Summary
Cellekalsiumavbildning er en allsidig metodikk for å studere dynamisk signalering av individuelle celler, på blandede populasjoner i kultur eller til og med på vekkede dyr, basert på uttrykk for kalsiumgjennomtrengelige kanaler / reseptorer som gir unike funksjonelle signaturer.
Abstract
Her rapporterer vi om selektive in vitro-modeller av kretser basert på glia (astrocytter, oligodendrocytter og mikroglia) og/eller nevroner fra perifere (dorsale rot ganglia) og sentrale vev (cortex, subventrikulær sone, organoid) som studeres dynamisk når det gjelder kalsiumskift. Modellen som er valgt for å illustrere resultatene er netthinnen, et enkelt vev med komplekse cellulære interaksjoner. Kalsium er en universell budbringer involvert i de fleste av de viktige cellulære rollene. Vi forklarer i en trinnvis protokoll hvordan retinal neuron-glial celler i kultur kan tilberedes og evalueres, og ser for seg kalsiumskift. I denne modellen skiller vi nevroner fra glia basert på deres selektive respons på KCl og ATP. Kalsiumgjennomtrengelige reseptorer og kanaler uttrykkes selektivt i forskjellige rom. For å analysere kalsiumresponser bruker vi ratiometriske fluorescerende dør som Fura-2. Denne sonden kvantifiserer gratis Ca2+ -konsentrasjon basert på Ca2+-frie og Ca2+-bundne former, og presenterer to forskjellige topper, basert på fluorescensintensiteten som oppfattes på to bølgelengder.
Introduction
På grunn av de universelle egenskapene til kalsium som andre budbringer, er denne ion involvert i et stort antall signalaktiviteter: gentranskripsjon, fødsel og død, spredning, migrasjon og differensiering, synaptisk overføring og plastisitet. Derfor vil en metode som er i stand til å spore kalsiumaktiveringsdynamikk med troskap og smidighet, gi en måte å observere unike romlige-temporale responser. En slik metode er den cellulære kalsiumavbildningsteknikken, som korrelerer kalsiumforskyver funksjonelle data med spesifikke cellefenotyper basert på deres distinkte svar.
Ca2+ sonder ble først utviklet på 1980-tallet, med senere forbedringer som gjør at disse molekylene kan brukes i levende celleanalyser1. Som en kjemisk indikator anses Fura-2 å være standarden for kvantitative [Ca2+]i målinger. Acetoksymetyl (AM) ester av denne indikatoren (dvs. Fura-2 AM) gjennomsyrer lett cellemembranen og kan nå intracellulære konsentrasjoner 20 ganger større enn inkubasjonsfortynning (f.eks. [5 μM]o/[100 μM]i). En annen fordel med Fura-2 er at den har god fotobleaching motstand; Dermed vil avbildning av denne indikatoren i lengre perioder ikke i stor grad påvirke fluorescensevnen. Til slutt er Fura-2 følsom for et bredt spekter av kalsiumnivåer, fra ~ 100 nM til ~ 100 μM, og har en Kd på ~ 145 nM, som kan sammenlignes med hvile [Ca2 +]i2. Senere ble cellekalsiumavbildning utviklet med bedre fluorescerende mikroskoper og beregningsmetoder, sammen med rasjonsmetriske sonder som ikke påvirkes av fargebelastning.
Hver celle uttrykker forskjellige kalsiumenheter (pumper, transportører, reseptorer og kanaler) som bidrar til den endelige responsen som en bestemt signatur. Det viktige tipset er å finne selektive responser av forskjellige typer celler korrelert med deres fenotypiske uttrykk. Følgelig er det minst to forskjellige reseptorer som opererer gjennom kalsiumskift: ionotrope reseptorer som gjennomsyrer Ca2 + i rask modus og langsomme metabotrope reseptorer koblet til signalveier og intracellulære lagre som frigjør Ca2 + aktivert av andre budbringere, for eksempel inositol triphosfat og syklisk ADP-ribose3.
For eksempel uttrykker stamceller nestin i den umodne netthinnen og viser GABAA-reseptorer depolarisert av GABA (eller muscimol)4. Dette skjer på grunn av cl-elektrokjemisk gradient med høye intracellulære Cl- nivåer; etter hvert som vevet utvikler seg, bytter KCC2-transportører fra eksitasjon på forfedre til hemming på modne GABAergiske nevroner5. På den annen side presenterer stamceller som uttrykker sox-2 ved den umodne subventrikulære sonen (SVZ) av postnatale gnagere også metabotrope H1-reseptorer aktivert av histamin som øker Ca2 + på en langsom måte6. En annen metabotrop reseptor fra den proteaseaktiverte reseptor-1 (PAR-1) familien, aktivert av trombin og nedstrøms til G (q/ 11) og fosfolipase C (PLC), gir langsomme Ca2 + skift i oligodendrocytter (som uttrykker O4 og PLP) generert fra multipotente SVZ nevrale stamceller7.
Generelt uttrykker nevroner spenningsavhengige kalsiumkanaler samt store nevrotransmitterreseptorer som kan gjennomsyres av Ca2+, som glutamatergic (AMPA, NMDA, kainate) og perifere og sentrale nikotinreseptorer. Kaliumklorid brukes vanligvis som et depolariserende middel for å aktivere perifere nevroner, som dorsal rot ganglion neurons8 eller sentrale nevroner, fra subventricular sone9 eller netthinne10. På den annen side er ATP anerkjent som den store gliotransmitteren (i tillegg til D-serin), som aktiverer selektive Ca2 + gjennomtrengelige P2X-medlemmer, som P2X7 og P2X4. Begge reseptorene presenterer tilsvarende Ca2+ strømmer, lik de som vises av NMDA-reseptorer anerkjent som de største Ca2 + strømmene aktivert av sendere11. P2X7 reseptorer er sterkt uttrykt på mikroglia, men med lavere tetthet på astrocytter og oligodendrocytter, har en rolle i utgivelsen av proinflammatoriske cytokiner12. P2X7 reseptorer er også uttrykt på Schwann celler13 og Müller glia i netthinnen14,15.
Netthinnen er kjent for å vise nesten alle sendere sett i hjernen. For eksempel er den vertikale aksen (fotoreseptorer, bipolare og retinal ganglionceller) hovedsakelig glutamatergic, med kalsiumgjennomtrengelige AMPA- eller kainatreseptorer uttrykt i OFF-bipolare celler og mgluR6 uttrykt i ON-bipolare celler16. Merkelig nok finnes alle tre reseptorene også i Müller glia, som er koblet til kalsium og inositol triphosfatveier17,18. Den horisontale hemmende aksen, laget av horisontale og amacrine celler, utskiller ikke bare GABA, men også dopamin, acetylkolin og andre klassiske nevrotransmittere. Amacrine celler er hovedtyper av celler som finnes i fugleretinal kulturer, som viser flere typer kalsiumdrevne kanaler, som glutamatergic, purinergic, nikotinic og spenningsavhengige kalsiumkanaler. Av denne grunn er dette en utmerket modell for å evaluere forskjellige egenskaper av kalsiumskift blant nevroner og glia.
Derfor tillater kombinasjonen av forskjellige reseptorer og kanaler summert til selektive fenotypiske markører under utvikling med distinkte agonistiske responsmønstre unike signaturer i stamme, stam, stamfar, nevron, astrocytt, oligodendrocytt og mikroglia som opererer gjennom selektive signalenheter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimenter som involverer dyr ble godkjent av og utført etter retningslinjene fra Institutional Animal Care and Use Committee ved Federal University of Rio de Janeiro, etter "Principles of Laboratory Animal Care" (NIH, Bethesda, USA); tillatelse nummer IBCCF-035 for befruktede hvite leghorn kyllingegg.
1. Utarbeidelse av løsninger
- Forbered Krebs løsning: (132 mM NaCl, 4 mM KCl, 1,4 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2, 6 mM glukose, 10 mM HEPES, pH 7,4, 373 mOsm).
- Forbered saltvannsbuffer (Ca2+ og Mg2 + fri løsning - CMF): 76.55 g / L NaCl, 3.05 g / L KCl, 1.65 g / L Na2HPO4, 0.610 g / L KH2PO4, 21.95 g / L glukose og 7.90 g / L NaHCO3.
- Forbered inkubering av løsning (med Fura-2 i Krebs løsning:) 5 μM Fura-2-acetoxymethyl ester (Fura-2), 0,1% fettsyrefri bovint serumalbumin (BSA) og 0,02% Poloxamer 407.
- For blandet populasjon eller gliakultur, forberede DMEM / F12 med 10% foster kalv serum (FCS) og 40 mg / L gentamicin som medium.
- For nevronberiket kultur, forberede DMEM / F12 med 1% FCS, nevronal cellekultur supplement, 40 mg / L og gentamicin som medium.
2. Netthinne disseksjon og cellekultur forberedelse
- Åpne det 8-dagers gamle kyllingembryoet (E8) der luftcellen ligger.
- Fjern egginnholdet til en Petri-tallerken og fortsett med embryo eutanasi ved halshugging med et par pinsett.
- Ta hodet til en ren Petri-tallerken og hell litt kalsium- og magnesiumfri løsning (CMF) for å vaske den.
- Fjern øynene, pass på at du ikke skader det i prosessen.
MERK: Prøv å unngå å skjære eller makulere øyets lag før du fjerner det fra øyehulen. - Ta øynene til en ren Petri-tallerken som inneholder CMF.
- Begynn øyerassjonen ved å fjerne linsen.
- Lag 3 eller 4 langsgående kutt i øyet, og start ved hullet som er igjen av linsen. Lag kutt ved å trekke pinsettene, holde øyeskleren i motsatte retninger.
- Fjern den gjennomsiktige glasslegemet med forsiktighet, og sørg for at netthinnen ikke er bundet til den.
- Løsne netthinnen fra det pigmenterte epitelet og fjern eventuelt gjenværende vev.
- Klipp den klare netthinnen i små biter.
- Overfør netthinnen til en annen mottaker og kort sentrifuge (~ 1800 x g i 1 min) den for å fjerne CMF.
- Enzymatisk dissosier netthinnen med 1 ml 0,25% trypsin, ved å inkubere den ved 37 °C i 10 minutter.
- Stopp reaksjonen ved å tilsette 1 ml medium som inneholder 10% FCS.
- Vask netthinnen 2 eller 3 ganger med medium. Vasken består av sykluser med å legge til medium og fjerne det ved sentrifugering (~ 1800 x g i 1 min).
- Tilsett 2 ml komplett medium per netthinne og fjern forsiktig netthinnen mekanisk ved å pipettere den opp og ned.
MERK: Her kan etterforskerne velge hvilken type kultur som skal utarbeides. For en beriket nevronkultur, bruk DMEM-F12 + nevronaltilskudd + 1% FCS + antibiotika. For blandet populasjon eller renset glia, bruk DMEM-F12 + 10% FCS + antibiotika. - Tell cellene og fortynn dem til ønsket tetthet.
MERK: Ideelt sett bør dette være en kultur med lav tetthet med ~ 2 x 106 celler eller mindre. - Tilsett 50 μL av celleopphenget i hver dekslelip.
- Coverslip behandling
- Inkuber deksler i minst 1 time (ideelt over natten) i 1 ml 10-50 μg/ml poly-L-lysin i sterilisert renset vann ved 37 °C.
- Fjern poly-L-lysinoppløsningen og vask dekslene med sterilisert renset vann 2-3 ganger.
- La dekslene tørke i et sikkerhetsskap med UV-lys slått på. På dette tidspunktet, lagre dem i en forseglet beholder ved 4 °C i opptil 1 måned.
- Valgfritt trinn: For nevronberikede kulturer, tilsett 50 μL 10-20 ng/ml laminin i PBS eller middels til hver dekslelip i 2 timer ved 37 °C. Etter inkubasjon, fjern lamininoppløsningen overflødig og dekslene er klare til bruk.
- Inkuber celler ved 37 °C i en 5 % CO2-atmosfære til de festes til glasset. Dette bør ta ca 1-2 h.
- Tilsett 1 ml komplett medium til hver brønn og returner platen til inkubatoren til dagen for eksperimentet. Bytt om nødvendig mediet hver 2-3 dager.
3. Laster celler med Fura-2 AM
- Rekonstituer et 50 μg hetteglass med Fura-2 AM med 50 μL DMSO.
- For å forberede arbeidende Fura-2 AM-løsning, tilsett 3 μL 10% Poloxamer 407, 7,5 μL Fura-2 AM i DMSO og Krebs løsning q.s.p. til 1,5 ml.
- Soniker blandingen i 7 min i et vannbad.
- Vask dekslene med cellekulturen 3x med Krebs løsning før du inkuberer den i Fura-2.
- Inkuber ved 37 °C og 5 % CO2 i 30 minutter.
- Etter inkubasjon, vask den 3x igjen og overfør den til en annen mottaker som inneholder Krebs og beskyttet mot lyset.
MERK: Fungerende Fura-2 AM-løsning forblir stabil i 24 timer hvis den er beskyttet mot lyset.
4. Kalsiumavbildning av celler
- Før hver kjøring, legg til silisium på coverlipstøtten og kammeret for å unngå lekkasje under eksperimentet.
- Vask bunnen av dekslene med destillert vann for å unngå saltkrystallisering på mikroskoplinsen.
- Sett dekslene på støtten, trykk forsiktig på grensene.
- Fest støtten og kammeret til mikroskopet og begynn å parfyme celler med Krebs løsning.
MERK: Celleperfusjon under enkeltcellede kalsiumavbildningsforsøk kalibreres til en strømningshastighet på 0,5 ml/min, og det tar 8-10 s før plattformløsningen byttes ut. - Ta en titt på cellene, og merk et passende synsfelt.
- Merk celletekstene manuelt basert på deres distinkte morfologi.
- Før du bruker noen stimulans, vent på baseline stabilisering. Hver stimulus bør ta ca 30 sekunder.
MERK: Forbered alle løsningene umiddelbart før hvert eksperiment. - Evaluer variasjonene i [Ca2+]i ved å kvantifisere forholdet mellom fluorescensen som slippes ut ved 510 nm etter alternativ eksitasjon (750 millisekunder) ved 340 og 380 nm.
- Prosess ervervede verdier ved hjelp av en fluorescensanalyseprogramvare.
- Uttrykk eksperimentelle resultater i en tabell der hver rad representerer en enkelt celle, og hver linje et tidspunkt.
5. Databehandling
- Ved hjelp av en regnearkprogramvare tegner du variasjonen av Fura-2 fluorescensforholdsverdier for entallsceller separat eller av dem alle samtidig.
- For å kvantifisere antall reaktive celler til bestemt stimulans, sett en avskjæring på 30% økning i kalsium baseline nivåer
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her brukte vi netthinneceller i kultur fra embryonale dag 8 kyllinger for å undersøke hvordan nevroner og glia signaliserer når det gjelder kalsiumskift. Kulturer ble i hovedsak tilberedt som beskrevet15,19 som blandede nevron-glialceller (med en tetthet på ≥ 1 x 106 celle / tallerken) på et stadium av 7 dager in vitro (figur 1A). Alternativt kan berikede nevronceller fremstilt i lav tetthet (5 x 105 celler/fat), sådd på behandlet poly-L-lysin (10 μg/ml) deksler på et stadium av 3 dager in vitro (figur 1B). I tillegg ble renset Müller glia opprettholdt i 10 dager i DMEM som inneholder 10% FCS, da nevroner ble fjernet. For å funksjonelt kvantifisere responsen til nevroner og glia, ble cellene stimulert med 50 mM KCl eller 1 mM ATP. Som vist (figur 1A), av 302 celler, svarte 50% på KCl mens 53% signaliserte til ATP. I denne forstand hadde beriket nevroncellekultur en 89% av kalsiumresponsene på KCl sammenlignet med 17% som reagerte på ATP (figur 1B). Faktisk ble en renset Müller glia-kultur, hvor nevroner fjernes etter 10 dager i kulturen, utelukkende aktivert av ATP (figur 1C).
Figur 1. Retinalceller fremstilt som blandede, nevronalberikede eller glia-rensede kulturer viser forskjellige responsmønstre på kalsiumavbildning. (A) Lyse og fluorescensfelt av blandede embryonale retinalceller i kultur. Det samme mikroskopfeltet vist under 5 μM fura-2 AM fluorescens. 50 mM KCl aktiverer halvparten av cellene (nevronal fenotype), mens 1 mM ATP aktiverer den andre halvdelen (glial fenotype), med høye F340/380-forhold som tilsvarer økninger i intracellulært kalsiumnivå ([Ca2+]i). (B) Den berikede nevroncellekulturen hadde en 89% kalsiumrespons på KCl sammenlignet med 17% som reagerte på ATP. (C) På den annen side ble en renset Müller glia-kultur, hvor nevroner fjernes etter 10 dager i kulturen, utelukkende aktivert av ATP. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har brukt netthinnevevet til å vise at kalsiumresponser mediert av KCl eller ATP tydelig deles inn i henholdsvis nevronale og glialresponser (figur 1). Selv om noen data i litteraturen antyder at P2X7-reseptorer uttrykkes i nevroner, som regulerer nevronaktivitet og synaptisk nevrotransmitterutløsning20, stiller andre forfattere spørsmål ved eksistensen av nevronale P2X7-reseptorer. Faktisk opprettholder nåværende resultater ideen om at primære glial P2X7-reseptorer formidler nevroneffekter summert til høye ekstracellulære ATP-konsentrasjoner som finnes i usunn vev21.
Vi har tidligere koblet den funksjonelle differensiering av retinal celler med deres fenotypiske skjerm, på en måte som variasjoner av [Ca2 +]i skift som aktiveres av KCl eller AMPA (en glutamat agonist) uttrykke mikrotubule assosiert protein (MAP-2), markør for en moden neuron1. Alternativt uttrykker celler aktivert av ATP glutaminsyntetase, en typisk Muller glia-markør.
Vi har brukt forskjellige typer cellekulturer som vist her (blandede, nevronale berikede eller rensede glialceller), i tillegg til nevrosfærer avledet4 for å svare på mange spørsmål relatert til forskjellige nevrokjemiske systemer som glutamatergic22, dopaminergic19, GABAergic23, cannabinoid9,10, purinergic14,24, serotoninergic25 , blant annet for å forstå nevro-glial retinal kommunikasjon. Müller glia uttrykker et stort antall nevrotransmitterreseptorer26 og utskiller gliotransmittere som D-serin, ATP og glutamat, som kan frigjøres på en vesikulær, Ca2 + avhengig måte27.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Tilskudd, sponsorer og finansieringskilder: MH er mottaker av et ph.d.CNPq-stipend. HRF er mottaker av et postdoktorstipend støttet av CNPq (HRF-tilskuddsnummer 152071/2020-2). RAMR støttes av CNPq og FAPERJ (tilskuddsnummer E-26/202.668/2018, E-26/010.002215/2019, 426342/2018-6 og 312157/2016-9 og INCT-INNT (National Institute for Translational Neuroscience).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mm coverslip | Paul Marienfeld GmbH & Co. KG | 111550 | Cell suport |
| 510 nm long-pass filter | Carl Zeiss | ||
| ATP | Sigma | A1852 | |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504044 | Suplement |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| CoolSNAP digital camera | Roper Scientific, Trenton, NJ | ||
| D-(+)-Glucose | Neon | 1466 | |
| DMEM/ F-12 | Gibco | 12400-24 | Cell culture medium |
| Excel Software | Microsoft | ||
| Fetal Calf Serum | Sigma-Aldrich | F9665 | Suplement |
| Fluorescence Microscope | Axiovert 200; Carl Zeiss | B 40-080 | |
| Fura-2 AM | Molecular Probes | F1221 | Ratiometric Ca2+ indicator |
| Gentamicin Sulfate | Calbiochem | 1405-41-0 | antibiotics |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| KH2PO4 | Sigma | P5655 | |
| Lambda DG-4 apparatus | Sutter Instrument, Novato, CA | DG-4PLUS/OF30 | |
| Laminin | Gibco | 23017-015 | Help cell adhesion |
| Metafluor software | Universal Imaging Corp. West Chester, PA | ||
| MgCl2 | Sigma | M4880 | |
| Na2HPO4 | Vetec | 129 | |
| NaCl | Isofar | 310 | |
| NaHCO3 | Vetec | 306 | |
| PH3 platform | Warner Intruments, Hamden, CT | 64-0286 | |
| Pluronic F-127 | Molecular Probes | P6866 | nonionic, surfactant |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | Help cell adhesion |
| Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | Dissociation enzyme |
References
- Tsien, R. Y., Pozzan, T., Rink, T. J. Calcium homeostasis in intact lymphocytes: cytoplasmic free calcium monitored with a new, intracellularly trapped fluorescent indicator. Journal of Cell Biology. 94 (2), 325-334 (1982).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D.
- Islam, M. S. Calcium Signaling: From Basic to Bedside. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1131, 1-6 (2020).
- De Melo Reis, R. A., et al. Functional identification of cell phenotypes differentiating from mice retinal neurospheres using single cell calcium imaging. Cellular and Molecular Neurobiology. 31 (6), 835-846 (2011).
- Ganguly, K., Schinder, A. F., Wong, S. T., Poo, M. GABA itself promotes the developmental switch of neuronal GABAergic responses from excitation to inhibition. Cell. 105 (4), 521-532 (2001).
- Schitine, C., et al. Ampakine CX546 increases proliferation and neuronal differentiation in subventricular zone stem/progenitor cell cultures. European Journal of Neuroscience. 35 (11), 1672-1683 (2012).
- Xapelli, S., et al. Modulation of subventricular zone oligodendrogenesis: a role for hemopressin. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 59 (2014).
- Ribeiro-Resende, V. T., et al. Mice lacking GD3 synthase display morphological abnormalities in the sciatic nerve and neuronal disturbances during peripheral nerve regeneration. PLoS One. 9 (10), 108919 (2014).
- Xapelli, S., et al. Activation of type 1 cannabinoid receptor (CB1R) promotes neurogenesis in murine subventricular zone cell cultures. PLoS One. 8 (5), 63529 (2013).
- Kubrusly, R. C. C., et al. Neuro-glial cannabinoid receptors modulate signaling in the embryonic avian retina. Neurochemistry International. 112, 27-37 (2018).
- Egan, T. M., Khakh, B. S. Contribution of calcium ions to P2X channel responses. Journal of Neuroscience. 24 (13), 3413-3420 (2004).
- Illes, P. P2X7 Receptors Amplify CNS Damage in Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 21 (17), (2020).
- Faroni, A., et al. Purinergic signaling mediated by P2X7 receptors controls myelination in sciatic nerves. Journal of Neuroscience Research. 92 (10), 1259-1269 (2014).
- Freitas, H. R., et al. Cannabinoids Induce Cell Death and Promote P2X7 Receptor Signaling in Retinal Glial Progenitors in Culture. Molecular Neurobiology. 56 (9), 6472-6486 (2019).
- Freitas, H. R., et al. Glutathione-Induced Calcium Shifts in Chick Retinal Glial Cells. PLoS One. 11 (4), 0153677 (2016).
- Yang, X. L. Characterization of receptors for glutamate and GABA in retinal neurons. Progress in Neurobiology. 73 (2), 127-150 (2004).
- Reis, R. A., Kubrusly, R. C., de Mello, M. C., de Mello, F. G. Transient coupling of NMDA receptor with ip3 production in cultured cells of the avian retina. Neurochemistry International. 26 (4), 375-380 (1995).
- López-Colomé, A. M., Ortega, A., Romo-de-Vivar, M. Excitatory amino acid-induced phosphoinositide hydrolysis in Müller glia. Glia. 9 (2), 127-135 (1993).
- Ventura, A. L., de Mello, F. G., de Melo Reis, R. A. Methods of dopamine research in retina cells. Methods in Molecular Biology. 964, 25-42 (2013).
- Miras-Portugal, M. T., Sebastián-Serrano, Á, de Diego García, L., Díaz-Hernández, M. Neuronal P2X7 Receptor: Involvement in Neuronal Physiology and Pathology. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7063-7072 (2017).
- Illes, P., Khan, T. M., Rubini, P. Neuronal P2X7 Receptors Revisited: Do They Really Exist. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7049-7062 (2017).
- Schitine, C. S., et al. Functional plasticity of GAT-3 in avian Müller cells is regulated by neurons via a glutamatergic input. Neurochemistry International. 82, 42-51 (2015).
- Ferreira, D. D., Stutz, B., de Mello, F. G., Reis, R. A., Kubrusly, R. C. Caffeine potentiates the release of GABA mediated by NMDA receptor activation: Involvement of A1 adenosine receptors. Neuroscience. 281, 208-215 (2014).
- Faria, R. X., Freitas, H. R., Reis, R. A. M. P2X7 receptor large pore signaling in avian Müller glial cells. Journal of Bioenergetics and Biomembranes. 49 (3), 215-229 (2017).
- Passos, A., et al. Regulation of the Serotonergic System by Kainate in the Avian Retina. Cellular and Molecular Neurobiology. 39 (7), 1039-1049 (2019).
- de Melo Reis, R. A., Ventura, A. L., Schitine, C. S., de Mello, M. C., de Mello, F. G. Müller glia as an active compartment modulating nervous activity in the vertebrate retina: neurotransmitters and trophic factors. Neurochemical Research. 33 (8), 1466-1474 (2008).
- Harada, K., Kamiya, T., Tsuboi, T. Gliotransmitter Release from Astrocytes: Functional Developmental, and Pathological Implications in the Brain. Frontiers in Neuroscience. 9, 499. 9, 499 (2015).
