Summary
Le présent protocole décrit l’injection intracérébroventriculaire (ICV) de poissons zèbres adultes avec de la 6-hydroxydopamine neurotoxique (6-OHDA) au niveau du diencéphale ventral (Dn) et l’évaluation de la déficience et de la récupération ultérieure du comportement de nage après la llésion à l’aide du test en cuve ouverte, qui est accompagné d’une analyse à l’aide d’un logiciel de suivi vidéo.
Abstract
Les limites des traitements actuels pour retarder la perte neuronale dopaminergique dans la maladie de Parkinson (MP) augmentent le besoin de thérapies alternatives qui peuvent restaurer ces neurones. Beaucoup d’efforts sont actuellement dirigés vers une meilleure compréhension de la neurorégénération à l’aide de modèles précliniques in vivo . Cette capacité de régénération pour l’auto-réparation est cependant inefficace chez les mammifères. Les animaux non mammifères comme le poisson-zèbre sont ainsi apparus comme un excellent modèle neurorégénératif en raison de sa capacité à s’auto-renouveler continuellement et à avoir une homologie cérébrale proche de celle des humains. Dans le cadre de l’effort visant à élucider les événements cellulaires impliqués dans la neurorégénération in vivo, nous avons établi le modèle de à base de poisson zèbre adulte induit par la 6-hydroxydopamine (6-OHDA). Ceci a été réalisé grâce à la micro-injection intracérébroventriculaire (ICV) optimisée de 99,96 mM 6-OHDA pour ablation spécifique des neurones dopaminergiques (DpN) dans le diencéphale ventral (Dn) du cerveau du poisson-zèbre. L’immunofluorescence a indiqué plus de 85 % de l’ablation de la DpN au troisième jour après la llésion et la restauration complète de la DpN au site lésionné 30 jours après la lèse. La présente étude a déterminé l’altération et la récupération subséquente du comportement de nage du poisson-zèbre après une lésion en utilisant le test en plein champ à travers lequel deux paramètres, la distance parcourue (cm) et la vitesse moyenne (cm / s), ont été quantifiés. La locomotion a été évaluée en analysant les enregistrements des poissons individuels de chaque groupe (n = 6) à l’aide d’un logiciel de suivi vidéo. Les résultats ont montré une réduction significative (p < 0,0001) de la vitesse (cm / s) et de la distance parcourue (cm) du poisson zèbre lésionné 3 jours après la lèse par rapport au simulacre. Le poisson-zèbre lésionné a montré une récupération complète du comportement de nage 30 jours après la lèse. Les résultats actuels suggèrent que le poisson-zèbre adulte sectionné au 6-OHDA est un excellent modèle de qualité reproductible pour faciliter l’étude de la neurorégénération dans la MP. Des études futures sur les mécanismes sous-jacents à la neurorégénération ainsi que sur les facteurs intrinsèques et extrinsèques qui modulent le processus pourraient fournir des informations importantes sur les nouvelles stratégies de traitement de remplacement cellulaire contre la MP.
Introduction
La maladie de Parkinson (MP), une maladie caractérisée distinctement par la rigidité musculaire, les tremblements au repos et la bradykinésie, est la maladie neurologique qui connaît la croissance la plus rapide au monde1,2. Le risque et la prévalence de la MP augmentent rapidement avec l’âge, en particulier chez les personnes âgées de 50 ans et plus3. L’étiologie et la pathogenèse de la MP restent jusqu’à présent mal comprises. Cela a souvent laissé l’apparition précoce de la MP non diagnostiquée. À l’heure actuelle, le manque de dopamine et la perte de neurones dopaminergiques (DpN) chez les patients atteints de MP sont fortement liés à la manifestation de symptômes moteurs4. Capitalisant sur cette relation, plusieurs traitements ont été conçus soit pour agir directement comme remplacement de la dopamine (c.-à-d. la lévodopa), soit pour compenser la perte de DpN (c.-à-d. stimulation cérébrale profonde). Bien que ces traitements apportent des avantages symptomatiques, ils ne modifient pas l’évolution de la maladie5. Compte tenu de cette faiblesse importante, une thérapie de remplacement cellulaire a été proposée. L’efficacité de cette approche est toutefois incohérente compte tenu des défis de la préparation du greffon, du contrôle de la croissance cellulaire et de l’instabilité du phénotype. La thérapie de remplacement cellulaire, qui avait soulevé des préoccupations éthiques, pose également le risque d’induire des tumeurs cérébrales et des réactions immunitaires indésirables6,7.
Les limites des stratégies thérapeutiques actuelles ont conduit à mettre davantage l’accent sur la régénération de la DpN en tant qu’approche potentielle dans le traitement de la MP. La régénération de la DpN ou neurorégénération est apparue comme l’une des percées prometteuses dans la prise en charge de la MP, non seulement en raison de son potentiel en tant que nouvelle méthode thérapeutique, mais aussi en tant que moyen de comprendre le mécanisme de la maladie8, 9. L' Cette approche se concentre sur la restauration de la fonction neuronale par la différenciation, la migration et l’intégration des cellules progénitrices existantes dans les circuits lésionnés10. Afin d’explorer davantage la neurorégénération, diverses études in vivo ont été entreprises. Il a été constaté que les vertébrés tels que les mammifères, les amphibiens et les reptiles génèrent de nouvelles cellules cérébrales après une blessure11,12. Chez les vertébrés, les mammifères sont plus recherchés étant donné leur ressemblance génétique avec les êtres humains. Les mammifères, cependant, présentent une capacité réparatrice limitée et médiocre dans le système nerveux central (SNC) qui peut durer jusqu’à l’âge adulte après une lésion cérébrale13. En général, les mammifères ne sont pas adaptés en tant que modèles animaux pour comprendre la neurorégénération étant donné que le faible nombre de neurones produits ne sera pas suffisant pour restaurer les circuits neuronaux endommagés observés dans la MP. En tant que tel, le modèle basé sur le téléostéen, en particulier chez le poisson-zèbre, est grandement favorisé pour son taux de prolifération élevé, sa capacité à s’auto-renouveler continuellement et son homologie cérébrale proche des humains14,15.
Le poisson-zèbre est le plus souvent utilisé pour étudier les troubles du mouvement dans PD16. Le modèle à base de poisson-zèbre est généralement induit par des neurotoxines, qui comprennent la 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP) et la 6-hydroxydopamine (6-OHDA)17. Bien qu’efficaces pour induire une perte spécifique de DpN et une diminution des niveaux de dopamine, les modèles basés sur mpTP n’imitent pas étroitement les conditions de la MP car la perte de DpN ne se limite pas uniquement au SNC18. L’incapacité du 6-OHDA à traverser la barrière hémato-encéphalique a limité ses effets sur les changements cellulaires et fonctionnels dans le cerveau lorsqu’il est administré par voie intracrânienne par opposition à intramusculaire19. L’administration périphérique de 6-OHDA a entraîné une réduction globale des niveaux de dopamine dans tout le système nerveux20. Alors que l’administration de 6-OHDA dans le liquide céphalo-rachidien a provoqué une ablation de DpN dans tout le CNS21, ce qui n’imite pas la condition comme on le voit dans où la perte de DpN se produit spécifiquement à la substantia nigra du cerveau humain. L’administration de 6-OHDA par ICV, au contraire, a spécifiquement induit une ablation significative de DpN dans la zone de Dn ventral dans le cerveau du poisson zèbre, qui ressemblait beaucoup à substantia nigra22. Fait intéressant, la récupération de la DpN a été rapportée 30 jours après la lésion induite par 6-OHDA et ces neurones ont survécu au cours de la vie23,24. La récupération fonctionnelle de la DpN a été démontrée par une évaluation locomotrice de la distance parcourue (cm) et de la vitesse moyenne (cm/s) à l’aide du modèle PD22 à base de poisson zèbre adulte induit par 6 OHDA.
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Protocol
La présente étude a été approuvée par le Comité de la recherche et de l’éthique animales (CARE), Universiti Technologi MARA (UiTM) [N° de référence : UiTM CARE 346/2021, en date du 7 mai 2021].
REMARQUE: Les protocoles publiés22,25,26 pour l’élevage standard et l’entretien du modèle de poisson zèbre adulte à lésion 6-OHDA ont été utilisés. Des expériences ont été menées sur des poissons-zèbres mâles adultes (Danio rerio) âgés de plus de cinq mois avec une longueur normalisée de 3,2 à 3,7 cm.
1. Entretien du poisson-zèbre et préparations de micro-injection pré-ICV
- Maintenir le poisson dans un réservoir d’eau aérée à une température contrôlée de 28 ± 1,0 °C. Pour l’élevage et l’entretien du poisson-zèbre, utilisez de l’eau distillée minéralisée avec du sel de mer commercial (1 g/L) tout au long de l’expérience27.
- Hébergez un maximum de 25 poissons par aquarium de 45 L ou un poisson par 1,8 L d’eau et exposez-les à un horaire de 14 h de lumière et de 10 h de photopériode sombre. Nourrissez les poissons au moins deux fois par jour avec des granulés de nourriture complétés par des vers lyophilisés.
- Préparer une solution mère concentrée de méthanesulfonate de tricaïne (MS-222) en dissolvant 2,5 g de MS-222 et 5 g de bicarbonate de sodium dans 250 mL d’eau distillée. Diluer 2 mL de solution mère pour produire 200 mL de solution d’anesthésie de travail.
- Préparer 99,96 mM de 6-OHDA en dissolvant d’abord 0,2 mg d’acide ascorbique dans 1 mL de NaCl filtré stérile à 0,9 % p/v. Filtrer la solution avec un filtre de 0,2 micron avant d’ajouter 25 mg de 6-OHDA sous forme de poudre dans la solution. Préparer la solution fraîche avant chaque injection et la conserver dans l’obscurité à 4 °C.
ATTENTION : Portez l’équipement de protection individuelle approprié (c.-à-d. gants, blouse de laboratoire et masque facial) et appliquez les bonnes pratiques de laboratoire lorsque vous manipulez les produits chimiques. Toutes les manipulations des produits chimiques doivent être effectuées dans une armoire de biosécurité.
2. Anesthésie et injection de VCI de poisson-zèbre
- Jeûnez le poisson pendant 24 h pour éviter les régurgitations pendant l’anesthésie. Anesthésier le poisson en l’immergeant dans un récipient contenant 0,01 % p/v de solution de MS-222 pendant environ 1 min ou jusqu’à ce que tout mouvement musculaire visible cesse.
- Placez le poisson anesthésié sur une éponge imbibée d’eau placée sous un stéréomicroscope et mouillez le poisson régulièrement.
- Identifiez la position d’injection en fonction de l’intersection entre la suture métopique (SEP), la suture coronale (CS) et la suture sagittale (SS) qui relie le crâne frontal et pariétal du cerveau du poisson-zèbre.
- Faites un petit trou de 1,0 mm2 à l’aide d’une aiguille pointue de 27 G dans le crâne guidée par la position anatomique spécifique sur le crâne du poisson-zèbre (Figure 1A, B).
- Abaissez l’injecteur microcapillaire à un angle de 60° jusqu’à ce qu’il atteigne une profondeur de 1 200 μm du toit crânien du crâne du poisson-zèbre (Figure 1C). Appuyez sur la limite Z pour fixer la position.
- Réglez la pression d’injection initiale à 4000 hPa et la pression de compensation à 10 hPa. Réglez la durée de l’injection à 0,3 s. Réduire l’intensité de l’injection à chaque injection ultérieure.
- Injecter 0,5 μL de 99,96 mM de neurotoxine 6-OHDA (ou 0,9 % p/v de solution saline pour le groupe témoin simulé) et laisser reposer la microcapillaire pendant 20 s. Continuez à mouiller le poisson avec de l’eau distillée tout au long du processus d’injection pour éviter le dessèchement.
- Retirez lentement le microcapillaire et réanimez le poisson sous l’eau distillée courante. Placez le poisson dans un réservoir de récupération isolé et éliminez toute distraction pouvant perturber le processus de récupération.
- Rincer le microcapillaire avant la prochaine injection pour éliminer le blocage et s’assurer que l’intensité de l’injection est suffisante pour obtenir le volume souhaité de 0,5 μL de 6-OHDA.
Figure 1 : Site d’injection de la neurotoxine, 6-OHDA. (A) Le point d’entrée microcapillaire est guidé par l’intersection entre la suture métopique (SEP), la suture coronale (CS) et la suture sagittale (SS) qui relie le crâne frontal et pariétal du cerveau du poisson zèbre (vue plan). (B) Un dessin schématique (vue plan) du crâne et du cerveau du poisson-zèbre montre le microcapillaire, qui est abaissé directement au-dessus de l’habenula (Hab), et son point d’entrée à l’intersection entre les hémisphères. (C) Un dessin schématique (section sagittale) du cerveau du poisson-zèbre montre l’angle d’injection et la profondeur de pénétration. Le point noir représente le site lésionné situé au-dessus de la zone ciblée, le diencéphale ventral. Abréviations: 6-OHDA: 6-hydroxydopamine, CS: suture coronale, Dn: diencéphale, Hab: habenula, Hyp: hypothalamus, MS: suture métopique, OB: bulbe olfactif, POA: zone préoptique, PT: tubercule postérieur, SS: suture sagittale, Tec: tectum et Tel: télencéphale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
3. Évaluation locomotrice
NOTE: L’évaluation locomotrice du poisson-zèbre (n = six / groupe; simulacre vs lésion) a été évaluée individuellement via le test en cuve ouverte en utilisant les protocoles établis28,29 au troisième jour et au jour 30 post-lésion 6-OHDA.
- Enregistrement vidéo
- Placez le réservoir expérimental (longueur 20 cm, largeur 11,5 cm, hauteur 13 cm) avec ses parois recouvertes de papier blanc sur une plate-forme surélevée (Figure 2A).
- Éclairez le réservoir par le bas à l’aide d’une source lumineuse. Remplissez le réservoir avec de l’eau distillée (80% -90% plein) et maintenez la température à 28 ± 1,0 ° C. Mesurez la température à l’aide d’un thermomètre et régulez-la à l’aide d’un chauffe-aquarium commercial.
- Après un minimum de 2 minutes d’acclimatation, enregistrez le comportement de nage des poissons à partir d’une vue de plan sur le plan 2dimensionnel (2D) de l’arène expérimentale à l’aide d’une caméra vidéo pendant 5 minutes (Figure 2B). Pour éviter toute incohérence dans le comportement de nage du premier et du dernier lot d’enregistrements, ne dépassez pas l’acclimatation de 10 min30.
- Analysez les vidéos à l’aide d’un logiciel de suivi vidéo avec le protocole open-tank pour l’acquisition de la distance parcourue (cm) et de la vitesse moyenne (cm/s) de chaque sujet.
Figure 2 : Installation expérimentale d’un essai en aquarium ouvert pour l’évaluation du comportement locomoteur du poisson-zèbre. (A) Le réservoir expérimental (vue de face) est placé sur une plate-forme surélevée éclairée par le bas. Les quatre parois du réservoir sont recouvertes de papier blanc et les enregistrements sont capturés axialement. La température est mesurée à l’aide d’un thermomètre et régulée à 28 ± 1,0 °C à l’aide d’un chauffe-aquarium commercial. (B) Capture d’écran (vue plan) de l’enregistrement vidéo capturé à l’aide de la configuration. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
- Analyse des données
- Double-cliquez sur l’icône pour ouvrir le logiciel de suivi vidéo. Cliquez sur l’onglet Fichier et sélectionnez Créer une nouvelle expérience vide. Cela permettra à l’utilisateur de personnaliser les paramètres de l’expérience en fonction des objectifs de l’enquête.
- Cliquez sur l’onglet Protocole , sélectionnez Sources vidéo, puis cliquez sur Ajouter une nouvelle source vidéo. Cliquez sur la liste déroulante disponible et sélectionnez l’option Fichier vidéo . Cela invitera la fenêtre contextuelle de navigation de fichier à partir de laquelle les enregistrements vidéo d’intérêt peuvent être sélectionnés.
- Cliquez sur le sous-onglet Appareil et sélectionnez l’icône Rectangulaire pour configurer l’appareil. Faites glisser l’icône rectangulaire pour couvrir toute l’arène expérimentale. Réglez la barre d’échelle en conséquence et entrez la valeur numérique de la mesure d’échelle utilisée dans la longueur de la section de la règle. La présente expérience a utilisé une échelle de 10 mm pour l’essai en réservoir ouvert.
- Définissez la couleur de l’animal en sélectionnant Les animaux sont plus sombres que l’arrière-plan de l’appareil. Laissez les autres options disponibles dans Suivi aux paramètres par défaut prédéfinis.
- Dans le sous-onglet Zones , cliquez sur l’appareil dessiné précédemment. Cette zone est définie comme la zone standard dont la position est la même pour tous les tests.
- Sélectionnez les options suivantes sous Planification des tests et rapport de données de test : Durée du test, Distance totale parcourue et Vitesse moyenne. Les autres tests disponibles sur la liste sont facultatifs et dépendent de l’intérêt d’enquête du chercheur.
- Dans l’onglet Expérience , affectez les animaux en fonction de leur groupe de test en tapant le nom du groupe dans la section Nom et le nombre d’animaux par groupe dans la section Nombre d’animaux .
- Basculez vers l’onglet Tests pour exécuter l’expérience. Cliquez sur l’icône Démarrer le test et attendez que toutes les vidéos soient analysées.
- Dans l’onglet Résultats , cliquez sur l’icône Afficher le rapport pour afficher les données locomotrices sous forme de rapport texte.
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Representative Results
La présente expérience a évalué les changements dans le comportement de nage du poisson zèbre adulte après la micro-injection de CICV avec 6-OHDA. La raison de l’utilisation de la 6-OHDA comme neurotoxine de choix était due à son incapacité à traverser la barrière hémato-encéphalique, ce qui a produit une ablation spécifique et ciblée de la DpN dans la zone du diencéphale ventral d’intérêt (Dn)16. La sous-population DpN présente ici une ressemblance anatomique avec la sous-population DpN dans la substantia nigra pars compacta31 de l’homme.
Selon nos travaux précédents22, l’effet cellulaire de la micro-injection de 6-OHDA ICV contre la DpN du poisson-zèbre adulte a été confirmé par immunohistostaining du marqueur DpN-tyrosine hydroxylase (TH). La principale région cérébrale d’intérêt était le Dn, composé de la zone préoptique (POA), du tubercule postérieur (PT) et de l’hypothalamus (Hyp). Il a été constaté que 99,96 mM 6-OHDA entraînait un taux de survie de 100% du poisson-zèbre adulte avec le plus faible nombre de TH-immunoréactif (TH-ir) dans Dn. Il a également été constaté que plus de 85% (p < 0,01) de TH-ir DpN dans le Dn a été ablation le troisième jour après la postlesion. Le nombre de DpN TH-ir a ensuite augmenté de plus de 50 % au jour 14 après la postlesion avant d’atteindre une régénération complète 30 jours après la postlesion (Figure 3). Ces données confirment les capacités de régénération de la sous-population DpN dans Dn de poissons zèbres adultes après l’ablation32.
Figure 3 : Régénération du DpN dans la région Dn du poisson-zèbre sectionné par 99,96 mM 6-OHDA. (A) Le nombre de DpN TH-ir dans trois zones principales de la région Dn, POA, PT et Hyp, sur quatre points de données : simulacre, 3, 14 et 30 jours après la lésion par la neurotoxine 6-OHDA de 99,96 mM. Chaque barre représente la moyenne ± ET de n = 6 expériences indépendantes; *p < 0,05. (B) Images représentatives au microscope confocal du cerveau de poisson zèbre sectionnel de simulacre (I, I' et I''), 3 jours après la lésion (II, II' et II''), 14 jours après la lésion (III, III' et III''), et 30 jours après la lésion (IV, IV' et IV'') colorés avec TH (DpN; vert) et DAPI (noyaux; bleu). Barre d’échelle = 50 μm. Abréviations- DAPI: 4′, 6-diamidino-2-phénylindole, 6-OHDA: 6-hydroxydopamine, Dn: diencéphale, DpN: neurones dopaminergiques, Hyp: hypothalamus, POA: aire préoptique, PT: tubercule postérieur, SD: écart-type et TH-ir: tyrosine hydroxylase immunoréactive. Adapté de Vijayanathan et al.22. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Nous avons ensuite effectué une évaluation locomotrice à l’aide du test en aquarium ouvert pour étudier les changements dans la distance parcourue (cm) et la vitesse moyenne (cm / s) du poisson zèbre adulte après la micro-injection ICV de 6-OHDA et simulacre. Les poissons expérimentaux ont ensuite été évalués le troisième jour après la lèse (le moins grand nombre de DpN TH-ir observés) et le jour 30 après la postlesion (DpN entièrement restauré signalé au site de la lésion). L’analyse du comportement de nage du poisson-zèbre à l’aide d’un logiciel de suivi vidéo a indiqué que la vitesse moyenne (cm /s) et la distance parcourue (cm) du groupe lésé le troisième jour de la postlesion étaient significativement réduites (p < 0,001) à <45 % par rapport à l’imposture (Figure 4). Le groupe lésé a présenté une récupération de la fonction motrice 30 jours après la lèse sans différence significative de la vitesse moyenne (cm / s) et de la distance parcourue (cm) par rapport à l’imposture.
Figure 4 : Changements dans le comportement de nage après injection intracérébroventriculaire par 6-OHDA. Le comportement de nage du poisson-zèbre adulte a été évalué avant la lésion, le troisième jour et le jour 30 après la post-lèse par 99,96 mM 6-OHDA. Les paramètres évalués comprenaient : (A) vitesse moyenne (cm/s) et (B) distance parcourue (cm). Chaque barre représente la moyenne ± SD de six poissons; p < 0,0001 (test t de l’élève). Abréviations : 6-OHDA : 6-hydroxydopamine, SD : écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Les présents travaux ont démontré avec succès l’évaluation locomotrice du modèle établi de à base de poisson zèbre adulte induit par 6-OHDA. L’ensemble de l’expérience comportait trois étapes principales : les préparations de micro-injection pré-ICV, la micro-injection ICV du poisson-zèbre et l’évaluation locomotrice. Afin d’assurer la récupération saine du poisson-zèbre adulte après la procédure de micro-injection ICV et de bons résultats expérimentaux, certaines bonnes pratiques pour chaque étape ont été recommandées dans la présente étude.
Préparation de micro-injection pré-ICV : La sélection des animaux a été mieux effectuée la veille de l’expérience. Le sexe a été identifié et la longueur du poisson a été mesurée. Les poissons-zèbres adultes mâles d’une longueur normalisée de 3,2 à 3,7 cm ont été placés dans un réservoir expérimental séparé. De plus, le poisson doit subir une période de jeûne de 24 heures pour éviter la régurgitation pendant l’anesthésie33. Un aquarium (avec ses quatre parois recouvertes de papier blanc) avec un réservoir d’eau stagnante mis en place doit être préparé avant l’expérience pour réduire le stress extérieur et aider le processus de récupération du poisson-zèbre. Tous les produits chimiques ont été préparés frais avant le début de chaque expérience, car ils pouvaient se détériorer rapidement au fil du temps et devenir instables à température ambiante34,35.
Microinjection du 6-OHDA: Une manipulation propre et douce du poisson-zèbre doit être effectuée tout au long du processus pour éviter l’introduction de blessures et d’infections inutiles chez les poissons. Le poisson doit être placé sur une éponge humide et maintenu dans un état humide pour éviter le dessèchement36. Une petite incision a été faite à l’aide d’une aiguille stérile avec une force ferme et appropriée pour éviter une pression supplémentaire qui pourrait fissurer le crâne du poisson zèbre. Cette incision devrait permettre l’entrée de la microcapillaire dans la cavité cérébrale. Le microcapillaire a ensuite été abaissé jusqu’à une profondeur de 1 200 μm du point d’entrée, qui se trouve entre deux hémisphères - le télencéphale et le tectum (Figure 1B, C). Le point d’entrée a été choisi entre ces hémisphères pour éviter toute lacération supplémentaire des neurones37. Cette technique impliquait l’utilisation d’un microinjecteur, la pression et le moment de l’administration doivent être étalonnés pour assurer l’administration de 0,5 μL de neurotoxine. Cet étalonnage peut être effectué en mesurant la taille de la gouttelette formée sur le papier filtre38. Notre pratique impliquait généralement la configuration suivante de paramètres programmables par lesquels l’intensité de l’injection était réduite à chaque injection ultérieure (pression d’injection: 4000 hPa, durée de l’injection: 0,3 s et pression de compensation: 10 hPa). Afin d’éviter que la neurotoxine ne s’échappe de la cavité cérébrale, un intervalle de 20 s a été appliqué entre l’injection et le retrait de la microcapillaire35. En raison de la petite taille du capillaire, le microcapillaire peut être bloqué après chaque injection. En tant que tel, le microcapillaire doit être essentiellement rincé avant la prochaine injection afin de dégager le blocage et de s’assurer que l’intensité de l’injection est suffisante pour produire le volume souhaité de 0,5 μL de 6-OHDA. Le poisson serait ensuite transféré dans un réservoir de récupération maintenu à 28 ± 1,0 °C. Si le poisson ne parvient pas à récupérer dans les 30 secondes, rincez ses branchies et sa bouche avec de l’eau distillée jusqu’à ce que la récupération complète des mouvements musculaires se produise.
Évaluation locomotrice: Pour assurer une bonne évaluation locomotrice sur le poisson zèbre adulte induit par 6-OHDA, l’étude comportementale doit être menée dans le même laps de temps pour chaque point temporel. Chaque étude comportementale doit prévoir une période d’acclimatation d’au moins 2 min et doit être réalisée dans les 4 h39. La présente expérience a été réalisée tôt le matin entre 8 h et 12 h car les poissons-zèbres étaient plus actifs pendant cette période40. Une période d’acclimatation plus longue est nécessaire si le poisson-zèbre présente un comportement anormal avec des signes évidents de stress et d’anxiété (comportement glacial et erratique)41. Cependant, pour éviter toute incohérence dans le comportement de nage du premier et du dernier lot d’enregistrements, l’acclimatation ne doit pas dépasser 10 min30. Pour le test en champ ouvert, un réservoir expérimental de toute taille, couleur, forme et texture pourrait être utilisé pour des enregistrements allant d’un minimum de 5 à 30 min42,43. Le comportement du poisson-zèbre est grandement influencé par la température de son environnement. De petites fluctuations de plus de 4 °C pourraient avoir un impact considérable sur la vitesse de nage44. Par conséquent, la température de l’eau dans le réservoir expérimental doit être strictement maintenue sous une température contrôlée de 28 ± 1,0 ° C à l’aide d’un appareil de chauffage commercial, et le niveau d’eau a été maintenu à environ 12 cm de profondeur tout au long de l’expérience. Les parois du réservoir ont été recouvertes de papier blanc pour créer un contraste entre le sujet testé et l’arène expérimentale ainsi que pour réduire les stimuli externes pouvant provoquer une réaction spontanée des sujets testés45. Les poissons de chaque groupe ont été testés individuellement conformément à la pratique standard actuelle pour la recherche neuroviolève sur le poisson-zèbre23,37,46. Compte tenu de la propension des poissons-zèbres aux interactions sociales, on craint que l’isolement pendant la période de test n’ait un impact sur leur comportement47. Cependant, la configuration expérimentale actuelle était limitée à un maximum de 10 minutes par essai et cette courte période d’isolement s’est avérée n’avoir aucun effet sur l’activité locomotrice du poisson-zèbre adulte48. Afin de fournir une collecte de données précise pour l’étude comportementale, l’évaluation a été effectuée en sélectionnant au hasard le poisson-zèbre de différents groupes expérimentaux (c’est-à-dire en alternant deux poissons-zèbres du groupe simulé et du groupe 6-OHDA jusqu’à n = 6) pendant le test en aquarium ouvert49. Les vidéos enregistrées ont été analysées à l’aide d’un système de suivi vidéo couramment utilisé pour le suivi comportemental des rongeurs. Le poisson-zèbre étant un modèle animal émergent, les tests comportementaux menés à l’aide du poisson-zèbre sont généralement adaptés de la littérature scientifique établie sur les rongeurs50. Ici, nous avons démontré la capacité du logiciel de suivi vidéo à suivre automatiquement le poisson-zèbre dans l’arène expérimentale et à calculer efficacement les paramètres souhaités. Le logiciel de suivi vidéo se démarquait des autres logiciels disponibles en raison de la variété de fichiers vidéo pris en charge par le logiciel, des versions régulières des packages de mise à jour et de la prise en charge des différents systèmes d’exploitation51.
L’une des limites des modèles de MP existants à base d’animaux est l’absence de similitudes mécanistes qui imitent la déficience motrice observée après une perte neuronale dopaminergique dans la substantia nigra pars compacta du cerveau humain52. L’émergence du modèle de DP à base de poisson zèbre adulte peut toutefois remédier à cette limitation particulière. Comme observé dans la présente étude, la vitesse de nage réduite correspondait à nos résultats cellulaires précédents, selon lesquels une perte neuronale dopaminergique de plus de 85% dans le diencéphale ventral du modèle de poisson zèbre adulte induit par 6-OHDA trois jours après la llession22. Il semble qu’une ablation spécifique des neurones dopaminergiques dans cette zone d’intérêt soit nécessaire pour perturber la signalisation motrice descendante du cerveau, provoquant une lenteur dans les mouvements53. L. J. Caldwell, et al.23 qui ont effectué une injection ICV de 6-OHDA au tectum optique (point d’entrée), par exemple, n’ont observé que des changements dans le comportement de banc et d’accouplement du poisson-zèbre. L’ablation de DpN dans le Dn ventral est cruciale car la population de DpN dans le Dn du poisson-zèbre adulte agit comme la seule source de dopamine pour les motoneurones du poisson-zèbre. Ceci est analogue à la substantia humaine nigra54. La présente étude a également observé une vitesse de nage plus rapide et une distance plus longue parcourue par les poissons-zèbres sectionnés dans les points de temps post-lésion ultérieurs, indiquant une restauration continue et finalement complète de la signalisation dopaminergique qui régit le comportement de nage du poisson-zèbre. Ces résultats ont ainsi validé la capacité des neurones dopaminergiques nouvellement régénérés à retrouver leurs activités fonctionnelles chez les poissons-zèbres adultes sectionnés.
La voie d’application actuelle du 6-OHDA impliquait un paradigme d’injection légèrement invasif qui nécessitait l’insertion de microcapillaires profondément dans le cerveau, vers la zone lésionnelle du Dn ventral. Cette méthode est légèrement laborieuse par rapport à l’injection périphérique et doit être effectuée dans les 3 minutes par poisson pour réduire le risque de mortalité après l’injection. En tant que tel, une pratique préalable de l’injection de VCI est nécessaire pour s’assurer que la méthode peut être effectuée dans la durée critique à la zone ciblée (Dn). Afin d’obtenir une évaluation locomotrice valide du poisson-zèbre adulte, l’essai en aquarium ouvert est limité à seulement 4 h de période d’évaluation par jour. Par conséquent, une planification préalable est requise dans un cadre expérimental qui implique un grand nombre d’animaux, ce qui devrait allouer plus de temps pour s’assurer que l’installation répond aux exigences minimales pour chaque enregistrement (par exemple, la température et la profondeur de l’eau). Cette planification est particulièrement cruciale dans les expériences basées sur le temps telles que celle de l’étude actuelle, car chaque enregistrement doit être effectué sur le point temporel prévu. La configuration expérimentale actuelle se limitait à l’étude de deux paramètres de nage qui évaluaient spécifiquement la fonction motrice du poisson-zèbre. D’autres paramètres comportementaux tels que le haut-fond et le comportement anxieux, cependant, nécessitaient d’autres configurations expérimentales et différentes méthodes d’analyse. En résumé, il s’agit d’une méthode reproductible et utile pour étudier le processus de neurorégénération DpN chez le poisson-zèbre adulte induit par 6-OHDA, ce qui peut fournir des informations importantes sur les stratégies de traitement de remplacement cellulaire contre la MP.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le ministère de l’Enseignement supérieur de Malaisie dans le cadre du programme de subventions à la recherche fondamentale [600-IRMI/FRGS 5/3 (033/2019)].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| 6-Hydroxydopamine (6-OHDA) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | 162957 | |
| Ascorbic acid | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FKC#A/8882/53 | |
| Disposable pasteur pipette, 3 mL | Thermo Fisher Scientific, California, USA | FB55348 | |
| Microcentrifuge tube, 0.2 mL | Eppendorf, Hamburg, Germany | 30124332 | |
| Nice conical flask, 100 mL | Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia | SumYau0200 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | P4417 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | S5761 | |
| Sodium chloride | Merck, Darmstadt, Germany | 106404 | |
| Stereomicroscope | Nikon, Tokyo, Japan | SMZ745 | |
| Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich, Missouri, USA | E10521 | |
| Equipment | |||
| ANY-maze software | Stoelting Co., Illinois, USA | - | version 7.0; video tracking software |
| Cubis II Micro Lab Balance | Sartorius, Göttingen, Germany | SE 2 | |
| FemtoJet IV microinjector | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5192000035 | |
| Femtotip II, sterile injection capillary | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5242957000 | |
| InjectMan 4 micromanipulator | Eppendorf, Hamburg, Germany | 5192000027 | |
| LED Portable Lamp | MR. DIY, Selangor, Malaysia | 9023251 | 20 mAh |
| PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips | Ted Pella, California, USA | 5367-12NM | |
| Shanda aquarium heater | Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia | SDH-228 | |
| Thermometer | Sera Precision, Heinsberg, Germany | 52525 | |
| Video camera | Nikon, Tokyo, Japan | D3100 |
References
- Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
- Maserejian, N., Vinikoor-Imler, L., Dilley, L. Estimation of the 2020 global population of Parkinson's Disease (PD). Movement Disorder Council. 35 (1), 198 (2020).
- Hirsch, L., Jette, N., Frolkis, A., Steeves, T., Pringsheim, T. The Incidence of Parkinson's Disease: A Systematic Review and Meta-Analysis. Neuroepidemiology. 46 (4), 292-300 (2016).
- Przedborski, S. The two-century journey of Parkinson disease research. Nature Review Neuroscience. 18 (4), 251-259 (2017).
- Cookson, M. R. Disease-Modifying Targets in Neurodegenerative Disorders. , Academic Press. Ch. 6 157-174 (2017).
- Jamebozorgi, K., et al. Cellular and molecular aspects of Parkinson treatment: Future therapeutic perspectives. Molecular Neurobiology. 56 (7), 1-13 (2018).
- Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. The future of stem cell therapies for Parkinson disease. Nature Review Neuroscience. 21 (1), 1-13 (2020).
- Foltynie, T. Can Parkinson's disease be cured by stimulating neurogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 978-980 (2015).
- Winner, B., Winkler, J.
- Huang, C., et al. Nerve guidance conduits from aligned nanofibers: improvement of nerve regeneration through longitudinal nanogrooves on a fiber surface. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (13), 7189-7196 (2015).
- Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
- Dietz, V., Schwab, M. E. From the rodent spinal cord injury model to human application: promises and challenges. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1826-1830 (2017).
- La Rosa, C., Bonfanti, L. Brain plasticity in mammals: An example for the role of comparative medicine in the neurosciences. Frontiers in Veterinary Science. 5 (274), 1-8 (2018).
- Ferretti, P., Prasongchean, W. Neural Stem Cells in Development, Adulthood and Disease. , Springer. 1-21 (2015).
- Vijayanathan, Y., et al. Adult endogenous dopaminergic neuroregeneration against Parkinson's Disease: Ideal animal models. Neurotoxicity Research. 39 (2), 504-532 (2021).
- Vaz, R. L., Outeiro, T. F., Ferreira, J. J. Zebrafish as an animal model for drug discovery in Parkinson's disease and other movement disorders: a systematic review. Frontier Neuroscience. 9, 347 (2018).
- Nie, S., et al. Small molecule TrkB agonist deoxygedunin protects nigrostriatal dopaminergic neurons from 6-OHDA and MPTP induced neurotoxicity in rodents. Neuropharmacology. 99, 448-458 (2015).
- Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Research. 318 (1), 215-224 (2004).
- Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T.
- Anichtchik, O. V., Kaslin, J., Peitsaro, N., Scheinin, M., Panula, P. Neurochemical and behavioural changes in zebrafish Danio rerio after systemic administration of 6-hydroxydopamine and 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Journal of Neurochemistry. 88 (2), 443-453 (2004).
- Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. d Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
- Vijayanathan, Y., et al. 6-OHDA-lesioned adult zebrafish as a useful Parkinson's disease model for dopaminergic neuroregeneration. Neurotoxicity Research. 32 (3), 496-508 (2017).
- Caldwell, L. J., et al. Regeneration of dopaminergic neurons in adult zebrafish depends on immune system activation and differs for distinct populations. Journal of Neuroscience. 39 (24), 4694-4713 (2019).
- Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. Journal of Comparative Neurology. 488 (3), 290-319 (2005).
- Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture Research. 269 (1-4), 1-20 (2007).
- Reed, B., Jennings, M. Guidance on the Housing and Care of Zebrafish Danio rerio. Royal Society for the Prevention of Cruelty to Animals (RSPCA). , 7-53 (2011).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Altenhofen, S., et al. Tebuconazole alters morphological, behavioral and neurochemical parameters in larvae and adult zebrafish (Danio rerio). Chemosphere. 180, 483-490 (2017).
- Bridi, D., Altenhofen, S., Gonzalez, J. B., Reolon, G. K., Bonan, C. D. Glyphosate and Roundup alter morphology and behavior in zebrafish. Toxicology. 392, 32-39 (2017).
- Wright, D., Krause, J. Repeated measures of shoaling tendency in zebrafish (Danio rerio) and other small teleost fishes. Nature Protocols. 1 (4), 1828-1831 (2006).
- Pienaar, I. S., Götz, J., Feany, M. B. Parkinson's disease: insights from non-traditional model organisms. Progress in Neurobiology. 92 (4), 558-571 (2010).
- Becker, T., Becker, C. G.
- Collymore, C., Tolwani, A., Lieggi, C., Rasmussen, S. Efficacy and safety of 5 anesthetics in adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (2), 198-203 (2014).
- Katz, E. M., et al. The stability and efficacy of tricaine methanesulfonate (MS222) solution after long-term storage. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (4), 393-400 (2020).
- Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J. E. Development of a unilaterally-lesioned 6-OHDA mouse model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3234 (2012).
- Neiffer, D. L., Stamper, M. A. Fish sedation, analgesia, anesthesia, and euthanasia: considerations, methods, and types of drugs. Institute for Laboratory Animal Research. 50 (4), 343-360 (2009).
- Barbosa Júnior, A., et al. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. 66, Springer. 323-330 (2012).
- Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F.
- Stewart, A., et al. Modeling anxiety using adult zebrafish: a conceptual review. Neuropharmacology. 62 (1), 135-143 (2012).
- Sykes, D. J., Suriyampola, P. S., Martins, E. P. Recent experience impacts social behavior in a novel context by adult zebrafish (Danio rerio). PLOS ONE. 13 (10), 0204994 (2018).
- Collymore, C., Tolwani, R. J., Rasmussen, S. The behavioral effects of single housing and environmental enrichment on adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (3), 280-285 (2015).
- Grossman, L., et al. Characterization of behavioral and endocrine effects of LSD on zebrafish. Behavioural Brain Research. 214 (2), 277-284 (2010).
- Stewart, A., et al. Homebase behavior of zebrafish in novelty-based paradigms. Behavioural Processes. 85 (2), 198-203 (2010).
- Abozaid, A., Tsang, B., Gerlai, R. The effects of small but abrupt change in temperature on the behavior of larval zebrafish. Physiology and Behavior. 227, 113169 (2020).
- Sekhar, M., Singh, R., Bhat, A., Jain, M. Feeding in murky waters: acclimatization and landmarks improve foraging efficiency of zebrafish (Danio rerio) in turbid waters. Biology Letters. 15 (7), 1-5 (2019).
- Valcarce, D. G., Martínez-Vázquez, J. M., Riesco, M. F., Robles, V. Probiotics reduce anxiety-related behavior in zebrafish. Heliyon. 6 (5), 03973 (2020).
- Tunbak, H., Vazquez-Prada, M., Ryan, T. M., Kampff, A. R., Dreosti, E. Whole-brain mapping of socially isolated zebrafish reveals that lonely fish are not loners. eLife. 9, 55863 (2020).
- Shams, S., Seguin, D., Facciol, A., Chatterjee, D., Gerlai, R. Effect of social isolation on anxiety-related behaviors, cortisol, and monoamines in adult zebrafish. Behavioral Neuroscience. 131 (6), 492-504 (2017).
- Burghardt, G. M., et al. Perspectives - Minimizing observer bias in behavioral studies: A review and recommendations. Ethology. 118 (6), 511-517 (2012).
- Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
- Franco-Restrepo, J. E., Forero, D. A., Vargas, R. A. A review of freely available, open-source software for the automated analysis of the behavior of adult zebrafish. Zebrafish. 16 (3), 223-232 (2019).
- Beal, M. F. Parkinson's disease: a model dilemma. Nature. 466 (7310), 8-10 (2010).
- Jha, U., Thirumalai, V. Neuromodulatory selection of motor neuron recruitment patterns in a visuomotor behavior increases speed. Current Biology. 30 (5), 788-801 (2020).
- Reimer, M. M., et al. Dopamine from the brain promotes spinal motor neuron generation during development and adult regeneration. Developmental Cell. 25 (5), 478-491 (2013).
