Summary
Her beskriver vi en protokoll for å skape utviklingsrelevante humane hjerteorganoider (hHOer) effektivt ved hjelp av menneskelige pluripotente stamceller av selvorganisering. Protokollen er avhengig av sekvensiell aktivering av utviklingssignaler og produserer svært komplekse, funksjonelt relevante menneskelige hjertevev.
Abstract
Evnen til å studere menneskelig hjerteutvikling i helse og sykdom er svært begrenset av evnen til å modellere kompleksiteten til den menneskelige hjerteintroen. Å utvikle mer effektive organlignende plattformer som kan modellere komplekse in vivo-fenotyper , som organoider og organer-på-en-chip, vil forbedre evnen til å studere menneskelig hjerteutvikling og sykdom. Dette dokumentet beskriver en protokoll for å generere svært komplekse humane hjerteorganoider (hHOer) ved hjelp av menneskelige pluripotente stamceller og trinnvis utviklingsveiaktivering ved hjelp av små molekylhemmere. Embryoide legemer (EBs) genereres i en 96-brønns plate med rundbunns, ultra-lave festebrønner, noe som letter suspensjonskulturen til individualiserte konstruksjoner.
EB-ene gjennomgår differensiering i hHOer ved en tre-trinns Wnt-signalmoduleringsstrategi, som innebærer en innledende Wnt-baneaktivering for å indusere hjertemesoderm skjebne, et andre trinn i Wnt-hemming for å skape definitive hjerteavstamninger, og et tredje Wnt-aktiveringstrinn for å indusere proepikardiale organvev. Disse trinnene, utført i et 96-brønns format, er svært effektive, reproduserbare og produserer store mengder organoider per løp. Analyse ved immunfluorescensavbildning fra dag 3 til dag 11 av differensiering avslører første og andre hjertefeltspesifikasjoner og svært komplekse vev inne i hHOer på dag 15, inkludert myokardvev med regioner av atrie- og ventrikulære kardiomyocytter, samt indre kamre foret med endokardvev. Organoidene har også et intrikat vaskulært nettverk gjennom hele strukturen og en ekstern foring av epikardialt vev. Fra et funksjonelt synspunkt slår hHOer robust og presenterer normal kalsiumaktivitet som bestemt av Fluo-4 levende bildebehandling. Samlet sett utgjør denne protokollen en solid plattform for in vitro-studier i humant organlignende hjertevev.
Introduction
Medfødte hjertefeil (CHD) er den vanligste typen medfødt defekt hos mennesker og påvirker ca. 1% av alle levendefødte1,2,3. Under de fleste omstendigheter forblir årsakene til CHDer ukjente. Evnen til å lage menneskelige hjertemodeller i laboratoriet som ligner på det utviklende menneskelige hjertet, utgjør et betydelig skritt fremover for å direkte studere de underliggende årsakene til CHD hos mennesker i stedet for i surrogatdyrmodeller.
Symbolet på laboratoriedyrkede vevsmodeller er organoider, 3D-cellekonstruksjoner som ligner et organ av interesse for cellesammensetning og fysiologisk funksjon. Organoider er ofte avledet fra stamceller eller stamceller og har blitt brukt til å modellere mange organer som hjernen4,5, nyre6,7, tarm8,9, lung10,11, lever12,13 og bukspyttkjertel14,15 , bare for å nevne noen. Nyere studier har dukket opp som viser muligheten for å skape selvmontering av hjerteorganoider for å studere hjerteutvikling in vitro. Disse modellene inkluderer bruk av mus embryonale stamceller (mESCs) for å modellere tidlig hjerteutvikling16,17 opp til atrioventricular spesifikasjon18 og menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs) for å generere multi-bakterie lag hjerte-endoderm organoider19 og kamret kardioider20 med svært kompleks cellulær sammensetning.
Dette dokumentet presenterer en ny 3-trinns WNT-modulasjonsprotokoll for å generere svært komplekse hHOer på en effektiv og kostnadseffektiv måte. Organoider genereres i 96-brønnsplater, noe som resulterer i et skalerbart, høygjennomstrømningssystem som enkelt kan automatiseres. Denne metoden er avhengig av å skape hPSC aggregater og utløse utviklingstrinn av kardiogenese, inkludert mesoderm og hjertemesoderm dannelse, første og andre hjertefelt spesifikasjon, proepicardial organ dannelse, og atrioventricular spesifikasjon. Etter 15 dager med differensiering inneholder hHOer alle store celleavledninger som finnes i hjertet, veldefinerte indre kamre, atrie- og ventrikulære kamre og et vaskulært nettverk i hele organoiden. Dette svært sofistikerte og reproduserbare hjerteorganoidsystemet er egnet til å undersøke strukturelle, funksjonelle, molekylære og transkripsjonsmessige analyser i studiet av hjerteutvikling og sykdommer og farmakologisk screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hPSC kultur og vedlikehold
MERK: De menneskeskapte PSCene (hiPSCer) eller humane embryonale stamceller (hESCer) må dyrkes i minst 2 påfølgende passasjer etter opptining før de brukes til å generere EBs for differensiering eller ytterligere kryopreservering. hPSCer dyrkes i PSC-medium (se materialtabellen) på kjellermembran-ekstracellulær matrise (BM-ECM)-belagte 6-brønns kulturplater. Når du utfører middels endringer på hPSCer i 6-brønnsplater, legg mediet direkte til innsiden av brønnen i stedet for direkte på toppen av cellene for å forhindre uønsket celleavløsning eller stress. Brukere bør være på vakt mot pre-oppvarming PSC media som ikke bør varmes ved 37 °C; alle PSC-medier som ble brukt i denne protokollen var termostable.
- For å belegge brønnplatene med BM-ECM, tin en aliquot av BM-ECM (lagret ved -20 °C i henhold til produsentens instruksjoner) på is og bland 0,5 mg BM-ECM med 12 ml kaldt Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM)/F12 medium (lagret ved 4 °C). Fordel 2 ml av DMEM/F12-BM-ECM-blandingen på hver brønn av en 6-brønns plate og inkuber ved 37 °C i minst 2 timer.
- For å tine cellene, tin først hPSC-kryonalen i en 37 ° C perle eller vannbad i 1-2 min til bare en liten mengde is er synlig. Overfør de tinte cellene til et sentrifugerør og tilsett sakte 8-9 ml PSC-medium supplert med 2 μM av ROCK-hemmeren, thiazovivin (Thiaz) og sentrifuger ved 300 × g i 5 minutter. Fjern supernatanten og resuspend cellepellet i PSC-mediet supplert med 2 μM Thiaz. Fordel cellene i kulturmediet i 1-2 brønner avhengig av kryo toårig cellekonsentrasjon og kultur ved 37 °C, 5 % CO2 i 24 timer før du endrer PSC-mediet.
- Endre mediet på cellene med 48 t intervaller. Utfør vasker og middels endringer ved hjelp av henholdsvis DMEM/F12 (1 ml/brønn) og PSC-mediet (2 ml/brønn).
MERK: Vasker bidrar til å fjerne celleavfall og rusk, mens ferske medieforandringer gir cellene en fornyet næringskilde. - Før cellene på underkonfluens (60-80% konfluent) ved å aspirere mediet, og vask deretter hver brønn med 1 ml 1x Dulbeccos fosfatbufrede løsning (ikke kalsium, ingen magnesium; DPBS). Aspirer DPBS og tilsett 1 ml av dissosiasjonsreagenset for hPSCer (se materialtabellen), etterfulgt av ambisjonen om alle unntatt en tynn film av reagenset etter 10 s.
- Inkuber i 2-5 min med den tynne filmen av dissosiasjonsreagensen for hPSC-er til det dannes hull mellom cellene.
MERK: Tiden for å stoppe dissosiasjonen er cellelinjeavhengig. - Tilsett 1 ml PSC-medium supplert med 2 μM Thiaz (PSC medium+Thiaz) i brønnen og trykk forsiktig på platen for å indusere celleavløsning. Pipette de frittliggende cellene i mediet 1-2 ganger for å bryte opp store kolonier, og resuspender cellene i PSC medium + Thiaz i et 1: 6 brønnforhold (celler fra 1 brønn resuspendert i 12 ml kulturmedium). Replate cellene på BM-ECM-belagte brønner.
2. Generering av 3D selvmontering av menneskelige hjerteorganoider
- Embryoid kroppsdannelse (EB):
MERK: Det er viktig å begrense observerbare differensierte celler før embryoid kroppsdannelse. To til tre brønner av en 6-brønns plate med en 60-80% konfluens vil gi nok celler til en enkelt 96-brønns plate av organoider. Alle medier bør alisiteres og varmes opp i en 37 °C perle eller vannbad før et medium endres for å minimere temperatursjokk på EB-ene eller organoidene (dette inkluderer ikke celledissosiasjonsreagenser). Se figur 1A,B.- Dag -2
- For å lage EBs, på dag -2, vask sub-confluent hPSCs (60-80% confluent) med DPBS i minst 10 s for å vaske celleavfall og aspirer DPBS.
- For å løsne cellene og slippe dem inn i en encellet tilstand, legg til 1 ml romtemperaturcelledissosiasjonsreagens (se materialtabellen) til hver brønn i 3-6 min. Trykk forsiktig på platen ~ 5 ganger i minuttet for å fremkalle løsrivelse mens du sjekker under mikroskopet. Tilsett 1 ml PSC medium+Thiaz for å stoppe reaksjonen.
- For å samle cellene og bryte opp eventuelle gjenværende aggregater, pipette mediet opp og ned i brønnen 2-3 ganger for å generere en encellet suspensjon. Overfør encellet suspensjon til et sentrifugerør og spinn i 5 min ved 300 × g.
- For å oppnå ønsket cellekonsentrasjon, kast supernatanten og resuspend cellene i 1 ml PSC medium + Thiaz. Tell cellene ved hjelp av en celleteller eller hemocytometer og fortynn cellene i PSC medium+Thiaz til en konsentrasjon på 100 000 celler/ml.
- For å fordele cellene for EB-dannelse, bruk en flerkanals pipette for å legge til 100 μL (10.000 celler) til hver brønn av en rundbunns ultra-lav vedlegg 96-brønns plate. Sentrifuger platen ved 100 × g i 3 min og inkuber i 24 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
- Dag -1
- Fjern forsiktig 50 μL medium fra hver brønn og tilsett 200 μL fersk PSC-medium oppvarmet til 37 °C for å oppnå et sluttvolum på 250 μL per brønn. Inkuber cellene i 24 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
MERK: Fjern og tilsett mediet forsiktig på siden av brønnen for å unngå å forstyrre EB-ene nederst i brønnen. På grunn av EBs delikate natur og suspensjonskulturen, er det nødvendig å legge igjen et lite volum væske i hver brønn når du bytter medium for å unngå å forstyrre EB-ene.
- Fjern forsiktig 50 μL medium fra hver brønn og tilsett 200 μL fersk PSC-medium oppvarmet til 37 °C for å oppnå et sluttvolum på 250 μL per brønn. Inkuber cellene i 24 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
- Dag -2
- Human Heart Organoid (hHO) Differensiering:
MERK: Alle medier skal varmes opp i en 37 °C perle eller vannbad før medieforandringer. Fjern og tilsett medium forsiktig på siden av brønnen for å unngå å forstyrre de utviklende organoidene på bunnen av brønnen. Vasker er ikke nødvendig mellom medieendringer for å minimere agitasjon og tillate gradvis fjerning av inhibitorer og vekstfaktorer. RPMI med 2% B-27 supplement (Tabell over materialer) ble brukt gjennom differensieringsprotokollen. B-27 supplement inneholder insulin med mindre det er spesifisert (insulinfritt i dag 0-5). Se figur 1C.- Dag 0
- For å initiere differensiering mot en mesoderm avstamning, fjern 166 μL medium fra hver brønn (~ 2/3rd av totalt brønnvolum) og tilsett 166 μL RPMI 1640 som inneholder insulinfri B-27 supplement, 6 μM CHIR99021, 1,875 ng/ml benmorfogenetisk protein 4 (BMP4) og 1,5 ng/ml Activin A for en endelig brønnkonsentrasjon på 4 μM CHIR99021, 1,25 ng/ml BMP4 og 1 ng/ml Activin A. Inkuber i 24 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
- Dag 1
- Fjern 166 μL medium fra hver brønn og tilsett 166 μL fersk RPMI 1640 med insulinfri B-27 supplement. Inkuber i 24 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
- Dag 2
- For å indusere hjertemesoderm spesifikasjon, fjern 166 μL medium fra hver brønn og tilsett 166 μL RPMI 1640 som inneholder insulinfri B-27 supplement og 3 μM Wnt-C59 for en endelig brønnkonsentrasjon på 2 μM Wnt-C59. Inkuber i 48 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
- Dag 4
- Fjern 166 μL medium fra hver brønn og tilsett 166 μL fersk RPMI 1640 med insulinfri B-27 supplement. Inkuber i 48 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
- Dag 6
- Fjern 166 μL medium fra hver brønn og tilsett 166 μL RPMI 1640 med B-27 supplement. Inkuber i 24 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
- Dag 7
- For å indusere proepicardial differensiering, fjern 166 μL medium fra hver brønn og tilsett 166 μL fersk RPMI 1640 som inneholder B-27 supplement og 3 μM CHIR99021 for en endelig brønnkonsentrasjon på 2 μM CHIR99021. Inkuber i 1 time ved 37 °C, 5 % CO2.
- Fjern 166 μL medium fra hver brønn og tilsett 166 μL fersk RPMI 1640 som inneholder B-27 supplement. Inkuber i 48 timer ved 37 °C, 5 % CO2.
MERK: Ekstra forsiktighet anbefales ved denne andre mediumendringen på dag 7, da organoidene er mer utsatt for bevegelse på grunn av medieendringene. - Fra dag 7 og utover til innsamling eller overføring for analyser eller eksperimentering, utfør middels endringer hver 48 t ved å fjerne 166 μL medium fra hver brønn og tilsett 166 μL fersk RPMI 1640 som inneholder B-27 supplement.
MERK: Organoider er klare for analyser og eksperimentering på dag 15 med mindre tidligere utviklingsstadier er av interesse. De kan dyrkes etter dag 15 for langsiktig kultur eller modningseksperimenter.
- Dag 0
3. Organoid analyse
- Overføring av hele organoider (levende eller fast)
MERK: For levende organoidoverføring må du sørge for at pipettespissene som brukes, er sterile.- Klipp spissen av en P200 pipettespiss 5-10 mm fra spissåpningen, noe som resulterer i en bred åpning på ~ 2-3 mm diameter.
- Sett spissen rett inn i rundbunnsbrønnen som inneholder organoiden, slik at pipetten er helt vertikal (vinkelrett på platen). Pass på at pipettestempeet allerede er trykket helt inn før spissen settes inn i mediet.
- Slipp pipettestempelets langsomt, ta opp nok medium (100-200 μL) til å samle organoiden.
- Overfør organoiden i medium til måldestinasjonen (f.eks. for festing, levende avbildning, elektrofysiologiopptak, ny platekultur).
- Feste organoider
MERK: Festing og farging av organoider kan gjøres enten i 96-brønns kulturplaten eller mikrocentrifugerørene. Paraformaldehyd (PFA) skal kun håndteres i en avtrekkshette.- For fiksering i mikrosentrifugerør, overfør levende organoider til separate rør med 1-8 organoider per rør.
MERK: Ikke overskrid 8 organoider per rør. - Fjern og kast forsiktig så mye medium fra røret som mulig uten å berøre organoidene.
- Tilsett 4% PFA til hvert rør eller brønn (300-400 μL per mikrocentrifugerør og 100-200 μL per brønn av en 96-brønns plate). Inkuber ved romtemperatur i 30-45 min.
MERK: Inkubasjonstider over 1 time kan kreve antigeninnhentingstrinn og anbefales ikke. - Kast PFA trygt uten å forstyrre organoidene. Utfør 3 vasker med DPBS supplert med 1,5 g/l glycin (DPBS/Gly), med samme volum som brukes for 4% PFA, venter 5 minutter mellom vasker. Fjern DPBS/Gly og fortsett til immundempende eller andre analyser eller tilsett DPBS og oppbevar ved 4 °C for fremtidig bruk i opptil 2 uker.
MERK: Lagring av faste organoider i mer enn 2 uker kan føre til vevsforringelse og forurensning og anbefales ikke.
- For fiksering i mikrosentrifugerør, overfør levende organoider til separate rør med 1-8 organoider per rør.
- Helmontert immunfluorescerende farging
- Tilsett 100 μL blokkerings-/permeabiliseringsløsning (10 % normalt eselserum + 0,5 % bovint serumalbumin (BSA) + 0,5 % Triton X-100 i 1x DPBS) til hver brønn eller rør som inneholder de faste organoidene. Inkuber ved romtemperatur over natten på en shaker.
MERK: Ikke overskrid 8 organoider per rør. - Fjern og kast forsiktig så mye av blokkeringsløsningen som mulig uten å berøre organoidene. Utfør 3 vasker med DPBS, venter 5 min mellom vasker.
- Forbered den primære antistoffløsningen (1% normalt eselserum + 0,5% BSA + 0,5% Triton X-100 i 1x DPBS) med de ønskede primære antistoffene ved anbefalte konsentrasjoner. Inkuber ved 4 °C i 24 timer på en shaker.
- Fjern og kast forsiktig så mye av antistoffløsningen som mulig uten å berøre organoidene. Utfør 3 vasker med DPBS, venter 5 min mellom vasker.
- Forbered sekundær antistoffløsning (1% normalt eselserum + 0,5% BSA + 0,5% Triton X-100 i 1x DPBS) med de ønskede sekundære antistoffene ved anbefalte konsentrasjoner. Hvis antistoffene er fluorescerende merket, inkuberer du ved 4 °C i mørket (f.eks. dekket av aluminiumsfolie) i 24 timer på en shaker.
- Fjern og kast forsiktig så mye av antistoffløsningen som mulig uten å berøre organoidene. Utfør 3 vasker med DPBS, venter 5 min mellom vasker.
- Forbered lysbilder med perler (90-300 μm i diameter) montert i et monteringsmedium (se materialtabellen) nær kantene på lysbildet der dekslene med organoidene skal plasseres.
MERK: Det anbefales å la monteringsmediet rundt perlene tørke før du fortsetter; Dette vil forhindre at perlene beveger seg rundt. Se figur 2. - Overfør de fargede organoidene ved hjelp av en kuttet pipettespiss på lysbildet, mellom perlene, og sørg for avstand for å unngå kontakt mellom organoidene en gang på lysbildet. Bruk hjørnet av en opprullet laboratorieserviett for å forsiktig fjerne overflødig væske rundt organoiden.
- Dekk organoidene med monteringsklaringsmedium (fruktose-glyserol clearing løsning er 60% (vol / vol) glyserol og 2,5 M fruktose)37 ved hjelp av 120-150 μL av monteringsklaringsmediet per lysbilde.
MERK: Det anbefales å bruke en kuttet pipettespiss når du arbeider med monteringsklaringsmediet, da det er veldig viskøs. - Hold dekslene over sklien med organoidene dekket med monteringsryddingsløsning og trykk dekslene sakte over lysbildet, og sørg for at organoidene er mellom de monterte perlene.
- Forsegle omkretsen av dekslene på lysbildet ved hjelp av spikerlakk. La gliden tørke i mørket ved romtemperatur i 1 time. Oppbevars ved 4 °C i mørket for langtidsoppbevaring.
- Tilsett 100 μL blokkerings-/permeabiliseringsløsning (10 % normalt eselserum + 0,5 % bovint serumalbumin (BSA) + 0,5 % Triton X-100 i 1x DPBS) til hver brønn eller rør som inneholder de faste organoidene. Inkuber ved romtemperatur over natten på en shaker.
- Kalsium forbigående avbildning i levende hjerteorganoider
MERK: I henhold til produsentens instruksjoner ble Fluo4-AM rekonstituert i dimetylsulfoksid (DMSO) til en endelig lagerløsningskonsentrasjon på 0,5 mM. Fluo4-AM ble tilsatt direkte til organoidbrønnen i 96-brønnsplaten.- Utfør 2 vasker på organoidene ved hjelp av RPMI 1640 medium.
- Fjern 166 μL av det brukte mediet fra brønnen.
- Tilsett 166 μL oppvarmet RPMI 1640 medium, fjern 166 μL medium, og tilsett 166 μL fersk RPMI 1640 medium.
MERK: Vaskene er utført for å fjerne avfallsmateriale og celleavfall. To tredjedeler av mediet fjernes fra brønnene under vaskene for å unngå å forstyrre organoidene på bunnen av brønnen før den funksjonelle analysen.
- Tilsett Fluo4-AM medium til organoidene.
- Tilsett Fluo4-AM rekonstituert i DMSO til RPMI 1640 som inneholder B-27 supplement for å klargjøre en 1,5 μM løsning.
- Fjern 166 μL medium fra brønnen.
- Tilsett 166 μL 1,5 μM Fluo4-AM i RPMI 1640 som inneholder B-27 supplement for en endelig brønnkonsentrasjon på 1 μM. Inkuber ved 37 °C, 5 % CO2 i 30 minutter.
- Utfør 2 vasker som i trinn 3.4.1.
- Tilsett 166 μL RPMI 1640 som inneholder B-27 supplement til brønnen.
- Bruk en kuttet tupp av en P200 pipettespiss, overfør organoiden til en petriskål med glassbunn (f.eks. 8-brønns kammeret dekkglass med #1,5 høyytelses coverglass) med 100-200 μL medium.
MERK: Se pkt. 3.1 om overføring av hele organoider. - Bilde organoidene lever under et mikroskop med et temperatur- og CO2-kontrollert kammer ved 37 °C, 5 % CO2.
- Ta opp flere 10-20 s videoer på forskjellige steder over organoiden, som viser økningen og nedgangen i fluorescensintensitetsnivåer når kalsiumet kommer inn og ut av cellene.
MERK: For opptak med høy oppløsning anbefales det å ta opp med en hastighet på 10 fps eller raskere; 50 fps anbefales. - Analyser videoene ved hjelp av bildeanalyseprogramvare (f.eks. ImageJ) ved å velge interesseområder og måleintensitetsnivåer over tid.
- Normaliser intensitetsopptakene ved hjelp av ΔF/F0 vs. tid i millisekunder og plott.
- Utfør 2 vasker på organoidene ved hjelp av RPMI 1640 medium.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For å oppnå selvorganiserende hHO-in vitro modifiserte og kombinerte vi differensieringsprotokoller som tidligere er beskrevet for 2D-monolagsdifferensiering av kardiomyocytter21 og epikardiardialceller22 ved hjelp av Wnt-banemodulatorer og for 3D-prekariacorganoider16 ved hjelp av vekstfaktorene BMP4 og Activin A. Ved hjelp av 96-brønnsplaten EB og hHO differensieringsprotokollen beskrevet her og vist i figur 1 , ble konsentrasjonene og eksponeringsvarighetene til Wnt-baneaktivatoren CHIR99021 optimalisert for å gi svært reproduserbare og komplekse hHOer avledet fra menneskelige PSCer. hPSCer eller hESCer dyrket i PSC medium til 60-80% konfluens i kolonilignende formasjon med minimal til ingen synlig differensiering er ideelle for EB-generering (figur 1B).
EBs fikk lov til å inkubere i 48 timer med en middels endring etter 24 timer før du startet differensiering på dag 0. På dag 0 skal EB-ene fremstå som et mørkt sfærisk aggregat i midten av hver brønn under et lysmikroskop (figur 1B). Differensieringsprotokollen starter på dag 0 med Wnt-baneaktivering og vekstfaktortillegg i nøyaktig 24 timer. Denne mesoderm induksjon etterfulgt av en hjerte mesoderm induksjon på dag 2 ved hjelp av Wnt pathway inhibitor Wnt-C59 vil resultere i en betydelig utvidelse av organoid fra ~ 200 μm i diameter til 500-800 μm i diameter på dag 4 og til så mye som 1 mm (organoider kan oppleve en liten reduksjon i størrelse etter dag 15 (Figur 1C)). HHO vil begynne å slå så tidlig som dag 6 (Video 1), med 100% av organoidene som viser synlig juling etter dag 10 (Video 2) (med mindre det gjennomgår narkotikabehandling eller hvis utilstrekkelig hPSC ble brukt til å generere EBs). Dette er observert i 5 forskjellige hPSC cellelinjer23.
For å evaluere kapasiteten til hHOene til å representere ulike trinn i hjertets fysiologiske utvikling, samlet vi organoider på ulike tidspunkter gjennom differensieringsprotokollen og lette etter tilstedeværelsen og det trans transcriptomiske uttrykket av hjertefeltmarkører. Immunfluorescerende farging for den første hjertefeltmarkøren (FHF), HAND1, og den andre hjertefeltmarkøren (SHF), HAND2, avslørte deres kjernefysiske tilstedeværelse i disse hjerteforfedercellene som oppsto rundt henholdsvis dag 3 og dag 5 (figur 3A).
Uttrykket av begge markørene skjer i regioner i organoidene som avtar i størrelse etter dag 7 for FHF og etter dag 9 for SHF. Interessant nok viste høyforstørrelsesbilder av dag 7 organoider at de fleste HAND1-uttrykkende celler var kardiomyocytt opprinnelse (som vist av den kardiomyocyttspesifikke markøren TNNT2). I motsetning uttrykte mange av de HAND2-uttrykkende cellene ikke kardiomyocyttmarkøren (figur 3B). Denne observasjonen er i samsvar med prekariac organoider avledet fra mus ESC som demonstrerer utviklingen av ikke-myocyttceller fra SHF stamceller16. Det er viktig å merke seg at RNA-Sekvenseringsdataene viser at RNA-transkripsjonene for både HAND1 og HAND2 ble uttrykt fra dag 3 og utover, med FHF-markøren mer høyt uttrykt mellom dag 3 og 11 og SHF-markøren mer høyt uttrykt etter dag 13 (figur 3C).
Immunfluorescence farging avslørte tilstedeværelsen av markører av ulike celle-type avstamninger som utgjør menneskehjertet. Myokardvev (identifiserbart ved hjelp av den kardiomyocyttspesifikke markøren TNNT2) ved siden av epikardialt vev (merket med den kjernefysiske transkripsjonsfaktoren WT1 og epitelmembranmarkøren TJP1) (figur 4A). Endokardielle celler som uttrykker NFATC1 ble oppdaget ved å fôre veggene i indre kammerlignende strukturer i organoidene (figur 4B). Endotelceller i et fartøylignende nettverk kan sees så tidlig som dag 13 av differensiering (figur 4C). Til slutt rapporterer vi tilstedeværelsen av hjertefibroblaster blandet gjennom hele organoiden (figur 4D). Disse celletypemarkørene ble også observert i RNA-Seq-genuttrykksprofilene (figur 4E). Sammensetningen av celletyper i organoidene, målt ved arealet av organoiden de opptar, ble funnet å være ~ 58% kardiomyocytter, mens resten består av ikke-myokytt hjerteceller, inkludert epikardialceller (~ 15%), endokardiale celler (~ 13%), hjertefibroblaster (~ 12%), og endotelceller (~ 1%) (Figur 4F).
Organoidenes elektrofysiologiske funksjon ble målt ved levende kalsiumavbildning av individuelle celler i hele organoider. Fluo-4 fluorescensintensiteten varierer over tid på grunn av kalsiuminngang og utgang fra cellen, og avslører regelmessige virkningspotensialer (figur 5A). Varmekart som viser kalsiumintensiteter over en høyforstørrelsesregion av organoiden viser den økte intensiteten på grunn av kalsiumtransienter i individuelle celler (figur 5B og video 3).
Figur 1: Embryoid kroppsgenerasjon og hjerteorganoid differensieringstrinn. (A) (1-2) Dissosierte celler frøes inn i brønner av en 96-brønns ultra-lav festeplate via en flerkanals pipette. (3) 96-brønnsplaten sentrifugeres deretter, noe som gjør at cellene kan aggregere i midten. (4) Over tid, etter tilsetning av vekstfaktorer og banemodulatorer, begynner den embryoide kroppen å skille seg ut i flere hjerteavledninger og danne romlig og fysiologisk relevante distinkte cellepopulasjoner rundt indre mikrochambers. (B) Representative bilder av utviklingen av embryoid kroppsgenerering, begynner med 2-dimensjonal iPSC kultur (venstre) og slutter med en dag 0 embryoid kropp (høyre); skala bar = 500 μm. (C) Sammendrag av human hjerte organoid differensieringsprotokoll, inkludert kjemiske banemodulatorer og hemmere med respektive tidspunkter, varigheter og utvikling av organoidbilder under lysmikroskopi fra dag 1 til dag 15; skala bar = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Hel organoid montering på lysbilder for avbildning. Trinn for å forberede lysbilder og montering av organoider for avbildning. (A) Plassering av mikrober på periferien av en glasssklie. (B) Dekker mikrober med monteringsmedium. (C) Overføre organoider til gliden mellom perlene og fjerne overflødig væske rundt organoidene. (D) Dekker organoidene med klarings-/monteringsmedium. (E) Plassere dekslene på toppen av lysbildet med organoider og perler. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Første hjertefelt og andre hjertefeltspesifikasjon i hHOer rekapitulerer fysiologisk menneskelig hjerteutvikling. (A) Konfokale immunfluorescensbilder av dag 3 til dag 11 hHOer som viser dannelsen av FHF (HAND1, topp) og SHF (HAND2, bunn) og kardiomyocytter (TNNT2) og kjernefysisk fargestoff DAPI; skalastenger = 500 μm. (B) Høyforstørrelsesbilder av dag 7 organoider som viser samlokalisering av HAND1 og HAND2 med kardiomyocyttmarkøren TNNT2; skalastenger = 50 μm. (C) RNA-Seq genuttrykksprofiler av FHF-markøren HAND1 (rød) og SHF-markøren HAND2 (blå) fra dag 0 til dag 19. Forkortelser: hHOer = humane hjerteorganoider; FHF = første hjertefelt; SHF = andre hjertefelt; HAND = hjerte og nevrale kamderivater uttrykt; TNNT2 = hjerte troponin T2; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: hHOer utviklermultiple hjertelinje. (A-D) Confocal immunfluorescence bilder av dag 15 hHOer som viser dannelsen av kardiomyocytter (TNNT2) og farging med kjernefysisk fargestoff DAPI i ikke-myocytt hjerteceller. (A) Hel organoid og høy forstørrelse av epikardial markør WT1 (grønn) og epitelmembranmarkør TJP1 (hvit) som viser epikardiale celler av epitelial opprinnelse på toppen og ved siden av myokardvev; skala bar = 500 μm, innfelt = 50 μm. (B) Endokardielle markør NFATC1 (grønn) uttrykk på foringen av kamre; skala bar = 500 μm. (C) Endotelial fartøy nettverk i hHOer vist av PECAM1 (grønn). Skalastang = 500 μm. (D) Hjertefibroblaster markører THY1 og VIM vist i henholdsvis grønt og hvitt, fordelt over hele organoiden. Skalastang = 500 μm. (E) RNA-Seq genuttrykksprofiler av de viktigste celletypene som finnes i hHOene fra dag 0 til 19 av differensiering. Forkortelser: hHOer = humane hjerteorganoider; TNNT2 = hjerte troponin T2; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; WT1 = Wilms tumor-1 transkripsjonsfaktor; NFATC1 = cytoplasmisk kjernefysisk faktor for aktivert T-celle; PECAM1 = platelet endotelial celle vedheft molekyl-1; VIM = vimentin. (F) Sektordiagram over gjennomsnittlig vevstypesammensetning i hHOer, beregnet som det prosentvise området med den respektive cellemarkøren over en hel organoid ved kjernefysisk farging over tre z-plan gjennom organoiden ved hjelp av ImageJ. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Fluo-4 levende kalsium forbigående opptak i levende menneskelige hjerteorganoider. (A) Representative kalsium forbigående opptak av individuelle kardiomyocytter i hele organoider. (B) Varmekart som viser lave og topp kalsiumnivåer mellom virkningspotensialer som bestemt av Fluo-4 intensitet; skalastenger = 10 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Video 1: Levende bildebehandling av representativ organoid avledet fra hPSCer på dag 6 av differensiering under lysmikroskopi ved romtemperatur. Forkortelse: hPSC = human pluripotent stamcelle. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 2: Levende bildebehandling av representativ organoid avledet fra hPSCer på dag 15 av differensiering under lysmikroskopi ved romtemperatur. Forkortelse: hPSC = human pluripotent stamcelle. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Video 3: Live opptak av dag 10 organoid som viser varmekart over kalsiumtransienter under et fluorescensmikroskop. Klikk her for å laste ned denne videoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nylige fremskritt i humane stamcelleavledede kardiomyocytter og andre celler med hjerteopprinnelse har blitt brukt til å modellere menneskelig hjerteutvikling22,24,25 og sykdom26,27,28 og som verktøy for å screene terapeutiske midler29,30 og giftige stoffer31,32 . Her rapporterer vi en lett-å-implementere, svært reproduserbar protokoll for å generere og differensiere EBer i svært komplekse hHOer. Denne protokollen har vært vellykket i flere cellelinjer, inkludert hPSCer og hESCer23, som viser konsekvente slagfrekvenser og celletypeorganisasjon. Denne protokollen trekker aspekter fra tidligere beskrevne protokoller for kardiomyocyttdifferensiering24, epikardiardialcelledifferensiering22 og prekariacorganoider avledet fra mus ESCs16 og optimaliserer den trinnvise moduleringen av kanonisk WNT-signalering ved hjelp av kjemiske hemmere og vekstfaktorer i et fullt definert medium. Flere optimaliseringsmetoder ble brukt i genereringen av denne protokollen.
For det første har de kjemiske hemmerkonsentrasjonene og eksponeringsvarighetene, samt tilsetning av vekstfaktorer, blitt optimalisert for 3D-miljøet og diskutert i tidligere arbeid23. Disse ble optimalisert for å belyse strukturer med fysiologisk kompleksitet og representasjon av in vivo menneskehjerte, med fysiologisk sammensetning og forhold mellom kardiomyocytter og ikke-myokytt hjertecelletyper (epikardialceller, hjertefibroblaster). For det andre tillater den to tredjedeler middels endringsstrategien minimal agitasjon av EBs / organoidene, da de sitter i suspensjon nær bunnen av brønnen, samtidig som de letter en gradienteksponering for kjemiske hemmere og vekstfaktorer når mediet oppdateres. Kombinasjonen av hjertemesoderm differensiering gjennom Wnt-baneaktivering, etterfulgt av hemming24, og den påfølgende induksjonen av proepicardial spesifikasjon via en annen Wnt-baneaktivering22, gjør det mulig for en enkelt protokoll å gi svært komplekse hHOer. Organoidene vokser opp til 1 mm etter 15 dager med differensiering og kan enkelt overføres for levende eller faste analyser og analyser. For det tredje, gitt den store størrelsen på organoidene, ble bruken av mikrober eller andre lignende strukturer for å opprettholde plass mellom lysbildet og dekslene funnet for bedre å bevare organoidenes 3D-struktur og forbedre avbildningsprosessen.
Denne utviklende menneskelige hjertemodellen gir tilgang til ellers utilgjengelige stadier av hjerteutvikling, for eksempel tidlig første og andre hjertefeltspesifikasjon observert mellom dag 3 og 9 av differensiering- og organisering i hjerteforfedrene celler som gir opphav til hjertevev, inkludert myokardi, endardium, endotel, endotelalvaskulatur og støtte hjertefibroblaster, som ble observert på dag 15 av differensiering. Vevstypene som finnes i hjerteorganoidene avledet fra denne protokollen er svært representative for det menneskelige fosterhjertet i både komposisjon33 og transkripsjonsprofil23,34. De kan derfor legge til rette for vev-vev og celle-celle høyere orden interaksjoner som ligner på in vivo hjerte. Denne protokollen var svært effektiv og reproduserbar på tvers av eksperimenter og cellelinjer, noe som ga organoider som hovedsakelig består av kardiomyocytter og inkluderer ikke-myokytt hjerteceller, som epikardiale celler, endokardialceller, hjertefibroblaster og endotelceller, som representerer den fysiologiske sammensetningen23,33,35.
Analyser av ultrastrukturen til de dannende kardiomyocyttene via transmisjonselektronmikroskopi og utvikling av kamre og et vaskulært nettverk via optisk koherenstomografi og konfokal avbildning diskuteres i detalj i tidligere arbeid23. En stor fordel med denne hjerteorganoide protokollen over andre eksisterende protokoller som nylig ble publisert17,18,19,20,36,37 er den robuste dannelsen av et endotelnettverk gjennom hele organoiden, slik at evnen til å undersøke vaskulær utvikling og sykdom i det tidlige menneskelige hjerte, uten behov for ytterligere eksterne induksjoner til protokollen. Til slutt er funksjonell analyse av hjerteorganoidene oppnåelig gjennom ulike tilnærminger, inkludert bruk av kalsiumfølsom fargestoff for å spore kalsiumtransientene i kardiomyocyttene over organoiden. Ved hjelp av høyoppløselig mikroskopi registrerte vi fluorescensintensiteten til kalsium som kom inn og ut av celler og observerte svært representative virkningspotensialer. Andre mulige funksjonelle analysemetoder inkluderer bruk av en transgen linje med en kalsiumsensitiv indikator eller direkte opptak ved hjelp av en mikroelektrode array23.
Hjerteorganoidene som er beskrevet her, er rekapitalistiske for det utviklende menneskelige fosterhjertet, men er likevel begrenset til å demonstrere mer modne, voksenlignende egenskaper. Fremtidige protokoller kan bygge på protokollen som er beskrevet her for å indusere modning i disse organoidene og utbyttekonstruksjoner som bedre modellerer voksenhjertet. Videre er denne protokollen designet for å skape miniatyrmodeller av menneskehjertet og er begrenset til forskningsstudier av hjerteutvikling og sykdom eller for farmasøytisk screening og kan ikke være egnet som et middel til klinisk intervensjon som erstatning av hjertevev via transplantasjon. Totalt sett beskriver vi her en lettfattelig og kostnadseffektiv protokoll for å generere svært reproduserbare og sofistikerte humane hjerteorganoider som kan lette forskningsstudier innen menneskelig hjerteutvikling, sykdomsetiologi og farmakologisk screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å erklære.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under prisnumrene K01HL135464 og R01HL151505 og av American Heart Association under tildelingsnummer 19IPLOI34660342. Vi ønsker å takke MSU Advanced Microscopy Core og Dr. William Jackson ved MSU Department of Pharmacology and Toxicology for tilgang til konfikale mikroskoper, IQ Microscopy Core og MSU Genomics Core for sekvenseringstjenester. Vi ønsker også å takke alle medlemmer av Aguirre Lab for deres verdifulle kommentarer og råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21202 | 1:200 |
| Alexa Fluor 488 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21206 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti- mouse | Invitrogen | A-21203 | 1:200 |
| Alexa Fluor 594 Donkey anti- rabbit | Invitrogen | A-21207 | 1:200 |
| Alexa Fluor 647 Donkey anti- goat | Invitrogen | A32849 | 1:200 |
| HAND1 | Abcam | ab196622 | Rabbit; 1:200 |
| HAND2 | Abcam | ab200040 | Rabbit; 1:200 |
| NFAT2 | Abcam | ab25916 | Rabbit; 1:100 |
| PECAM1 | DSHB | P2B1 | Rabbit; 1:50 |
| TNNT2 | Abcam | ab8295 | Mouse; 1:200 |
| THY1 | Abcam | ab133350 | Rabbit; 1:200 |
| TJP1 | Invitrogen | PA5-19090 | Goat; 1:250 |
| VIM | Abcam | ab11256 | Goat; 1:250 |
| WT1 | Abcam | ab89901 | Rabbit; 1:200 |
| Media and Reagents | |||
| Accutase | Innovative Cell Technologies | NC9464543 | cell dissociation reagent |
| Activin A | R&D Systems | 338AC010 | |
| B-27 Supplement (Minus Insulin) | Gibco | A1895601 | insulin-free cell culture supplement |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | cell culture supplement |
| BMP-4 | Gibco | PHC9534 | |
| Bovine Serum Albumin | Bioworld | 50253966 | |
| CHIR-99021 | Selleck | 442310 | |
| D-(-)-Fructose | Millipore Sigma | F0127 | |
| DAPI | Thermo Scientific | 62248 | 1:1000 |
| Dimethyl Sulfoxide | Millipore Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 10566016 | |
| Essential 8 Flex Medium Kit | Gibco | A2858501 | pluripotent stem cell (PSC) medium containing 1% penicillin-streptomycin |
| Fluo4-AM | Invitrogen | F14201 | |
| Glycerol | Millipore Sigma | G5516 | |
| Glycine | Millipore Sigma | 410225 | |
| Matrigel GFR | Corning | CB40230 | Basement membrane extracellular matrix (BM-ECM) |
| Normal Donkey Serum | Millipore Sigma | S30-100mL | |
| Paraformaldehyde | MP Biomedicals | IC15014601 | Powder dissolved in PBS Buffer – use at 4% |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffer Solution | Gibco | 10010049 | |
| Phosphate Buffer Solution (10x) | Gibco | 70011044 | |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 73155 | 90 µm |
| ReLeSR | Stem Cell Technologies | NC0729236 | dissociation reagent for hPSCs |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | |
| Thiazovivin | Millipore Sigma | SML1045 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | T8787 | |
| Trypan Blue Solution | Gibco | 1525006 | |
| VECTASHIELD Vibrance Antifade Mounting Medium | Vector Laboratories | H170010 | |
| WNT-C59 | Selleck | NC0710557 | |
| Other | |||
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 02682002 | |
| 15 mL Falcon Tubes | Fisher Scientific | 1495970C | |
| 2 mL Cryogenic Vials | Corning | 13-700-500 | |
| 50 mL Reagent Reservoirs | Fisherbrand | 13681502 | |
| 6-Well Flat Bottom Cell Culture Plates | Corning | 0720083 | |
| 8 Well chambered cover Glass with #1.5 high performance cover glass | Cellvis | C8-1.5H-N | |
| 96-well Clear Ultra Low Attachment Microplates | Costar | 07201680 | |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Kimwipes | Kimberly-Clark Professional | 06-666 | laboratory wipes |
| Micro Cover Glass | VWR | 48393-241 | 24 x 50 mm No. 1.5 |
| Microscope Slides | Fisherbrand | 1255015 | |
| Moxi Cell Counter | Orflo Technologies | MXZ001 | |
| Moxi Z Cell Count Cassette – Type M | Orflo Technologies | MXC001 | |
| Multichannel Pipettes | Fisherbrand | FBE1200300 | 30-300 µL |
| Olympus cellVivo | Olympus | For Caclium Imaging, analysis with Imagej | |
| Sorvall Legend X1 Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004261 | |
| Thermal Mixer | ThermoFisher Scientific | 13-687-717 | |
| Top Coat Nail Varish | Seche Vite | Can purchase from any supermarket |
References
- Hoffman, J. I. E., Kaplan, S. The incidence of congenital heart disease. Journal of the American College of Cardiology. 39 (12), 1890-1900 (2002).
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), 20593 (2020).
- Fahed, A. C., Gelb, B. D., Seidman, J. G., Seidman, C. E. Genetics of congenital heart disease: the glass half empty. Circulation Research. 112 (4), 707-720 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36, 432-441 (2018).
- Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
- Uchimura, K., Wu, H., Yoshimura, Y., Humphreys, B. D. Human pluripotent stem cell-derived kidney organoids with improved collecting duct maturation and injury modeling. Cell Reports. 33 (11), 108514 (2020).
- Serra, D., et al. Self-organization and symmetry breaking in intestinal organoid development. Nature. 569, 66-72 (2019).
- Mithal, A., et al. Generation of mesenchyme free intestinal organoids from human induced pluripotent stem cells. Nature Communications. 11, 215 (2020).
- Porotto, M., et al. Authentic modeling of human respiratory virus infection in human pluripotent stem cell-derived lung organoids. mBio. 10 (3), 00723 (2019).
- Dye, B. R., et al. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids. Elife. 4, 05098 (2015).
- Mun, S. J., et al. Generation of expandable human pluripotent stem cell-derived hepatocyte-like liver organoids. Journal of Hepatology. 71 (5), 970-985 (2019).
- Vyas, D., et al. Self-assembled liver organoids recapitulate hepatobiliary organogenesis in vitro. Hepatology. 67 (2), 750-761 (2018).
- Dossena, M., et al. Standardized GMP-compliant scalable production of human pancreas organoids. Stem Cell Research & Therapy. 11, 94 (2020).
- Georgakopoulos, N., et al. Long-term expansion, genomic stability and in vivo safety of adult human pancreas organoids. BMC Developmental Biology. 20 (1), 4 (2020).
- Andersen, P., et al. Precardiac organoids form two heart fields via Bmp/Wnt signaling. Nature Communications. 9, 3140 (2018).
- Rossi, G., et al.
- Lee, J., et al. In vitro generation of functional murine heart organoids via FGF4 and extracellular matrix. Nature Communications. 11 (1), 4283 (2020).
- Drakhlis, L., et al. Human heart-forming organoids recapitulate early heart and foregut development. Nature Biotechnology. 39 (6), 737-746 (2021).
- Hofbauer, P., et al. Cardioids reveal self-organizing principles of human cardiogenesis. Cell. 184 (12), 3299-3317 (2021).
- Bao, X., et al. Directed differentiation and long-term maintenance of epicardial cells derived from human pluripotent stem cells under fully defined conditions. Nature Protocols. 12 (9), 1890-1900 (2017).
- Bao, X., et al. Long-term self-renewing human epicardial cells generated from pluripotent stem cells under defined xeno-free conditions. Nature Biomedical Engineering. 1, 0003 (2016).
- Lewis-Israeli, Y., et al. Self-assembling human heart organoids for the modeling of cardiac development and congenital heart disease. Nature Communications. 12, 5142 (2021).
- Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), 1848-1857 (2012).
- Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of de novo cardiomyocytes: Human pluripotent stem cell differentiation and direct reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
- Hashem, S. I., et al. Impaired mitophagy facilitates mitochondrial damage in Danon disease. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 108, 86-94 (2017).
- Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
- Stroud, M. J., et al. Luma is not essential for murine cardiac development and function. Cardiovascular Research. 114 (3), 378-388 (2018).
- Liang, P., et al. Drug screening using a library of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes reveals disease-specific patterns of cardiotoxicity. Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).
- Mills, R. J., et al. Functional screening in human cardiac organoids reveals a metabolic mechanism for cardiomyocyte cell cycle arrest. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (40), 8372-8381 (2017).
- Braam, S. R., et al. Prediction of drug-induced cardiotoxicity using human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research. 4 (2), 107-116 (2010).
- Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
- Pinto, A. R., et al.
- Bertero, A., et al. Dynamics of genome reorganization during human cardiogenesis reveal an RBM20-dependent splicing factory. Nature Communications. 10 (1), 1538 (2019).
- Gilbert, S. F. Lateral plate mesoderm: Heart and Circulatory System. Developmental Biology. 6th edition. , Sinauer Associates. Sunderland (MA). 591-610 (2000).
- Richards, D. J., et al. Human cardiac organoids for the modelling of myocardial infarction and drug cardiotoxicity. Nature Biomedical Engineering. 4 (4), 446-462 (2020).
- Lewis-Israeli, Y. R., Wasserman, A. H. Heart Organoids and Engineered Heart Tissues: Novel Tools for Modeling Human Cardiac Biology and Disease. Biomolecules. 1277, (2021).
