Summary
Yüksek hızlı video mikroskopi analizi, gerçekleştirilmesi nispeten kolay, hızlı, uygun maliyetli ve deneyimli ellerde, primer siliyer diskinezinin birinci basamak teşhisi için oldukça güvenilir bir araçtır ve ciddi akciğer hastalıklarının teşhisi ve tedavisinde yer alan her merkezde mevcut olmalıdır.
Abstract
Primer siliyer diskinezi (PKD), ağırlıklı olarak otozomal resesif geçişli kalıtsal bir konjenital hastalıktır. Bozukluk, kirpiklerin hareketinde bozulmaya neden olur ve mukosiliyer klirensin (MCC) ciddi şekilde bozulmasına neden olur. Teşhis edilmezse veya çok geç teşhis edilirse, durum bronşektazi gelişimine ve daha sonraki yaşamda akciğerlerde ciddi hasara yol açar. PCD'yi teşhis etme yöntemlerinin çoğu zaman alıcıdır ve bunları kurmak için kapsamlı ekonomik kaynaklar gerektirir. Yüksek hızlı video mikroskopi analizi (HSVMA), canlı solunum hücrelerini in vitro kirpikleri yenerek görselleştirmek ve analiz etmek için tek tanı aracıdır. Hızlı, uygun maliyetli ve deneyimli ellerde PCD için bir teşhis aracı olarak çok güvenilirdir. Ek olarak, transmisyon elektron mikroskobu (TEM) gibi klasik tanısal önlemler, morfolojik değişiklikler olmadığı için bazı mutasyonlar için geçerli değildir.
Bu yazıda solunum epitel hücrelerinin toplanması süreci, numunenin daha fazla hazırlanması ve HSVMA süreci açıklanmaktadır. Ayrıca, fırçalanmış hücrelerin, bir kliniğin HSVMA'yı gerçekleştirecek ekipmana sahip olmadığı durumlarda, depolama ve araştırma alanına taşınması için besleyici bir ortamda tutarak nasıl başarılı bir şekilde zarar görmeden ve dövülmeden tutulabileceğini de açıklıyoruz. Ayrıca, TEM tanısı konamayan dynein kolu ağır zincir 11 geninde (DNAH11) mutasyonu olan hastalardan patolojik dayak paternleri içeren videolar da gösterilmiştir; üst solunum yollarının enfeksiyonu nedeniyle sonuçsuz bir HSVMA'nın yanı sıra kırmızı kan hücrelerinin üst üste binmesiyle başarısız bir fırçalamanın sonucu. Bu makalede, pulmonoloji hastaları ve nadir görülen akciğer hastalıkları ile ilgilenen her birimi, PCD için günlük rutin teşhislerinin bir parçası olarak HSVMA gerçekleştirmeye veya örnekleri HSVMA gerçekleştirme konusunda uzmanlaşmış bir merkeze göndermeye teşvik etmek istiyoruz.
Introduction
Primer siliyer diskinezi (PKD), kirpiklerin dövülme hareketinde bozukluklara neden olan nadir, kalıtsal bir genetik bozukluktur. Teşhis edilmezse, MCC'nin ciddi şekilde bozulması nedeniyle daha sonraki yaşamda ciddi akciğer hasarına yol açar. Geçmişte, prevalansının 1: 4.000 ila 50.000 arasında olduğu tahmin edilmektedir. Sürekli olarak gelişen teşhis ve durumun artan farkındalığı nedeniyle, PCD prevalansı ile ilgili güncellemeler, çok daha yaygın olabileceğini ve muhtemelen 1.2yerine 1: 4.000 ila 20.000 aralığında olabileceğini düşündürmektedir. Bununla birlikte, PCD'li hastalar hala az teşhis edilir veya çok geç teşhis edilir 1,3. Bu nedenle, konjenital situs inversus ve/veya heterotaksi veya perinatal rinore, yenidoğan solunum sıkıntısı, tıkalı burun ve beslenme güçlüğü olan bebekler PKD açısından şüpheli olmalıdır. Daha sonraki yaşamda, kronik otitis, tekrarlayan pnömoni, rinosinüzit ve bozulmuş MCC'ye bağlı kronik, tipik ıslak öksürük, bronşektazi ve bozulmuş akciğer fonksiyonu ile kombinasyon halinde yetişkinliğe kadar devam eden PCD'nin ayırt edici semptomlarıdır2.
PCD'li olduğundan şüphelenilen hastalara farklı tanı araçları kullanılarak tanı konulabilir. TEM, geçmişte birinci basamak teşhis için altın standart olarak kabul edilmiştir. Bununla birlikte, PCD vakalarının% 30'una kadarı anormal ultrayapı 1,3,4,5,6 göstermez ve farklı bir tanısal yaklaşım gerektirir. Bu nedenle, giderek artan sayıda merkez ve Avrupa Solunum Derneği'nin (ERS) kılavuzları, ilk basamak tanı1,7,9,10 olarak nazal nitrik oksit (nNO) ve HSVMA'nın bir kombinasyonunu önermektedir. HSVMA ve nNO, PCD11'li bir hastanın tanımlanmasında da en uygun maliyetli seçeneklerdir. Bununla birlikte, genetik testler tanıya dahil edilmiş olsa bile, şu anda PCD'yi% 100 kesinlik 8,9,10 ile dışlayabilecek tek başına bir test veya test kombinasyonu olmadığı akılda tutulmalıdır.
Mevcut tanı seçeneklerinden HSVMA, canlı, kirpik kaplı solunum hücrelerine odaklanan ve siliyer atım paterni (CBP) ve siliyer atım frekansını (CBF) değerlendiren tek testtir. TEM'in aksine, HSVMA'nın sonuçları genellikle test gününde hızlı bir şekilde elde edilebilirken, TEM'in sonuçları numune alındıktan aylar sonra gelebilir. HSVMA tüm yaş grupları için uygulanabilirken, nNO yüksek derecede uyumluluk gerektirir; 5 yaşın altında kullanma girişimleri genelliklebaşarısız olur 10. Deneyimli ellerde, HSVMA PCD'yi sırasıyla% 100 ve% 96,12'de teşhis etmek için mükemmel duyarlılık ve özgüllüğe sahiptir.
Bu makalede, kirpik kaplı solunum hücrelerinin burnun inferior konkasından toplanması, hasat edilen hücrelerin araştırma bölgesine taşınması için hücre besleyici bir ortamda korunması ve CBF ve CBP'yi belirlemek için mikroskobik video analizi süreci dahil olmak üzere HSVMA'yı gerçekleştirmek için adım adım prosedür açıklanmaktadır. Ek olarak, normal CBP'leri ve CBF'leri anormal kirpik fonksiyonu ile karşılaştıran hastalardan bazı video klipler gösterilmiştir (Video 3, Video 4, Video 5, Video 6, Video 7 ve Video 8).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Beyan:
Bu çalışma yerel etik kurul tarafından onaylanmıştır (69/2017) ve Helsinki deklarasyonuna uygun olarak yürütülmüştür.
1. Solunum epitel hücrelerinin toplanması ve taşınması
- Fırçalama
- Fırçalamadan önce, kirpik fonksiyonuna müdahale eden biyofilmleri ortadan kaldırmak için hastaya iki haftalık bir oral amoksisilin-klavulanik asit kürü uygulayın. Antibiyotiğin işlemden 2 gün önce sonlandırıldığından emin olun.
- Fırçalanmış epitel hücre şeritleri üzerindeki mukoza materyalinin bir kaplamasını azaltmak için, hastadan burnunu iyice üflemesini isteyin. Ebeveynlerden küçük çocuklarının burunlarını üflemesine yardım etmelerini isteyin.
- Fırçalama için, 0,6 mm boyutunda bir diş arası fırça kullanın ( bkz. Hastanın başını bir elinizle sabit tutun ve diğer elinizle yeterli epitel hücre şeridi toplamak için her iki burun deliğinin inferior konkasını fırçalayın.
NOT: Dişler arası fırçayı inferior konkanın altına derinlemesine yerleştirirken genellikle hafif bir direnç görülür. Burun fırçalama işlemi yaklaşık 2 sn hızlı dönme ve toplama ile gerçekleştirilir. Daha uzun ve yoğun fırçalama, aksi takdirde ciddi epitel hasarına ve ardışık epistaksislere neden olabilir. - Bronkoskopi şüpheli PCD dışındaki nedenlerle planlanıyorsa, bronkoskopi sırasında karina veya bronşiyal epiteli fırçalayarak veya biyopsi ile örnekler toplayın13.
- Hasat edilen hücre şeritlerini, hücre besleyici Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını (DMEM) içeren 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne bırakın.
NOT: Epitel hücre şeritleri genellikle fırçayı tüp duvarına fırlatıp çevirerek fırçayı daha kolay düşürür. - Mikrosantrifüj tüpünün kapağını kapatın ve tüpü bir ışık kaynağına karşı tutun. Hasat edilen hücre şeritlerini ve konglomeraları keşfetmek için tüpü sallayın.
- Numunenin taşınması
- Mikrosantrifüj tüplerini sıkıca kapatılmış bir polistiren kutuya yerleştirin ve tüplerin kapağının düzgün bir şekilde kapatıldığından ve tüplerin kutunun içine sabitlendiğinden emin olun.
- Soğuk bir paket ekleyin; ancak, numuneyi dondurmaktan kaçının.
NOT: İncelemeden önce numunenin korunması için optimum sıcaklık yaklaşık 4-8 ° C'dir (39.2-46.4 ° F). - Korunan numunelerin sonraki 24 saat boyunca analiz edildiğinden emin olun.
NOT: Bu deneylerde, fırçalama ve HSVMA arasındaki ortalama süre 3 saattir.
2. Yüksek hızlı video mikroskopi analizi (HSVMA)
- Örneklerin video mikroskopisi
- Numuneleri içeren mikrosantrifüj tüplerini aldıktan sonra, optimal, in vivo benzeri bir ortamı taklit etmek için 37 ° C'ye (98.6 ° F) kadar ısıtın.
- Mikroskop bir ısıtma ünitesi ile donatılmışsa, tüpleri kaputun altına yerleştirin ve orada ısıtın. Alternatif olarak, numuneleri ısıtmak için bir inkübatör kullanın.
- PC'deki kamerayı ve video ünitesinin yazılımını başlatın.
- Bir pipet kullanarak, numuneden az miktarda alın ve bir küvet veya cam tabanlı bir kaba iki damla yerleştirin ( bkz. Küvet veya tabağı bir kapakla örtün ve mikroskop altına yerleştirin.
- Örneklerin değerlendirilmesi için, soğuk ışık kaynağı ve yüksek hızda (en az 200 kare / s) kayıt yapabilen bir video kamera ile donatılmış bir diferansiyel girişim mikroskobu kullanın. 100x büyütmeli bir yağ daldırma lensi kullanın ve optiğin yüzeyine bir damla daldırma yağı koyun.
NOT: Lensin aşağıdan yaklaştığı mikroskoplar önerilir. - Kabın dibine mikroskop merceği ile yaklaşın ve kırmızı kan hücreleri olmayan ve düşük mukus içeriğine sahip hücre kümelerini arayın. Temsili bir ilgi alanı (ROI) bulduktan sonra, en büyük kirpik hareketlerine sahip belirli bir kirpik grubuna odaklanın ve bir video dizisi kaydedin. Yenen kirpikleri olan hücreleri yana doğru ve yukarıdan kaydedin. Bundan sonra, başka bir temsili hücre kümesi arayın ve kaydı tekrarlayın.
NOT: Kirpik kaplı hücreler 1.000x büyütme altında araştırılmalı ve dövülen kirpikler, 200 / s veya daha fazla kare hızında ayarlanmış bir dijital yüksek hızlı video (DHSV) kamera ile kaydedilmelidir (bu protokolde 256 / s). Kaydedilen video kliplerden elde edilen veriler sabit sürücüde çok fazla alan gerektirdiğinden, harici bir SSD sabit sürücüsü önerilir.
- Video dizilerinin analizi
- CBF ve CBP'yi belirlemek için video klipleri kare kare oynatın.
- CBF'yi belirlemek için kare hızını 15 kare/sn ile ağır çekime ayarlayın ve art arda 10 vuruş sayın.
- 10 atımlık tek bir döngü sırasında geçen kare sayısını kaydedin ve sonucu Eq'ya (1) ekleyin. Kaydedilen tüm kirpik vuruş döngülerinin ortalamasını hesaplayarak frekansı belirleyin ve sonucu yaş için referans değerlerle karşılaştırın (bkz. Tablo 1)14.
(1)
Burada X, 10 atımlık bir döngü sırasında geçen karelerin sayısıdır. - CBP'yi değerlendirmek için, dayak kirpiklerinin hareketinin tam aralıkta olup olmadığını (bkz. Şekil 1) ve senkronize olup olmadığını izleyin. Seçim yanlılığını önlemek için CBP'yi iki bağımsız operatörün değerlendirmesini sağlayın.
- HSVMA analizinin sonuçlarını PCD ile uyumlu, olası olmayan veya sonuçsuz olarak raporlayın.
(1)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Video 1 ve Video 2, CBF ve CBP'nin normal aralıkta olduğu normal bir kontrol gösterir (bkz. Şekil 1). Video 3, Video 4, Video 5 ve Video 6, DNAH11 geninde homozigot mutasyonu olan iki PCD hastasını temsil etmektedir (c.2341G > A; p. Glu781Lys)3. Bu temsili videolar, DNAH11 genindeki mutasyonların fenotiplerinin dikkate değer olması nedeniyle seçilmiştir, çünkü morfolojik değişikliklerin yokluğu nedeniyle TEM tarafından teşhis edilemezler 3,4,5.
Video 3 , PCD ile uyumlu siliyer vuruşun klasik sert, minimal hareketli modelini göstermektedir. Video 1 ve Video 2'de gösterilen normal, tam aralıklı desen yoktur (bkz. Şekil 1). Video 4, aynı hastanın bir dizisini (Video 3) gösterir, ancak yukarıdan kaydedilir. Video 5 ve Video 6 , DNAH11 geninde mutasyon taşıyan hastalarda PCD ile de uyumlu, hiperkinetik ve etkisiz bir dayak kirpik fenotipi göstermektedir. CBF o kadar yüksekti ki belirlenemedi. Video 6 aynı hastadan (Video 5) ancak yukarıdan kaydedilmiştir. CBP anormaldir ve sağlıklı kirpiklerin tam aralıklı hareketini göstermez (bkz. Şekil 1, Video 1 ve Video 2).
Video 7 ve Video 8, tekrarlayan üst solunum yolu enfeksiyonlarından muzdarip bir hastadan yana doğru (Video 7) ve yukarıdan (Video 8) patolojik bir CBF ve CBP göstermektedir; ancak PCD kurulamadı. 10 Hz'de, CBF yaş için normal aralığın biraz altında kalır (bkz. Tablo 1) ve CBP, kontrol video dizisinin normal CBP'sine (Video 1, Video 2 ve Şekil 1) kıyasla anormaldir ve döner bir siliyer hareket gösterir. Olgu yetersizdir ve hastanın klinik tablosu PCD'yi düşündürse de, nNO, TEM ve genetik testler de dahil olmak üzere daha ileri tanısal önlemler düşünülmelidir.
Fırçalama işlemi titizlikle gerçekleştirilirse, burun epiteli yaralanabilir ve epistaksis oluşabilir. Numunede çok fazla kan hücresi varsa, HSVMA analizi yapılamaz, çünkü siliyer epitel hücreleri, Video 9'da görülebileceği gibi, kırmızı kan hücrelerinin bir kaplaması ile kaplanmıştır.
Resim 1: Normal siliyer inme. Sağlıklı bir bireyin siliyer inmesi, normal bir ileri ve iyileşme inmesinin tüm aralığını gösterir. Etkili vuruş (koyu mavi) soldan sağa kırbaç şeklinde hareket eder. Kurtarma vuruşu (açık mavi), kirpikleri sağdan sola doğru başlangıç konumuna geri hareket ettirir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Video 1: PCD'si olmayan bir hastanın normal kirpik hareketi, yana doğru görülür. Kısaltma: PCD = Primer siliyer diskinezi. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 2: PCD'si olmayan bir hastanın yukarıdan normal kirpik hareketi. Kısaltma: PCD = Primer siliyer diskinezi. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 3: DNAH11 geninde mutasyona uğramış bir PCD hastasının ( c.2341G > A p. Glu781Lys)3, sert, neredeyse hareketsiz kirpikler gösteren yanal video dizisi. Kısaltmalar: PCD = Primer siliyer diskinezi; DNAH11 = dynein kolu ağır zincir 11 geni. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 4: Yukarıdan kaydedilen aynı PCD hastasından video dizisi (Video 3). Kısaltma: PCD = Primer siliyer diskinezi. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 5: Bir PCD hastasının yana doğru video dizisi, tamamen farklı, hiperkinetik ama verimsiz bir kirpik dövme paterni göstermektedir. Hasta, Video 3 ve Video 4'teki hastayla aynı ailenin bir üyesiydi ve aynı mutasyona sahipti. Kısaltma: PCD = Primer siliyer diskinezi. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 6: Aynı PCD hastasından yukarıdan kaydedilen video dizisi (Video 5). Kısaltma: PCD = Primer siliyer diskinezi. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 7: Tekrarlayan üst solunum yolu enfeksiyonundan muzdarip bir PCD hastasında anormal, koordinasyonsuz ve yavaş kirpik hareketinin video dizisi. Kısaltma: PCD = Primer siliyer diskinezi. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 8: Aynı PCD hastasından yukarıdan video dizisi (Video 7). Kısaltma: PCD = Primer siliyer diskinezi. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Video 9: Dikkatsiz fırçalama nedeniyle analiz edilemeyen ve epistaksise ve kırmızı kan hücrelerinin üst üste binmesine yol açan bir numunenin video dizisi. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.
| Siliyer atış frekansı (Hz)* | ||||
| Yaş (yıl) | Demek | SD | 5., 95. | Diskinetik olarak kenarları yenen (%) † |
| 0-6 | 12.9 | 2.3 | 10.0, 18.1 | 10.4 (0.0, 36.8) |
| 7-12 | 12.9 | 1.4 | 10.9, 15.0 | 9.1 (0.0, 40.3) |
| 13-18 | 12.6 | 1.7 | 10.9, 15.3 | 24.8 (0.0, 56.9) |
| ≥19 | 11.5 | 2.8 | 7.7, 15.5 | 5.8 (0.0, 24.3) |
| *Ortalama siliyer vuruş frekansı, standart sapma (SD) ve 5. ve 95. persentiller | ||||
| †Siliyer diskinezi alanları sergileyen kenarların ortalama (5., 95. persentiller) yüzdesi | ||||
Tablo 1: Normal vuruş frekansları. Normal, yaşa bağlı, siliyer vuruş sıklığı. Bu tablo Chilvers ve ark.14'ten değiştirilmiştir. * Ortalama siliyer vuruş frekansı, SD ve 5. ve 95.yüzdelik dilimler. †Siliyer diskinezi alanları sergileyen kenarların ortalama (5., 95. yüzdelik dilimler). Kısaltma: SD = standart sapma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada, HSVMA kullanarak PCD için teşhis süreci, birinci basamak teşhis ışığında tanımlanmış ve tartışılmıştır. HSVMA'nın kurulması nispeten kolay, uygun maliyetli11 ve deneyimli ellerde güvenilir bir yöntem12 olmasına rağmen, HSVMA tuzakları olmayan bir teşhis önlemi değildir. Anormal CBF ve CBP, bronko-respiratuar epitel15'in iltihaplanmasına yol açan ikincil enfeksiyona bağlı olabilir ve aynı nedenle, sigara içen bireylerin anormal vuruş frekansları16,17 olabilir. Ek olarak, PKD tanısı konmadan önce kistik fibroz dışlanmalıdır. Bir hasta örneğinin analizinin PCD ile uyumlu olduğuna karar verilmeden önce, anormal sonuçlar, yeni fırçalamalar ve CBF ve CBP'nin yeniden analiz edilmesini gerektiren, bağımsız olarak toplanan iki örnekle doğrulanmalıdır. Bu, özellikle çocuklar için zor olabilir. Bu nedenle, bazı araştırmacılar tekrarlanan fırçalamaları önlemek için ilk fırçalama seansından elde edilen epitel hücrelerinin kültürlenmesini önermektedir 9,15.
Bronkoskopi PKD tanısı için tercih edilen seçenek olmasa da, PCD dışındaki nedenlerle yapılıyorsa, bronşiyal epitel fırçalanarak veya biyopsi alınarak alternatif olarak anestezi altında örnekler alınabilir13. Sekonder enfeksiyon siliyer hareketi değiştirebilir ve sıklığı yenebilir. Bu istenmeyen etkileri azaltmak için, yaygın solunum yolu patojenlerini hedeflemek için amoksisilin artı klavulanik asit veya bir sefalosporin gibi geniş spektrumlu bir oral antibiyotik ile iki haftalık bir kurs uygulanması önerilir. PCD18'in tedavisinde önemli faydalara sahip olmasına rağmen, makrolidlerden muhtemelen bu amaçla kaçınılmalıdır, çünkü kirpik19'u yenme üzerindeki prokinetik bir etki nedeniyle CBF'yi değiştirebilirler. Ayrıca, literatürdeki kanıt eksikliğinden bağımsız olarak, CBF üzerinde herhangi bir etkiden kaçınmak için antibiyotikler fırçalama ve analizden en az 48 saat önce durdurulmalıdır. Fırçalama veya biyopsi ile elde edilen örneklerin antibiyotik içeren sıvılarda yetiştirildiği deneylerde antibiyotiklerin CBF veya CBP üzerinde önemli bir etkisi gözlenememiştir20,21,22.
HSVMA, Avrupa'daki en doğru ve tekrarlanabilir teknik olarak kabul edilmesine rağmen, seçim yanlılığı ve yukarıda belirtilen sorunlar nedeniyle operatör hatası riski taşımaktadır15. Bu nedenle, birkaç grup son zamanlarda bu sorunun üstesinden gelmek için dijital görüntülerden analizi otomatikleştirmek için yazılım çözümleri geliştirmiştir23,24,25. Bu otomasyon hala geliştirilme aşamasında olduğundan, yazarlar CBF ve CBP'yi manuel olarak analiz etmek için iki bağımsız, uzman operatör kullanarak mükemmel ve güvenilir sonuçlar elde etmektedir.
Bu makalenin temsili sonuçları, DNAH11 geninde mutasyonu olan hastalardan video klipler göstermektedir. Bu gendeki mutasyonlar normal bir ultrayapı gösterir ve bu nedenle bu mutasyona sahip hastalar TEM ile teşhis edilemez. TEM tarafından gösterilen kirpiklerin normal ultrayapısı, tüm PCD vakalarının %30'una kadar görülebilir6. Ek olarak, nNO, bu mutasyonun hiperkinetik fenotipi (Video 5 ve Video 6) ile normal olabilir, bu da HSVMA'yı genetik testlerle birlikte tek güvenilir tanı aracı 3,8 yapar. Ayrıca pediatrik hastalar PKD tanısı için birincil hedefi oluşturmaktadır. Birçok durumda, yenidoğan dönemi26'da PCD'yi düşündüren semptomlar gözlenebilir ve HSVMA'yı diğer alternatiflere göre tercih edilen hızlı, birinci basamak bir tanı önlemi haline getirir.
Bir Kuzey Amerika çalışmasında, nNO, PCD27 için birinci basamak tanısal tarama testi olarak incelenmiş ve önerilmiştir. Özgüllük ve duyarlılığın HSVMA'nınkine yakın olduğu bildirilse de (0.98/0.79), en genç hastanın 5.1 yaşında olduğu ve yaş ortalamasının çok daha yüksek olduğu belirtilmelidir. Ayrıca, birkaç araştırmacının PCD15 ile ilişkili normal nNO değerlerini bildirdiği de belirtilmelidir. Bu nedenle, okul öncesi çağdaki deneklerde nNO'yu gerçekleştirmek için teknik donanımda bir gelişme hala devam ederken, HSVMA PCD için tek güvenilir birinci basamak tanı olmaya devam etmektedir ve normal sonuçlar tüm yaş gruplarında neredeyse% 100 kesinlik ile PCD'yi dışlamaktadır.
Bununla birlikte, HSVMA kullanarak PCD tanısı konusunda uzman olmak için, uygun eğitim ve uzman ekipman gerektiren yüksek miktarda normal ve patolojik numune elde etmek gerekir. Bu zorunlu olmalı ve nadir akciğer hastalıklarının teşhisi ve tedavisi ile ilgilenen bir klinik için ödüllendirici olacaktır. Herhangi bir nedenle, numunelerin işlenmesi bir engel oluşturuyorsa, bunun yerine HSVMA kullanarak PCD teşhisinde uzman personele sahip bir merkez kullanılabilir. Bu gibi durumlarda, tedavi eden doktor fırçalamayı yapabilir ve numune teşhis merkezine gönderilebilir. Genel olarak, numuneler fırçalamadan sonra mümkün olan en kısa sürede analiz edilmelidir. Bununla birlikte, deneyimlerimize göre, numuneler düzgün bir şekilde işlenirse (protokol adım 1.2'ye bakınız), epitel hücreleri 20,22'yi fırçaladıktan sonra en az24 saat boyunca hayati ve analiz için hazır kalır. HSVMA'yı kendileri gerçekleştiren çoğu merkez, analizi genellikle örnekleme15'ten sonraki 4 saat içinde gerçekleştirir. Her durumda ve son analizden önce, numuneler optimal in vivo koşulları taklit etmek için vücut sıcaklığına kadar ısıtılmalıdır.
Bu yazıda daha önce açıklandığı gibi, HSVMA kullanan PCD'nin tanı sürecinde, özellikle temsili sonuçlar bölümünde (Video 7 ve Video 8) açıklananlar gibi sonuçsuz vakalarda tuzaklar vardır. PCD'nin kesin tanısı için, bazen farklı tanı önlemlerinin bir bataryasının gerekli olduğunu gösteren kılavuzlar mevcuttur 9,10,15 ve en önemlisi, PCD'yi% 100 kesin olarak teşhis eden tek bir test veya test kombinasyonu yoktur. Bununla birlikte, PCD'nin tanı ve tedavisinde yer alan her birim, HSVMA'yı birinci basamak tanılamada bir araç olarak kullanmaya teşvik edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Çocuk hemşiresi Bayan Johanna Juvankoski'ye fırçalamalarla ilgili mükemmel yardımı için özel teşekkürlerimizi sunmak istiyoruz. Ayrıca, Profesör Heymut Omran'a (University Clinic Münster, UKM), web sitelerinden normal siliyer hareketin şematik figürünü kullanma izni verdiği için özel şükranlarımızı sunmak istiyoruz. Son olarak, PGCE'den Bay Alan Brown BA'ya (Hons) makaleyi düzelttiği için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amoxiciline-clavulanic acid | Orion Oyj | 40 mg/kg divided in 2 doses/day, for adults 875/125 mg 1 tablet x2/day | |
| Camera Software | Hamamatsu | HCI Image | |
| Cold pack | any | for preservation and transport | |
| Differential interference microscope | Carl Zeiss | Inverted, cell observer microscope | |
| Digitial High Speed Video Camera | Hamamatsu | Orca Flash 4.0, digital camera type C11440 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium | Thermo Fisher | 10565018 | basal cell culture medium |
| Eppendorf tube | Eppendorf | 30120086 | 1.5 mL tube |
| Glass-bottom microwell dish | MatTek | P35G-1.5-14-C | cuvette for microscopy |
| Heating Unit | Carl Zeiss/PeCon | 810-450001 | Carl Zeiss incubation elements with PeCon TempModule S1 temperature control |
| Interdental brush 0.6 mm | Doft | 872267 | Interdental brush on a long wire with a reusable handle and cap in zipbag |
| Objective | Carl Zeiss | 100x/1.46, α Plan-Apochromat DIC objective | |
| Small polystyrene box with lid | any | for transport |
References
- Werner, C., Onnebrink, J. G., Omran, H. Diagnosis and management of primary ciliary dyskinesia. Cilia. 4 (1), 2 (2015).
- Mirra, V., Werner, C., Santamaria, F. Primary ciliary dyskinesia: An update on clinical aspects, genetics, diagnosis and future treatment strategies. Frontiers in Pediatrics. 5, 135 (2017).
- Schultz, R., Elenius, V., Lukkarinen, H., Saarela, T. Two novel mutations in the DNAH11 gene in primary ciliary dyskinesia (CILD7) with considerable variety in the clinical and beating cilia phenotype. BMC Medical Genetics. 21 (1), 237 (2020).
- Knowles, M. R., et al. Mutations of DNAH11 in patients with primary ciliary dyskinesia with normal ciliary ultrastructure. Thorax. 67 (5), 433-441 (2012).
- Boon, M., et al. Primary ciliary dyskinesia: critical evaluation of clinical symptoms and diagnosis in patients with normal and abnormal ultrastructure. Orphanet Journal of Rare Diseases. 9, 11 (2014).
- Kouis, P., et al. Prevalence of primary ciliary dyskinesia in consecutive referrals of suspected cases and the transmission electron microscopy detection rate: a systematic review and meta-analysis. Pediatric Research. 81 (3), 398-405 (2017).
- Marthin, J. K., Nielsen, K. G. Choice of nasal nitric oxide technique as first-line test for primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 37 (3), 559-565 (2011).
- Jackson, C. L., Behan, L., Collins, S. A. Accuracy of diagnostic testing in primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 47 (3), 837-848 (2016).
- Lucas, J. S., et al. European Respiratory Society guidelines for the diagnosis of primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal. 49 (1), 1601090 (2017).
- Shoemark, A., Dell, S., Shapiro, A., Lucas, J. S. ERS and ATS diagnostic guidelines for primary ciliary dyskinesia: similarities and differences in approach to diagnosis. European Respiratory Journal. 54 (3), 1901066 (2019).
- Kouis, P. Cost-effectiveness analysis of three algorithms for diagnosing primary ciliary dyskinesia: a simulation study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 14 (1), 142 (2019).
- Rubbo, B., et al. Accuracy of high-speed video analysis to diagnose primary ciliary dyskinesia. Chest. 155 (5), 1008-1017 (2019).
- Friedman, N. R., Pachigolla, R., Deskin, R. W., Hawkins, H. K. Optimal technique to diagnose primary ciliary dyskinesia. The Laryngoscope. 110 (9), 1548-1551 (2000).
- Chilvers, M. A., Rutman, A., O´Callaghan, C. Functional analysis of cilia and ciliated epithelial ultrastructure in healthy children and young adults. Thorax. 58 (4), 333-338 (2003).
- Lucas, J. S., Paff, T., Goggin, P., Haarman, E. Diagnostic methods in primary ciliary dyskinesia. Paediatric Respiratory Reviews. 18, 8-17 (2016).
- Ballenger, J. J. Experimental effect of cigarette smoke on human respiratory cilia. New England Journal of Medicine. 263, 832-835 (1960).
- Stanley, P. J., Wilson, R., Greenstone, M. A., Mac William, L., Cole, P. J. Effect of cigarette smoking on nasal mucociliary clearance and ciliary beat frequency. Thorax. 41 (7), 519-523 (1986).
- Kobbernagel, H. E., et al. Efficacy and safety of azithromycin maintenance therapy in primary cilia dyskinesia (BESTCILIA): a multicentre, double-blind, randomised, placebo-controlled phase 3 trial. Lancet Respiratory Medicine. 8 (5), 493-505 (2020).
- Takeyama, K., Tamaoki, J., Chiyotani, A., Tagaya, E., Konno, K. Effect of macrolide antibiotics on ciliary motility in rabbit airway epithelium in-vitro. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 45 (8), 756-758 (1993).
- Toskala, E., Haataja, J., Shirasaki, H., Rautliainen, M. Culture of cells harvested with nasal brushing: a method for evaluating ciliary function. Rhinology. 43 (2), 121-124 (2005).
- Pifferi, M., et al. Simplified cell culture method for the diagnosis of atypical primary ciliary dyskinesia. Thorax. 64 (12), 1077-1081 (2009).
- Hirst, R. A., et al. Culture of primary ciliary dyskinesia epithelial cells at air liquid interface can alter ciliary phenotype but remains a robust and informative, diagnostic aid. PLoS One. 9 (2), 89675 (2014).
- Papon, J. F., et al. Quantitative analysis of ciliary beating in primary ciliary dyskinesia: a pilot study. Orphanet Journal of Rare Diseases. 7 (10), 78 (2012).
- Smith, C. M., et al. Cilia FA: a research tool for automated, high-throughput measurement of ciliary beat frequency using freely available software. Cilia. 1 (8), 14 (2012).
- Sampaio, P., et al. Ciliar Move: new software for evaluating ciliary beat frequency helps find novel mutations by a Portuguese multidisciplinary team on primary ciliary dyskinesia. European Respiratory Journal Open Research. 7 (1), 00792 (2021).
- Mullowney, T., et al. Primary ciliary dyskinesia and neonatal respiratory distress. Pediatrics. 134 (6), 1160-1166 (2014).
- Leigh, M. W., et al. Standardizing nasal nitric oxide measurement as a test for primary ciliary dyskinesia. Annals of the American Thoracic Society. 10 (6), 574-581 (2013).
