Il presente protocollo descrive l'iniezione intracerebroventricolare (ICV) di zebrafish adulto con 6-idrossidopamina neurotossica (6-OHDA) al diencefalo ventrale (Dn) e la valutazione della compromissione e del successivo recupero del comportamento di nuoto postlesione utilizzando il test in vasca aperta, che è accompagnato da analisi utilizzando un software di tracciamento video.
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Articolo metodologico
Valutazione locomotoria del modello di malattia di Parkinson a base di zebrafish adulto indotto da 6-idrossidopamina
In questo articolo
Sommario
Abstract
I limiti degli attuali trattamenti nel ritardare la perdita neuronale dopaminergica nella malattia di Parkinson (PD) aumentano la necessità di terapie alternative in grado di ripristinare questi neuroni. Molti sforzi sono attualmente diretti verso una migliore comprensione della neurorigenerazione utilizzando modelli preclinici in vivo . Questa capacità rigenerativa per l'autoriparazione è, tuttavia, inefficiente nei mammiferi. Gli animali non mammiferi come il pesce zebra sono così emersi come un eccellente modello neurorigenerativo grazie alla sua capacità di auto-rinnovarsi continuamente e di avere una stretta omologia cerebrale per gli esseri umani. Come parte dello sforzo per chiarire gli eventi cellulari coinvolti nella neurorigenerazione in vivo, abbiamo stabilito il modello pd a base di pesce zebra adulto indotto da 6-idrossidopamina (6-OHDA). Ciò è stato ottenuto attraverso la microiniezione intracerebroventricolare (ICV) ottimizzata di 99,96 mM 6-OHDA per ablare specificamente i neuroni dopaminergici (DpN) nel diencefalo ventrale (Dn) del cervello del pesce zebra. L'immunofluorescenza ha indicato oltre l'85% dell'ablazione di DpN al terzo giorno postlesion e il ripristino completo di DpN nel sito lesionato 30 giorni dopo la lesione. Il presente studio ha determinato la compromissione e il successivo recupero del comportamento di nuoto del pesce zebra a seguito della lesione utilizzando il test in campo aperto attraverso il quale sono stati quantificati due parametri, distanza percorsa (cm) e velocità media (cm / s). La locomozione è stata valutata analizzando le registrazioni dei singoli pesci di ciascun gruppo (n = 6) utilizzando un software di tracciamento video. I risultati hanno mostrato una significativa (p < 0,0001) riduzione della velocità (cm/ s) e della distanza percorsa (cm) del pesce zebra lesionato 3 giorni dopo la lesione rispetto allo sham. Il pesce zebra lesionato ha mostrato un pieno recupero del comportamento di nuoto 30 giorni dopo la lesione. I risultati attuali suggeriscono che il pesce zebra adulto lesionato 6-OHDA è un modello eccellente con qualità riproducibile per facilitare lo studio della neurorigenerazione nel PD. Studi futuri sui meccanismi alla base della neurorigenerazione e sui fattori intrinseci ed estrinseci che modulano il processo possono fornire importanti informazioni sulle nuove strategie di trattamento sostitutivo cellulare contro il PD.
Introduzione
Il morbo di Parkinson (PD), una malattia caratterizzata in modo distintivo da rigidità muscolare, tremore a riposo e bradicinesia, è la malattia neurologica in più rapida crescita al mondo1,2. Il rischio e la prevalenza di PD aumentano rapidamente con l'età, specialmente negli individui di età pari o superiore a 50 anni3. L'eziologia e la patogenesi del PD finora rimangono poco conosciute. Questo ha spesso lasciato l'insorgenza precoce del PD non diagnosticata. Allo stato attuale, la mancanza di dopamina e la perdita di neuroni dopaminergici (DpN) nei pazienti con PD sono fortemente leg....
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Protocollo
Il presente studio è stato approvato dal Committee on Animal Research and Ethics (CARE), Universiti Technologi MARA (UiTM) [Numero di riferimento: UiTM CARE 346/2021, datato 7 maggio 2021].
NOTA: Sono stati utilizzati i protocolli pubblicati22,25,26 per l'allevamento standard e il mantenimento del modello PD di zebrafish adulto 6-OHDA-lesionato. Gli esperimenti sono stati condotti con pesci zebra maschi adulti (Danio rerio) di età superiore ai cinque mesi con una lunghezza standardizzata di 3,2-3,7 cm.
1. ....
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Risultati
Il presente esperimento ha valutato i cambiamenti nel comportamento di nuoto del pesce zebra adulto dopo la microiniezione ICV con 6-OHDA. La ragione per l'utilizzo di 6-OHDA come neurotossina di scelta era dovuta alla sua incapacità di attraversare la barriera emato-encefalica, che produceva un'ablazione specifica e mirata di DpN nell'area di interesse-diencefalo ventrale (Dn)16. La sottopopolazione DpN qui ha una somiglianza anatomica con la sottopopolazione DpN nella substantia nigra pars compa.......
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Discussione
Il presente lavoro ha dimostrato con successo la valutazione locomotoria del modello di PD adulto a base di pesce zebra adulto indotto da 6-OHDA. L'intero esperimento ha coinvolto tre fasi principali: preparazioni di microiniezione pre-ICV, microiniezione ICV di zebrafish e valutazione locomotoria. Per garantire il sano recupero del pesce zebra adulto seguendo la procedura di microiniezione ICV e un buon risultato sperimentale, nel presente studio sono state raccomandate alcune buone pratiche per ogni fase.
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero dell'Istruzione Superiore della Malesia nell'ambito del Fundamental Research Grant Scheme [600-IRMI/FRGS 5/3 (033/2019)].
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Materiali | |||
| 6-idrossidopamina (6-OHDA) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | 162957 | |
| Acido ascorbico | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FKC#A/8882/53 | |
| Pipetta pasteur monouso, 3 mL | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FB55348 | |
| Provetta per microcentrifuga, 0,2 mL | Eppendorf, Amburgo, Germania | 30124332 | |
| Pallone conico Nice, 100 mL | Evergreen Engineering & Risorse, Semenyih, Malesia | SumYau0200 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | P4417 | |
| Bicarbonato di sodio | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | S5761 | |
| Cloruro di sodio | Merck, Darmstadt, Germania | 106404 | |
| Stereomicroscopio | Nikon, Tokyo, Giappone | SMZ745 | |
| Tricaina metanosolfonato (MS-222) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | E10521 | |
| Equipment | |||
| ANY-maze software | Stoelting Co., Illinois, USA-version | 7.0; software di tracciamento video | |
| Cubis II Micro Lab Balance | Sartorius, Gö ttingen, Germania | Microiniettore SE 2 | |
| FemtoJet IV | Eppendorf, Amburgo, Germania | 5192000035 | |
| Femtotip II, capillare di iniezione sterile | Eppendorf, Amburgo, Germania | 5242957000 | |
| Micromanipolatore InjectMan 4 | Eppendorf, Amburgo, Germania | 5192000027 | |
| Lampada portatile a LED | MR. Fai da te, Selangor, Malesia | 9023251 | 20 mAh |
| PELCO Pro Superlega, offset, punte fini | Ted Pella, California, USA | 5367-12NM | |
| Riscaldatore per acquari Shanda | Yek Fong Acquario, Selangor, Malesia | SDH-228 | |
| Termometro | Sera Precision, Heinsberg, Germania | 52525 | |
| Videocamera | Nikon, Tokyo, Giappone | D3100 |
Riferimenti
- Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
- Maserejian, N., Vinikoor-Imler, L., Dilley, L.
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Ristampe e permessi
