Summary
本手稿提供了一种开发称为肌肉袖带再生周围神经接口 （MC-RPNI） 的生物周围神经接口的创新方法。 这种手术结构可以放大其相关周围神经的运动传出信号，以促进运动意图的准确检测和外骨骼装置的潜在控制。
Abstract
机器人外骨骼最近在康复医学领域获得了赞誉，成为四肢无力个体功能恢复的一种有前途的方式。然而，它们的使用仍然主要局限于研究机构，由于运动检测方法仍然不可靠，它们经常作为静态肢体支持的手段。周围神经接口已成为这一缺点的潜在解决方案;然而，由于其固有的振幅很小，这些信号很难与背景噪声区分开来，从而降低了它们的整体电机检测精度。由于目前的界面依赖于非生物材料，随着时间的推移，固有的材料分解可能会随着异物组织反应而发生，从而进一步影响其准确性。 肌肉袖带再生周围神经接口（MC-RPNI）旨在克服这些明显的并发症。由一段围绕圆周固定在完整周围神经上的游离肌肉移植物组成，随着时间的推移，该结构再生并被所包含的神经重新支配。在大鼠中，这种结构已经证明能够通过产生复合肌肉动作电位（CMAPs）将周围神经的运动传出动作电位放大到正常值的100倍。这种信号放大有助于高精度检测电机意图，从而有可能可靠地利用外骨骼设备。
Introduction
仅在美国，就有大约 1.3 亿人受到神经肌肉和肌肉骨骼疾病的影响，每年的经济影响超过 8000 亿美元1，2。这组疾病通常继发于神经系统内、神经肌肉接头或肌肉本身的病理学3。尽管病理起源多种多样，但大多数人都有一定程度的肢体无力1，3。不幸的是，鉴于神经和肌肉组织再生的局限性，这种弱点通常是永久性的，特别是在严重创伤的情况下4，5，6。
四肢无力治疗算法通常侧重于康复和支持措施，通常依赖于利用剩余完整肢体（手杖、轮椅等）的能力。7. 然而，对于那些弱点不仅限于单一肢体的人来说，这种策略是不够的。随着机器人技术的最新创新，已经开发出先进的外骨骼设备，可以恢复四肢无力患者的肢体功能8，9，10，11，12，13。这些机器人外骨骼通常是动力的可穿戴设备，可以帮助启动和终止运动或维持肢体位置，提供不同数量的力，可以为用户量身定制8，9，10，11，12，13.这些设备根据它们如何向用户提供运动辅助分为被动或主动：有源设备包含增强用户功率的电动执行器，而无源设备存储来自用户运动的能量，以便在必要时将其释放回用户14.由于有源设备具有增加用户功率能力的能力，因此在肢体无力的情况下，这些设备被更频繁地使用[14]。
为了确定该人群中的运动意图，现代外骨骼通常依赖于从远端肢体肌肉8、15、16、17 的肌电图 （EMG） 或大脑表面脑电图 （sEEG）18、19、20 生成的模式识别算法。.尽管这些检测方式很有希望，但这两种选择都有明显的局限性，阻碍了这些设备的广泛使用。由于sEEG通过经颅检测微伏级信号18，19，20，因此批评经常集中在无法将这些信号与背景噪声区分开来21上。当背景噪声与所需的记录信号相似时，会产生低信噪比（SNR），导致电机检测和分类不准确22，23。准确的信号检测还依赖于稳定的低阻抗头皮接触21，这可能会受到粗/浓毛的存在，用户活动甚至出汗22，24的显着影响。相比之下，EMG信号的幅度要大几个数量级，有利于更高的电机信号检测精度15，18，25。然而，这是有代价的，因为附近的肌肉会污染信号，降低设备16，17，25能够控制的自由度，并且无法检测到深层肌肉运动25，26，27，28。最重要的是，当存在明显的肌肉损伤和完全没有组织时，肌电图不能用作控制方法29。
为了推进机器人外骨骼的发展，需要一致和准确地检测目标用户的运动意图。利用周围神经系统的接口因其相对简单的访问和功能选择性而作为一种有前途的接口技术出现。目前的周围神经接口方法可以是侵入性的或非侵入性的，通常属于以下三类之一：神经外电极30，31，32，33，束内电极34，35，36和穿透电极37，38，39，40.由于周围神经信号通常处于微伏级，因此很难将这些信号与类似幅度的背景噪声41，42区分开来，这降低了接口的整体电机检测精度能力。这些低信噪比（SNR）通常会随着时间的推移而恶化，继发于电极阻抗43恶化，这是由设备39，43的降解或局部异物反应在设备周围产生疤痕组织和/或局部轴突变性37，44引起的。虽然这些缺点通常可以通过再次手术和植入新的周围神经接口来解决，但这不是一个可行的长期解决方案，因为异物相关反应会继续发生。
为了避免周围神经与非生物界面相互作用产生的这些局部组织反应，需要包含生物成分的界面。为了解决这一缺点，开发了再生周围神经接口（RPNI），以将横断的周围神经整合到带有假肢装置的截肢患者的残肢中45，46，47，48。RPNI 的制造涉及将横断的周围神经手术植入一段自体游离肌移植物中，随着时间的推移发生血运重建、再生和神经再支配。通过生成毫伏级复合肌肉动作电位（CMAP），RPNI能够将其包含的神经的微伏级信号放大几个数量级，从而有助于准确检测运动意图45，48，49。在过去的十年中，RPNI有了相当大的发展，在动物50，51和人类47试验中，在放大和传输传出运动神经信号方面取得了显着成功，促进了具有多个自由度的高精度假肢装置控制。
四肢无力但周围神经完整的个体同样受益于通过周围神经接口高精度检测运动意图，以控制外骨骼装置。由于RPNI是为与横断的周围神经（例如截肢患者）整合而开发的，因此需要手术修改。根据RPNI的经验，开发了肌肉袖带再生周围神经接口（MC-RPNI）。它由与RPNI相似的游离肌肉移植段组成，而是在周围固定在完整的周围神经上（图1）。随着时间的推移，它通过侧支轴突发芽再生并重新支配，将这些传出运动神经信号放大并转化为大几个数量级的肌电图信号52。由于MC-RPNI起源于生物学，因此它避免了目前使用的周围神经接口不可避免的异物反应52。此外，MC-RPNI赋予了同时控制多个自由度的能力，因为它们可以放置在远端解剖的神经上，没有明显的串扰，正如之前在RPNIs49中证明的那样。最后，MC-RPNI可以独立于远端肌肉功能运行，因为它位于近端神经上。鉴于其相对于当前周围神经接口的优势，MC-RPNI有望提供一种安全，准确和可靠的外骨骼控制方法。
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Protocol
所有动物程序和实验均在密歇根大学动物机构护理和使用委员会（IACUC）的批准下进行。3-6个月大的雄性和雌性Fischer F344和Lewis大鼠（~200-300g）在实验中最常使用，但理论上可以使用任何菌株。如果使用供体大鼠而不是自体肌肉移植，供体大鼠必须与实验菌株同质。允许大鼠在术前和术后自由获得食物和水。终末终点评估后，在深度麻醉下进行安乐死，心内注射氯化钾，然后采用双侧气胸的辅助方法。
1.大鼠的实验制备
- 在诱导室中以0.8-1.0L / min的速度使用5%异氟醚在氧气中的溶液麻醉实验大鼠。一旦达到足够的麻醉并在没有角膜反射的情况下确认，将大鼠放在复呼吸器鼻锥上，异氟醚降低至1.75%-2.25%以维持麻醉。
- 在0.2 mL无菌盐水中注射0.02-0.03 mL卡洛芬（50 mg / mL）溶液，并在肩胛骨之间的皮下平面上注射27 G针，用于围手术期和术后镇痛。
- 在双眼上涂抹无菌眼膏，以防止麻醉时角膜溃疡。
- 使用电动剃须刀剃除双侧下肢的外侧部分，从髋关节延伸到大腿，再到爪背表面。
- 首先用酒精制备垫擦拭手术部位，然后使用聚维酮碘溶液，最后用新的酒精制备垫进行最后一次清洁，以去除残留的聚维酮碘溶液。重复这种交替清洁过程三次以保持无菌。
注意：这可能是皮肤病刺激物;确保删除大部分解决方案。
2.肌肉移植的准备
- 将大鼠放在手术显微镜下方的加热垫上，并带有用于体温监测的口内体温探头。将异氟醚维持在1.75%-2.25%，氧气保持在0.8-1.0升/分钟。
- 用#15手术刀沿着所需供体后肢的前侧做一个纵向切口，从脚踝上方延伸到膝盖下方。
- 使用锋利的虹膜剪刀解剖下面的皮下组织，以暴露踝关节近端的底层肌肉组织和远端肌腱。胫骨前部（TA）是最大和最前部的肌肉;指长伸肌（EDL）可以在该肌肉的深处和后部找到。将 EDL 肌肉及其远端肌腱与周围肌肉组织隔离开来。
- 通过将镊子或虹膜剪刀的两个尖齿插入踝关节近端的远端肌腱下方，确保隔离正确的肌腱。通过打开镊子或虹膜剪刀对肌腱施加向上压力。这种运动应该同时产生所有脚趾的同时伸展。如果发生孤立性踝关节背屈、踝关节外翻或单趾背屈，则已隔离错误的肌腱。
- 用锋利的虹膜剪刀在踝关节水平处对EDL肌肉进行远端肌腱切开术，并将肌肉从周围组织中剥离出来，朝近端朝其肌腱起源工作。
- 一旦看到近端肌腱，使用锋利的虹膜剪刀进行近端肌腱切开术以释放移植物。
- 修剪肌肉移植物的两端，并用锋利的虹膜剪刀切成所需的长度。
注意：8-13毫米的移植物已成功使用;但是，最常用的长度是 10 毫米。 - 在肌肉移植物的一侧，沿着整个修剪的长度做一个纵向切口，以促进神经在肌肉移植物内的位置，并使神经与肌内膜接触。
- 将准备好的肌肉移植物放在盐水润湿的纱布中，以防止组织干燥。
- 以运行方式用4-0铬缝合线关闭覆盖供体部位的皮肤。
3.腓总神经隔离与制备
- 标记手术切口，该切口将从坐骨神经切口延伸~5毫米，延伸到膝关节下方。确保该标记低于下方可触诊的股骨，并且与股骨成一定角度。
- 用#15刀片沿着标记的切口线切开皮肤和皮下组织。小心切开下面的股二头肌筋膜，注意不要延伸到整个肌肉深度，因为坐骨神经就在下方。
- 使用钝尖小剪刀或止血器，仔细解剖股二头肌。
注意：坐骨神经在二头肌下方的这个空间中移动，方向与皮肤上标记的切口大致相同。坐骨神经有三个值得注意的分支：腓肠神经分支（神经的最后部和最小神经），胫骨神经（通常最前方，但该神经总是深入膝关节）和腓总神经（通常位于胫骨和腓骨之间，总是在膝关节上方行进）。 - 识别腓总（CP）神经，并使用一对微型镊子和微型剪刀小心地将其与周围神经隔离。从神经中间 2 cm 处去除任何周围的结缔组织。在此过程中注意不要用镊子压碎CP神经，因为挤压伤会改变终点结果。
- 在游离的CP神经的最中央部分，通过沿与所需肌肉移植长度相匹配的神经长度去除25%的外神经来执行神经外膜窗口。
- 为此，用微镊子握住近端外神经，用显微解剖剪刀切入紧靠下方的外神经膜，并切除沿神经远端行进的~25%的外神经。注意将这一段整体移除，因为多次尝试会导致不规则的外神经切除，增加神经损伤的风险。
注意：表外神经下部的神经组织将具有粘稠的质地;注意这种神经质量可确保去除正确的组织平面。
4. MC-RPNI结构制造
- 从盐水润湿的纱布上取下肌肉移植物，并将其放置在产生神经外膜窗口的CP神经中央部分下方。将神经旋转 180°，使神经外膜窗口部分接触完整的肌肉，并且不会支撑最终的缝合线。
- 使用 8-0尼龙缝合线，使用简单的间断缝线将CP神经的外神经在步骤2.8中创建的凹槽内的肌肉移植物近端和远端缝合，以将表外神经固定到肌内膜。
注意：放置这些缝线，确保肌肉处于正常的静息长度。过度拉伸或压缩肌肉会影响以后的再生和信号传导能力。 - 使用简单的中断 8-0 将围绕现在固定的神经和缝合线的肌肉移植边缘圆周包裹到位尼龙针迹（~4-6，取决于长度）。
- 一旦达到止血效果，用5-0的染色缝合线将股二头肌筋膜封闭在结构上。
- 用4-0的彩色缝合线以跑步方式关闭覆盖的皮肤。
- 用酒精准备垫清洁手术区域并涂抹抗生素软膏。
- 终止吸入麻醉剂并将大鼠置于与笼友隔离的干净笼子中，并允许 用食物和水随意恢复。
- 一旦老鼠适当恢复，将其与笼子伙伴一起放回干净的笼子里。
注意：这些结构至少需要三个月的成熟才能产生足够的神经信号放大。
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Representative Results
如果大鼠在手术后一周内无法从手术麻醉中存活或发生感染，则 MC-RPNI 手术制造被认为是围手术期失败。先前的研究表明，3个月的成熟期将导致该结构42，45，48，49的可靠信号放大。在那时或之后，可能会发生结构的手术暴露和评估。如果MC-RPNI制造成功，血运重建肌肉应该在原始MC-RPNI植入部位很容易看到（图2B）。成功的 MC-RPNI 在近端神经刺激后还会收缩（视频 1）。有时，可能存在明显的瘢痕形成和萎缩性肌肉移植（图 2C），表明血运重建/再生失败，通常继发于移植物过大、处理不当或围手术期组织损伤。这些萎缩性移植物通常在近端神经刺激时有一定程度的收缩，但产生的信号放大较低。总体而言，如果在暴露后发现MC-RPNI从神经中移开或在近端神经刺激时没有收缩，则被认为是制造失败。
这些结构的组织学分析应显示活的神经和肌肉组织没有任何明显的纤维化或瘢痕形成（图3）。还可以进行免疫组织化学检查以确认神经支配神经肌肉接头的存在，神经丝作为一般神经标志物，与α-邦加罗毒素联合作为突触后乙酰胆碱受体的标志物（图4）。如果目标植入神经未能支配MC-RPNI的肌肉成分，则免疫染色不会显示任何穿过构建体的侧支运动神经芽，也没有任何神经支配的神经肌肉接头。
电生理学测试可以在成熟后的任何时间对这些构建体进行，发表的结果表明，在人类受试者47 的 RPNI 中，在 3 个月52 和长达 3 年的 MC-RPNI 中特异性地显示稳定的信号。电生理学检查示意图可能因感兴趣的区域和可用的设备而异（图 5），但评估最常见的方法是用钩电极对近端神经进行最大刺激，然后记录在 MC-RPNI 处产生的复合肌肉动作电位 （CMAP）（表 1).记录电极可以根据用户的偏好而变化，但肌外膜贴片/垫、外表肌双极探头和穿透性双极电极已在实验中使用并取得了成功。近端神经刺激后CP神经记录的平均复合神经振幅（CNAP）为119.47μV±14.87μV。 在类似的近端CP神经刺激后，MC-RPNI记录的平均CMAP振幅为3.28 mV±0.49 mV，导致神经信号从11-87倍放大，总体平均放大因子为31.8±7.70。这些生成的 CMAP 波形在外观上与天然肌肉相似，进一步支持它们已被其包含的神经重新支配（图 6B）。
为了确保MC-RPNI制造不会造成负面的功能影响，可以对远端神经支配的肌肉进行电生理学和肌肉力测试。大多数测试是在同侧 EDL 肌肉上进行的，因为它很容易进入测试并且由腓总神经支配（对侧 EDL 用于制造 MC-RPNI，因此未进行评估）。近端CP神经刺激后生理性EDL肌肉产生的CMAP通常在20-30mV52之间。当对植入MC-RPNI的大鼠进行该测试时，EDL CMAP没有显着差异，平均为24.27 mV±1.34 mV。此外，当比较这两组之间生成的CMAP波形时，它们非常相似（图6C）。作为远端神经支配肌功能的附加指标，可以对感兴趣的肌肉进行肌力测试（表 2）。近端CP神经刺激后，MC-RPNI受试者产生的平均EDL最大手足搐风力为2451 mN±115 mN，类似于对照受试者52中从EDL肌肉获得的平均2497 mN±122 mN。
MC-RPNI的总体目的是将其所包含神经的微伏级信号放大几个数量级，提高SNR比，从而促进对运动意图的准确检测。这种扩增已被证明在10-20乘以52的范围内以可靠的方式发生，最近的实验实现了50倍以上的扩增因子;因此，如果结构不能提供类似的扩增水平，则认为它是次优的。次优结果通常可归因于MC-RPNI中肌肉移植水平的问题，因为不完全再生和神经再支配会导致低于标准CMAP，从而降低结构的整体扩增能力。生成的波形通常会衰减，外观明显异常。如果肌肉移植完全失败，则在肌肉组件处测量的信号可能不存在（继发于显着的疤痕组织）或反映上游神经产生的CNAP。
图 1：MC-RPNI 的说明性示意图。 在周围的肌肉移植物中，目标周围神经可以以黄色看到。MC-RPNI能够通过产生大几数量级的复合肌肉动作电位（CMAP）来将其所包含神经的运动传出动作电位放大到微伏水平。这有助于检测易于与背景噪声区分开来的电机意图。 请点击此处查看此图的大图。
图 2： 体内的 MC-RPNI。 MC-RPNI 是使用从对侧肢体收获的自体指长伸肌 （EDL） 肌肉移植物制造的。然后将其环形固定在腓总神经上，在初始制造时用白色（A）勾勒出MC-RPNI示例。在 3 个月后的终点评估时，相同的 MC-RPNI 再次显示在 （B） 中。MC-RPNI具有与周围肌肉相似的颜色，并保留了很大一部分体积。萎缩性肌肉移植的例子如（C）所示。MC-RPNI的外观与周围的疤痕和结缔组织相似，并且已经失去了相当大的体积。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：MC-RPNI 组织学。（A） MC-RPNI横截面的H&E，M表示肌肉成分，N表示神经。（B）具有MC-RPNI的大鼠同侧远端神经支配EDL肌肉的横截面。（C）没有MC-RPNI的对照大鼠EDL肌肉的横截面。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：MC-RPNI 的免疫染色。 左上角的图像显示了 MC-RPNI 标本的纵向切片，其中细胞核以蓝色 （DAPI） 表示，神经组织以绿色表示（神经丝）。右下角显示了另一个 MC-RPNI 的特写镜头，存在多个神经肌肉接头（乙酰胆碱受体的红色 α-邦加罗毒素）。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：终点电生理学评估设置。 电生理学测试至少需要三个电极：（1） 接地电极 - 未附图;（2）神经刺激双极电极;（3）双极记录电极。在此设置中，可以在放置在腓总神经上的图像右侧看到白色的双极刺激钩电极。记录双极探针电极放置在远端MC-RPNI上。然后在钩形电极处进行近端神经刺激后记录来自MC-RPNI的信号，直到达到最大CMAP。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：标准电生理波形。 这些图表描述了在近端CP神经刺激后植入MC-RPNI的大鼠的电生理学分析中捕获的典型波形。（A）在蓝色中，图为从CP神经近端到MC-RPNI记录的CNAP（*）。系统工件用 （**） 表示。（B） 在（A）中生成的CNAP之后，MC-RPNI记录的具有代表性的CMAP。（C）从同侧远端神经支配的EDL肌肉记录的CMAP波形。 请点击此处查看此图的大图。
| 大鼠身份证 | 大鼠重量（g） | 神经 CNAP 振幅 （μV） | MC-RPNI CMAP 振幅 （MV） | 神经信号放大因子 | 延迟（毫秒） |
| 1 | 421 | 123.3 | 1.4 | 11.35 | 0.8 |
| 2 | 368 | 65.6 | 1.6 | 24.39 | 1.05 |
| 3 | 390 | 110.7 | 4.5 | 40.65 | 1.45 |
| 4 | 482 | 217.2 | 3.61 | 16.62 | 0.95 |
| 5 | 417 | 144.6 | 1.39 | 9.61 | 0.9 |
| 6 | 417 | 156.1 | 3.4 | 21.78 | 0.95 |
| 7 | 381 | 82 | 7.2 | 87.8 | 0.9 |
| 8 | 393 | 87.9 | 2.3 | 26.17 | 1.15 |
| 9 | 378 | 87.8 | 4.2 | 47.84 | 1 |
| 10 | 459 | 不适用 | 5.3 | 不适用 | 1.55 |
| 11 | 380 | 不适用 | 2.1 | 不适用 | 0.75 |
| 12 | 415 | 不适用 | 2.4 | 不适用 | 1 |
表 1：MC-RPNI 的终点电生理学分析。从制造后3个月（大鼠1-9）和6个月（大鼠10-12）进行终点分析的大鼠获得的结果选择。腓骨近端（CP）神经刺激后，下游CP神经记录复合神经动作电位（CNAP），下游MC-RPNI记录复合肌肉动作电位（CMAP）。每个测试的扩增因子可以在右侧的列中看到。注意：对于大鼠10-12，由于制造MC-RPNI太靠近CP神经从坐骨神经起飞而导致的解剖学限制，无法测量MC-RPNI近端的CNAP。记录的平均CNAP幅度为119.47 μV±14.87 μV，而平均CMAP幅度为3.28 mV±0.49 mV，产生31.8±7.70的平均放大因子。
| 大鼠身份证 | 最大抽搐 （mN） | V | 最大手足搐搦 （mN） | V | 赫兹 | 低（毫米） |
| 1 | 927.13 | 3 | 2668.29 | 3 | 80 | 30.64 |
| 2 | 768.22 | 3.5 | 2677.85 | 3.5 | 80 | 31.15 |
| 3 | 646.99 | 3 | 2164.84 | 3 | 80 | 28.36 |
| 4 | 863.62 | 3.5 | 3109.67 | 3.5 | 150 | 31.07 |
| 5 | 774.48 | 1.5 | 2723.24 | 2 | 80 | 28.83 |
| 6 | 558.19 | 4 | 1930.22 | 4 | 120 | 29.46 |
| 7 | 753.97 | 1 | 2605.64 | 1 | 100 | 31.13 |
| 8 | 768.38 | 2 | 2897.08 | 2 | 100 | 31.86 |
| 9 | 559.9 | 1.5 | 1984.17 | 1.5 | 100 | 31.11 |
| 10 | 600.6 | 5.5 | 2416.09 | 5.5 | 80 | 32.51 |
| 11 | 770.27 | 5.5 | 2496.89 | 5.5 | 80 | 31.89 |
| 12 | 672.22 | 2.5 | 1740.04 | 2.5 | 50 | 31.34 |
表2：植入MC-RPNIs的大鼠的肌肉力量分析。 对同侧指长伸肌（EDL）进行肌力测试，以确定MC-RPNI是否对远端神经支配的肌肉功能有任何影响。在近端CP神经刺激后，记录力追踪并计算与感兴趣的测试相关的活动力。Lo 被定义为产生最大力的最佳肌肉静息长度。植入MC-RPNIs的大鼠记录的平均最大抽搐力为722.0mN±32.11mN，记录的平均最大破伤风力为2451mN±115mN，与对照动物获得的值相似（最大抽搐：822.2mN±41.11mN;最大手足搐搦：2497mN±122mN）。
视频 1：近端神经电刺激后的 MC-RPNI 收缩。在右侧钩形电极提供的近端神经电刺激下，可以在中心看到MC-RPNI的明显肌肉收缩。 请点击此处下载此视频。
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Discussion
MC-RPNI是一种新颖的结构，可以放大完整的外周运动神经的传出动作电位，以便精确控制外骨骼装置。具体来说，MC-RPNI为那些由严重的肌肉疾病和/或肌肉缺失引起的四肢无力的个体提供了特别的好处，而肌电图信号无法记录。减少已经受损的肌肉功能在这个人群中将是毁灭性的;然而，MC-RPNI能够提供这种神经信号放大，而不会损害远端神经支配的肌肉52 （表1和 表2）。在那些患有基于肌肉或下运动神经元疾病的个体中，周围感觉神经通常不受疾病过程的影响53。由于感觉得以保留，因此必须保持神经连续性并避免损伤，根据组织学（图 3）、免疫组织化学（图 4）和肌肉功能评估（表 2），MC-RPNI 似乎避免了对整个远端神经支配靶标的任何损害。
MC-RPNI依赖于所包含的周围神经的侧支轴突萌芽的概念，这一概念在先前的研究52 和描述的端到端神经出血54，55的手术技术中都很容易证明。为了确保在MC-RPNI制造过程中肌肉移植物的充分再神经化并避免对远端神经支配靶点产生负面影响，必须对神经进行细致处理。在神经解剖过程中，仅通过简洁处理表神经或结缔组织可以避免创伤。然而，在 MC-RPNI 制造中，神经损伤的可能性在神经外观窗口步骤中最高。为避免神经纤维的尖锐横断，建议仅在非实验大鼠上练习几次机会后，仅在高倍手术显微镜（至少5倍）下执行此步骤。此步骤可能需要多次尝试才能掌握，不建议首先在用于实验分析的大鼠身上执行此步骤。从理论上讲，连续性神经瘤是MC-RPNI制造后可能发生的并发症，尤其是在存在严重神经创伤的情况下。然而，在多年的开发中没有遇到这种复杂性。
大多数使用 MC-RPNI 进行的实验都是在腓总神经上进行的，因为它相对容易进入以及对远端神经支配靶点的评估。从理论上讲，任何具有运动成分的周围神经都可以被替代。纯感觉轴突可以利用，因为肌肉组织确实具有感觉成分（纺锤体纤维，高尔基体肌腱器官等），但这些实验至今尚未进行，结果难以预测。对于MC-RPNI的肌肉移植成分，移植物范围为20-150mg，具体取决于移植物长度和大鼠的年龄，并且可以成功利用任何类似大小的肌肉移植物。肌肉移植物再生部分依赖于血运重建的能力，大/厚的移植物更容易发生坏死和纤维化，影响整体信号传导能力56。专门针对RPNI进行的研究表明，在高达300mg56的移植物中，肌肉再生成功并维持信号放大。关于大鼠品种，建议使用刘易斯和费舍尔，因为已知大多数用于实验目的的其他大鼠会继发于神经损伤57，58的自残。
总体而言，目前MC-RPNI制造的经验产生了<5%的失败率。最常见的结构失败通常归因于肌肉移植段，因此在暴露时，它们被注意到萎缩或从神经中脱落。MC-RPNI脱落通常是由于制造时缝合不充分造成的，导致圆周包裹的肌肉移植物“打开”并最终部分挤压所包含的神经。然而，这些MC-RPNI通常保留一定程度（尽管降低）的信号放大能力，因为移植物的一部分仍然固定在神经上。萎缩性MC-RPNIs在暴露时很明显，因为它们缺乏典型的骨骼肌外观，通常与浅粉红色至灰色/白色的疤痕组织无法区分（图2C）。肌肉组织萎缩可由许多因素引起，包括感染、肌肉移植物过大/过厚、急性失血性贫血、制造过程中的肌肉和/或神经损伤，以及外神经固定缝合线的失败导致移植物在神经上的活塞，从而减少血运重建。在电生理学检查中，萎缩性 MC-RPNI 通常几乎不产生信号放大;如果使用高灵敏度电极，可以通过萎缩肌记录下层神经的CNAP。如果在多个实验对象中发现明显的萎缩，则必须返回协议并确定哪些步骤需要调整。当然，如果在执行评估时没有记录到信号，那么排除故障而不是假设构造失败是很重要的。对设备设置进行故障排除至关重要，因为缺乏信号可能是继发于电极损坏（推荐阻抗 <16 Ω）、电极配置不正确，甚至近端神经刺激不足（某些神经需要 0.5-5 mA 电刺激才能开始在下游 MC-RPNI 产生 CMAP）。
目前用于四肢无力患者外骨骼的人机接口方法通常依赖于从周围神经或肌肉组织获得的肌电图记录。如前所述，MC-RPNI为那些肌肉组织严重受损或缺失且无法进行肌电图记录的个体提供了外骨骼控制方面的显着益处29。与当前的周围神经接口选项相比，MC-RPNI 还具有优势，包括神经外电极 30、31、32、33、束内电极 34、35、36 和穿透电极 37、38、39、40.由于固有的神经信号通常处于微伏水平，MC-RPNI能够将这些神经信号放大30倍以上，有助于从背景噪声中准确检测运动意图，从而实现可靠的外骨骼控制。由于长期使用，目前基于电极的方法最终难以克服材料体内寿命和异物反应固有的并发症，MC-RPNI由于其生物学来源而能够避免的并发症。随着时间的推移，这些异物反应会导致组织损伤、瘢痕组织形成，并最终导致轴突脱髓鞘和变性。长达六个月的实验没有发现任何神经元损伤、疤痕或远端神经支配肌肉组织纤维化/变性的证据（图 3），结合人类受试者在三年观察期内注意到的 RPNI 稳定性47，可以合理地得出结论，MC-RPNI 可以成功地与周围神经连接数年到数十年。
MC-RPNI旨在用于各种病理中的外骨骼控制，包括神经系统水平以及肌肉本身引起的病理。例如，基于肌肉的病变可能包括创伤、肌肉萎缩症、炎症性肌病和重症肌无力等疾病。尽管严重的肌肉损伤和虚弱可能导致这些情况1，2，3，但大多数具有功能性的下运动神经元，这将促进MC-RPNI神经再支配和运动意图的检测。对于那些导致广泛肌肉疾病（肌肉萎缩症等）的疾病，游离肌肉移植成分当然有可能受到影响，从而限制了扩增潜力。然而，鉴于即使是单个运动单元（10-400μV）59的检测也可以提供周围神经信号的放大，因此可以合理地假设MC-RPNI在其较小的定义区域内包含足够的运动单元，以促进该人群的外骨骼控制。然而，该结构的一个显着局限性在于那些导致上运动神经元和/或下运动神经元显着减少的病理，例如中风、脊髓损伤、脊椎肌肉萎缩 （SMA） 和肌萎缩侧索硬化症 （ALS）。如果没有合适的周围神经纤维群来重新支配MC-RPNI，它就无法再生并提供信号放大，从而导致构建失败。正在进行实验以确定足够的MC-RPNI功能所需的功能性周围神经纤维的最小群体。
MC-RPNI的前身RPNI通过放大和记录从横断的周围神经产生的信号，在精确控制人类受试者的动力假肢方面取得了不可估量的成功。最值得注意的是，它能够在数月至数年的规模上做到这一点，而无需重新手术或重新校准假肢装置。外骨骼控制中心当前人机接口方法的常见抱怨是串扰造成的信号污染以及依赖肌电图的方法需要频繁重新校准 26，27，28，以及随着时间的推移，周围神经界面不稳定需要二次手术 37，39，44.然而，MC-RPNI能够避免这些并发症，因为它的生物组成以及战略放置能力。必须建立对这种结构的透彻理解，以便为在人类受试者中使用铺平道路，并最终在四肢无力的人中广泛使用准确、可靠的外骨骼装置。
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Disclosures
作者没有披露。
Acknowledgments
作者感谢Jana Moon的专业实验室管理和技术援助，以及Charles Hwang的成像专业知识。本文中的实验部分由整形外科基金会资助SS（3135146.4）以及国家儿童健康与人类发展研究所（奖励号为1F32HD100286-01）资助给SS，以及美国国立卫生研究院国家关节炎，肌肉骨骼和皮肤病研究所，奖励号为P30 AR069620。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| #15 Scalpel | Aspen Surgical, Inc | Ref 371115 | Rib-Back Carbon Steel Surgical Blades (#15) |
| 2-N-thin film load cell (S100) | Strain Measurement Devices, Inc | SMD100-0002 | Measures force generated by the attached muscle |
| 4-0 Chromic Suture | Ethicon | SKU# 1654G | P-3 Reverse Cutting Needle |
| 5-0 Chromic Suture | Ethicon | SKU# 687G | P-3 Reverse Cutting Needle |
| 8-0 Monofilament Suture | AROSurgical | T06A08N14-13 | Black polyamide monofilament suture on a threaded tapered needle |
| Experimental Rats | Envigo | F344-NH-sd | Rats are Fischer F344 Strain |
| Fine Forceps - mirror finish | Fine Science Tools | 11413-11 | Fine tipped forceps with mirror finish ideal for handling delicate structures like nerves |
| Fluriso (Isofluorane) | VetOne | 13985-528-40 | Inhalational Anesthetic |
| Force Measurement Jig | Red Rock | n/a | Custom designed force measurement jig that allows for immobilization of hindlimb to allow for accurate muscle force recording |
| MATLAB software | Mathworks, Inc | PR-MATLAB-MU-MW-707-NNU | Calculates active force for each recorded force trace from passive and total force measurements |
| Nicolet Viasys EMG EP System | Nicolet | MFI-NCL-VIKING-SELECT-2CH-EMG | Portable EMG and nerve signal recording system capable of simultaneous 2 channel recordings from nerve and/or muscle |
| Oxygen | Cryogenic Gases | UN1072 | Standard medical grade oxygen canisters |
| Potassium Chloride | APP Pharmaceuticals | 63323-965-20 | Injectable form, 2 mEq/mL |
| Povidone Iodine USP | MediChoice | 65517-0009-1 | 10% Topical Solution, can use one bottle for multiple surgical preps |
| Puralube Vet Opthalmic Ointment | Dechra | 17033-211-38 | Corneal protective ointment for use during procedure |
| Rimadyl (Caprofen) | Zoetis, Inc. | NADA# 141-199 | Injectable form, 50 mg/mL |
| Stereo Microscope | Leica | Model M60 | User can adjust magnification to their preference |
| Surgical Instruments | Fine Science Tools | Various | User can choose instruments according to personal preference or from what is currently available in their lab |
| Triple Antibiotic Ointment | MediChoice | 39892-0830-2 | Ointment comes in sterile, disposable packets |
| Vannas Spring Scissors - 2mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-04 | Curved micro-dissection scissors used to perform the epineurial window |
| VaporStick 3 | Surgivet | V7015 | Anesthesia tower with space for isofluorane and oxygen canister |
| Webcol Alcohol Prep | Coviden | Ref 6818 | Alcohol prep wipes; use a new wipe for each prep |
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