Integrativt verktøysett for å analysere cellulære signaler: krefter, bevegelse, morfologi og fluorescens

Summary

Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS)-plattformen automatiserer prosessen med samtidig måling av et bredt utvalg av kjemiske og mekaniske signaler i adherentceller. iTACS er designet for å lette samfunnsdrevet utvikling og gjøre det mulig for forskere å bruke alle plattformfunksjoner uavhengig av utdanningsbakgrunn.

Abstract

Kvantitativ vurdering av cellulære krefter og bevegelse har utviklet seg betydelig de siste fire tiårene. Disse fremskrittene ga rammene for å undersøke innsiktsfulle mekaniske signalprosesser i cellekultursystemer. Feltet står imidlertid for tiden overfor tre problemer: mangel på kvalitetsstandardisering av de oppkjøpte dataene, tekniske feil i dataanalyse og visualisering, og kanskje viktigst av alt, teknologien forblir stort sett utenfor rekkevidde for vanlige cellebiologiske laboratorier. For å overvinne disse begrensningene utviklet vi en ny eksperimentell plattform - Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS). iTACS består av to komponenter: Anskaffelses- og opplæringsmodul (AcTrM) og analyse- og visualiseringsmodul (AnViM). AcTrM er basert på μManager - en NIH-ImageJ-basert mikroskopkontrollprogramvare - og letter brukerens selvopplæring og automatisering av vanlige bildeanskaffelsesprotokoller. AnViM er basert på NIH-ImageJ og legger til rette for brukervennlig automatisering av dataanalyse og innsiktsfull visualisering av resultater. Disse eksperimentene innebærer å dyrke tilhengerceller på hydrogeler, avbilde fiducial markører innebygd i hydrogelen, og til slutt trekke ut fra disse bildene en omfattende mekanisk karakterisering av cellene. For tiden gjør iTACS det mulig for brukeren å analysere og spore et bredt spekter av egenskaper, inkludert morfologi, bevegelse, cytoskeletale krefter og fluorescens av individuelle celler og deres nærliggende region. Kvalitetsstandardiseringsproblemet ble løst i AcTrM med en referansebildestyrt refokuseringsteknikk. De tekniske problemene i dataanalyse ble løst i AnViM med en flerdelt bildesegmenteringsprosedyre, en brukervennlig tilnærming for å identifisere grensebetingelser og en ny mobil eiendomsbasert datavisualisering. AcTrM er designet for å lette enkel transformasjon av grunnleggende fluorescensmikroskoper til eksperimentelle cellemekanikkrigger, og AnViM er utstyrt for å gjøre det mulig for brukere å måle cellulære mekaniske signaler uten å kreve ingeniørbakgrunn. iTACS vil være tilgjengelig for forskningsmiljøet som en åpen kildekode-pakke med fellesskapsdrevne utviklingsmuligheter.

Introduction

Vanlige optiske bildebehandlings- og dataanalyseverktøy bruker maskinvare- og programvareteknologier som er nesten foreldet. Etterslepet i oversettelse og implementering av fremskritt innen elektroniske enheter, beregningstilnærminger og matematisk analyse i vanlige eksperimentelle cellebiologiske verktøy er en stor begrensning på veksttakten i vår kunnskap om cellulær fysiologi. For tiden finner cellebiologiforskere molekylærbiologiske verktøy innen rekkevidde, men verktøy basert på tekniske prinsipper som skal være utenfor rekkevidde. Et slikt ingeniørprinsipperbasert verktøy er Monolayer Stress Microscopy (MSM)^1,2. Mens MSM har blitt tilpasset og studert i ulike laboratorier over hele verden, er bruken primært begrenset til laboratorier med ingeniørkompetanse3,4,5,6,7,8,9.

NIH-ImageJ er et av de mest populære open source-verktøyene blant cellebiologiforskere10. Bidragsdrevne fremskritt i brukersamfunnet har vært sentrale i ^{populariteten11,12}. ImageJ har funksjoner som lar brukerne utvikle programmer med en blanding av et avansert programmeringsspråk og forenklede skripttilnærminger. Disse funksjonene gjør det mulig for brukere med grunnleggende programmeringskunnskap å implementere, tilpasse og fremme ethvert nytt bidrag til programvaren. Basert på disse egenskapene til NIH-ImageJ har vi utviklet Integrative Toolkit for å analysere cellulære signaler (iTACS), som muliggjør en rimelig integrasjon av ønsket maskinvare og programvareverktøy for å automatisere målingen av et bredt utvalg av kjemiske og mekaniske signaler på tvers av ^{tilhengerceller11,12}.

iTACS består av to komponenter: Anskaffelses- og opplæringsmodul (AcTrM) og analyse- og visualiseringsmodul (AnViM). AcTrM er bygget på μManager - et NIH-ImageJ-basert bildeanskaffelsesprogram - for å gjøre det mulig for brukere å sette opp tidsforløpmålinger av tradisjonelle optiske egenskaper og en rekke fysiske egenskaper til tilhørende celler i flere ^prøver12. AcTrM forenkler brukeropplæringen gjennom konsise retninger som er inkludert i det grafiske grensesnittet. I tillegg har den en ny funksjon av referansebildebasert autofokusering som er designet for å lette sanntidsmålinger av fysiske krefter og muliggjøre kvalitetsstandardisering av de oppkjøpte dataene.

AnViM er bygget på ImageJ-plugins, fremskyndet programvare og filhåndteringsskript som gjør det mulig for brukere å kvantitativt vurdere mer enn 50 egenskaper, inkludert cellulær form, størrelse, orientering, hastighet og bevegelsesretning, trekkrafter som utøves på den ekstracellulære matrisen (ECM), og på nærliggende celler, kontraktile og skjær øyeblikk av både individuelle følgeceller og deres naboregion. AnViM gjør det mulig for brukere å kvantifisere de cellulære fysiske egenskapene uten å mestre den underliggende tekniske ^bakgrunnen11. Videre muliggjør den dataanalyse i en interaktiv eller satsvis behandlingsmodus. Det genererer varmekart som avslører romlig variasjon og grafer som viser den tidsmessige variasjonen av egenskapene til individuelle celler.

I et typisk eksperiment kulturer brukeren celler på en elastisk hydrogel med passende ekstracellulære matriseproteiner på toppoverflaten og to typer innebygde fluorescerende markører. I hovedsak er bilder av disse fluorescerende markørene før og etter dyrking av cellene tilstrekkelig til å kvantifisere kreftene i og rundt individuelle ^celler2,13. AnViM kartlegger disse resultatene til individuelle celler i tilhengerklyngen og genererer innsiktsfulle bilder og grafer.

Protocol

MERK: Prøver som undersøkes ved hjelp av iTACS-plattformen, er celler som følges av et mykt substrat. Protokollen for vurdering av mekaniske og kjemiske signaler er delt inn i to sekvensielle deler: Anskaffelses- og opplæringsmodul (AcTrM) og analyse- og visualiseringsmodul (AnViM).

1. Anskaffelses- og opplæringsmodul (AcTrM)

MERK: AcTrM automatiserer prosessen med datainnsamling og selvopplæring av brukere. Før en datainnsamling, lag et mykt substrat som er i stand til å gi informasjon som er nødvendig for å kvantifisere krefter som celler utøver på den.

1. Hydrogel forberedelse
   MERK: Målet her er å forberede en 1250 Pa skjær modulus, ca 100 μm tykkelse, og 22 mm diameter polyakrylamid (PAA) hydrogel.
   1. Forbered polyakrylamidoppløsning ved å følge metoden til Yeung et al. og kast hydrogelene ved å følge trinnene beskrevet av Trepat et ^al.14,15. Et unntak fra prosedyren er at perlene som er innebygd umiddelbart under cellene, er 0,5 μm i diameter og avgir gul fluorescens.
   2. Hopp over trinnet med å feste 2 μm perler til dekselglasset hvis visningsområdet forventes å ha et stort cellefritt område.
      MERK: Hydrogels forberedelsesprotokoll er nå ganske etablert på ^feltet16. Gjennom den påfølgende beskrivelsen blir de 0,5 μm perlene referert til som "toppperler", og de 2 μm perlene kalles "bunnperler". De nederste perlene er imidlertid valgfrie der det avbildede området inneholder et stort cellefritt område. Det øverste perlemønsteret fra et slikt cellefritt område vil tjene formålet med bunnperlemønsteret.
   3. Monter hydrogelen med innebygde fluorescerende perler på mikroskopstadiet.
   4. La det være 15-20 min for at temperaturen på platen skal oppnå en steady-state.
      MERK: Platens toppoverflate er funksjonalisert med ekstracellulære matriseproteiner, men cellene er ennå ikke sådd på hydrogelen.
2. Referansebildeanskaffelse
   1. Del 1: Opprette en stillingsliste
      MERK: Manuell inngang i dette trinnet inkluderer å følge AcTrM-ledetekstene for å velge steder med den beste perledistribusjonen. Ingen tidligere opprettede filer brukes i dette trinnet. Viktige nye mapper som produseres i dette trinnet inkluderer mappene t0imgs, tnimgs og textfiles, og filen som produseres, inneholder plasseringslistefilen. Se figur 2 for den visuelle beskrivelsen av følgende trinn som styrer opprettelsen av en posisjonsliste ved hjelp av AcTrM. Det demonstrerte eksemplet henter data ved 20x forstørrelse.
      1. Start μManager 2.0 - Beta.
      2. Kjør AcTrM ved å klikke actrm.bsh-knappen i vinduet IMBL Resources .
      3. I vinduet Definer anskaffelsesegenskaper velger du riktig målsetting, toleranse for nøyaktigheten av lateral posisjon (dvs. XY) gjenoppretting, trinnstørrelsen på den grove og raffinerte refokuseringen (dvs. z) og verdien av akseptabel bildekorrelasjonskoeffisient for fokusgjenoppretting.
         MERK: En finere toleranse for gjenoppretting av laterale posisjoner vil redusere posisjonsgjenvinningen, men en betydelig toleranse vil trenge posisjonskorrigering under dataanalyse og kan føre til vanskeligheter med å gjenopprette fokus. En mindre trinnstørrelse vil redusere refokuseringsoperasjonen, men en veldig høy trinnstørrelse kan føre til rask bevegelse med muligheter til å gå glipp av fokuset.
      4. I vinduet AcTrM - trinn 0 velger du Ny anskaffelse for å opprette en stillingsoversikt.
         MERK: Vinduet actrm - trinn 1 viser alle de neste trinnene. Disse trinnene innebærer å flytte scenen, justere fokus og klikke på knapper i μManager. Disse trinnene veileder i å konstruere listen over stillinger som passer for datainnsamling.
      5. Klikk på Live in Micromanager for å visualisere prøvene for manuelle justeringer som er oppført i AcTrM - Trinn 1-vinduet .
      6. Følg trinnene som er oppført i dette vinduet.
      7. Nå skaffe bildet av perlene. Velg riktig kanal for de øverste perlene.
      8. Sørg for å se på bunnperlene også. For å gjøre det, velg kanalene for de nederste perlene. Et uklart bilde av bunnperler er sett.
         MERK: Kanaler kan byttes fra den forhåndsinnstilte rullegardinmenyen i hovedvinduet i μManager. Hvis bunnperlene brukes i eksperimentet, må du sørge for at de er til stede i den valgte posisjonen. Disse perlene vil virke uklare.
      9. Når du velger riktig posisjon, klikker du på Merk i vinduet Plasseringsliste for å lagre posisjonen.
         MERK: Den beste posisjonen er definert av en tett og jevn fordeling av de øverste perlene som er innebygd rett under toppoverflaten (dvs. toppperler) og minst to perler festet til dekkglasset (dvs. bunnperler) (supplerende figur S1). Fokusgjenoppretting er raskere hvis de nederste perlene vises som store ringer utenfor fokus. Men hvis eksperimenter gjøres i en posisjon uten behov for fokus eller lateral posisjon utvinning, ignorere instruksjoner knyttet til bunnen perler bilde.
      10. Følg trinn 6-9 som er beskrevet i figur 2 , for å inkludere flere posisjoner i listen.
          MERK: Velg noen ekstra posisjoner slik at en elimineringsrunde kan tillate de beste posisjonene som er valgt på platen.
   2. Del 2: Oppkjøp av referansebilder
      MERK: Dette trinnet involverer ingen manuelle inndata. Tidligere opprettede nøkkelfiler som brukes i dette trinnet inkluderer 'tekstfiler /*.pos'. Viktige nye filer og mapper produsert i dette trinnet inkluderer de i mappene t0imgs og tnimgs. Se figur 3 og tilleggsfigur S2 for den visuelle beskrivelsen av følgende trinn som styrer anskaffelsen av referansebilder ved hjelp av AcTrM. Vinduet AcTrM - Trinn 2 viser også alle de viktigste trinnene.
      1. Følg trinnene som er oppført i vinduet AcTrM - Trinn 2 , og foreta valgene i vinduet Flerdimensjonal anskaffelse . Hvis du for eksempel vil utføre en lang tidsforløp, angir du et antall bilder som skal tas, velger den første kanalen som fasekanal, og deretter velger du den neste for de øverste perlene og den etter det er for bunnperler. Klikk Lukk i vinduet Flerdimensjonal anskaffelse , og klikk deretter ok i vinduet ActrM - Trinn 2 .
      2. I actrm - trinn 3-vinduet velger du å engasjere den referansebildebaserte XYZ-posisjonsgjenopprettingen. Valget er generelt ja. Men hvis bilder er anskaffet i en posisjon uten rom for fokus eller scenedrift, vil valget i AcTrM - Trinn 3-vinduet være Nei.
      3. I vinduet AcTrM - XYZ Recovery Options angir du kanalen for grov XYZ-gjenoppretting, om du vil utføre raffinert XYZ-gjenoppretting, region og kanal for raffinert XYZ-gjenoppretting og retningen for å begynne å fokusere på nytt (tilleggsfigur S4). Når den er fullført, vil AcTrM skaffe seg referansebilder.
         MERK: Typiske valg for kanalen vil være den nederste perlekanalen. XYZ-gjenoppretting fungerer best når den utføres med hele bildet i gjeldende implementering. Referansebilder vil vanligvis inkludere et overført lysbilde av hydrogelen, et fluorescerende bilde av toppperler og et fluorescerende bilde av bunnperlene. Innholdet i hvert bildesett kan variere avhengig av valgene som er gjort i vinduet Flerdimensjonal anskaffelse . Likevel vil programvaren skaffe referansebildesettet i hver posisjon bestemt i figur 2. På slutten av dette trinnet opprettes tre mapper i den valgte katalogen: t0imgs, tnimgs og textfiles. Mappen t0imgs inneholder referansebilder i formatet som gjenkjennes av μManager og brukes i de påfølgende trinnene. 'tnimgs' mappen inneholder separate TIFF-bilder med filnavn 'c0_p0_t0.tif', 'c1_p0_t0.tif', etc. Her står 'c' for kanalen, 'p' står for stillingen, og 't' står for tiden. Etter disse bokstavene finner du henholdsvis kanalnummer, posisjonsnummer og rammenummer. Mappen "tekstfiler" inneholder plasseringslisten i XML-format og brukervalg for bildeanskaffelse og posisjonsgjenoppretting.
3. Cellesåing og vekst
   MERK: iTACS-plattformen har fleksibiliteten til å imøtekomme prøveprepareringsprotokoller som brukes i vanlig in vitro-vurdering av mekanisk oppførsel av adherentceller, inkludert sparsomme celler, fullt konfluente monolayer, nettverksformasjonsanalyse og monolayers med hull eller betydelige hull.
   1. Kultur rotte lungemikrovaskulære endotelceller til samløp i en ^kolbe17,18.
   2. Koble fra cellene ved hjelp av trypsin. Resuspend cellene i et kulturmedium som inneholder 10% foster bovint serum til en konsentrasjon 1 x ¹⁰⁶ celler / ml.
   3. Plasser en 5 μL dråpe av de resuspenderte cellene på en delvis tørr hydrogeloverflate og plasser den i cellekulturinkubatoren.
      MERK: Etter 2 dager i kulturmediet som inneholder 10% foster bovint serum, danner cellene i det dråpen en overfylt øy av ^celler1.
4. Automatisert bildeanskaffelse for det gjenværende eksperimentet
   MERK: Manuelle inndata for dette trinnet inkluderer å følge AcTrM-ledetekstene for å gjenoppta bildeanskaffelsen. Nøkkel tidligere opprettede filer som brukes av dette trinnet inkluderer 'tekstfiler /*.pos' og bunnperle bildefiler i mappen 't0imgs'. Viktige nye filer produsert i dette trinnet inkluderer oppdaterte posisjonslistefiler og bilder 'tnimgs/*_t*.tif'.
   1. Sørg for at mikroskopets miljøkontrollsystem når stabile vevskulturforhold.
   2. Monter platen som inneholder dyrkede celler, forsiktig på mikroskopstadiet.
   3. La 15-20 min for temperatur og fuktighet stabilisere seg.
      MERK: Se figur 4 for den visuelle beskrivelsen av følgende trinn som styrer anskaffelsen av bilder for det gjenværende eksperimentet ved hjelp av AcTrM.
   4. Start μManager 2.0 - Beta.
   5. Kjør AcTrM ved å klikke actrm.bsh-knappen i vinduet IMBL Resources .
      MERK: Ignorer valgene som ble gjort i vinduet Definer anskaffelsesegenskaper, men bruk valgene som ble gjort i forrige trinn.
   6. I vinduet AcTrM - trinn 0 velger du Fortsett anskaffelsespause.
   7. Velg forstørrelsen og katalogen som ble identifisert i vinduet Flerdimensjonal anskaffelse i det tidligere trinnet der datamapper ('t0imags', 'tnimgs' og 'tekstfiler') ble lagret.
      MERK: Tittelen på vinduet veileder brukeren til å velge riktig katalog.
   8. I vinduet Omplassering av platen velger du valg for omplassering av platen (tre ikke-fargede posisjoner) sammen med kanalen som brukes til omplassering.
      MERK: Lagrede bilder vises i kameraet. Hvis overlappende bilder vises som et rødt, grønt og svart fargebilde, utfører du manuell justering.
   9. Klikk på Godta for å fortsette med oppkjøpet.
      MERK: Dette trinnet overvinner de små skiftene fra irreproducibility av platejustering når platen monteres på mikroskopstadiet. Følg AcTrM-ledetekster for å fremskynde justeringen ved hver av de tre posisjonene ved å vise et sammensatt bilde av referansebildet vist i rødt (vanligvis av de nederste perlene) og bildet som for øyeblikket observeres gjennom målsettingen vist i grønt. Å få greenen tilstrekkelig nær rødt etterlater mindre arbeid for programvaren. Når overlappingen er perfekt, vises det sammensatte bildet gult og svart. Tilstrekkelig nær er vanligvis når de samme bunnperlene er synlige i både røde og grønne bilder, og de tilsvarende røde og grønne ut-av-fokus-ringene berører hverandre. Når plateomplasseringen er fullført, tar AcTrM scenen til hver valgte posisjon og gjenoppretter XYZ-posisjonen ved å matche referansebildet med det som for øyeblikket ses gjennom kameraet. Den første laterale posisjonen (XY) samsvarer, og deretter samsvarer fokusposisjonen (Z). Grov utvinning etterfølges av raffinert utvinning av posisjon og fokus. Oppdateringer av gjeldende status for eksperimentet vises på skjermen gjennom et firedelt vindu vist i Tilleggsfigur S3. De oppkjøpte bildene lagres i tnimgs-mappen etter *_t1.tif, *_t2.tif, som angir tidsantallet for bildesettet. Hvis XYZ-gjenoppretting identifiserer en oppdatert posisjon, genereres og lagres den nye posisjonslisten i mappen tekstfiler.

2. Analyse- og visualiseringsmodul (AnViM)

1. Sette opp automatisert dataanalyse
   MERK: Manuelle inndata i dette trinnet inkluderer å identifisere plasseringen av 'tnimgs' -mappen. Nøkkel tidligere opprettede filer som brukes i dette trinnet inkluderer 'tnimgs/*.tif'. Viktige nye filer og mapper produsert i dette trinnet inkluderer "analyse" -mappen i samme overordnede mappe som "tnimgs" og mapper for hver posisjon "analyse / p *". I hver 'analyse/p*' oppretter dette trinnet en ny '*.tif' bildefiler i 'phs' og 'tny' mapper. Disse bildene er beskårne og avdrevne bilder av celler og toppperler. De andre filene som er opprettet inkluderer 'analyse / analyseChoices.txt' som viser analysevalg, 'analyse / p */ skipAnalysis.txt', som viser forekomster der analyse hoppes over på grunn av betydelig eksisterende drift, og 'analyse / p * / part_shift_values_pixel_degree.dat' som viser estimerte driftverdier. AnViM endrer ikke rådataene i mappen tnimgs. Se figur 5 for den visuelle beskrivelsen av følgende trinn som styrer oppsettet av automatisert dataanalyse ved hjelp av AnViM.
   1. Start Fiji-programvaren og velg det første alternativet i MSM-rullegardinmenyen merket som MSM - forhåndsbehandling.
   2. Ved hjelp av filleserdialogboksen velger du mappen som inneholder mappen tnimgs, som inneholder de analyserte dataene.
   3. Definer kanalen for bildene. Etter retningslinjene fra Supplementary Figure S5, identifiser kanalnumrene til det overførte lysbildet av cellene (fasekontrastbilde av cellene), bilde av bunnperler og toppperler. Følgende tre avmerkingsbokser ('Flytt filer til posisjonsmappen', 'Gjør ytterligere korreksjon for stiv bevegelse', og 'Beskjær data og lagre i posisjonsmappe') er vanligvis merket. Til slutt definerer du toleransen for å avvise data med mye drift, pikselstørrelse og sider av bildet der cellene krysser hverandre.
   4. Svar på ledeteksten for å forbedre lysstyrken og kontrasten til de nederste perlebildene slik at perlene vises fremtredende. Juster dette ved hjelp av glidebryteren i menyen og klikk på OK.
   5. Utfør nå posisjonskorrigering for å kvitte seg med skiftene, hvis noen. Når du er ferdig, opprettes det en analysemappe.
      MERK: Kontrastforbedring er vanligvis ikke nødvendig, men denne bestemmelsen er tilgjengelig for eksperimenter der eksponering for lasere må minimeres. Etter det valget kopierer AnViM filene fra 'tnimgs' -mappen til 'analyse' -mappen. Filene som tilsvarer hver posisjon lagres i mappene 'analyse / p0, analyse / p1', etc. I hver av disse posisjonsmappene lager AnViM mappene "cels", "defs" og "refs" som inneholder det opprinnelige overførte lysbildet, toppperler og bilder med bunnperler (tilleggsfigur S6). AnViM analyserer deretter stiv bevegelse i bildene av de nederste perlene og oppretter en 'phs' mappe som inneholder et korrigert overført lysbilde av cellene og en 'tny' mappe som inneholder oppdaterte toppperler bilder. Til slutt lagres brukervalg for kanaler, operasjoner, toleranse, pikselstørrelse og grenseovergang i 'analyseChoices.txt' -filen (Tilleggsfigur S6).
2. Kvantifisering av deformasjon av hydrogel og monolayer
   MERK: Det er viktig å merke seg at kvantifisering av bevegelse fra en sekvens av bilder er et felt i rask ^utvikling19. Teknologien er kontinuerlig optimalisert for funksjoner, inkludert hastighet, nøyaktighet, spesifikke funksjoner i RAW-bildene og spesifikke deformasjonsmønstre. Derfor er det sannsynlig at noen brukere kan bruke en annen deformasjons kvantifiseringstilnærming enn den som presenteres her.
   1. Del 1: Kvantifisering av hydrogeldeformasjon
      MERK: Manuelle inndata i dette trinnet inkluderer identifisering av datakatalog og valg av rutenettoppløsning. Nøkkel tidligere opprettede filer som brukes i dette trinnet inkluderer 'p */tny/*.tif'. Viktige nye filer produsert i dette inkluderer 'p */forskyvning/*_disp.dat' som viser forskyvningsvektorer på den øverste overflaten av hydrogelen. Se figur 6 for den visuelle beskrivelsen av følgende trinn for å engasjere, via AnViM, particle image velocimetry analyse på de øverste perlene ^bilder20.
      1. Start Fiji-programvaren, og velg MSM - Gel Deformasjon på rullegardinmenyen MSM.
      2. Herfra velger du alternativet som passer for eksperimentet.
      3. Bruk dialogboksen for filleser til å velge den overordnede mappen for analysemappen som inneholder de analyserte dataene.
      4. I vinduet Parametere for beregning av geldeformasjon velger du riktig vindusstørrelse, støynivå og terskelverdi på tvers av korrelasjoner (tilleggsfigur S7)²⁰.
         MERK: Resultatene lagres i en nyopprettet "forskyvningskatalog" i hver posisjonsmappe 'analyse / p0, analyse / p1', etc. Det er her alle utdatafilene er lagret.
   2. Del 2: Kvantifisering av monolayer deformasjon
      MERK: Manuelle inndata i dette trinnet inkluderer å identifisere datakatalogen og valg av rutenettoppløsning. Nøkkel tidligere opprettede filer som brukes i dette trinnet inkluderer 'p */tny/*.tif'. Viktige nye filer produsert i dette inkluderer 'p */hastighet/*_vel.dat' som viser bevegelsesvektorer av cellene. Se figur 7 for den visuelle beskrivelsen av trinnene for å engasjere, via AnViM, particle image velocimetry analyse på de øverste perlene ^bilder20. Prosedyren ligner den som følges for kvantifisering av hydrogeldeformasjon og velger MSM - Cellular Motion fra MSM-rullegardinmenyen . Resultatene lagres i en nyopprettet "hastighetskatalog" i hver posisjonsmappe "analyse / p0", "analyse / p1", etc.
3. Kvantifisering av celle-ECM og cellecellekrefter
   MERK: Manuelle inndata i dette trinnet inkluderer å identifisere datakatalogen, indikere hydrogelstivheten og svare på segmenteringsmeldinger for cellulære klynger for å oppdage celler fra ikke-celleområdet. Nøkkel tidligere opprettede filer som brukes i dette trinnet inkluderer 'p */forskyvning/*_disp.dat'. Viktige nye filer produsert i dette trinnet inkluderer: 'p */trekkraft/*_trac.dat', som viser krefter som utøves av cellene på hydrogelen; 'p*/trekkraft/*_domain.dat', som viser plasseringen av rutenettpunkter som inneholder celler; og inndatafiler 'p*/traction.in, p*/clusterInput.txt' og 'p*/prestress.in' som registrerer brukervalg for dette trinnet. Etter den første kvantitative vurderingen av celle-ECM og cellecellekrefter er det utviklet flere variasjoner i ^{teknikken1,15}. Variasjonene fokuserer på bestemte tilfeller av substrater, celler, eksperimentelle forhold eller numeriske verktøy7,8,21,22. Se figur 8 for den visuelle beskrivelsen for å engasjere deg via AnViM, Fourier Transform Traction Microscopy og Monolayer Stress Microscopy-analysen på hydrogeldeformasjonsdataene1,2,15.
   1. Start Fiji-programvaren, og velg MSM - Cell-ECM og Cell-Cell Forces (tredje alternativ i rullegardinmenyen) på rullegardinmenyen MSM - Cell-ECM og Cell-Cell Forces (tredje alternativ i rullegardinmenyen).
   2. Ved hjelp av filleserdialogboksen velger du den overordnede katalogen til "analyse" -mappen som inneholder mappene 'tnimgs' og 'analyse' som inneholder analyserte data. Klikk på Velg.
   3. I vinduet Parametere for beregning av cellulære krefter angir du skjærmodulus, tykkelse på hydrogelen og det forventede støynivået. Velg OK. Dette lar den utføre trekkraft via MATLAB-funksjonen.
      MERK: Etter disse inngangene beregner AnViM celle-ECM-krefter.
   4. Deretter angir du om monolayer er confluent. Hvis hele cellebildet er dekket med celler, er svaret Ja. I så fall beregnes cellecellekreftene over hele rammen. På den annen side, hvis en del av bildet ikke har celler, er svaret Nei. I så fall følger du AnViM-ledetekster for å gjøre det enklere å segmentere bildeområdet som inneholder celler.
   5. Hvis svaret er nei, tegner du en polygon manuelt rundt ikke-celleobjektet når programvaren ber om det, og deretter velger du en passende metode(er) for segmentering. Programvaren vil be om fargen (svart eller hvit) av cellene.
   6. Merk av for Fyll flekker automatisk i programvaren og klikk på OK.
      MERK: Trinnene for segmentering av et ikke-sammenfallende monolag vil bli dekket i første del av 'Avsnitt 2.4. Cell-ECM-krefter lagres i '* _trac.dat ' filer i en nyopprettet katalog 'trekkraft' i hver posisjonsmappe, og inngangen til celle-ECM force beregning programvare er lagret i filen 'traction.in' (Supplerende figur S8). Cellecellekrefter lagres i *_prestress.dat-filer i en nyopprettet katalog 'prestress' i hver posisjonsmappe, og inngangen til cellecellekraftberegningsprogramvaren lagres i filen 'prestress.in' (Tilleggsfigur S9).
4. Tilordne rutenettpunktverdier for enkeltceller
   MERK: Et av de nåværende fokusene på iTACS er å innføre en enkel tilnærming for å tolke de målte mekaniske signalene i feltet. Denne tilnærmingen er gunstig for å undersøke mekaniske interaksjoner mellom nærliggende celler i en klynge¹⁸. Totalt sett kvantifiseres egenskapene til nå på rutenettpunkter med jevne mellomrom på tvers av mobilklyngen. Disse dataene identifiserer median-, gjennomsnitts- og standardavvik for utvalgte egenskaper innenfor den morfologiske grensen til enkeltceller og tilordner dem som cellulære fysiske egenskaper/signaler. Fra disse brukes standardavviket til å indikere variasjon, forskjellen mellom gjennomsnitt og median brukes til å indikere distribusjonsarten, og medianverdien brukes til å indikere den generelle tilstanden til cellene for de valgte egenskapene.
   1. Del 1: Segmentering av bildeområdet som inneholder celler
      MERK: Manuelle inndata til dette trinnet inkluderer å identifisere datakatalog og svare på segmenteringsledetekstene for å oppdage celler fra ikke-celleområdet. Nøkkel tidligere opprettede filer som brukes i dette trinnet inkluderer 'p * / phs / * .tif '. Viktige nye filer produsert i dette trinnet inkluderer 'p */phs/bwImages/*.tif' som er binære bilder som skiller celleregioner fra ikke-celleregioner, 'p */phs/textResults/frameNum_percentHealed.txt', som viser prosentbildeområdet som dekkes av celler i hver forekomst, og 'p */clusterInput.txt', som registrerer brukervalg angitt i AcTrM-grensesnittet. Se figur 9 hvis du vil ha den visuelle beskrivelsen av følgende trinn for å segmentere bildeområdet som inneholder celler. Denne delen må fullføres før du beregner cellecellekreftene. I så fall trenger ikke disse trinnene gjentas. Hvis disse trinnene utføres før cellecellekraftberegningene, blir de heller ikke forespurt i begynnelsen av kraftberegningene.
      1. Start Fiji-programvaren, og velg Segmentering - Cellular Cluster fra rullegardinmenyen MSM.
      2. Ved hjelp av nettleserdialogboksen velger du posisjonskatalogen 'analyse/p0', 'analyse/p1', etc., som inneholder egenskaper kvantifisert på rutenettpunkter med jevne mellomrom.
      3. Angi om monolayeren er sammenfallende.
         MERK: Trinnene nedenfor aktiveres bare når monolayeren ikke er sammenfallende. Følg AnViM-ledetekster for å bruke den nye flerdelte tilnærmingen for å identifisere bildeområdene som inneholder celler. Prosessen innebærer fire metoder - hver nærmer seg segmentering på en annen måte. En eller flere av disse metodene som brukes i kombinasjon dekker et bredt utvalg av bilder av cellene. Prøv derfor forskjellige tilnærminger for å finne ut hvilken kombinasjon som fungerer best for dataene deres.
      4. Juster 'Domenetilkoblingsfaktor' og 'Smørefaktor' for å oppnå optimal segmentering.
         MERK: Smørefaktoren gjør regionene som inneholder celler større.
      5. Angi om cellene vises i svart eller hvitt i det binære bildet.
      6. I vinduet Veibeskrivelse for å rengjøre grensebildet velger du om du vil rengjøre bildet automatisk eller manuelt.
         MERK: Uønskede funksjoner i bildene er svarte flekker på pikslene okkupert av celler og hvite flekker på pikslene som er koblet fra celleklyngen som skal analyseres. Analyse kan bare utføres på områdene som er koblet sammen. Så flere frakoblede regioner må analyseres separat.
   2. Del 2: Segmentering av de enkelte cellene i bildene
      MERK: Manuelle inndata til dette trinnet inkluderer å identifisere datakatalogen og svare på segmenteringsledetekstene for å oppdage individuelle celler i bildet. Nøkkel tidligere opprettede filer som brukes i dette trinnet inkluderer 'p */phs/*.tif' og 'p */phs/bwImages/*.tif'. Viktige nye filer produsert inkluderer 'p */phs/textResults/*.csv', som inneholder cellulære morfologiske egenskaper. Se figur 10 for den visuelle beskrivelsen av følgende trinn for å segmentere enkeltceller i monolayeren.
      1. Start Fiji-programvaren, og velg Segmentering - Individuelle celler på rullegardinmenyen MSM.
      2. Ved hjelp av nettleserdialogboksen velger du posisjonskatalogen 'analyse/p0', 'analyse/p1', etc., som inneholder egenskaper kvantifisert på rutenettpunkter med jevne mellomrom.
      3. I vinduet Velg inndataparametere angir du det maksimale størrelsesforholdet, hvor mye cellesenteret skiller seg ut sammenlignet med cellegrensen, og to uskarphetsparametere for å lede deteksjonen av cellene (Tilleggsfigur S10).
      4. Tegn en polygon på den minste normalcellen i bildestakken for hver plassering. Dette brukes til å beregne området. Noe mindre enn dette vil ikke bli ansett som en celle av programvaren.
      5. Deretter tegner du en polygon rundt den største normale cellen og angir om cellesenteret eller cellecellegrensesnittet er lysere.
         MERK: AnViM oppretter deretter filene 'phs/textResults/0001.csv', 'phs/textResults/0002.csv' , etc., for hver ramme som inneholder informasjon om celler innenfor rammen. På dette stadiet inneholder denne filen morfologisk informasjon om cellene, inkludert område, centroid, perimeter, orientering, sirkularitet, størrelsesforhold, avrundethet, soliditet, avstand fra no-cell-regionen. Lengdeenheten i disse egenskapene er piksler, og vinkelen er i grader. Til slutt oppdateres denne filen for å inneholde intensitet, bevegelse og krefter for mobilpiksler i de påfølgende trinnene.
   3. Del 3: Kartlegging av pikselintensitetene på cellene
      MERK: Manuelle inndata i dette trinnet inkluderer å identifisere datakatalogen og velge tilordningsegenskaper og parametere. Viktige tidligere opprettede filer som brukes i dette trinnet inkluderer 'p */phs/*.tif' (eller 'p*/fluo/*.tif ') og 'p*/phs/bwImages/*.tif'. Viktige nye filer produsert i dette trinnet inkluderer 'p */phs/textResults/*.csv', som viser cellulære morfologiske egenskaper. Se figur 11 for den visuelle beskrivelsen av følgende trinn for å vurdere pikselintensitetene i regionen som omfattes av enkeltceller og deres nærliggende region, og definer dem som egenskaper for cellene.
      1. Start Fiji-programvaren, og velg Kart over celler - intensiteter på rullegardinmenyen MSM.
      2. Ved hjelp av nettleserdialogboksen velger du posisjonskatalogen 'analyse/p0', 'analyse/p1', etc., som inneholder egenskaper kvantifisert på rutenettpunkter med jevne mellomrom.
      3. Velg Oppdag celledeling eller Kvantifiser cellulær fluorescens når du blir bedt om det av programvaren. Definer størrelsen på naboområdet. Merk av for både Samle inn egenskaper for naboområdet og Samle inn egenskaper for cellene . Klikk på OK.
      4. I vinduet Formål med registrering av celleintensitet angir du hvilken type bilde som skal brukes til intensitetstilordning, størrelsen på naboregionen og om data samles inn for enkeltceller eller begge celler og deres nærliggende regioner (Tilleggsfigur S11).
         MERK: Kartlegging av pikselintensitetene i et fasekontrastbilde gjør det mulig å oppdage celledelingshendelser. Kartlegging av fluorescerende bildeintensiteter vil muliggjøre deteksjon av svingninger i de fluorescerende merkede cytoplasmatiske molekylene. Utdataene for trinnene ovenfor er gjennomsnitts-, median-, standardavviks-, minimums- og maksimumsverdier for bildepunktintensitet for enkeltceller. Disse tallene er angitt som nye kolonner i filene 'phs/textResults/0001.csv', 'phs/textResults/0002.csv' , etc.
   4. Del 4: Kartlegging av krefter og bevegelse på cellene
      MERK: Manuelle inndata til dette trinnet inkluderer å identifisere datakatalogen og velge tilordningsegenskaper og parametere. Viktige tidligere opprettede filer som brukes i dette trinnet inkluderer 'p */phs/textResults/*.csv', 'p*/hastighet/*_vel.dat', 'p*/forskyvning/*_disp.dat', 'p*/trekkraft/*_trac.dat', 'p*/prestress/*_prestress.dat', og 'p*/phs/bwImages/*.tif '. Ingen nye filer opprettes i løpet av dette trinnet. I stedet legges den nye informasjonen (cellulær kraft og bevegelsesegenskaper) til filene 'p */phs/textResults/*.csv '. Se figur 12 for den visuelle beskrivelsen av trinnene for å vurdere kreftene og bevegelsene i regionen som omfattes av enkeltceller og deres nærliggende region, og definer dem som egenskaper for cellene.
      1. Velg fra rullegardinmenyen MSM Kart over celler - bevegelses-/kraftdata (tilleggsfigur S12).
      2. Følg deretter trinnene som er oppført i trinn 2.4.3.
         MERK: Nye kolonner legges til filene 'phs/textResults/0001.csv', 'phs/textResults/0002.csv', etc. og inkluderer gjennomsnittlig, median og standardavvik for hastighet, orientering av hastighet, gjennomsnittlig cytoskeletal spenning, spenningsanisotropi, belastningsenergi i hydrogelen, orienteringen av høyeste spenning og størrelsen på celle-ECM-trekkraft (Tilleggsfigur S13).
5. Visualisering av resultater
   1. Del 1: Sporing av mobilidentitetene på tvers av eksperimentet
      MERK: Manuelle inndata til dette trinnet inkluderer å identifisere datakatalogen og velge tilordnede egenskaper for å visualisere. Viktige tidligere opprettede filer som brukes i dette trinnet inkluderer 'p */phs/textResults/*.csv'. Viktige nye filer produsert i løpet av dette trinnet inkluderer 'p */phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv', som inneholder et tidsspor av mobildataene. Se figur 13 hvis du vil ha den visuelle beskrivelsen av trinnene nedenfor for å spore egenskapene til enkeltceller i løpet av eksperimentets varighet.
      1. Start Fiji-programvaren, og velg Resultater - Spor data på rullegardinmenyen MSM.
      2. Ved hjelp av filleserdialogboksen velger du posisjonskatalogen 'analyse / p0', 'analyse / p1', etc., som inneholder mobilegenskaper som skal spores. Når du er ferdig, klikker du på Velg.
      3. I vinduet Velg startpunkt for sporing velger du startrammen for overvåking, og antall delbilder som spores samtidig (tilleggsfigur S14). Start alltid fra ramme nummer 2, da hastighet ikke kan bestemmes for rammenummer 1. Når du er ferdig, klikker du på OK.
      4. I vinduet Kontroller variablene som skal lage spor velger du variablene enten ved å skrive inn variabelnavnene eller merke av for termene fra avmerkingsboksene (Tilleggsfigur S15). Klikk deretter på OK.
         MERK: Sporing genererer 'phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv'-filer med hver kolonne som inneholder et unikt cellenummer og hver etterfølgende rad som representerer den påfølgende tidsforekomsten.
   2. Del 2: Generering av tidsspor av de vurderte mobilegenskapene
      MERK: Manuelle inndata til dette trinnet inkluderer å identifisere datakatalogen og velge tilordnede egenskaper for å visualisere. Viktige tidligere opprettede filer som brukes i dette trinnet inkluderer 'p */phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv'. Viktige nye filer produsert i løpet av dette trinnet inkluderer 'p */phs/trackedDataPlots/*.tif', som inneholder tidssporplott og 'p */phs/trackedDataPlots/*.csv', som inneholder plottdata. Se figur 14 for den visuelle beskrivelsen av følgende trinn for å generere tidsspor for de vurderte mobilegenskapene.
      1. Start Fiji-programvaren, og velg Resultater - plott fra rullegardinmenyen MSM.
      2. Ved hjelp av filleserdialogboksen velger du posisjonskatalogen 'analyse / p0', 'analyse / p1', etc., som inneholder sporede mobilegenskaper som skal plottes.
      3. Velg om du vil begrense plottingen til celler med ubrutte spor ved å klikke Ja eller Nei .
         MERK: Dette alternativet ignorerer cellene, som ikke kunne oppdages i en eller flere tidsforekomster.
      4. Velg antall variabler som skal tegnes inn samtidig, og klikk på OK.
         MERK: For øyeblikket tillater AnViM maksimalt tre variabler som skal vises i samme plott.
      5. Velg individuelle variabler for plotting ved hjelp av en rullegardinmeny.
         MERK: Disse trinnene oppretter en TIFF-fil (tagged image file format) og en kommadelt datafil i mappen 'phs/trackedDataPlots/'. Filnavnet består av variabelnavn atskilt med et understrekingstegn og slutter med et cellenummer.
   3. Del 3: Generering av varmekart over de vurderte cellulære egenskapene
      MERK: Manuelle inndata i dette trinnet inkluderer å identifisere datakatalogen og velge tilordnede egenskaper for å visualisere. Viktige tidligere opprettede filer som brukes i dette trinnet inkluderer 'p */phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv'. Viktige nye filer generert i dette trinnet inkluderer 'p */phs/segmentedImages/cellPropMaps/*.tif', som er varmekart over cellulære egenskaper. Se figur 15 for den visuelle beskrivelsen av trinnene for å generere varmekart over de vurderte cellulære egenskapene.
      1. Velg fra rullegardinmenyen MSM Resultater - Bilde.
      2. Følg trinnene som er beskrevet i trinn 2.5.2.
         MERK: Utgangen lagres som TIFF-filfiler i mappen 'phs/segmentedImages/cellPropMaps/'. Filnavnene er tidsforekomstnummeret og variabelnavnet atskilt med et understrekingstegn.

Representative Results

Vi presenterer her to av nøkkelutgangene for det demonstrerte eksemplet. Den første utgangen er tidssporet for cellulær hastighet og cytoskeletal spenning for celle nummer 1 (figur 16). Egenskapene vises på en delt loddrett akse for å lette den visuelle tilknytningen mellom egenskapene, og den vannrette aksen angir tidsforekomstnummer. I dette eksperimentet ble etterfølgende rammer oppnådd med et intervall på 15 minutter. Den andre utgangen er en rekke varmekart 1 t inn i eksperimentet (figur 17). Egenskapene som vises her inkluderer spredningsområde, orientering, sirkularitet, hastighet, bevegelsesretning, maksimal spenningsorientering, cytoskeletal spenning, substratgrep og spenningsanisotropi av individuelle celler.

Figur 1: Struktur av integrativt verktøysett for å analysere mobilsignaler (iTACS). To nøkkelkomponenter i iTACS er Anskaffelses- og opplæringsmodul (AcTrM) og analyse- og visualiseringsmodul (AnViM). AcTrM kan bruke ulike hydrogelforberedelsesteknikker som for tiden eksisterer for å forberede hydrogeler som kan holdes fast på et mikroskopstadium, enhver cellesåing og en vekstprotokoll som beholder celler i ett fokusplan. AnViM kan bruke ulike teknikker for å kvantifisere hydrogel- og monolagdeformasjonen, celle-ECM-kreftene og cellecellekreftene. Alle disse bruker foretrukne komponentene i kraftmålingsprotokollen kan innkvarteres i iTACS, og de er identifisert med stiplede bokser. Komponentene identifisert med faste bokser er nye bidrag til mobil kraftmålingsteknologi. Visualisering i AnViM fokuserer på medianverdien og variasjonen av egenskapene på tvers av enkeltceller. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2: Referansebildeanskaffelse - del 1. Trinn for å opprette en stillingsliste ved hjelp av AcTrM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3: Referansebildeanskaffelse - del 2. Fremgangsmåte for å hente referansebilder ved hjelp av AcTrM. Detaljerte visninger av trinn 2, 4 og 6 presenteres i tilleggstallene S2, S3 og S4. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 4: Automatisert bildeanskaffelse for det gjenværende eksperimentet. Fremgangsmåte for å gjenoppta bildeanskaffelse for å vurdere mobilatferd ved hjelp av AcTrM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 5: Sette opp automatisert dataanalyse. Trinn for å starte automatisert bildeanalyse ved hjelp av AnViM. Programvaren gjenkjenner bildeformatet som brukes av AcTrM. En detaljert visning av panelene i trinn 3 og 5 er presentert i henholdsvis supplerende figur S5 og supplerende figur S6. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 6: Kvantifisering av deformasjon av hydrogel og monolayer - del 1. Fremgangsmåte for å engasjere, via AnViM, partikkelbilde velocimetry implementeringen av Tseng, Q. et al., PNAS (2012)²⁰ for å kvantifisere deformasjon av den øverste overflaten av hydrogelen. Brukere kan også implementere innenfor AnViM andre tilnærminger for å kvantifisere hydrogel deformasjon. En detaljert oversikt over trinn 3 presenteres i supplerende figur S7. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 7: Kvantifisering av deformasjon av hydrogel og monolayer - del 2. Fremgangsmåte for å engasjere, via AnViM, partikkelbilde velocimetry implementeringen av Tseng, Q. et al., PNAS (2012)²⁰ for å kvantifisere den lokale bevegelsen til individuelle celler. Brukere kan også implementere i AnViM andre tilnærminger for å kvantifisere cellulær bevegelse. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 8: Kvantifisering av celle-ECM og cellecellekrefter. Fremgangsmåte for å utføre bildeanalyse for å engasjere, via AnViM, Fourier Transform Traction Microscopy-implementeringen av Trepat et al., Nature Physics (2009)¹⁵ for å kvantifisere krefter som utøves av cellene på hydrogelen, og Monolayer Stress Microscopy-implementeringen av Tambe et al., Nature Materials (2011)¹ for å kvantifisere krefter i individuelle celler og mellom nærliggende celler. Brukere kan også implementere i AnViM andre tilnærminger for å kvantifisere celle-ECM og cellecellekrefter. En detaljert oversikt over trinn 6 er presentert i supplerende figur S8 og supplerende figur S9. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 9: Tilordne rutenettpunktverdier på enkeltceller - del 1. Fremgangsmåte for å segmentere bildeområdene som inneholder celler ved hjelp av en ny flerdelt tilnærming. Denne tilnærmingen kan brukes til å segmentere fasekontrast-, lysfelt- eller fluorescensbilder av cellene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 10: Tilordne rutenettpunktverdier på enkeltceller - del 2. Fremgangsmåte for å segmentere individuelle celler i en monolayer ved hjelp av en ny multi-pronged tilnærming utviklet i AnViM. Denne tilnærmingen kan brukes til å segmentere fasekontrast-, lysfelt- eller fluorescensbilder av cellene. En detaljert oversikt over trinn 2 er presentert i supplerende figur S10. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 11: Tilordne rutenettpunktverdier på enkeltceller - del 3. Fremgangsmåte for å vurdere pikselintensiteter i området i enkeltceller og innenfor naboområdet til enkeltceller ved hjelp av AnViM. Intensitetene som vurderes inkluderer overført lysintensitet og fluorescensintensitet. Denne delen tilordner medianverdien og standardavviket for pikselintensitetene i enkeltceller og innenfor et nærliggende område av enkeltceller. En detaljert oversikt over trinn 2 er presentert i supplerende figur S11. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 12: Tilordne rutenettpunktverdier på enkeltceller - del 4. Fremgangsmåte for å vurdere krefter og bevegelsesegenskaper for rutenettpunktene i enkeltceller og innenfor naboområdet til enkeltceller ved hjelp av AnViM. Denne delen tilordner medianverdien og standardavviket for egenskapene i enkeltceller og innenfor et nærliggende område av enkeltceller. En detaljert oversikt over trinn 2 og 3 er presentert i supplerende figur S12 og supplerende figur S13. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 13: Visualisering av resultater - del 1. Fremgangsmåte for å spore egenskaper for enkeltceller i løpet av hele eksperimentets varighet ved hjelp av AnViM. En detaljert oversikt over trinn 2 og 3 er presentert i supplerende figur S14 og supplerende figur S15. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 14: Visualisering av resultater - del 2. Fremgangsmåte for å generere tidssporinger av de vurderte egenskapene ved hjelp av AnViM. Brukeren har muligheten til å tegne inn opptil tre egenskaper i ett diagram. Tidssporinger genereres enten for alle celler eller bare de cellene som sporingen var vellykket for gjennom hele eksperimentet. En detaljert oversikt over trinn 5 er presentert i supplerende figur S16 og supplerende figur S17. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 15: Visualisering av resultater - del 3. Fremgangsmåte for å generere varmekart over de vurderte egenskapene ved hjelp av AnViM. Varmekart genereres for alle rammer etter startrammen og alle de valgte egenskapene. En detaljert oversikt over trinn 3 presenteres i supplerende figur S18. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 16: Tidssporinger for celle-ID 1. To egenskaper som vises er den cellulære cytoskeletale spenningen ("avgtenMedian") og cellulær hastighet ("speedMedian"). Både cellulær cytoskeletal spenning og cellulær hastighet kvantifiseres som medianverdien på tvers av rutenettpunktene i cellene. De to egenskapene tegnes inn på samme akse med vilkårlige enheter for å visualisere relasjoner mellom de vurderte egenskapene. Flere variabelnavn er oppført i Supplerende tabell S1. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 17: Varmekart over egenskapene til enkeltceller på tvers av det analyserte monolayeret. Hver celle er farget med medianverdien til egenskapen som er angitt i panelet. Dermed indikerer dyp rød den maksimale cellulære verdien i fargespekteret, og dyp blå indikerer den minste cellulære verdien på tvers av den analyserte monolayeren. Som beskrevet i Tambe et al., PLoS One (2013)², har cellene som ligger nærmere grensen mekaniske krefter påvirket av ukjente egenskaper til cellene utenfor bildet. Derfor genereres varmekartet for celler langt fra grensen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur S1: Prøvebilder av den øverste og nederste fluorescerende perlen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S2: En detaljert visning av trinn 2 fra figur 3. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S3: En detaljert visning av trinn 4 fra figur 3. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S4 A: detaljert visning av trinn 6 fra figur 3. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S5: En detaljert visning av trinn 3 fra figur 5. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S6: En detaljert visning av trinn 5 fra figur 5. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S7: En detaljert visning av trinn 3 fra figur 6. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S8: En detaljert visning av celle-ECM-kraftutgangen på trinn 6 fra figur 8. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S9: En detaljert visning av cellecellekraftutgangen i trinn 6 fra figur 8. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S10: En detaljert visning av trinn 2 fra figur 10. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S11: En detaljert visning av trinn 2 fra figur 11. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S12: En detaljert visning av trinn 2 fra figur 12. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S13: En detaljert oversikt over utdataene for trinn 3 fra figur 12. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S14: En detaljert visning av trinn 2 i figur 13. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S15: En detaljert visning av trinn 3 fra figur 13. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S16: En detaljert visning av datafiler generert i trinn 5 fra figur 14. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S17: En detaljert visning av et plott generert i trinn 5 fra figur 14. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S18: En detaljert visning av et varmekart og filen som inneholder fargespekterets område generert i trinn 4 fra figur 15. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tabell S1: En liste over valgte egenskaper kvantifisert av iTACS. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Adherent-celler bruker både mekaniske og kjemiske signaler for å overleve, vokse og fungere. Et bredt utvalg av mikroskopi programvare optimaliserer brukeropplevelsen i å vurdere kjemiske signaler gjennom fluorescensbasert avbildning. Imidlertid innebærer vurdering av de mekaniske signalene evner som ikke er tilgjengelige i standard mikroskopiprogramvare. Videre er vurderingen av mekaniske signaler mest effektiv når datainnsamlingen integreres med dataanalyse. Mangelen på en enhetlig plattform som oppfyller de unike behovene til mekanisk signalvurdering har vært et stort teknologisk gap i eksperimentell cellebiologi. Integrative Toolkit for å analysere mobilsignaler (iTACS) er designet for å møte dette gapet. De to komponentene i iTACS, AnViM og AcTrM utstyrer brukerne med de nødvendige mulighetene til å kvantifisere cellulære egenskaper i fire brede kategorier: krefter, bevegelse, morfologi og fluorescens /lysstyrke. På tvers av disse kategoriene er iTACS for tiden i stand til å avsløre mer enn 50 unike aspekter ved individuelle tilhengerceller. Disse aspektene omfatter spesifikke egenskaper for hver brede kategori, inkludert deres representative verdi og variasjon på tvers av cellen (Supplerende tabell S1). For eksempel, innenfor kreftene, er det strekkkrefter over cytoskjelettet, anisotropi av denne spenningen, orienteringen av maksimal spenning og skjærspenning over celle-ECM-grensesnittet som har en dyp innflytelse på oppførselen til tilhengerceller1,3,6.

En ny tilnærming for å undersøke den mekaniske oppførselen til individuelle celler i en monolayer
Individuelle celler av en monolayer er engasjert i utveksling av signaler av kjemisk og mekanisk ^natur3. Disse to typer signaler overføres over det cellulære monolayeret på en annen ^måte23. Den mekaniske signaloverføringskunnskapen henger imidlertid etter kjemisk signaloverføring. Dette kunnskapsgapet sammenfaller med en vedvarende mangel på enkle og intuitive tilnærminger for å vurdere cellulære mekaniske signaler. Den nye datakartleggingsmetoden som er beskrevet her, er utstyrt for å fylle dette gapet. Slik kartlegging viser at svingninger i iboende cytoskeletal spenning i naboregionen av en celle tjener som avslapnings-, fluidiserings- og forankringssignaler som regulerer endringer i cellulær form, størrelse og hastighet på ^cellen18. Kart over egenskapene til nærliggende regioner viser "multicellulære underinndelingsmønstre" der celler i underinndelingen blir utsatt for et relativt ensartet mikromiljø, og cellene ved grensen til underavdelingen blir utsatt for et bemerkelsesverdig ikke-enhetlig ^{mikromiljø18}.

Tilgjengelighet av kraftmålingsteknologien
Det finnes en rekke protokoller for å lage PAA-hydrogeler, analysere hydrogeldeformasjon og cellulær bevegelse og kvantifisere celle-ECM og cellecellekrefter1,2,7,8,9,13,14,15,18,20,21,24,25,26,27 ^,28,29,30,31,32. Imidlertid forblir denne utviklingen utenfor rekkevidden til vanlige cellebiologiske laboratorier og begrenset til laboratorier med ingeniørkompetanse. Ved å automatisere de tekniske aspektene ved disse tilnærmingene og integrere dem under en enhetlig og brukervennlig plattform, er målet med iTACS å gjøre vurdering av mekaniske signaler til en rutinemessig aktivitet i eksperimentell cellebiologiforskning og utdanning.

ImageJ lar brukerne utvikle applikasjoner ved hjelp av tilnærminger som krever liten eller ingen ^opplæring11. iTACS er i stor grad bygget ved hjelp av enkle skripttilnærminger for å lette samfunnsdrevet fortsatt utvikling. En stor del av AcTrM er programmert ved hjelp av BeanShell-skript, og hoveddelen av AnViM er programmert ved hjelp av ImageJ Macros. Disse skriptene og veiledningen for implementering av disse funksjonene på brukerens mikroskop er tilgjengelige via GitHub (https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS).

Kvalitetsstandardisering av de oppkjøpte bildene
Selv om de elastiske substratbaserte teknikkene for å kvantifisere fysiske krefter i tilhengerceller er utviklet og implementert i ulike laboratorier, mangler protokollen fortsatt standardisering. Et område som trenger standardisering mest er kvaliteten på de oppkjøpte toppperlene (Supplementary Figure S1). Vesentlige problemstillinger oppstår fra driften i fokus gjennom hele eksperimentet. Vår nye referansebildebaserte refokuseringsmetode gjør en slik fokusering til en objektiv prosess. Parametrene som er definert i det aller første trinnet i AcTrM, pålegger nødvendige objektive kvalitetsgrenser. Andre standardiseringstiltak kan programmeres i fremtidige versjoner av AcTrM.

Den brede anvendbarheten av iTACS
I tillegg til å kvantifisere mange aspekter av tilhengerceller, letter iTACS-strukturen bruken for ulike eksperimentelle protokoller og behov. AcTrM tillater programvarestyrt bruker selvopplæring. Høyhastighetsavbildning som kreves av for eksempel samtidig vurdering av cytoplasmatiske kalsiumsvingninger, er for tiden begrenset av hastigheten på omplassering og refokusering av maskinvare og gjøres best på ett sted om gangen. Imidlertid er den nåværende implementeringen godt utstyrt for langsiktig avbildning, avbrutt bildebehandling, hvor prøven ikke kan beholdes på mikroskopstadiet i hele eksperimentets varighet. Siden referansebildene er anskaffet i begynnelsen av eksperimentet, muliggjør iTACS sanntidsavbildning av mekaniske signaler, og åpner nye veier i narkotikascreeningsapplikasjoner. AnViM lar brukerne gi svært teknisk informasjon i lekmannsbetingelser. Evnen til å kvantifisere et bredt spekter av cellulære egenskaper og spore dem gjennom hele eksperimentet utgjør kritiske evner som trengs for å oppdage nye intercellulære kommunikasjonsmekanismer.

For den fremtidige utviklingen av iTACS har vi identifisert fire fokusområder: (1) forbedring av datainnsamlings- og dataanalysehastighet, (2) implementering av tilnærminger for å vurdere nye cellulære ^signaler13, (3) utvikling av workshops og utdanningsmoduler på iTACS-basert cellulær signalvurdering, (4) utvikling av rimelige automatiseringsløsninger.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and components used in prepare glass surface for hydrogel coating
(3-Aminopropyl)trimethoxysilane, 97%	Aldrich chemistry	13822565
2% Bis Solution	Bio-rad	1610142
3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate,98%	Acros organics	2530850
40% Acrylamide Solution	Bio-rad	1610140
Glass bottom 35 mm dish/ 6 or 12 or 24 well plates	MatTek or CellVis
Glutaraldehyde, EM Grade, 25%	Polysciences	1909100
Sodium Hydroxide	Sigma-aldrich	1002074706
Reagents and components used in preparing suitable hydrogel
2% Bis Solution	Bio-rad	1610142
40% Acrylamide Solution	Bio-rad	1610140
Ammonium Persulfate	Bio-rad	1610700
Cover Slips	Electron Microscopy Sciences	7222301
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1M)	Gibco	14190136
FluoSpheres carboxylate 0.2 um, yellow-green(505/515)	Invitrogen	F8811
FluoSpheres carboxylate 0.5 um, red(580/605)	Invitrogen	F8812
FluoSpheres carboxylate 2.0 um, red(580/605)	Invitrogen	F8826
Rain-X
TEMED	Bio-rad	1610801
Reagents used in coating extracellular matrix on the hydrogel
Collagen Type I Rat Tail	Corning	354236
HEPES(1M)	Gibco	15630080
Phosphate Buffered Saline (1M)	Gibco	10010023
Sulfo-SANPAH	CovaChem	102568434
Microscope hardware used in the current study
Camera	Hamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS Camera	C11440-42U
H117 ProScanTM Stages	Prior Scientific
Light source- Lambda DG4 and Lambda DG5	Sutter instrument company
Microscope	Nikon eclipse TE2000-S	550372
ProScan III Universal Microscope Automation Controller	Prior Scientific
Stagetop incubator	ibidi	11922
Stepper Motor Focus Drive	Prior Scientific