Summary
用于分析细胞信号的集成工具包 (iTACS) 平台可自动测量贴壁细胞中的各种化学和机械信号。iTACS旨在促进社区驱动的开发,并使研究人员能够使用所有平台功能,无论其教育背景如何。
Abstract
在过去四十年中,对细胞力和运动的定量评估有了相当大的进步。这些进步为检查细胞培养系统中富有洞察力的机械信号传导过程提供了框架。然而,该领域目前面临三个问题:获取数据缺乏质量标准化,数据分析和可视化中的技术错误,也许最重要的是,该技术对于普通的细胞生物学实验室来说仍然遥不可及。为了克服这些限制,我们开发了一个新的实验平台 - 分析蜂窝信号的集成工具包(iTACS)。iTACS由两个组件组成:采集和训练模块(AcTrM)以及分析和可视化模块(AnViM)。AcTrM基于μManager(一种基于NIH-ImageJ的显微镜控制软件),有助于用户进行自我培训和自动化常用图像采集协议。AnViM基于NIH-ImageJ,有助于用户友好的数据分析自动化和结果的有见地可视化。这些实验涉及在水凝胶上培养贴壁细胞,对嵌入水凝胶中的基准标记物进行成像,最后从这些图像中提取细胞的全面机械表征。目前,iTACS使用户能够分析和跟踪各种特性,包括形态学,运动,细胞骨架力以及单个细胞及其邻近区域的荧光。质量标准化问题在AcTrM中得到了解决,这是一种参考图像引导的重新对焦技术。AnViM通过多管齐下的图像分割程序,用户友好的边界条件识别方法以及基于蜂窝属性的新型数据可视化解决了数据分析中的技术问题。AcTrM旨在促进基本荧光显微镜直接转换为实验细胞力学装置,而AnViM的配备使用户无需工程背景即可测量细胞机械信号。iTACS将作为具有社区驱动开发能力的开源套件提供给研究社区。
Introduction
常用的光学成像和数据分析工具采用的硬件和软件技术几乎过时。电子设备,计算方法和数学分析的进步在常见实验细胞生物学工具中的翻译和实施滞后是对我们细胞生理学知识增长速度的主要制约因素。目前,细胞生物学研究人员发现分子生物学工具触手可及,但基于工程原理的工具遥不可及。一个基于工程原理的工具是单层应力显微镜(MSM)1,2。虽然MSM已在全球各种实验室中进行了改编和研究,但其使用主要限于具有工程专业知识的实验室3,4,5,6,7,8,9。
NIH-ImageJ是细胞生物学研究人员中最受欢迎的开源工具之一10。用户社区贡献驱动的进步是其受欢迎程度的核心11,12。ImageJ具有允许用户使用高级编程语言和简化脚本方法开发应用程序的功能。这些功能有助于具有基本编程知识的用户实现,适应和推进对软件的任何新贡献。基于NIH-ImageJ的这些特性,我们开发了分析细胞信号的集成工具包(iTACS),该工具包能够以低成本集成所需的硬件和软件工具,以自动测量贴壁细胞中的各种化学和机械信号11,12。
iTACS由两个组件组成:采集和训练模块(AcTrM)以及分析和可视化模块(AnViM)。AcTrM基于μManager(一种基于NIH-ImageJ的图像采集应用程序)构建,使用户能够设置多个样品中贴壁细胞的传统光学特性和各种物理特性的延时测量12。AcTrM 通过图形界面中包含的简明说明方便用户培训。此外,它还具有基于参考图像的自动对焦的新颖功能,旨在促进物理力的实时测量,并使采集的数据的质量标准化。
AnViM基于ImageJ插件,加急软件和文件处理脚本构建,使用户能够定量评估50多种属性,包括细胞形状,大小,方向,运动速度和方向,对细胞外基质(ECM)施加的牵引力,以及对相邻细胞,单个贴壁细胞及其邻近区域的收缩和剪切矩。AnViM有助于用户量化细胞物理特性,而无需掌握底层技术背景11。此外,它还支持在交互式或批处理模式下进行数据分析。它生成显示空间变化的热图和显示单个细胞属性的时间变化的图形。
在典型的实验中,用户在弹性水凝胶上培养细胞,顶部表面有适当的细胞外基质蛋白和两种类型的嵌入荧光标记物。从本质上讲,在培养细胞之前和之后这些荧光标记物的图像足以量化单个细胞内和周围的力2,13。AnViM将这些结果映射到贴壁簇的单个细胞上,并生成有见地的图像和图表。
Protocol
注:使用iTACS平台检查的样品是粘附在软底物上的细胞。用于评估机械和化学信号的协议分为两个顺序部分:采集和训练模块(AcTrM)以及分析和可视化模块(AnViM)。
1. 采集和培训模块
注意:AcTrM 可自动执行数据采集和用户自培训过程。在任何数据采集之前,准备一个能够提供必要信息的软基质来量化细胞对其施加的力。
- 水凝胶制备
注意:这里的目标是制备1,250 Pa剪切模量,约100μm厚度和22 mm直径聚丙烯酰胺(PAA)水凝胶。- 按照Yeung等人的方法制备聚丙烯酰胺溶液,并按照Trepat等人描述的步骤施注水凝胶。该过程的一个例外是嵌入细胞正下方的微珠直径为0.5μm,并发出黄色荧光。
- 如果观察区域预计具有较大的无细胞区域,则跳过将2μm珠连接到盖玻片的步骤。
注意:水凝胶制备方案现已在该领域建立得相当成熟16。在随后的描述中,0.5 μm珠被称为"顶部珠子",2 μm珠子被称为"底部珠子"。但是,底部磁珠是可选的,其中成像区域包含较大的无细胞区域。来自这种无细胞区域的顶部珠图案将用于底部珠图案的目的。 - 将嵌入荧光珠的水凝胶安装在显微镜载物台上。
- 等待15-20分钟,使板的温度达到稳态。
注意:板的顶层用细胞外基质蛋白功能化,但细胞尚未接种在水凝胶上。
- 参考图像采集
- 第 1 部分:创建职位列表
注意:此步骤中的手动输入包括按照 AcTrM 提示选择具有最佳磁珠分布的位置。此步骤中不使用以前创建的任何文件。在此步骤中生成的关键新文件夹包括"t0imgs"、"tnimgs"和"textfiles"文件夹,生成的文件包括位置列表文件。有关指导使用 AcTrM 创建仓位列表的以下步骤的直观说明,请参阅 图 2 。所示示例以20倍放大倍率获取数据。- 启动 μManager 2.0 - Beta。
- 通过单击"IMBL 资源"窗口中的"AcTrM.bsh"按钮来运行 AcTrM。
- 在标题为 "定义采集属性"的窗口中,选择适当的物镜、横向位置(即 XY)恢复精度的容差、粗略和精细的重新聚焦(即 z)操作的步长,以及用于焦点恢复的可接受图像相关系数的值。
注意:对横向位置恢复的更精细的容差将减慢位置恢复的速度,但在数据分析期间需要对大量容差进行位置校正,并可能导致焦点恢复困难。较小的步长会减慢重新对焦操作的速度,但非常高的步长可能会导致快速移动,并有机会错过焦点。 - 在 "AcTrM - 步骤 0 "窗口中,选择" 全新获取 "以创建仓位列表。
注意:标题为 "AcTrM - 步骤 1" 的窗口列出了所有关键的后续步骤。这些步骤包括移动载物台、调整焦点以及单击 μManager 中的按钮。这些步骤指导构建适合数据采集的位置列表。 - 单击"在微管理器中实时运行"以可视化"AcTrM - 步骤 1"窗口中列出的手动调整示例。
- 按照此窗口中列出的步骤操作。
- 现在获取珠子的图像。为顶部磁珠选择适当的通道。
- 确保也要查看底部的珠子。为此,请选择底部磁珠的通道。看到底部珠子的模糊图像。
注:通道可以从主μManager窗口的预设下拉菜单中切换。如果在实验中使用了底部磁珠,请确保它们存在于所选位置。这些珠子会显得模糊。 - 选择适当的位置后,单击"舞台位置列表"窗口中的"标记"以保存位置。
注:最佳位置由嵌入在顶面下方的顶部珠子(即顶部珠子)和至少两个附着在盖板上的珠子(即底珠)的密集和均匀分布来定义(补充图S1)。如果底部珠子显示为大而失焦的环,则对焦恢复速度更快。但是,如果在一个位置进行实验,而不需要聚焦或横向位置恢复,请忽略与底部珠子图像相关的说明。 - 按照 图 2 中描述的步骤 6-9 将其他位置包含在列表中。
注意:选择几个额外的位置,以便一轮淘汰赛可以在板上选择最佳位置。
- 第 2 部分:获取参考图像
注意:此步骤不涉及任何手动输入。在此步骤中使用的以前创建的关键文件包括"textfiles/*.pos"。在此步骤中生成的关键新文件和文件夹包括"t0imgs"和"tnimgs"文件夹中的文件和文件夹。请参阅 图3 和 补充图S2 ,了解指导使用AcTrM采集参考图像的以下步骤的直观描述。 "AcTrM - 步骤 2 "窗口还列出了所有关键步骤。- 按照 AcTrM - 步骤 2 窗口中列出的步骤,在"多维采集"窗口中进行选择。例如,要执行长时间的拍摄,请指示要拍摄的图像数量,选择第一个通道作为相位通道,然后选择下一个通道作为顶部磁珠,然后选择后一个通道用于底部磁珠。在"多维采集"窗口中单击"关闭",然后在"ActrM - 步骤 2"窗口中单击"确定"。
- 在 "AcTrM - 步骤 3 "窗口中,选择启动基于参考映像的 XYZ 位置恢复。选择通常是肯定的。但是,如果在一个位置采集图像,没有余地进行对焦或舞台漂移,则 AcTrM - Step 3 窗口中的选择将是 "否"。
- 在" AcTrM - XYZ 恢复选项" 窗口中,设置粗略 XYZ 恢复的通道、是否执行优化的 XYZ 恢复、区域和优化 XYZ 恢复的通道以及开始重新聚焦的方向(补充图 S4)。完成后,AcTrM 将获取参考图像。
注:通道的典型选择是底部磁珠通道。在当前实施中,使用完整映像执行 XYZ 恢复效果最佳。参考图像通常包括水凝胶的透射光图像、顶部磁珠的荧光图像和底部磁珠的荧光图像。每个图像集的内容可能会根据在" 多维采集 "窗口中所做的选择而有所不同。尽管如此,软件仍将在 图2中确定的每个位置采集参考图像集。在此步骤结束时,将在所选目录中创建三个文件夹:"t0imgs"、"tnimgs"和"textfiles"。"t0imgs"文件夹包含μManager识别的格式的参考图像,并在后续步骤中使用;"tnimgs"文件夹包含单独的TIFF图像,文件名为"c0_p0_t0.tif","c1_p0_t0.tif"等。在这里,"c"代表通道,"p"代表位置,"t"代表时间。这些字母后面分别是通道号、位置号和帧号。文件夹"文本文件"包含 XML 格式的位置列表以及用于图像采集和位置恢复的用户选择。
- 第 1 部分:创建职位列表
- 细胞接种和生长
注意:iTACS平台具有灵活性,可以适应贴壁细胞机械行为的常见 体外 评估中使用的样品制备方案,包括稀疏细胞,完全融合的单层,网络形成测定以及具有孔或显着间隙的单层。- 培养大鼠肺微血管内皮细胞在烧瓶中汇合17,18。
- 使用胰蛋白酶分离细胞。将细胞重悬于含有10%胎牛血清的培养基中,浓度为1×10 6 个细胞/ mL。
- 将重悬细胞的5μL液滴放在部分干燥的水凝胶表面上,并将其置于细胞培养箱中。
注意:在含有10%胎牛血清的培养基中培养2天后,该液滴中的细胞形成拥挤的细胞岛1。
- 剩余实验的自动图像采集
注:此步骤的手动输入包括按照 AcTrM 提示恢复图像采集。此步骤使用以前创建的关键文件包括"textfiles/*.pos"和文件夹"t0imgs"中的底部珠状图像文件。此步骤中生成的关键新文件包括更新的位置列表文件和图像"tnimgs/*_t*.tif"。- 确保显微镜环境控制系统达到稳定的组织培养条件。
- 将含有培养细胞的板轻轻安装到显微镜载物台上。
- 等待15-20分钟,使温度和湿度稳定下来。
注:参见 图4 ,了解以下步骤的直观描述,这些步骤指导使用AcTrM为剩余实验采集图像。 - 启动 μManager 2.0 - Beta。
- 通过单击"IMBL 资源"窗口中的"AcTrM.bsh"按钮来运行 AcTrM。
注意:忽略在 "定义购置属性" 窗口中所做的选择,但使用在上一步中所做的选择。 - 在" AcTrM - 步骤 0 "窗口中,选择" 继续暂停的采集"。
- 选择在前面步骤的 "多维采集 "窗口中标识的放大倍率和目录,其中保存了数据文件夹("t0imags"、"tnimgs"和"textfiles")。
注意:窗口的标题将指导用户选择适当的目录。 - 在 "重新定位板" 窗口中,选择用于重新定位板的选项(三个非共线性位置)以及用于重新定位的通道。
注:保存的图像将在相机中看到。如果重叠图像显示为红色、绿色和黑色图像,请执行手动调整。 - 单击" 接受 "以继续进行获取。
注:此步骤克服了将板重新安装在显微镜载物台上时板对准的不可重复性的轻微变化。按照 AcTrM 提示,通过显示以红色显示的参考图像(通常为底部珠子)和当前通过绿色显示的物镜观察到的图像的复合图像,在三个位置中的每个位置加快对齐。使绿色足够接近红色会减少软件的工作量。当重叠完美时,合成图像将显示为黄色和黑色。通常,当相同的底部珠子在红色和绿色图像中都可见,并且相应的红色和绿色失焦环相互接触时,通常足够接近。板重新定位完成后,AcTrM将载物台带到每个选定的位置,并通过将参考图像与当前通过相机看到的内容进行匹配来恢复XYZ位置。匹配第一个横向 (XY) 位置,然后匹配焦点 (Z)。粗略恢复之后是位置和焦点的精细恢复。实验当前状态的更新通过 补充图 S3 中所示的四部分窗口显示在屏幕上。采集的图像保存在"*_t1.tif"、"*_t2.tif"之后的"tnimgs"文件夹中,指示图像集的时间计数。如果 XYZ 恢复标识了更新的位置,则会生成新的位置列表并将其保存在"文本文件"文件夹中。
2. 分析和可视化模块 (AnViM)
- 设置自动数据分析
注意:此步骤中的手动输入包括标识"tnimgs"文件夹的位置。此步骤中使用的以前创建的关键文件包括"tnimgs/*.tif"。在此步骤中生成的关键新文件和文件夹包括与"tnimgs"位于同一父文件夹中的"分析"文件夹以及每个位置"analysis/p*"的文件夹。在每个"analysis/p*"中,此步骤在"phs"和"tny"文件夹中创建新的"*.tif"图像文件。这些图像是细胞和顶部珠子的裁剪和去漂移图像。创建的其他文件包括列出分析选择的"analysis/analysisChoices.txt",列出"analysis/p*/skipAnalysis.txt",它列出了由于预先存在的显着漂移而跳过分析的实例,以及列出估计漂移值的"analysis/p*/part_shift_values_pixel_degree.dat"。AnViM 不会更改"tnimgs"文件夹中的原始数据。有关以下步骤的直观说明,请参阅 图 5 ,这些步骤指导使用 AnViM 设置自动数据分析。- 启动斐济软件,然后在 MSM 下拉菜单中选择标记为 "MSM - 预处理"的第一个选项。
- 使用文件浏览器对话框,选择包含"tnimgs"文件夹的文件夹,该文件夹包含分析的数据。
- 定义图像的通道。按照 补充图S5中的指南,确定细胞透射光图像(细胞的相衬图像),底部磁珠图像和顶部磁珠图像的通道号。通常会选中以下三个复选框("将文件移动到位置文件夹"、"对刚性运动执行其他更正"和"裁剪数据并保存在位置文件夹中")。最后,定义拒绝严重漂移数据的容差、像素大小和像元交叉的图像侧面。
- 响应提示以增强底部珠子图像的亮度和对比度,以便珠子突出显示。使用菜单中的滑块进行调整,然后单击 确定。
- 现在执行位置校正以消除偏移(如果有)。完成后,将创建一个分析文件夹。
注意:通常不需要对比度增强,但此规定可用于需要最小化暴露于激光的实验。选择后,AnViM会将文件从"tnimgs"文件夹复制到"分析"文件夹。与每个位置对应的文件保存在"analysis/p0"、"analysis/p1"等文件夹中。在每个位置文件夹中,AnViM 都会创建"cels"、"defs"和"refs"文件夹,分别包含原始透射光图像、顶部磁珠图像和底部磁珠图像(补充图 S6)。然后,AnViM分析底部磁珠图像中的刚性运动,并创建一个"phs"文件夹,其中包含细胞的校正透射光图像和包含更新的顶部磁珠图像的"tny"文件夹。最后,用户对通道、操作、容差、像素大小和边界交叉的选择保存在"analysisChoices.txt"文件中(补充图S6)。
- 水凝胶和单层变形的定量
注:请务必注意,量化图像序列的运动是一个快速发展的领域19。该技术不断针对各种特征进行优化,包括速度、精度、原始图像中的特定特征以及特定的变形模式。因此,某些用户可能会使用与此处介绍的方法不同的变形量化方法。-
第 1 部分:水凝胶变形的定量
注意:此步骤中的手动输入包括标识数据目录和选择网格分辨率。在此步骤中使用的以前创建的关键文件包括"p*/tny/*.tif"。其中产生的关键新文件包括"p*/位移/*_disp.dat",其中列出了水凝胶顶面的位移载体。有关以下步骤的直观描述,请参阅 图 6 , 通过 AnViM 对顶部珠子图像进行粒子图像测速分析20。- 启动斐济软件,然后从 MSM 下拉菜单中选择 MSM - 凝胶变形。
- 在此处,选择适合实验的选项。
- 使用文件浏览器对话框,选择包含分析数据的"analysis"文件夹的父目录。
- 在 "凝胶变形计算参数" 窗口中,选择适当的互相关窗口大小、噪声水平和阈值(补充图S7)20。
注意:结果保存在每个位置文件夹"analysis/p0,analysis/p1"等新创建的"位移"目录中。这是存储所有输出文件的位置。
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第 2 部分:单层变形的定量
注意:此步骤中的手动输入包括标识数据目录和选择网格分辨率。在此步骤中使用的以前创建的关键文件包括"p*/tny/*.tif"。其中产生的关键新文件包括"p*/velocity/*_vel.dat",其中列出了细胞的运动向量。参见 图7 ,了解 通过 AnViM对顶部珠子图像进行粒子图像测速分析的步骤的可视化描述20。该过程类似于量化水凝胶变形的过程,并从MSM下拉菜单中选择 MSM - 细胞运动 。 结果保存在每个位置文件夹"analysis/p0"、"analysis/p1"等新创建的"velocity"目录中。
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第 1 部分:水凝胶变形的定量
- 细胞-ECM和细胞-细胞力的定量
注意:此步骤中的手动输入包括识别数据目录,指示水凝胶刚度,以及响应细胞簇分割提示以检测来自无细胞区域的细胞。此步骤中使用的以前创建的关键文件包括"p*/位移/*_disp.dat"。在此步骤中产生的关键新文件包括:"p * / traction / * _trac.dat",其中列出了细胞对水凝胶施加的力;"p*/牵引/*_domain.dat",其中列出了包含单元格的网格点的位置;并输入记录此步骤的用户选择的文件"p*/traction.in、p*/clusterInput.txt"和"p*/prestress.in"。在对细胞-ECM和细胞-细胞力进行首次定量评估之后,已经开发了该技术的几种变体1,15。这些变化集中在底物,细胞,实验条件或数值工具的特定情况下7,8,21,22。参见 图8 , 了解通过 AnViM、傅里叶变换牵引力显微镜和单层应力显微镜对水凝胶变形数据进行分析的视觉描述1,2,15。- 启动斐济软件,然后从 MSM 下拉菜单中选择 MSM - Cell-ECM 和 Cell-Cell Forces (下拉菜单中的第三个选项)。
- 使用文件浏览器对话框,选择包含包含分析数据的文件夹"tnimgs"和"analysis"的"analysis"文件夹的父目录。单击" 选择"。
- 在 "计算细胞力的参数 "窗口中,输入剪切模量、水凝胶厚度和预期的噪声水平。选择 "确定"。这允许它 通过 MATLAB 函数执行牵引。
注意:在这些输入之后,AnViM 计算单元 ECM 力。 - 之后,指示单层是否汇合。如果整个细胞图像被细胞覆盖,那么答案 是肯定的。在这种情况下,将在整个帧中计算细胞 - 细胞力。另一方面,如果图像的一部分没有单元格,那么答案是否 定的。在这种情况下,请按照 AnViM 提示进行操作,以便对包含单元格的图像区域进行分割。
- 如果答案是否定的,请在软件提示时在非单元格对象周围手动绘制一个多边形,然后选择适当的分割方法。该软件将询问单元格的颜色(黑色或白色)。
- 检查软件中的 自动填充斑点 选项,然后单击 确定。
注:分割非汇合单层的步骤将在"第2.4节"的第一部分中介绍。Cell-ECM力存储在每个位置文件夹中新创建的目录"牵引"的"*_trac.dat"文件中,并且cell-ECM力计算软件的输入保存在文件"traction.in"中(补充图S8)。细胞-细胞力存储在每个位置文件夹中新创建的目录"预应力"的"*_prestress.dat"文件中,并且对细胞 - 细胞力计算软件的输入保存在文件"prestress.in"中(补充图S9)。
- 映射单个像元上的网格点值
注意:iTACS目前的重点是引入一种简单的方法来解释现场测量的机械信号。这种方法有利于检查簇相邻单元之间的机械相互作用。18.总体而言,到目前为止量化的属性位于蜂窝簇中规则间隔的网格点上。该数据识别单个细胞形态边界内所选属性的中位数,平均值和标准偏差,并将其分配为细胞物理属性/信号。从中,标准差用于指示变异性,平均值和中位数之间的差值用于指示分布的性质,中位数值用于指示所选属性的单元格的整体状态。- 第 1 部分:分割包含单元格的图像区域
注意:此步骤的手动输入包括标识数据目录和响应分段提示以检测来自无单元格区域的单元格。在此步骤中使用的以前创建的密钥文件包括"p*/phs/*.tif"。在此步骤中生成的关键新文件包括"p*/phs/bwImages/*.tif",它们是将单元格区域与非单元格区域分开的二进制图像,"p*/phs/textResults/frameNum_percentHealed.txt",它列出了每个实例中单元格覆盖的图像面积百分比,以及"p*/clusterInput.txt",它记录了在 AcTrM 界面中输入的用户选择。有关以下步骤的可视描述,请参阅 图 9 ,以分割包含单元格的图像区域。在计算细胞-细胞力之前,必须完成这一部分。在这种情况下,无需重复这些步骤。此外,如果在像元-像元力计算之前执行这些步骤,则在力计算开始时不会请求这些步骤。- 启动斐济软件,然后从 MSM 下拉菜单中选择 "分段 - 蜂窝群集"。
- 使用文件浏览器对话框,选择位置目录"analysis/p0"、"analysis/p1"等,其中包含在规则间隔的网格点上量化的属性。
- 指示单层是否汇合。
注意:仅当单层未融合时,才会调用以下步骤。按照AnViM提示应用新颖的多管齐下的方法识别包含细胞的图像区域。该过程涉及四种方法 - 每种方法都以不同的方式进行分割。这些方法中的一种或多种组合使用,涵盖了细胞的各种图像。因此,请尝试不同的方法来找到哪种组合最适合其数据。 - 调整"域连接因子"和"拖尾因子"以获得最佳分割效果。
注意:"涂片因子"使包含细胞的区域变大。 - 指示单元格在二进制图像中显示为黑色还是白色。
- 在 "清理边界图像的说明 "窗口中,选择是自动清洁图像还是手动清理图像。
注意:图像不需要的特征是细胞占据的像素上的黑点和与要分析的细胞簇断开连接的像素上的白点。只能对连接的区域进行分析。因此,必须单独分析多个断开连接的区域。
- 第2部分:图像中单个细胞的分割
注意:此步骤的手动输入包括识别数据目录和响应分割提示以检测图像中的单个单元格。在此步骤中使用的以前创建的关键文件包括"p*/phs/*.tif"和"p*/phs/bwImages/*.tif"。生成的关键新文件包括"p*/phs/textResults/*.csv",其中包含细胞形态学特性。参见 图10 ,了解以下步骤的可视化描述,以分割单层的单个细胞。- 启动斐济软件,然后从 MSM 下拉菜单中选择 "分割 - 单个单元格"。
- 使用文件浏览器对话框,选择位置目录"analysis/p0"、"analysis/p1"等,其中包含在规则间隔的网格点上量化的属性。
- 在 "选择输入参数 "窗口中,指示最大纵横比、像元中心与像元边界相比突出程度的突出程度,以及两个用于指导检测像元的模糊参数(附图 S10)。
- 在每个位置的图像堆栈上,在最小的法线像元上绘制一个多边形。这用于计算面积。任何小于此值的内容都不会被软件视为单元。
- 接下来,在最大的法线像元周围绘制一个面,并指示像元中心还是像元-像元界面更亮。
注意:然后,AnViM 会为每个包含该帧内单元格信息的帧创建文件"phs/textResults/0001.csv"、"phs/textResults/0002.csv"等。在此阶段,此文件包括有关细胞的形态信息,包括面积,质心,周长,方向,圆度,长宽比,圆度,坚固性,与无细胞区域的距离。这些属性中的长度单位是像素,角度以度为单位。最后,在后续步骤中,此文件将更新为包含蜂窝像素强度、运动和力。
- 第3部分:细胞上像素强度的映射
注意:此步骤中的手动输入包括标识数据目录以及选择映射属性和参数。在此步骤中使用的以前创建的关键文件包括"p*/phs/*.tif"(或"p*/fluo/*.tif")和"p*/phs/bwImages/*.tif"。在此步骤中生成的关键新文件包括"p*/phs/textResults/*.csv",其中列出了细胞形态学特性。请参阅 图 11 ,了解以下步骤的直观描述,以评估单个像元及其邻近区域所包含的区域中的像素强度,并将其定义为像元的属性。- 启动斐济软件,然后从 MSM 下拉菜单中选择" 在像元上绘制 - 强度"。
- 使用文件浏览器对话框,选择位置目录"analysis/p0"、"analysis/p1"等,其中包含在规则间隔的网格点上量化的属性。
- 选择检测细胞分裂或在软件提示时量化细胞荧光。定义相邻区域的大小。选中"收集相邻区域的属性"和"收集单元格的属性"框。单击 "确定"。
- 在"记录细胞强度"窗口中,指示用于强度映射的图像类型、相邻区域的大小以及是否为单个细胞或两个细胞及其相邻区域收集数据(补充图 S11)。
注:映射相差图像的像素强度可以检测细胞分裂事件。绘制荧光图像强度将能够检测荧光标记的细胞质分子的波动。上述步骤的输出是各个像元的平均值、中位数、标准差、最小值和最大像素强度值。这些数字作为新列输入到文件"phs/textResults/0001.csv"、"phs/textResults/0002.csv"等文件中。
- 第4部分:细胞上力和运动的映射
注意:此步骤的手动输入包括标识数据目录以及选择映射属性和参数。在此步骤中使用的以前创建的关键文件包括"p*/phs/textResults/*.csv"、"p*/velocity/*_vel.dat"、"p*/displacement/*_disp.dat"、"p*/traction/*_trac.dat"、"p*/prestress/*_prestress.dat"和"p*/phs/bwImages/*.tif"。在此步骤中不会创建新文件。相反,新信息(细胞力和运动属性)被添加到文件"p*/phs/textResults/*.csv"中。参见 图12 ,了解评估单个细胞及其邻近区域所包含区域中的力和运动并将其定义为细胞属性的步骤的直观描述。- 从 MSM 下拉菜单" 单元格地图 - 运动/力数据 "中进行选择(补充图S12)。
- 然后,按照步骤 2.4.3 中列出的步骤操作。
注:新列添加到文件"phs/textResults/0001.csv"、"phs/textResults/0002.csv"等中,包括速度的平均值、中位数和标准偏差、速度方向、平均细胞骨架张力、张力各向异性、水凝胶中的应变能、最高张力的方向以及细胞-ECM牵引的大小(补充图S13)。
- 第 1 部分:分割包含单元格的图像区域
- 结果可视化
- 第1部分:在整个实验中跟踪细胞身份
注意:此步骤的手动输入包括标识数据目录和选择要可视化的映射属性。此步骤中使用的以前创建的密钥文件包括"p*/phs/textResults/*.csv"。在此步骤中生成的关键新文件包括"p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv",其中包含蜂窝数据的时间跟踪。请参阅 图13 ,了解以下步骤的可视化描述,以在整个实验过程中跟踪单个细胞的性质。- 启动斐济软件,然后从 MSM 下拉菜单中选择 结果 - 跟踪数据。
- 使用文件浏览器对话框,选择位置目录"analysis/p0"、"analysis/p1"等,其中包含要跟踪的手机网络属性。完成后,单击" 选择"。
- 在 "选择跟踪的起始点 "窗口中,选择用于监视的起始帧以及同时跟踪的帧数(补充图 S14)。始终从第 2 帧开始,因为无法确定第 1 帧的速度。完成后,单击" 确定"。
- 在 "检查要制作轨迹的 变量"窗口中,通过键入变量名称或从复选框中选择术语来选择变量(补充图 S15)。然后,单击" 确定"。
注意:跟踪会生成"phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv"文件,其中每列包含唯一的单元格编号,并且每个连续行表示连续的时间实例。
- 第2部分:评估细胞特性的时间轨迹的生成
注意:此步骤的手动输入包括标识数据目录和选择要可视化的映射属性。此步骤中使用的以前创建的密钥文件包括"p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv"。在此步骤中生成的关键新文件包括包含时间跟踪图的"p*/phs/trackedDataPlots/*.tif"和包含绘制数据的"p*/phs/trackedDataPlots/*.csv"。有关以下步骤的可视化描述,请参阅 图 14 以生成评估的细胞属性的时间轨迹。- 启动斐济软件,然后从 MSM 下拉菜单中选择 结果 - 绘图。
- 使用文件浏览器对话框,选择位置目录"analysis/p0"、"analysis/p1"等,其中包含要绘制的跟踪的细胞属性。
- 通过单击"是"或"否"按钮,选择是否将绘图限制为具有不间断轨迹的单元格。
注意:此选项将忽略在一个或多个时间实例中无法检测到的单元格。 - 选择要同时绘制的变量数,然后单击 "确定"。
注意:目前,AnViM 允许在同一图中最多显示三个变量。 - 使用下拉菜单选择要绘制的单个变量。
注意:这些步骤将在"phs/trackedDataPlots/"文件夹中创建一个标记图像文件格式 (TIFF) 文件和一个逗号分隔的数据文件。文件名由下划线分隔的变量名称组成,并以单元格编号结尾。
- 第3部分:生成评估的细胞特性的热图
注意:此步骤中的手动输入包括标识数据目录和选择要可视化的映射属性。此步骤中使用的以前创建的密钥文件包括"p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv"。在此步骤中生成的关键新文件包括"p*/phs/segmentedImages/cellPropMaps/*.tif",它们是细胞属性的热图。参见 图15 ,了解生成评估细胞特性热图的步骤的直观描述。- 从 MSM 下拉菜单中选择 结果 - 图片。
- 按照步骤 2.5.2 中描述的步骤操作。
注意:输出作为 TIFF 文件文件存储在"phs/segmentedImages/cellPropMaps/"文件夹中。文件名是时间实例编号和变量名称,用下划线分隔。
- 第1部分:在整个实验中跟踪细胞身份
Representative Results
我们在这里介绍所演示示例的两个关键输出。第一个输出是细胞编号1的细胞速度和细胞骨架张力的时间痕迹(图16)。属性显示在共享的垂直轴上,以促进属性之间的视觉关联,水平轴指示时间实例编号。在该实验中,以15分钟的间隔获得连续帧。第二个输出是实验中1小时的热图数组(图17)。此处显示的属性包括扩散面积、方向、圆度、速度、运动方向、最大张力取向、细胞骨架张力、底物牵引和单个细胞的张力各向异性。
图1:用于分析蜂窝信号的集成工具包(iTACS)的结构。 iTACS的两个关键组件是采集和训练模块(AcTrM)以及分析和可视化模块(AnViM)。AcTrM可以使用目前存在的各种水凝胶制备技术来制备可以牢固地保持在显微镜载物台上的水凝胶,任何细胞接种以及将细胞保留在一个焦平面中的生长方案。AnViM可以使用各种技术来量化水凝胶和单层变形,细胞 - ECM力和细胞 - 细胞力。所有这些用户首选的力测量协议组件都可以在iTACS中容纳,并且它们已经用虚线框标识。用实心盒识别的组件是对细胞力测量技术的新贡献。AnViM 中的可视化侧重于各个单元格中属性的中值和可变性。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2:参考图像采集 - 第1部分。 使用 AcTrM 创建仓位列表的步骤。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3:参考图像采集 - 第2部分。 使用 AcTrM 获取参考图像的步骤。步骤 2、4 和 6 的详细视图分别显示在 补充图 S2、 S3 和 S4 中。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 4:剩余实验的自动图像采集。 恢复图像采集以使用 AcTrM 评估细胞行为的步骤。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 5:设置自动数据分析。 使用 AnViM 开始自动图像分析的步骤。该软件可识别AcTrM使用的图像格式。步骤3和5中面板的详细视图分别在 补充图S5 和 补充 图S6中显示。 请点击此处查看此图的放大版本。
图6:水凝胶和单层变形的定量 - 第1部分。 通过 AnViM参与Tseng,Q.等人的粒子图像测速实施的步骤,PNAS(2012)20 以量化水凝胶顶部表面的变形。用户还可以在AnViM中实施其他方法来量化水凝胶变形。步骤3的详细视图如 附图S7所示。 请点击此处查看此图的放大版本。
图7:水凝胶和单层变形的定量 - 第2部分。通过AnViM参与Tseng,Q.等人的粒子图像测速实现的步骤,PNAS(2012)20来量化单个细胞的局部运动。用户还可以在AnViM中实施其他方法来量化细胞运动。请点击此处查看此图的放大版本。
图8:细胞-ECM和细胞-细胞力的定量。 通过AnViM进行图像分析的步骤, 以 参与Trepat等人的傅里叶变换牵引显微镜实现,Nature Physics(2009)15 以量化细胞对水凝胶施加的力,以及Tambe等人的单层应力显微镜实现,Nature Materials(2011)1 以量化单个细胞内和相邻细胞之间的力。用户还可以在AnViM中实施其他方法来量化细胞ECM和细胞 - 细胞力。步骤6的详细视图如 附图S8 和 附图S9所示。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 9:映射单个像元上的网格点值 - 第 1 部分。 使用新颖的多管齐下的方法分割包含细胞的图像区域的步骤。这种方法可用于分割细胞的相差,明场或荧光图像。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 10:映射单个像元上的网格点值 - 第 2 部分。 使用AnViM中开发的新型多管齐下的方法分割单层单个细胞的步骤。这种方法可用于分割细胞的相差,明场或荧光图像。步骤2的详细视图如图 S10所示。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 11:映射单个像元上的网格点值 - 第 3 部分。 使用 AnViM 评估单个细胞内区域以及单个细胞相邻区域内的像素强度的步骤。评估的强度包括透射光强度和荧光强度。此部分映射单个像元内以及单个像元的相邻区域内像素强度的中值和标准差。步骤2的详细视图如 附图S11所示。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 12:映射单个像元上的网格点值 - 第 4 部分。 使用 AnViM 评估单个单元内以及单个单元的相邻区域内网格点的力和运动属性的步骤。此部分映射单个像元内以及各个像元的相邻区域内属性的中值和标准差。步骤 2 和 3 的详细视图显示在 补充图 S12 和 补充图 S13 中。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 13:结果可视化 - 第 1 部分。 使用AnViM在整个实验过程中跟踪单个细胞属性的步骤。步骤 2 和 3 的详细视图显示在 补充图 S14 和 补充 图 S15 中。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 14:结果可视化 - 第 2 部分。 使用 AnViM 生成评估属性的时间跟踪的步骤。用户可以选择在一个图形中绘制最多三个属性。为所有细胞或仅为在整个实验中成功跟踪的细胞生成时间痕迹。步骤5的详细视图如 附图S16 和 补充图S17所示。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 15:结果可视化 - 第 3 部分。 使用 AnViM 生成评估属性的热图的步骤。将为起始帧之后的所有帧和所有选定属性生成热图。步骤3的详细视图在补充 图S18中给出。 请点击此处查看此图的放大版本。
图 16:单元格 ID 1 的时间迹线。 显示的两个属性是细胞骨架张力("avgtenMedian")和细胞速度("speedMedian")。细胞骨架张力和细胞速度都被量化为细胞内网格点的中位值。这两个属性使用任意单位绘制在同一轴上,以可视化评估属性之间的关系。 补充表 S1 中列出了其他变量名称。 请点击此处查看此图的放大版本。
图17:分析单层中单个细胞性质的热图。 每个单元格都使用面板中指示的属性的中值进行着色。因此,深红色表示色谱中的最大细胞值,深蓝色表示所分析的单层中的最小细胞值。如Tambe等人,PLoS One(2013)2中所述,位于边界附近的细胞具有受图像外部细胞未知特性影响的机械力。因此,将为远离边界的像元生成热图。 请点击此处查看此图的放大版本。
图S1:顶部和底部荧光珠的样品图像。请点击此处下载此文件。
图 S2:图 3 中步骤 2 的详细视图。请点击此处下载此文件。
图 S3:图 3 中步骤 4 的详细视图。请点击此处下载此文件。
图S4 A:图3中步骤6的详细视图。请点击此处下载此文件。
图 S5:图 5 中步骤 3 的详细视图。请点击此处下载此文件。
图 S6:图 5 中步骤 5 的详细视图。请点击此处下载此文件。
图 S7:图 6 中步骤 3 的详细视图。请点击此处下载此文件。
图S8:图8中步骤6的单元-ECM力输出的详细视图。请点击此处下载此文件。
图S9:图8中步骤6的细胞-细胞力输出的详细视图。请点击此处下载此文件。
图 S10:图 10 中步骤 2 的详细视图。请点击此处下载此文件。
图 S11:图 11 中步骤 2 的详细视图。请点击此处下载此文件。
图 S12:图 12 中步骤 2 的详细视图。请点击此处下载此文件。
图 S13: 图 12 中步骤 3 输出的详细视图。 请点击此处下载此文件。
图 S14:图 13 中步骤 2 的详细视图。请点击此处下载此文件。
图 S15:图 13 中步骤 3 的详细视图。请点击此处下载此文件。
图 S16:图 14 中步骤 5 中生成的数据文件的详细视图。请点击此处下载此文件。
图 S17:图 14 中步骤 5 中生成的绘图的详细视图。请点击此处下载此文件。
图S18:热图的详细视图和包含图15中步骤4中生成的色谱范围的文件。请点击此处下载此文件。
表 S1:由 iTACS 量化的选定属性列表。请点击此处下载此表格。
Discussion
贴壁细胞使用机械和化学信号来生存,生长和功能。各种各样的显微镜软件通过基于荧光的成像优化了评估化学信号的用户体验。然而,机械信号的评估涉及标准显微镜软件中没有的功能。此外,当数据采集与数据分析相结合时,机械信号的评估效率最高。缺乏满足机械信号评估独特需求的统一平台一直是实验细胞生物学中的主要技术差距。用于分析蜂窝信号的集成工具包(iTACS)旨在满足这一差距。iTACS的两个组成部分,AnViM和AcTrM,为用户提供了必要的功能来量化四大类的细胞特性:力,运动,形态和荧光/亮度。在这些类别中,iTACS目前能够揭示单个贴壁细胞的50多个独特方面。这些方面包括每个广泛类别的特定性质,包括它们在细胞中的代表性值和变异性(补充表S1)。例如,在力内,细胞骨架上有拉伸力,这种张力的各向异性,最大张力的方向以及穿过细胞-ECM界面的剪切应力,这对贴壁细胞的行为有深远的影响1,3,6。
一种检查单层单个细胞机械行为的新方法
单层的单个细胞参与化学和机械性质的信号交换3。这两种类型的信号以不同的方式在蜂窝单层上传输23。然而,机械信号传输知识落后于化学信号传输。这种知识差距与持续缺乏简单直观的方法来评估细胞机械信号相吻合。这里描述的新颖数据映射方法足以填补这一空白。这种映射表明,细胞邻近区域内在细胞骨架张力的波动可作为弛豫,流态化和锚定信号,调节细胞形状,大小和细胞速度的变化18。邻近区域的属性图表现出"多细胞细分"模式,其中细分内的细胞暴露在相对均匀的微环境中,而细分边界的细胞暴露在非常不均匀的微环境中18。
力测量技术的可访问性
存在多种方案来制造PAA水凝胶,分析水凝胶变形和细胞运动,并量化细胞 - ECM和细胞 - 细胞力1,2,7,8,9,13,14,15,18,20,21,24,25,26,27,28,29,30,31,32.然而,这些发展仍然超出了普通细胞生物学实验室的范围,并且仅限于具有工程专业知识的实验室。通过自动化这些方法的技术方面,并将它们集成到一个统一且用户友好的平台下,iTACS的目标是使机械信号的评估成为实验细胞生物学研究和教育中的常规活动。
ImageJ 允许用户使用几乎不需要培训的方法开发应用程序11。iTACS 主要使用简单的脚本编写方法构建,以促进社区驱动的持续开发。大部分 AcTrM 使用 BeanShell 脚本进行编程,大部分 AnViM 使用 ImageJ 宏进行编程。这些脚本和在用户显微镜上实现这些功能的指南可通过 GitHub(https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS)获得。
采集图像的质量标准化
尽管基于弹性底物的量化贴壁细胞物理力的技术已经在各种实验室中开发和实施,但该协议仍然缺乏标准化。最需要标准化的一个领域是采集的顶部珠子图像的质量(补充图S1)。在整个实验过程中,焦点漂移会产生重大问题。我们新颖的基于参考图像的重新聚焦方法使这种聚焦成为一个客观的过程。AcTrM 第一步中定义的参数施加了必要的客观质量限制。其他标准化措施可以在未来版本的 AcTrM 中编程。
iTACS的广泛适用性
除了量化贴壁细胞的许多方面外,iTACS结构还有助于其用于各种实验方案和需求。AcTrM 允许软件引导的用户自我培训。例如,同时评估细胞质钙波动所需的高速成像目前受到重新定位和重新聚焦硬件速度的限制,最好一次在一个位置完成。然而,目前的实现对于长期成像,中断成像具有良好的条件,其中样品在整个实验过程中不能保留在显微镜载物台上。由于参考图像是在实验开始时采集的,因此iTACS能够对机械信号进行实时成像,从而为药物筛选应用开辟了新的途径。AnViM允许用户以外行术语提供高度技术性的信息。量化广泛的细胞特性并在整个实验过程中跟踪它们的能力构成了发现新的细胞间通信机制所需的关键能力。
对于iTACS的未来发展,我们确定了四个重点领域:(1)提高数据采集和数据分析速度,(2)实施评估新蜂窝信号的方法13,(3)开发基于iTACS的蜂窝信号评估的研讨会和教育模块,(4)开发低成本自动化解决方案。
Disclosures
作者声明没有利益冲突。
Acknowledgments
D.T.T.感谢南阿拉巴马大学肺生物学中心附属的工作人员激发了关于实验细胞生物学研究需求的讨论。这些讨论对于启动iTACS的发展至关重要。
这项工作得到了美国国立卫生研究院/国家心肺血液研究所P01 HL66299和R37 HL60024(史蒂文斯),R01-HL118334(Alvarez),F32-HL144040-01(Xu)以及南阿拉巴马大学通过亚伯拉罕米切尔癌症研究基金(Singh,Palanki,Tambe),研究和学术发展补助金(Tambe),荣誉学院和暑期本科生研究员(Nguyen)的部分资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Reagents and components used in prepare glass surface for hydrogel coating | |||
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane, 97% | Aldrich chemistry | 13822565 | |
2% Bis Solution | Bio-rad | 1610142 | |
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate,98% | Acros organics | 2530850 | |
40% Acrylamide Solution | Bio-rad | 1610140 | |
Glass bottom 35 mm dish/ 6 or 12 or 24 well plates | MatTek or CellVis | ||
Glutaraldehyde, EM Grade, 25% | Polysciences | 1909100 | |
Sodium Hydroxide | Sigma-aldrich | 1002074706 | |
Reagents and components used in preparing suitable hydrogel | |||
2% Bis Solution | Bio-rad | 1610142 | |
40% Acrylamide Solution | Bio-rad | 1610140 | |
Ammonium Persulfate | Bio-rad | 1610700 | |
Cover Slips | Electron Microscopy Sciences | 7222301 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1M) | Gibco | 14190136 | |
FluoSpheres carboxylate 0.2 um, yellow-green(505/515) | Invitrogen | F8811 | |
FluoSpheres carboxylate 0.5 um, red(580/605) | Invitrogen | F8812 | |
FluoSpheres carboxylate 2.0 um, red(580/605) | Invitrogen | F8826 | |
Rain-X | |||
TEMED | Bio-rad | 1610801 | |
Reagents used in coating extracellular matrix on the hydrogel | |||
Collagen Type I Rat Tail | Corning | 354236 | |
HEPES(1M) | Gibco | 15630080 | |
Phosphate Buffered Saline (1M) | Gibco | 10010023 | |
Sulfo-SANPAH | CovaChem | 102568434 | |
Microscope hardware used in the current study | |||
Camera | Hamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS Camera | C11440-42U | |
H117 ProScanTM Stages | Prior Scientific | ||
Light source- Lambda DG4 and Lambda DG5 | Sutter instrument company | ||
Microscope | Nikon eclipse TE2000-S | 550372 | |
ProScan III Universal Microscope Automation Controller | Prior Scientific | ||
Stagetop incubator | ibidi | 11922 | |
Stepper Motor Focus Drive | Prior Scientific |
References
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