Summary
Colônias fúngicas entomopatômicas são isoladas de amostras de solo tropical usando isca tenebrio , isca de Galleria , bem como meio artificial seletivo, ou seja, ágar de dextrose de batata enriquecido com extrato de levedura suplementado com clorofenicol, tiaabzolendae e ciclohexmida (meio CTC).
Abstract
O objetivo do presente estudo é comparar a eficácia do uso de iscas de insetos versus meio seletivo artificial para isolar fungos entomopatogênicos (EPF) a partir de amostras de solo. O solo é um rico habitat para microrganismos, incluindo o EPF particularmente pertencente aos gêneros Metarhizium e Beauveria, que podem regular pragas de artrópodes. Produtos biológicos à base de fungos estão disponíveis no mercado principalmente para controle de pragas de artrópodes agrícolas. No entanto, apesar da alta biodiversidade endêmica, apenas algumas cepas são usadas em bioprodutos comerciais em todo o mundo. No presente estudo, 524 amostras de solo foram cultivadas em ágar de dextrose de batata enriquecido com extrato de levedura suplementado com clorofenicol, thiabendazol e cicloheximida (meio CTC). O crescimento das colônias fúngicas foi observado durante 3 semanas. Todos os Metarhizium e Beauveria EPF foram morfologicamente identificados no nível do gênero. Além disso, alguns isolados foram identificados molecularmente no nível da espécie. Vinte e quatro dessas 524 amostras de solo também foram pesquisadas para ocorrência de EPF utilizando o método de isca de insetos (Galleria mellonella e Tenebrio molitor). Foram isoladas 51 cepas de EPF (41 Metarhizium spp. e 10 Beauveria spp.) das 524 amostras de solo. Todas as cepas fúngicas foram isoladas de plantações ou pastagens. Das 24 amostras selecionadas para comparação, 91,7% foram positivas para ePF usando isca galleria , 62,5% usando isca Tenebrio e 41,7% utilizando CTC. Nossos resultados sugeriram que o uso de iscas de insetos para isolar o EPF do solo é mais eficiente do que usar o meio CTC. A comparação de métodos de isolamento, além da identificação e conservação da EPF, tem impacto positivo no conhecimento sobre biodiversidade. O aprimoramento da coleção EPF apoia o desenvolvimento científico e a inovação tecnológica.
Introduction
O solo é a fonte de vários microrganismos, incluindo fungos entomopatômicos (EPF). Este grupo particular de fungos é reconhecido por sua capacidade de colonizar e muitas vezes matar hospedeiros artrópodes, especialmente insetos1. Após isolamento, caracterização, seleção de cepas virulentas e registro, a EPF é produzida em massa para o controle artrópode-praga, que sustenta sua relevância econômica2. Assim, o isolamento da EPF é considerado o primeiro passo para o desenvolvimento de um biopesticida. Beauveria spp. (Hipocreales: Cordycipitaceae) e Metarhizium spp. (Hipocreales: Clavicipitaceae) são os fungos mais comuns usados para o controle artrópode-praga3. A EPF foi isolada com sucesso do solo, artrópodes com micose visível, plantas colonizadas e rizosfera vegetal 4,5.
O isolamento da EPF também pode ser útil para estudar a diversidade, distribuição e ecologia desse grupo em particular. A literatura recente relatou que o uso de EPF é subestimado, citando diversas aplicações não convencionais de EPF, como sua capacidade de melhorar o crescimento das plantas4, remover contaminantes tóxicos do solo e ser utilizado na medicina6. O presente estudo tem como objetivo comparar a eficiência da isolação do EPF do solo usando iscas de insetos versus cultura artificial 7,8,9. O uso da Galleria mellonella L. (Lepidoptera: Phyralidae) como isca de inseto no contexto do isolamento da EPF tem sido bem aceito. Essas larvas são usadas em todo o mundo pela comunidade científica como modelo experimental para estudar interações hospedeiro-patógeno10,11. A larva tenebrio molitor L. (Coleoptera: Tenebrionidae) é considerada outro modelo de inseto para estudos envolvendo virulência e isolamento da EPF, uma vez que este inseto é fácil de raro em laboratório a um baixo custo 7,12.
Métodos independentes da cultura, como o uso de uma variedade de técnicas de PCR, podem ser aplicados para detectar e quantificar o EPF em seus substratos, incluindo o solo13,14. No entanto, para isolar adequadamente essas colônias fúngicas, seu substrato deve ser cultivado em um meio artificial seletivo9, ou os fungos presentes nas amostras podem ser iscas usando insetos sensíveis15. Por um lado, o CTC é um meio artificial sem dodine que consiste em ágar de dextrose de batata enriquecido com extrato de levedura suplementado com clorofenicol, thiabendazol e cicloheximida. Este meio foi desenvolvido por Fernandes et al. 9 para maximizar a recuperação de Beauveria spp. e Metarhizium spp. do solo. Por outro lado, as larvas G. mellonella e T. molitor também podem ser usadas com sucesso como iscas para obter isolados de EPF do solo. No entanto, de acordo com Sharma et al.15, menos estudos relataram o uso concomitante e a comparação desses dois insetos iscas. Os solos de vinhedos portugueses apresentaram recuperações significativas de Metarhizium robertsii (Metscn.) Sorokin usando T. larvas molitor em comparação com as larvas G. mellonella; em contraste, Beauveria bassiana (Bals. -Criv.) O isolamento vuill estava ligado ao uso das iscas de G. mellonella 15. Portanto, a decisão sobre qual método de isolamento da EPF utilizar (ou seja, G. mellonella-isca, T. molitor-isca ou meio CTC) deve ser considerada de acordo com o objetivo do estudo e a infraestrutura laboratorial. O objetivo do presente estudo é comparar a eficácia do uso de iscas de insetos versus meio seletivo artificial para isolar o EPF a partir de amostras de solo.
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Protocol
Como o presente estudo teve acesso ao patrimônio genético brasileiro, a pesquisa foi registrada no Sistema Nacional de Gestão do Patrimônio Genético e do Conhecimento Tradicional Associado (Sisgen) sob o código AA47CB6.
1. Amostragem do solo
- Colete 800 g de solo (com ou sem incidentes raízes secundárias da planta) a uma profundidade de 10 cm usando uma pequena pá. Guarde-os em sacos de polipropileno à temperatura ambiente até o início do experimento.
NOTA: Pequenas raízes também podem ser coletadas, pois o EPF tem competência de rizosfera. Quanto mais rápido o processamento das amostras, melhor porque os esporos fúngicos podem ser menos viáveis com o tempo. No presente estudo, as amostras foram analisadas no máximo 7 dias após a coleta. - Use um GPS para identificar a localização das amostras coletadas em latitude e longitude e classificar a área coletada de acordo com o tipo de solo (por exemplo, pastagens, floresta tropical nativa, beiras de lagos ou lavouras).
2. Métodos de isolamento para fungos entomopatômicos
- Isolamento utilizando meio artificial seletivo CTC.
- Para preparar o meio CTC [ágar de dextrose de batata mais extrato de levedura (PDAY) suplementado com 0,5 g/L de clororamfenicol, 0,001 g/L de thiabendazole, e 0,25 g/L de ciclohônima9], pesar todos os reagentes individualmente, misturá-los em água destilada e esterilizar o meio em autoclave. Em um armário de biossegurança, placa de 23 mL do meio em placas de Petri de 60 mm x 15 mm.
ATENÇÃO: Enquanto pesam os reagentes CTC, use um jaleco, máscara, luvas e óculos porque o cicloheximida e o clorofenícol são tóxicos. - Pesar 0,35 ± 0,05 g de cada amostra de solo (com ou sem raízes) e colocá-lo em um microtubo de 1,5 mL.
- Em um armário de biossegurança, adicione 1 mL de estéril 0,01% (vol/vol) de suspensão aquosa monooleate monooleana de polioximeeno ao microtubo contendo solo e vórtice para 30 s.
- Remova 50 μL do supernasce e pipete-o no centro das placas de Petri com meio CTC. Disperse as suspensões de forma homogênea na superfície do meio usando uma espátula drigalski estéril (6 mm de diâmetro).
NOTA: Pelo menos três réplicas para cada amostra de solo devem ser preparadas. - Incubar as placas em câmaras climáticas (25 ± 1 °C, umidade relativa ≥80%) no escuro e observar o crescimento das colônias fúngicas após 7, 14 e 21 dias de incubação.
- Observe a macromorfologia e micromorfologia das colônias fúngicas que buscam EPF. Transfira as culturas EPF para o ágar de dextrose de batata mais 0,05% de clorofenicol (PDAC) até que sejam obtidas culturas puras.
NOTA: Utilize as teclas de descrição apresentadas abaixo na etapa 3 para identificação de colônias EPF.
- Para preparar o meio CTC [ágar de dextrose de batata mais extrato de levedura (PDAY) suplementado com 0,5 g/L de clororamfenicol, 0,001 g/L de thiabendazole, e 0,25 g/L de ciclohônima9], pesar todos os reagentes individualmente, misturá-los em água destilada e esterilizar o meio em autoclave. Em um armário de biossegurança, placa de 23 mL do meio em placas de Petri de 60 mm x 15 mm.
- Isolamento usando iscas de insetos
- Use larvas desinfetadas por superfície G. mellonella e T. molitor em estágio final. Mergulhe as larvas em hipoclorito de sódio de 0,5% por 1 min para esterilização. Lave as larvas duas vezes usando água estéril.
NOTA: Foram utilizadas larvas G. mellonella do quarto estágio no presente estudo. Os estágios larvais t. molitor não foram padronizados. - Use potes de plástico para montar as iscas. Adicione 250 g de solo coletado a cada pote plástico (largura de 98 mm x 47 mm de altura x 142 mm de comprimento). Separe 15 larvas de cada espécie (T. molitor e G. mellonella) e deposite cinco larvas por pote plástico. Armazene os potes a 25 ± 1 °C e a umidade relativa ≥ 80% no escuro.
NOTA: Faça 10 pequenos furos (2 mm de diâmetro) nas tampas da panela para permitir a ventilação. Um dispositivo de ferro aquecido afiado pode ser usado para perfurar os furos. - Homogeneize o solo dia sim, dia não para permitir o máximo contato das larvas com o solo.
NOTA: A umidade é importante para suportar a infecção fúngica das larvas. Para manter a umidade no solo, pulverize água destilada estéril na superfície do solo sempre que necessário. Não mergulhe a amostra do solo na água. - Analise os potes diariamente em busca de insetos mortos.
NOTA: Observe as larvas remanescentes na colônia diariamente em busca de sinais patológicos invertebrados para garantir que os insetos não estejam infectados. Como alternativa, potes de controle com solo estéril podem ser incluídos no estudo para verificar o estado de saúde das larvas de insetos. - Remova os insetos mortos e esterilize-os superficialmente com hipoclorito de sódio de 0,5% por 1 min. Coloque os insetos estéreis em uma câmara úmida (umidade relativa ≥ 80%) a 25 ± 1 °C por 7 dias para favorecer a exteriorização de fungos entomopatômicos (micose).
- Após a micose, colhe a conidia da superfície dos insetos. Use um loop microbiológico para colocar a conidia no meio PDAC sob um microscópio estereoscópico. Como alternativa, coloque toda a larva infectada no meio PDAC. Incubar as placas de cultura em uma câmara climática a 25 ± 1 °C e a umidade relativa ≥ 80%.
- Observe a macromorfologia e micromorfologia das colônias fúngicas nas placas para confirmar a identidade da EPF. Repita a colheita no PDAC até que sejam obtidas colônias fúngicas puras.
NOTA: Utilize as teclas de descrição apresentadas abaixo na etapa 3 para identificação de colônias EPF.
- Use larvas desinfetadas por superfície G. mellonella e T. molitor em estágio final. Mergulhe as larvas em hipoclorito de sódio de 0,5% por 1 min para esterilização. Lave as larvas duas vezes usando água estéril.
3. Identificação da EPF (Metarhizium spp. e Beauveria spp.)
- Analise as características macromorfológicas das culturas fúngicas nas placas (ou seja, superfície e reverso das colônias, sua forma, borda, taxa de crescimento, cor, textura, pigmento difusível, exsudatos e conidia aérea) após 14 dias a 25 ± 1 °C e umidade relativa ≥ 80%.
- Transfira a conidia aérea para culturas de slides (técnica de microcultura)16 por 3 dias a 25 ± 1 °C e umidade relativa ≥ 80% e mancha com azul lactofenol para observar as características microscópicas (ou seja, arranjo de conidia, conidioforos, forma e tamanho de conidia)17,18, 19,20.
- Observe as estruturas fúngicas microscópicas a 400x usando um microscópio óptico para confirmar a identificação do EPF.
NOTA: As chaves morfológicas para ePF estão descritas nos relatórios por Bischoff et al., Rehner et al., Seifert et al., e Humber 17,18,19,20. A macro e micromorfologia das colônias fúngicas são os critérios mais frequentes utilizados para identificar fungos filamentosos no nível do gênero. Dependendo do gênero do EPF, essas características morfológicas mudarão. Humber20 apresenta uma chave de identificação para os principais gêneros de entomopatógenos fúngicos. As colônias de metarhizium spp. por exemplo, são geralmente circulares, em pó, exibindo diferentes tons de verde, e podem apresentar exsudato. Microscopicamente, essas colônias têm células conidiogêneas apical em conidioforos amplamente ramificados e densamente entrelaçados formando um hímeno compacto, e cilíndrico a conidia elípsida em cadeias paralelas formando colunas ou massas semelhantes a placas. Colônias beauveria spp. geralmente são brancas, em pó ou algodão. Eles exibem células conidiogêneas com uma porção basal dilatada que se estende apicamente em direção em ziguezague. Conidioforos beauveria formam aglomerados densos de conidia em forma de globo. São necessárias análises moleculares para a identificação do EPF no nível da espécie. - Realizar análises moleculares nos isolados para identificação taxonômica no nível da espécie. Para as cepas EPF isoladas neste estudo, ou seja, Metarhizium spp. e Beauveria spp., realizam análises moleculares com base nos relatórios de Bischoff et al.17 e Rehner et al.18.
- Após a confirmação dos isolados como EPF, deposite os isolados em uma coleção de culturas fúngicas. No presente estudo, os isolados foram depositados na coleta de culturas fúngicas entomopatômicas do Laboratório de Controle Microbiano (LCM) da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro.
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Representative Results
Foram coletadas 524 amostras de solo em pastagens: pastagem de gado (165 amostras), floresta tropical nativa (90 amostras), beira do lago (42 amostras) e cultivo/lavoura (227 amostras) entre 2015 e 2018 no Estado do Rio de Janeiro. Os detalhes das coordenadas geográficas das amostras positivas para ePF são dados na Tabela Complementar 1.
Das 524 amostras de solo, 500 amostras foram analisadas apenas utilizando-se do meio CTC, e 24 amostras foram analisadas concomitantemente utilizando-se três formas de isolamento (Galleria-isca, Isca de Tenebrio e o meio de cultura ctc seletivo), de modo que a eficiência relativa desses métodos poderia ser avaliada. Um total de 51 cepas de EPF foram isoladas de 524 amostras (41 Metarhizium spp. e 10 Beauveria spp.) (Figura 1). Características micromorfológicas de alguns isolados são mostradas na Figura 2. Todas as cepas fúngicas foram isoladas de pastagens ou lavouras (Tabela Suplementar 1). Os resultados revelaram que o Metarhizium spp. é mais prevalente do que a Beauveria spp. (Tabela Suplementar 1). Nove dos isolados de Metarhizium (LCM S01 a LCM S09) foram identificados molecularmente usando o gene ef1-a (fator de alongamento de tradução eucariótica 1-alfa)21. Destes, sete isolados (LCM S01-LCM S06 e LCM S08) foram identificados como Metarhizium anisopliae sensu stricto, enquanto dois isolados (LCM S07 e LCM S09) foram identificados como Metarhizium pingshaense21.
A ocorrência de EPF (% das amostras positivas de EPF) nas 24 amostras de solo estudadas utilizando os três diferentes métodos de isolamento está mostrada na Tabela 1. As taxas de recuperação do EPF foram analisadas por teste qui-quadrado. Como mostrado na Tabela 1, a isca da Galleria mostrou-se mais eficiente no isolamento da EPF (91,7% (22/24) de amostras positivas), seguida pela isca molitor ( 62,5% (15/24) de amostras positivas da EPF) e meio CTC (41,7% (14/24) de amostras positivas da EPF). Estas 24 amostras de solo não mostraram recuperação de Beauveria spp., mas apenas Metarhizium.
Figura 1: Colônias fúngicas entomopatômicas de cepas isoladas de amostras de solo. As colônias foram cultivadas em meio artificial CTC. (1) Placa de Petri que exibe colônias fúngicas a partir de amostras de solo 14 dias após a incubação em meio seletivo ctc antes da obtenção de culturas puras; (2-42) Pure Metarhizium spp. colonies; (43-52) Colônias puras de Beauveria . Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Características micromorfológicas de fungos entomopatogênicos isolados das amostras do solo. As colônias foram incubadas por 3 dias no ágar de dextrose de batata a 25 ± 1 °C e a umidade relativa ≥ 80%. O slide do microscópio estava manchado com solução azul lactofenol. As imagens mostram conidioforos e conidia de (A) Metarhizium anisopliae sensu stricto (s.s) isolar LCM S01; (B) Metarhizium anisopliae s.s. isolar LCM S03; (C) Metarhizium sp. isolar LCM S27; (D-F) Beauveria spp. isola LCM S23, LCM S24 e LCM S20, respectivamente. Todas as cepas aqui representadas foram isoladas utilizando-se o meio CTC. O LCM S27 também foi recuperado do solo usando iscas de insetos. Conidioforos e conidia. ** As cadeias conidiais mostram a colocação lado a lado característica dos esporos de Metarhizium em correntes adjacentes. Flechas pretas indicam metarhizium cilíndrico para conidia elípsida. Flechas vermelhas indicam conidia em forma de globo beauveria. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Método de isolamento | Fungos entomopatômicos* | χ2** | |
| Positivo | Negativo | ||
| Galleria-isca | 91.7% (22/24) | 8.3% (2/24) | 13.4 |
| Isca de Tenebrio | 62.5% (15/24) | 37.2% (9/24) | |
| Meio seletivo CTC | 41.7% (10/24) | 58.3% (14/24) | |
| * Apenas Metarhizium spp. foram isolados | |||
| ** Análise qui-quadrado, DF2. P = 0,0013 | |||
Tabela 1: Ocorrência de fungos entomopatômicos (% das amostras positivas) em 24 amostras de solo utilizando diferentes métodos de isolamento.
Tabela suplementar 1: Coordenadas geográficas, método de isolamento, código, ano de coleta e tipos de amostras de uso da terra positivos para fungos entomopatômicos. Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
Habitats naturais e agrícolas do solo são ambientes típicos da EPF22 e um excelente reservatório natural. No presente estudo, foram abordados dois métodos de isolamento da EPF utilizando iscas de insetos versus meio seletivo. O primeiro passo para o isolamento é a coleta das amostras de solo. O armazenamento adequado e a identificação das amostras do solo são cruciais. Informações sobre a latitude, longitude, tipo de solo e bioma são essenciais para estudos envolvendo epidemiológicos, modelagem e sujeitos geoespaciais23,24. Após a coleta, recomenda-se que as amostras sejam processadas o mais rápido possível (preferencialmente dentro de 7 dias) porque a viabilidade da conídia nessas amostras de solo pode eventualmente diminuir. As etapas críticas no isolamento do EPF utilizando CTC incluem: a) a) a investigação das placas ctc 1 e 2 semanas após a incubação (as primeiras semanas são críticas porque, em estágios posteriores, outras colônias fúngicas podem estreitar o desenvolvimento de EPF), e b) identificar com precisão colônias de EPF com base em sua macromorfologia e micromorfologia. Para o isolamento usando iscas de insetos, é essencial manter a amostra do solo úmida, mas não mergulhá-la na água.
Os resultados relatados por diversos estudos levaram a uma interpretação de que a anisopliae M. é mais comum em solos cultivados do que os ecossistemas naturais 8,25,26. Podem ocorrer diferenças na distribuição e ocorrência desses fungos. No presente estudo, todas as cepas foram isoladas tanto do solo cultivado (culturas) quanto das pastagens, e houve predominância de Metarhizium spp. sobre Beauveria spp. Sugere-se que as práticas de cultivo e o alto teor de matéria orgânica favorecem a presença de fungos saprofíticos no solo27. Assim, técnicas eficazes de isolamento que buscam o EPF devem considerar a redução de contaminantes fúngicos.
As mídias artificiais seletivas são comumente usadas para isolamento porque são fáceis de usar e têm se mostrado eficientes em isolar fungos entomopatômicos, principalmente Metarhizium spp. e Beauveria spp.28. Essas mídias seletivas usam produtos químicos específicos para reduzir o crescimento de contaminantes. Nas décadas de 1980 e 1990, o fungicida dodine tornou-se um meio seletivo amplamente utilizado para isolar Metarhizium spp. e Beauveria spp.29,30. Embora essas mídias artificiais sejam eficazes, algumas espécies de EPF como Metarhizium acridum podem ser suscetíveis a dodine31. É por isso que o meio CTC livre de dodine foi escolhido no presente estudo. De acordo com Fernandes et al.9, o CTC foi desenvolvido para maximizar o isolamento de fungos entomopatômicos de ocorrência natural, incluindo M. acridum. O uso de um meio seletivo em vez de iscas de insetos no isolamento do EPF é conveniente porque o primeiro requer menos espaço no processamento da amostra. A principal desvantagem no uso de CTC baseia-se no fato de que alguns de seus componentes (ou seja, cicloheximida e clororamfenicol) são tóxicos, por isso o uso de equipamentos de proteção individual é obrigatório.
Conforme observado no presente estudo, observou-se maior percentual de amostras positivas com iscas de insetos em comparação com as mídias seletivas artificiais para isolamento da EPF 15,32,33,34,35. O uso de iscas de insetos é considerado uma alternativa de baixo custo e alta eficiência na busca por um novo EPF. Apesar disso, há desvantagens associadas ao uso de iscas de insetos em meios seletivos. Como a quantidade de solo para analisar usando insetos é maior, também é necessário ter mais espaço físico para armazenar as amostras e incubar os vasos. A aquisição de insetos também pode ser uma limitação. No Brasil, por exemplo, G. mellonella não está disponível comercialmente, por isso é necessário estabelecer uma colônia no laboratório para usar esse inseto como isca. É essencial manter a salubridade das colônias de insetos, evitando infecções naturais por EPF. Uma infecção por EPF na colônia pode tornar os resultados de isolamento não confiáveis. Portanto, é preciso observar as larvas remanescentes na colônia em busca de sinais patológicos invertebrados. Como alternativa, potes de controle com solo estéril podem ser incluídos no estudo para verificar o estado de saúde das larvas de insetos.
Buscar novos isolados fúngicos com traços de biocontrole excelentes é crucial para aumentar a eficácia dos fungos no controle artrópode-praga. Fungos isolados do solo podem estar bem adaptados ao crescimento nesse ambiente22, e é provável que tenham persistência de campo elevado, característica essencial do sucesso da EPF no controle de pragas21. Assim, a EPF isolada localmente pode melhorar o controle biológico das pragas locais devido à sua congruência geográfica e temporal, aumentando as chances de sucesso e reduzindo os impactos ambientais causados pela aplicação de inseticidas sintéticos.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este estudo foi financiado em parte pela Coordenacão de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) do Brasil, pelo Código Financeiro 001, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) (número do projeto E-26/010.001993/2015) e Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) do Brasil.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclave | Phoenix Luferco | 9451 | |
| Biosafety cabinet | Airstream ESCO | AC2-4E3 | |
| Chloramphenicol | Sigma-Aldrich | C0378 | |
| Climate chambers | Eletrolab | EL212/3 | |
| Coverslip | RBR | 3871 | |
| Cycloheximide | Sigma-Aldrich | C7698 | |
| Drigalski spatula | Marienfeld | 1800024 | |
| GPS app | Geolocation app | 2.1.2005 | |
| Lactophenol blue solution | Sigma-Aldrich | 61335 | |
| Microscope | Zeiss Axio star plus | 1169 149 | |
| Microscope camera | Zeiss Axiocam 105 color | 426555-0000-000 | |
| Microscope softwere | Zen lite Zeiss 3.0 | ||
| Microscope slide | Olen | k5-7105-1 | |
| Microtube | BRAND | Z336769-1PAK | |
| Petri plates | Kasvi | K30-6015 | |
| Pipette tip | Vatten | VT-230-200C/VT-230-1000C | |
| Pippette | HTL - Labmatepro | LMP 200 / LMP 1000 | |
| Plastic pots | Prafesta descartáveis | 8314 | |
| Polypropylene bags | Extrusa | 38034273/5561 | |
| Potato dextrose agar | Kasvi | K25-1022 | |
| Prism software 9.1.2 | Graph Pad | ||
| Shovel | Tramontina | 77907009 | |
| Tenebrio mollitor | Safari | QP98DLZ36 | |
| Thiabendazole | Sigma-Aldrich | T8904 | |
| Tween 80 | Vetec | 60REAVET003662 | |
| Vortex | Biomixer | QL-901 | |
| Yeast extract | Kasvi | K25-1702 |
References
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