir. Kısaltmalar: nt = nükleotid; MALDI-TOF = Matris yardımlı Lazer Desorpsiyonu/İyonizasyon uçuş süresi; UDG = Urasil-DNA glikozilaz; AP = apurinik / apirimidinik; V, reaksiyon hızı nM/s. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: UGI ilavesiyle UDG enzim inhibisyon eğrisi. İnhibisyon eğrisi, 0.001 ünite (17:00) ila 0,1 birim (200 pM) arasında UGI varlığında 15 dakika boyunca 0,05 birim UDG (8 pM) ve 50 pmol substrat ile 20 μL'lik reaksiyonlar kullanılarak belirlendi. Veriler, üç bağımsız belirlemenin ortalamasıdır ve hata çubukları, çevrimiçi bir IC50 hesap makinesine uyan 1 S.D. Verisini temsil eder (bkz. Bu rakam 43'ten değiştirilmiştir. Kısaltmalar: UDG = Uracil-DNA glikozilaz; UGI = urasil glikozilaz inhibitörü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

DNA substratları Oligonükleotidler DNA Dizisi Başlangıç oranıc k kedi
(pmol/sn) (s-1)
ssU+9 U+9 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3' 0.560 ± 0.098 35
ssU+3 U+3 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3' 0.756 ± 0.083 47.3
ssU-3 U-3 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3' 0.448 ± 0.087 28
G:U T1 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' 0.149 ± 0.046 9.31
U+9 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3'
C:U T2 Serisi 3'-CTGGTCAGACCTGCAACCG-5' 0.053 ± 0.018 3.31
U+9 5'-GACCAGTCUGGACGTTGG-3'
G:U5'+3 T1 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' 0.256 ± 0.044 16
U+3 5'-GAUCAGTCCGGACGTTGG-3'
G:U5'+2 T3 Serisi 3'-CGGGTCAGGCCTGCAACCG-5' 0.567 ± 0.016 35.4
U+2 5'-GUCCAGTCCGGACGTTGG-3'
G:U5'+1 T4 Serisi 3'-GTGGTCAGGCCTGCAACCG-5' NDd ND
U+1 5'-UACCAGTCCGGACGTTGG-3'
G:U3'-3 T5 Serisi 3'-CTGGTCAGGCCTGCAGCCG-5' 0.138 ± 0.015 8.63
U-3 5'-GACCAGTCCGGACGTUGG-3'
G:U3'-2 T6 Serisi 3'-CTGGTCAGGCCTGCAAGC-5' ND ND
U-2 5'-GACCAGTCCGGACGTTUG-3'
G:U3'-1 T7 Serisi 3'-CTGGTCAGGCCTGCAACGG-5' ND ND
U-1 5'-GACCAGTCCGGACGTTGU-3'

Tablo 1: Substrat bileşimleri ve UDG özellikleri. Bu tablo U±N tarafından belirlenen 18 nt U içeren DNA'yı göstermektedir. '+', urasil pozisyonunun 5' terminustan sayıldığını ve '-', urasil pozisyonunun 3' terminusundan sayıldığını gösterir. Örneğin, U+9 5' terminusundan 9. pozisyondur, U-3 3' terminusundan 3. pozisyondur. T1'den T7'ye kadar olan tamamlayıcı 19 nt şablonu, belirtildiği gibi G: U veya A: U uyumsuzluklarını oluşturan U içeren DNA ile eşleştirilecektir. Urasil bazları kalın yazılmıştır. Reaksiyonlar, protokol bölümü 2'de açıklandığı gibi 10 μL'de 50 pmol U substratı, 0.05 birim UDG kullanıyordu. Bu Tablo 43'ten değiştirilmiştir. Kısaltmalar: UDG = urasil DNA glikozilaz; nt = nükleotid; ND, algılanamaz.

2. PCRP 1. PCRP AMP_LEN UP_CONF MP_CONF Tm PcGC UYARI UEP_DIR UEP_MASS UEP_SEQ EXT1_ ÇAĞRI EXT1_ KÜTLE
NA NA NA NA NA NA NA F 5789.8 GCCAACGTCCGGACTGGTC
NA NA NA NA NA NA NA F 5541.6 GACCAGTCUGGACGTTGG

Tablo 2: DOSYA I.xlsx dosyası. Ayarlar Şekil 1B, C ve Şekil 2A için kullanılmıştır; 0 dakikalık girişler. Bu çalışmada kullanılan MALDI-TOF MS sistemi, genişletilmiş primerin yükseltilmiş gen dizisi varyasyonu bölgesine tek bir nükleotid uzantısı ile tek nükleotid polimorfizmini analiz etmek için özel olarak tasarlanmıştır. UDG testi için, FILE I tahlil grubu hazırlanırken sadece altı alan kullanılmıştır. Kısaltmalar: WELL = tahlil için atanan kuyu numarası; TERM = sonlandırma karışımı; SNP_ID = tek nükleotid polimorfizminin giriş dizisinin adı; 2.-PCRP = ileri amplikon astarı; 1st-PCRP = ters amplikon astarı; AMP_LEN = amplikon uzunluğu; UP_CONF = uniplex amplifikasyon skoru; MP_CONF = multipleks amplifikasyon skoru; Tm = erime sıcaklığı; PcGC = yüzde GC içeriği; PWARN = tahlil tasarımı uyarı kodları; UEP_DIR = astar uzantısının yönü; UEP_MASS = uzatılmamış primer kütle; UEP_SEQ = genişletilmemiş astar dizisi; EXT1_CALL = analit 1 kütle zirvesine verilen isim; EXT1_MASS = analit kütlesi 1.

0620_1-2
0620_1-3
0620_1-4
0620_1-5
0620_1-6
0620_1-7
0620_1-8

Tablo 3: 0620.xlsx dosyası. Bu ayarlar Şekil 4A'daki UGI inhibisyon reaksiyonları için kullanılmıştır. Kısaltma: UGI = urasil glikozilaz inhibitörü.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda, AP içeren DNA ürünlerini doğrudan tespit etmek için UDG MALDI-TOF MS tahlil yönteminin kullanılması için ayrıntılı bir prosedür sunulmaktadır. Bu yöntemin temel avantajları, urasil içeren substratların etiketsiz, ölçeklenebilir, kullanımı kolay olması ve substrat tasarımında daha fazla esneklik sağlamasıdır.

UDG tedarikçisi tarafından önerilen fenol / kloroform ekstraksiyonu, ürün DNA'sının bozulmasını önlemek için enzimin inaktivasyonunu sağlar. Bununla birlikte, fenol ekstraksiyon protokolü, tehlikeli kimyasalların sıkıcı faz ayrımını içerir. Reaksiyon pH'ını 2 ± 0,5'e düşürmek için HCl kullanan alternatif bir asit sonlandırma yöntemi de UDG'yi etkili bir şekilde inaktive eder. Tris tabanı ile daha sonraki nötralizasyon, DNA hasarını önleyebilir. AP ürünü 30 saat içinde MS analizine tabi tutulduğunda, kütle spektrumlarında baz kaybı veya modifikasyon belirtisi yoktu (Şekil 1E). Reaksiyonlardaki Tris tamponu ticari UDG ile sağlandı. Bununla birlikte, Tris de dahil olmak üzere çeşitli aminler, yüksek reaktif konsantrasyonlarında da olsa, beta-eliminasyon yoluyla AP bölgelerini kesebilir44. HEPES ve fosfat tamponu gibi bazı alternatifler, beta-eliminasyon yoluyla AP bölgesinin bölünme riskini önlemek için düşünülebilir.

Potansiyel bir UDG referans yöntemi olarak, aşağıdaki nedenlerden dolayı standart substrat olarak merkezlenmiş G:U substratının dubleks bir dupleksiyonu (Tablo 1, T1/U+9) önerilmektedir: 1. fizyolojik alaka düzeyi için, G:C çiftlerinde sitozinin deaminasyonu G:U lezyonlarına neden olduğu için G:U, A:U'dan üstündür. 2. E. coli UDG, U'yu tek sarmallı DNA'dan hidrolize etmek için daha yüksek özgüllük gösterirken, tek sarmallı DNA'daki bir U lezyonunun onarımı nadirdir. 3. Test edilen tüm G: U substratı için, G: U + 2 ve G: U + 3, G: U + 9'dan daha yüksek reaksiyon hızları göstermiştir. Bununla birlikte, bir iplik kopmasına bitişik bir DNA deaminasyon lezyonu nadirdir. Doğal lezyonları taklit etmek için, DNA dubleksinin merkezine bir G:U yerleştirmek daha uygun olacaktır.

İlginç bir şekilde, MALDI-TOF MS yöntemi UDG kinetik parametreleri üretti ve G: U reaksiyonunun enzim birimleri (Şekil 3A-C), 3H-urasil38 kullanılarak geleneksel olarak türetilmiş sonuçlara çok benzerdi. Bununla birlikte, bu çalışmadaki tek G: U substratı, daha önce DNA sentez hatalarından çoklu A: U ile tanımlanan PBS1 bakteriyofaj DNA'sından çok farklıdır38. Dahası, UDG, G: U ile A: U substratından 3 kat daha yüksek aktivite göstermiştir (Tablo 1, Km ve Kcat G: U'ya karşı A: U). Bu görünüşte çelişkili sonuç, U'nun% 36'sını içeren PBS1 substratının DNA dizisine, G'deki U'nun sadece% 3'üne kıyasla45 çoklu A: U lezyonları şeklinde bağlanabilir: U substratı (Tablo 1). Bu arada, UDG çok 'süreçsel' bir enzimdir, yani tek bir protein-DNA bağlanma olayı çoklu urasil bölünmelerini ortaya çıkarır12. Bu iki UDG yöntemi arasında mükemmele yakın bire bir korelasyonun bulunması, bu MS yöntemini geleneksel radyoizotop testi yerine çekici bir seçenek haline getirmektedir.

Bu yaklaşım kolayca ölçeklenebilir. Bu çalışmadaki tüm UDG reaksiyonları, mikropipetler ve mikrosantrifüj tüpleri kullanılarak manuel olarak gerçekleştirildi ve belirli bir günde ~ 30 test yapıldı. Bu nedenle, bölüm 3-5'te açıklanan MALDI-TOF MS sistemi için 384 delikli plaka formatlı çip dizisinin kapasitesinin onda birinden daha azı kullanılmıştır ( Malzeme Tablosuna bakınız). Buna karşılık, 384 delikli bir mikroplaka için otomatik bir pipetleme sisteminin uyarlanması, asit sonlandırma yöntemini kullanarak bu yaklaşımın günlük çıktısını kolayca artırabilir. Böylece, 300 UDG reaksiyonu ~ 1 saat sürecektir. MALDI-TOF MS sistemi ( Malzeme Tablosuna bakınız) 1 saatte 300 reaksiyona kadar kütle spektrumu verilerini çıkarabilir. Bu nedenle, kolaylaştırılmış bir süreç, 300 UDG MALDI-TOF MS tahlilini tamamlamak için 2 saat gerektirecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

NCFPB Fonksiyonel Genomik Entegre Çekirdek Tesisi'ne (Taipei, Tayvan) ve NRPB Farmakogenomik Laboratuvarı'na (Taipei, Tayvan) teknik destekleri için teşekkür ederiz. Bu çalışma Tayvan, R.O..C. Bilim ve Teknoloji Bakanlığı tarafından desteklenmiştir [hibe numarası MOST109-2314-B-002 -186 - K.-Y.S., ÇOĞU 107-2320-B-002-016-MY3 - S.-Y.C., MOST 110-2320-B-002-043 - W.-h.F.]. H.-L.C., Ulusal Tayvan Üniversitesi'nden doktora bursu almıştır. Açık erişim ücreti için finansman: Bilim ve Teknoloji Bakanlığı, R.O.C.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Amino-2-hydroxymethyl-propane-1,3-diol (Tris base) J.T baker Protocol 1,2
Autoclaved deionized water MILLIPORE Protocol 1,2
EDTA J.T Baker Protocol 1,2
Gloves AQUAGLOVE Protocol 1,2,3
Hydrochloric acid (HCl) SIGMA Protocol 1,2
Ice bucket Taiwan.Inc Protocol 2
Low retention pipette tips(0.5-10 µL) extra gene Protocol 1,2
Low retention pipette tips(1,250 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
Low retention pipette tips(200 µL) national scientific supply co, Inc. Protocol 1,2
MassARRAY  Agena Bioscience, CA Protocol 4, 5
Mass spectrometry control programs include Typer Chip Linker, SpectroACQUIRE, and Start RT Process.
MassARRAY Nanodispenser AAT Bioquest, Inc. RS1000 Protocol 3
Microcentrifuge Kubota Protocol 2
Microcentrifuge Clubio Protocol 2
Microcentrifuge tube (1.5 mL) National scientific supply co, Inc. Protocol 2
Microcentrifuge tube rack Taiwan.Inc Protocol 1,2
Micropipette  (P1000) Gilson Protocol 1,2
Micropipette  (P2) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P10) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P100) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (P200) Gilson Protocol 1,2
Micropipette (SL2) Rainin Protocol 1,2
Oligonucleotides Integrated DNA Technologies (Singapore) Protocol 1,2
Quest Graph IC50 Calculator (v.1) AAT Bioquest, Inc. Fig. 4
https://www.aatbio.com/tools/ic50-calculator-v1
Sodium hydroxide (NaOH) WAKO Protocol 2
SpectroCHIP array  Agena Bioscience, CA #01509 Protocol 3, 5
Timer Taiwan.Inc Protocol 2
Typer 4.0 software  Agena Bioscience, CA #10145 Protocol 6
Typer 4.0 consists four programs including Assay Designer, Assay Editor, Plate Editor, and Typer Analyzer.
UDG Reaction Buffer (10x) New England Biolabs, MA B0280S Protocol 2
Uracil Glycosylase Inhibitor New England Biolabs, MA M0281S Protocol 2
Uracil-DNA Glycosylase New England Biolabs, MA M0280L Protocol 2
UV-VISBLE spectrophotometer UV-1601 SHIMADZU Protocol 1
Water bath ZETA ZC-4000 (Taiwan.Inc) Protocol 2

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Frederico, L. A., Kunkel, T. A., Shaw, B. R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. Biochemistry. 29 (10), 2532-2537 (1990).
  2. Kavli, B., Otterlei, M., Slupphaug, G., Krokan, H. E. Uracil in DNA-General mutagen, but normal intermediate in acquired immunity. DNA Repair. 6 (4), 505-516 (2007).
  3. Duncan, B. K., Miller, J. H. Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature. 287 (5782), 560-561 (1980).
  4. Gros, L., Saparbaev, M. K., Laval, J. Enzymology of the repair of free radicals-induced DNA damage. Oncogene. 21 (58), 8905-8925 (2002).
  5. Robertson, A. B., Klungland, A., Rognes, T., Leiros, I. Base excision repair: The long and short of it. Cellular and Molecular Life Sciences. 66 (6), 981-993 (2009).
  6. Lindahl, T. An N-glycosidase from Escherichia coli that releases free uracil from DNA containing deaminated cytosine residues. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 71 (9), 3649-3653 (1974).
  7. Caradonna, S. J., Cheng, Y. C. Uracil DNA-glycosylase. Purification and properties of this enzyme isolated from blast cells of acute myelocytic leukemia patients. Journal of Biological Chemistry. 255 (6), 2293-2300 (1980).
  8. Krokan, H., Urs Wittwer, C. Uracil DNA-glycosylase from HeLa cells: general properties, substrate specificity and effect of uracil analogs. Nucleic Acids Research. 9 (11), 2599-2614 (1981).
  9. Tchou, J., et al. 8-oxoguanine (8-hydroxyguanine) DNA glycosylase and its substrate specificity. Proceedings of The National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (11), 4690-4694 (1991).
  10. Knævelsrud, I., et al. Excision of uracil from DNA by the hyperthermophilic Afung protein is dependent on the opposite base and stimulated by heat-induced transition to a more open structure. Mutation Research-DNA Repair. 487 (3-4), 173-190 (2001).
  11. Minko, I. G., et al. Recognition of DNA adducts by edited and unedited forms of DNA glycosylase NEIL1. DNA Repair. 85, 102741 (2020).
  12. Bennett, S. E., Sanderson, R. J., Mosbaugh, D. W. Processivity of Escherichia coli and rat liver mitochondrial uracil-DNA glycosylase is affected by NaCl concentration. Biochemistry. 34 (18), 6109-6119 (1995).
  13. Xia, L., O'Connor, T. R. DNA glycosylase activity assay based on streptavidin paramagnetic bead substrate capture. Analytical Biochemistry. 298 (2), 322-326 (2001).
  14. Kreklau, E. L., et al. A novel fluorometric oligonucleotide assay to measure O(6)-methylguanine DNA methyltransferase, methylpurine DNA glycosylase, 8-oxoguanine DNA glycosylase and abasic endonuclease activities: DNA repair status in human breast carcinoma cells overexpressing methylpurine DNA glycosylase. Nucleic Acids Research. 29 (12), 2558-2566 (2001).
  15. Liu, B., et al. Real-time monitoring of uracil removal by uracil-DNA glycosylase using fluorescent resonance energy transfer probes. Analytical Biochemistry. 366 (2), 237-243 (2007).
  16. Zhang, L., Zhao, J., Jiang, J., Yu, R. A target-activated autocatalytic DNAzyme amplification strategy for the assay of base excision repair enzyme activity. Chemical Communications. 48 (70), 8820-8822 (2012).
  17. Zhou, D. M., et al. Graphene oxide-hairpin probe nanocomposite as a homogeneous assay platform for DNA base excision repair screening. Biosensors and Bioelectronics. 41, 359-365 (2013).
  18. Wang, X., Hou, T., Lu, T., Li, F. Autonomous exonuclease iii-assisted isothermal cycling signal amplification: A facile and highly sensitive fluorescence DNA glycosylase activity assay. Analytical Chemistry. 86 (19), 9626-9631 (2014).
  19. Wu, Y., Wang, L., Zhu, J., Jiang, W. A DNA machine-based fluorescence amplification strategy for sensitive detection of uracil-DNA glycosylase activity. Biosensors and Bioelectronics. 68, 654-659 (2015).
  20. Xi, Q., Li, J. J., Du, W. F., Yu, R. Q., Jiang, J. H. A highly sensitive strategy for base excision repair enzyme activity detection based on graphene oxide mediated fluorescence quenching and hybridization chain reaction. Analyst. 141 (1), 96-99 (2016).
  21. Liu, X., et al. A novel electrochemical biosensor for label-free detection of uracil DNA glycosylase activity based on enzyme-catalyzed removal of uracil bases inducing strand release. Electrochimica Acta. 113, 514-518 (2013).
  22. McWilliams, M. A., Anka, F. H., Balkus, K. J., Slinker, J. D. Sensitive and selective real-time electrochemical monitoring of DNA repair. Biosensors and Bioelectronics. 54, 541-546 (2014).
  23. Jiao, F., et al. A novel and label-free biosensors for uracil-DNA glycosylase activity based on the electrochemical oxidation of guanine bases at the graphene modified electrode. Talanta. 147, 98-102 (2016).
  24. Liu, X., et al. Label-free colorimetric assay for base excision repair enzyme activity based on nicking enzyme assisted signal amplification. Biosensors and Bioelectronics. 54, 598-602 (2014).
  25. Nie, H., Wang, W., Li, W., Nie, Z., Yao, S. A colorimetric and smartphone readable method for uracil-DNA glycosylase detection based on the target-triggered formation of G-quadruplex. Analyst. 140 (8), 2771-2777 (2015).
  26. Du, Y. C., Jiang, H. X., Huo, Y. F., Han, G. M., Kong, D. M. Optimization of strand displacement amplification-sensitized G-quadruplex DNAzyme-based sensing system and its application in activity detection of uracil-DNA glycosylase. Biosensors and Bioelectronics. 77, 971-977 (2016).
  27. Haff, L. A., Smirnov, I. P. Single-nucleotide polymorphism identification assays using a thermostable DNA polymerase and delayed extraction MALDI-TOF mass spectrometry. Genome Research. 7 (4), 378-388 (1997).
  28. Blondal, T., et al. A novel MALDI-TOF based methodology for genotyping single nucleotide polymorphisms. Nucleic Acids Research. 31 (24), 155 (2003).
  29. Cui, Z., Theruvathu, J. A., Farrel, A., Burdzy, A., Sowers, L. C. Characterization of synthetic oligonucleotides containing biologically important modified bases by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 379 (2), 196-207 (2008).
  30. Darwanto, A., Farrel, A., Rogstad, D. K., Sowers, L. C. Characterization of DNA glycosylase activity by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. Analytical Biochemistry. 394 (1), 13-23 (2009).
  31. Redrejo-Rodríguez, M., et al. New insights in the removal of the Hydantoins, oxidation product of pyrimidines, via the base excision and Nucleotide incision repair pathways. PLoS ONE. 6 (7), 21039 (2011).
  32. Prorok, P., et al. Uracil in duplex DNA is a substrate for the nucleotide incision repair pathway in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (39), 3695-3703 (2013).
  33. Alexeeva, M., et al. Excision of uracil from DNA by hSMUG1 includes strand incision and processing. Nucleic Acids Research. 47 (2), 779-793 (2019).
  34. Thapar, U., Demple, B. Deployment of DNA polymerases beta and lambda in single-nucleotide and multinucleotide pathways of mammalian base excision DNA repair. DNA Repair. 76, 11-19 (2019).
  35. Su, K. Y., et al. Proofreading and DNA repair assay using single nucleotide extension and MALDI-TOF mass spectrometry analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (136), e57862 (2018).
  36. Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers. Analytical Chemistry. 63 (24), 1193-1202 (1991).
  37. Brammer, K. W., Jones, A. S., Mian, A. M., Walker, R. T. Study of the use of alkaline degradation of DNA derivative as a procedure for the determination of nucleotide distribution. Biochimica et Biophysica Acta. 166 (3), 732-734 (1968).
  38. Lindahl, T., Ljungquist, S., Siegert, W., Nyberg, B., Sperens, B. DNA N-glycosidases: properties of uracil-DNA glycosidase from Escherichia coli. Journal of Biological Chemistry. 252 (10), 3286-3294 (1977).
  39. Rashtchian, A., Buchman, G. W., Schuster, D. M., Berninger, M. S. Uracil DNA glycosylase-mediated cloning of polymerasechain reaction-amplified DNA: Application to genomic and cDNA cloning. Analytical Biochemistry. 206 (1), 91-97 (1992).
  40. Varshney, U., van de Sande, J. H. Specificities and kinetics of uracil excision from uracil-containing DNA oligomers by Escherichia coli uracil DNA glycosylase. Biochemistry. 30 (16), 4055-4061 (1991).
  41. Delort, A. M., et al. Excision of uracil residues in DNA: Mechanism of action of Escherichia coli and Micrococcus luteus uracil-DNA glycosylases. Nucleic Acids Research. 13 (2), 319-335 (1985).
  42. Wang, Z. G., Smith, D. G., Mosbaugh, D. W. Overproduction and characterization of the uracil-DNA glycosylase inhibitor of bacteriophage PBS2. Gene. 99 (1), 31-37 (1991).
  43. Chang, H. L., et al. Measurement of uracil-DNA glycosylase activity by matrix assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry technique. DNA Repair. 97, 103028 (2021).
  44. Minko, I. G., et al. Catalysts of DNA strand cleavage at apurinic/apyrimidinic sites. Scientific Reports. 6 (1), 28894 (2016).
  45. Lindahl, T. Uracil-DNA glycosylase from Escherichia coli. Methods in Enzymology. 65, 284-290 (1980).

Tags

Biyokimya Sayı 182 Baz eksizyon onarımı MALDI-TOF kütle spektrometrisi Urasil-DNA glikozilaz apurinik / apirimididinik bölge glikozilaz inhibitörü
Matris Yardımlı Lazer Desorpsiyonu/İyonizasyon ile Urasil-DNA Glikozilaz Testi Uçuş Süresi Kütle Spektrometrisi Analizi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chang, H. L., Su, K. Y., Goodman, S. … More

Chang, H. L., Su, K. Y., Goodman, S. D., Cheng, W. C., Lin, L. I., Yang, Y. C., Chang, S. Y., Fang, W. h. Uracil-DNA Glycosylase Assay by Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-flight Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (182), e63089, doi:10.3791/63089 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter