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Neuroscience

Evaluación locomotora del modelo de enfermedad de Parkinson basado en pez cebra adulto inducido por 6-hidroxidopamina

Published: December 28, 2021 doi: 10.3791/63355
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1, 1, 2, 1
1Collaborative Drug Discovery Research (CDDR) Group and Brain Degeneration and Therapeutics Group, Faculty of Pharmacy, Universiti Teknologi MARA (UiTM), Cawangan Selangor, Kampus Puncak Alam, 2Department of Medicine, Faculty of Medicine, Universiti Malaya

Summary

El presente protocolo describe la inyección intraerebroventricular (ICV) de pez cebra adulto con 6-hidroxidopamina neurotóxica (6-OHDA) en el diencéfalo ventral (Dn) y la evaluación del deterioro y posterior recuperación del comportamiento de natación postlesión mediante el uso de la prueba de tanque abierto, que se acompaña de análisis utilizando un software de seguimiento de video.

Abstract

Las limitaciones de los tratamientos actuales para retrasar la pérdida neuronal dopaminérgica en la enfermedad de Parkinson (EP) plantean la necesidad de terapias alternativas que puedan restaurar estas neuronas. Mucho esfuerzo se dirige actualmente hacia una mejor comprensión de la neurorregeneración utilizando modelos preclínicos in vivo . Esta capacidad regenerativa para la autorreparación es, sin embargo, ineficiente en los mamíferos. Los animales no mamíferos como el pez cebra han surgido como un excelente modelo neurorregenerativo debido a su capacidad para autorrenovarse continuamente y tener una homología cerebral cercana a los humanos. Como parte del esfuerzo para dilucidar los eventos celulares involucrados en la neuroregeneración in vivo, hemos establecido el modelo de EP basado en pez cebra adulto inducido por 6-hidroxidopamina (6-OHDA). Esto se logró a través de la microinyección intracerebroventricular (ICV) optimizada de 99.96 mM 6-OHDA para extirpar específicamente las neuronas dopaminérgicas (DpN) en el diencéfalo ventral (Dn) del cerebro del pez cebra. La inmunofluorescencia indicó más del 85% de la ablación de DpN en el tercer día después de la eclosión y la restauración completa de DpN en el sitio lesionado 30 días después de la agresión. El presente estudio determinó el deterioro y posterior recuperación del comportamiento de natación del pez cebra tras la lesión mediante el uso de la prueba de campo abierto a través de la cual se cuantificaron dos parámetros, la distancia recorrida (cm) y la velocidad media (cm/s). La locomoción se evaluó analizando las grabaciones de peces individuales de cada grupo (n = 6) utilizando un software de seguimiento de video. Los hallazgos mostraron una reducción significativa (p < 0,0001) en la velocidad (cm / s) y la distancia recorrida (cm) del pez cebra lesionado 3 días después de la muerte en comparación con la farsa. El pez cebra lesionado exhibió una recuperación completa del comportamiento de natación 30 días después de la recesión. Los presentes hallazgos sugieren que el pez cebra adulto lesionado 6-OHDA es un excelente modelo con calidad reproducible para facilitar el estudio de la neurorregeneración en la EP. Los estudios futuros sobre los mecanismos subyacentes a la neurorregeneración, así como los factores intrínsecos y extrínsecos que modulan el proceso pueden proporcionar información importante sobre las nuevas estrategias de tratamiento de reemplazo celular contra la EP.

Introduction

La enfermedad de Parkinson (EP), una enfermedad caracterizada distintivamente por rigidez muscular, temblor en reposo y bradicinesia, es la enfermedad neurológica de más rápido crecimiento en el mundo1,2. El riesgo y la prevalencia de EP aumentan rápidamente con la edad, especialmente en individuos de 50 años o más3. La etiología y la patogénesis de la EP hasta ahora siguen siendo poco conocidas. Esto a menudo ha dejado el inicio temprano de la EP sin diagnosticar. En la actualidad, la falta de dopamina y la pérdida de neuronas dopaminérgicas (DpN) en pacientes con EP están fuertemente ligadas a la manifestación de síntomas motores4. Aprovechando esta relación, se han diseñado varios tratamientos para actuar directamente como reemplazo de dopamina (es decir, levodopa) o para compensar la pérdida de DpN (es decir, estimulación cerebral profunda). Aunque estos tratamientos producen beneficios sintomáticos, no modifican el curso deteriorado de la enfermedad5. En vista de esta debilidad significativa, se ha propuesto la terapia de reemplazo celular. Sin embargo, la eficacia de este enfoque es inconsistente dados los desafíos de la preparación del injerto, el control del crecimiento celular y la inestabilidad del fenotipo. La terapia de reemplazo celular, que había planteado preocupaciones éticas, también plantea el riesgo de inducir tumores cerebrales y reacciones inmunes no deseadas6,7.

Las limitaciones de las estrategias terapéuticas actuales han llevado a un mayor énfasis en la regeneración de DpN como un enfoque potencial en el tratamiento de la EP. La regeneración de DpN o neuroregeneración se ha convertido en uno de los avances prometedores en el manejo de la EP, no solo debido a su potencial como nuevo método terapéutico sino también como medio para comprender el mecanismo de la enfermedad8, 9. Este enfoque se centra en la restauración de la función neuronal a través de la diferenciación, la migración y la integración de las células progenitoras existentes en los circuitos lesionados10. Con el fin de explorar más a fondo la neurorregeneración, se han llevado a cabo varios estudios in vivo. Se encontró que vertebrados como mamíferos, anfibios y reptiles generan nuevas células cerebrales después de una lesión11,12. Entre los vertebrados, los animales mamíferos son más buscados dado su parecido genético con los seres humanos. Los mamíferos, sin embargo, exhiben una capacidad reparadora limitada y pobre en el sistema nervioso central (SNC) que puede durar hasta la edad adulta después de una lesión cerebral13. En general, los mamíferos no son adecuados como modelos animales para comprender la neurorregeneración, dado que el bajo número de neuronas producidas no será suficiente para restaurar los circuitos neuronales dañados observados en la EP. Como tal, el modelo basado en teleósteos, específicamente en el pez cebra, es muy favorecido por su alta tasa proliferativa, capacidad de autorrenovación continua y estrecha homología cerebral con humanos14,15.

El pez cebra se usa más comúnmente para estudiar el movimiento desordenado en PD16. El modelo de EP basado en pez cebra generalmente es inducido por neurotoxinas, que incluyen 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) y 6-hidroxidopamina (6-OHDA)17. Aunque son efectivos para inducir la pérdida específica de DpN y la disminución de los niveles de dopamina, los modelos basados en MPTP no imitan de cerca las condiciones de la EP, ya que la pérdida de DpN no se limita únicamente al SNC18. La incapacidad del 6-OHDA para atravesar la barrera hematoencefálica restringió sus efectos sobre los cambios celulares y funcionales dentro del cerebro cuando se administra intracranealmente en lugar de intramuscular19. La administración periférica de 6-OHDA provocó una reducción global de los niveles de dopamina en todo el sistema nervioso20. Mientras que la administración de 6-OHDA en el líquido cefalorraquídeo causó la ablación de DpN en todo el SNC21, que no imita la condición como se ve en la EP por la cual la pérdida de DpN ocurre específicamente en la sustancia negra del cerebro humano. La administración de ICV de 6-OHDA, por el contrario, indujo específicamente una ablación significativa de DpN en el área de Dn ventral en el cerebro del pez cebra, que se parecía mucho a la sustancia negra22. Curiosamente, la recuperación de DpN se reportó 30 días después de la lesión inducida por 6-OHDA y estas neuronas sobrevivieron a lo largo de la vida23,24. La recuperación funcional de DpN se demostró a través de una evaluación locomotora de la distancia recorrida (cm) y la velocidad media (cm/s) utilizando el modelo PD adulto basado en pez cebra inducido por 6-OHDA22.

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Protocol

El presente estudio ha sido aprobado por el Comité de Investigación y Ética Animal (CARE), Universiti Technologi MARA (UiTM) [Referencia No: UiTM CARE 346/2021, de fecha 7 de mayo de 2021].

NOTA: Se utilizaron los protocolos publicados22,25,26 para la cría y el mantenimiento estándar del modelo de DP de pez cebra adulto con lesiones 6-OHDA. Se realizaron experimentos con peces cebra machos adultos (Danio rerio) de más de cinco meses de edad con una longitud estandarizada de 3.2-3.7 cm.

1. Mantenimiento del pez cebra y preparaciones de microinyección pre-ICV

  1. Mantenga a los peces en un tanque de agua aireada a una temperatura controlada de 28 ± 1.0 ° C. Para la cría y el mantenimiento del pez cebra, utilice agua destilada mineralizada con sal marina comercial (1 g/L) durante todo el experimento27.
  2. Alberga un máximo de 25 peces por tanque de 45 L o un pez por cada 1.8 L de agua y expóndelos a un horario de 14 h de luz y 10 h de fotoperiodo oscuro. Alimente a los peces al menos dos veces al día con gránulos de alimentos complementados con gusanos liofilizados.
  3. Preparar una solución madre concentrada de metanosulfonato de tricaína (MS-222) disolviendo 2,5 g de MS-222 y 5 g de bicarbonato de sodio en 250 ml de agua destilada. Diluya 2 ml de solución madre para producir 200 ml de solución de anestesia de trabajo.
  4. Preparar 99.96 mM de 6-OHDA disolviendo primero 0.2 mg de ácido ascórbico en 1 mL de NaCl filtrado estéril al 0.9% p/v. Filtre la solución con un filtro de 0,2 micras antes de agregar 25 mg de 6-OHDA en forma de polvo a la solución. Prepare la solución fresca antes de cada inyección y guárdela en la oscuridad a 4 °C.
    PRECAUCIÓN: Use el equipo de protección personal apropiado (es decir, guantes, bata de laboratorio y máscara facial) y practique buenas prácticas de laboratorio al manipular los productos químicos. Todos los manejos de los productos químicos deben hacerse dentro de un gabinete de bioseguridad.

2. Anestesia e inyección ICV de pez cebra

  1. Ayunar el pescado durante 24 h para evitar la regurgitación durante la anestesia. Anestesiar el pescado sumergiéndolo en un recipiente que contenga 0,01% p/v de solución de MS-222 durante aproximadamente 1 min o hasta que cese todo movimiento muscular visible.
  2. Coloque el pez anestesiado en una esponja empapada en agua colocada debajo de un estereomicroscopio y humedezca el pez regularmente.
  3. Identifique la posición para la inyección en función de la intersección entre la sutura metópica (EM), la sutura coronal (CS) y la sutura sagital (SS) que conecta el cráneo frontal y parietal del cerebro del pez cebra.
  4. Haga un pequeño orificio de área de 1.0 mm2 usando una aguja afilada de 27 G en el cráneo guiada por la posición anatómica específica en el cráneo del pez cebra (Figura 1A, B).
  5. Baje el inyector microcapilar en un ángulo de 60° hasta que alcance una profundidad de 1.200 μm desde el techo craneal del cráneo del pez cebra (Figura 1C). Presione el límite Z para fijar la posición.
  6. Ajuste la presión de inyección inicial a 4000 hPa y la presión de compensación a 10 hPa. Establezca la duración de la inyección en 0,3 s. Reduzca la intensidad de la inyección con cada inyección posterior.
  7. Inyecte 0,5 μL de neurotoxina 6-OHDA de 99,96 mM (o solución salina al 0,9% p/v para el grupo de control simulado) y deje reposar el microcapilar durante 20 s. Continúe humedeciendo el pescado con agua destilada durante todo el proceso de inyección para evitar que se seque.
  8. Retire lentamente el microcapilar y resucite los peces con agua destilada corriente. Coloque a los peces en un tanque de recuperación aislado y elimine cualquier distracción que pueda perturbar el proceso de recuperación.
  9. Enjuague el microcapilar antes de la siguiente inyección para eliminar la obstrucción y asegúrese de que la intensidad de la inyección sea suficiente para producir el volumen deseado de 0,5 μL de 6-OHDA.

Figure 1
Figura 1: Sitio de inyección de neurotoxina, 6-OHDA. (A) El punto de entrada microcapilar está guiado por la intersección entre la sutura metópica (EM), la sutura coronal (CS) y la sutura sagital (SS) que conecta el cráneo frontal y parietal del cerebro del pez cebra (vista de plan). (B) Un dibujo esquemático (vista de plano) del cráneo y el cerebro del pez cebra muestra el microcapilar, que se baja directamente sobre la habénula (Hab), y su punto de entrada en la intersección entre hemisferios. (C) Un dibujo esquemático (sección sagital) del cerebro del pez cebra muestra el ángulo de inyección y la profundidad de penetración. El punto negro representa el sitio lesionado que se encuentra por encima del área objetivo, el diencéfalo ventral. Abreviaturas: 6-OHDA: 6-hidroxidopamina, CS: sutura coronal, Dn: diencéfalo, Hab: habénula, Hyp: hipotálamo, MS: sutura metópica, OB: bulbo olfatorio, POA: área preóptica, PT: tuberculum posterior, SS: sutura sagital, Tec: tectum y Tel: tel: telencéfalo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

3. Evaluación locomotora

NOTA: La evaluación locomotora del pez cebra (n = seis / grupo; simulada vs lesionada) se evaluó individualmente a través de la prueba de tanque abierto utilizando protocolos establecidos28,29 en el día tres y el día 30 después de la lesión 6-OHDA.

  1. Grabación de vídeo
    1. Coloque el tanque experimental (largo 20 cm, ancho 11.5 cm, altura 13 cm) con sus paredes cubiertas con papel blanco en una plataforma elevada (Figura 2A).
    2. Ilumine el tanque desde el fondo usando una fuente de luz. Llene el tanque con agua destilada (80% -90% lleno) y mantenga la temperatura a 28 ± 1.0 ° C. Mida la temperatura con un termómetro y regule con un calentador de acuario comercial.
    3. Después de un mínimo de 2 minutos de aclimatación, registre el comportamiento de natación de los peces desde una vista de plano en el plano bidimensional (2D) de la arena experimental utilizando una cámara de video durante 5 minutos (Figura 2B). Para evitar inconsistencias en el comportamiento de natación del lote anterior y el último de grabaciones, no exceda la aclimatación por 10 min30.
    4. Analizar los vídeos utilizando un software de seguimiento de vídeo con el protocolo de tanque abierto para la adquisición de la distancia recorrida (cm) y la velocidad media (cm/s) de cada sujeto.

Figure 2
Figura 2: Configuración experimental de una prueba de tanque abierto para la evaluación del comportamiento locomotor del pez cebra. (A) El tanque experimental (vista frontal) se coloca en una plataforma elevada que se ilumina desde abajo. Las cuatro paredes del tanque están cubiertas con papel blanco y las grabaciones se capturan axialmente. La temperatura se mide con un termómetro y se regula a 28 ± 1.0 ° C utilizando un calentador de acuario comercial. (B) Captura de pantalla (vista de plan) de la grabación de video que se captura utilizando la configuración. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

  1. Análisis de datos
    1. Haga doble clic en el icono para abrir el software de seguimiento de video. Haga clic en la pestaña Archivo y seleccione Crear nuevo experimento vacío. Esto permitirá al usuario personalizar los parámetros del experimento de acuerdo con los objetivos de la investigación.
    2. Haga clic en la pestaña Protocolo , seleccione Fuentes de video y haga clic en Agregar nueva fuente de video. Haga clic en la lista desplegable disponible y seleccione la opción Archivo de video . Esto mostrará la ventana emergente de navegación de archivos desde la que se pueden seleccionar las grabaciones de video de interés.
    3. Haga clic en la subpestaña Aparato y seleccione el icono Rectangular para configurar el aparato. Arrastre el icono rectangular para cubrir toda la arena experimental. Establezca la barra de escala en consecuencia e introduzca el valor numérico de la medida de escala utilizada en la longitud de la sección de regla. El presente experimento utilizó una escala de 10 mm para la prueba de tanque abierto.
    4. Establezca el color del animal seleccionando Los animales son más oscuros que el fondo del aparato. Deje las otras opciones disponibles en Seguimiento a la configuración predeterminada preestablecida.
    5. En la subpestaña Zonas , haga clic en el aparato dibujado anteriormente. Esta zona se establece como la zona estándar de la que la posición es la misma para todas las pruebas.
    6. Seleccione las siguientes opciones en Programación de pruebas e informe de datos de prueba: Duración de la prueba, Distancia total recorrida y Velocidad promedio. Otras pruebas disponibles en la lista son opcionales y dependen del interés investigativo del investigador.
    7. En la pestaña Experimento , asigne los animales de acuerdo con su grupo de prueba escribiendo el nombre del grupo en la sección Nombre y el número de animales por grupo en la sección Número de animales .
    8. Cambie a la pestaña Pruebas para ejecutar el experimento. Haga clic en el icono Iniciar prueba y espere hasta que se analicen todos los videos.
    9. En la pestaña Resultados , haga clic en el icono Ver el informe para ver los datos locomotores en forma de informe de texto.

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Representative Results

El presente experimento evaluó los cambios en el comportamiento de natación del pez cebra adulto después de la microinyección de ICV con 6-OHDA. La razón para utilizar 6-OHDA como neurotoxina de elección se debió a su incapacidad para cruzar la barrera hematoencefálica, lo que produjo una ablación específica y dirigida de DpN en el área de interés-diencéfalo ventral (Dn)16. La subpoblación dpn aquí tiene semejanza anatómica con la subpoblación DpN en la sustancia negra pars compacta del ser humano31.

Según nuestro trabajo anterior22, el efecto celular de la microinyección de 6-OHDA ICV contra DpN de peces cebra adultos se confirmó a través de la inmunohistostaining del marcador DpN-tirosina hidroxilasa (TH). La principal región cerebral de interés fue la Dn, formada por el área preóptica (POA), el tubérculo posterior (PT) y el hipotálamo (Hyp). Se encontró que 99.96 mM 6-OHDA resultó en una tasa de supervivencia del 100% del pez cebra adulto con el menor número de TH-inmunorreactivos (TH-ir) en Dn. También se encontró que más del 85% (p < 0,01) de TH-ir DpN en el Dn fue ablacionado en el tercer día después de la eclosión. El número de DpN TH-ir aumentó en más del 50% en el día 14 después de la eclosión antes de lograr la regeneración completa 30 días después de la eclosión (Figura 3). Estos datos respaldan las capacidades regenerativas de la subpoblación de DpN en Dn de peces cebra adultos después de la ablación32.

Figure 3
Figura 3: Regeneración de DpN en la región Dn del pez cebra lesionado por 99.96 mM 6-OHDA. (A) El número de DpN TH-ir en tres áreas principales de la región Dn, POA, PT e Hyp, en cuatro puntos de datos: sham, 3, 14 y 30 días después de la lesión por 99.96 mM 6-OHDA neurotoxina. Cada barra representa la media ± SD de n = 6 experimentos independientes; *p < 0,05. (B) Imágenes representativas de microscopio confocal del cerebro de pez cebra seccionado sagitalmente de simulación (I, I', e I''), 3 días después de la lesión (II, II', y II''), 14 días después de la lesión (III, III', y III''), y 30 días después de la lesión (IV, IV', y IV'') teñidas con TH (DpN; verde) y DAPI (núcleos; azul). Barra de escala = 50 μm. Abreviaturas- DAPI: 4′, 6-diamidino-2-fenilindol, 6-OHDA: 6-hidroxidopamina, Dn: diencéfalo, DpN: neuronas dopaminérgicas, Hyp: hipotálamo, POA: área preóptica, PT: tubérculo posterior, SD: desviación estándar, y TH-ir: tirosina hidroxilasa inmunorreactiva. Adaptado de Vijayanathan et al.22. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Luego realizamos una evaluación locomotora utilizando la prueba de tanque abierto para investigar los cambios en la distancia recorrida (cm) y la velocidad media (cm / s) del pez cebra adulto después de la microinyección de ICV de 6-OHDA y sham. Los peces experimentales se evaluaron en el tercer día después de la postlesión (menor número de DpN TH-ir observados) y el día 30 después de la postlesión (DpN completamente restaurado reportado en el sitio de la lesión). El análisis del comportamiento de natación del pez cebra utilizando un software de seguimiento de video indicó que tanto la velocidad media (cm / s) como la distancia recorrida (cm) del grupo lesionado en el tercer día de postlesión se redujeron significativamente (p < 0.001) a <45% en comparación con la simulación (Figura 4). El grupo lesionado mostró recuperación de la función motora 30 días después de la suspensión sin diferencias significativas tanto en la velocidad media (cm/s) como en la distancia recorrida (cm) en comparación con la simulación.

Figure 4
Figura 4: Cambios en el comportamiento de natación después de la inyección intraerebroventricular por 6-OHDA. El comportamiento de natación del pez cebra adulto se evaluó antes de la lesión, en el día tres y el día 30 después de la eclosión por 99.96 mM 6-OHDA. Los parámetros que se evaluaron incluyeron: (A) velocidad media (cm/s) y (B) distancia recorrida (cm). Cada barra representa la media ± SD de seis peces; p < 0,0001 (Prueba t de Student). Abreviaturas: 6-OHDA: 6-hidroxidopamina, SD: desviación estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El presente trabajo demostró con éxito la evaluación locomotora del modelo de EP adulto basado en pez cebra adulto inducido por 6-OHDA. Todo el experimento involucró tres pasos principales: preparaciones de microinyección pre-ICV, microinyección ICV de pez cebra y evaluación locomotora. Para garantizar la recuperación saludable del pez cebra adulto después del procedimiento de microinyección de ICV y un buen resultado experimental, se han recomendado algunas buenas prácticas para cada paso en el presente estudio.

Preparación de microinyección pre-ICV: La selección de animales se realizó mejor el día antes del experimento. Se identificó el género y se midió la longitud del pez. Los machos adultos de pez cebra con una longitud estandarizada de 3.2-3.7 cm se colocaron en un tanque experimental separado. Además, los peces deben someterse a un período de ayuno de 24 h para evitar la regurgitación durante la anestesia33. Una pecera (con sus cuatro paredes cubiertas con papel blanco) con un tanque de agua estancada debe prepararse antes del experimento para disminuir el estrés exterior y ayudar al proceso de recuperación del pez cebra. Todos los productos químicos se prepararon frescos antes del inicio de cada experimento, ya que podrían deteriorarse rápidamente con el tiempo y volverse inestables a temperatura ambiente34,35.

Microinyección de 6-OHDA: Se debe realizar un manejo limpio y suave del pez cebra durante todo el proceso para evitar la introducción de lesiones e infecciones innecesarias en los peces. El pescado debe colocarse encima de una esponja húmeda y mantenerse en condiciones húmedas para evitar que se seque36. Se realizó una pequeña incisión con una aguja estéril con la fuerza firme y adecuada para evitar una presión adicional que pueda agrietar el cráneo del pez cebra. Esta incisión debe permitir la entrada del microcapilar en la cavidad cerebral. El microcapilar se bajó hasta una profundidad de 1.200 μm desde el punto de entrada, que se encuentra entre dos hemisferios: el telencéfalo y el tectum (Figura 1B, C). Se eligió el punto de entrada entre estos hemisferios para evitar cualquier laceración adicional de las neuronas37. Esta técnica implicó el uso de un microinyector, la presión y el momento de la entrega deben calibrarse para garantizar la entrega de 0,5 μL de neurotoxina. Esta calibración se puede realizar midiendo el tamaño de la gota formada en el papel de filtro38. Nuestra práctica generalmente implicaba la siguiente configuración de parámetros programables mediante los cuales la intensidad de la inyección se reducía con cada inyección posterior (presión de inyección: 4000 hPa, duración de la inyección: 0,3 s y presión de compensación: 10 hPa). Para evitar que la neurotoxina se filtrara fuera de la cavidad cerebral, se aplicó un intervalo de 20 s entre la inyección y la retirada del microcapilar35. Debido al pequeño tamaño del capilar, el microcapilar puede bloquearse después de cada inyección. Como tal, el microcapilar debe ser esencialmente lavado antes de la siguiente inyección para eliminar el bloqueo y garantizar que la intensidad de la inyección sea suficiente para producir el volumen deseado de 0,5 μL de 6-OHDA. Los peces serían transferidos a un tanque de recuperación mantenido a 28 ± 1.0 ° C. Si el pez no se recupera dentro de los 30 s, enjuague sus branquias y boca con agua destilada hasta que se produzca la recuperación completa de los movimientos musculares.

Evaluación locomotora: Para garantizar una buena evaluación locomotora en el pez cebra adulto inducido por 6-OHDA, el estudio de comportamiento debe realizarse dentro del mismo marco de tiempo para cada punto de tiempo. Cada estudio conductual debe permitir un período de aclimatación mínimo de 2 minutos y debe realizarse dentro de las 4 h39. El presente experimento se llevó a cabo en la madrugada entre las 8 de la mañana y las 12 de la noche, ya que el pez cebra fue más activo durante este período40. Es necesario un período de aclimatación más largo si el pez cebra muestra algún comportamiento anormal con signos claros de estrés y ansiedad (congelación y comportamiento errático)41. Sin embargo, para evitar inconsistencias en el comportamiento de natación del primer y último lote de grabaciones, la aclimatación no debe exceder los 10 min30. Para la prueba de campo abierto, se podría usar un tanque experimental de cualquier tamaño, color, forma y textura para grabaciones que van desde un mínimo de 5 a 30 min42,43. El comportamiento del pez cebra está muy influenciado por la temperatura de su entorno. Pequeñas fluctuaciones de más de 4 °C podrían afectar en gran medida a la velocidad de natación44. Por lo tanto, la temperatura del agua en el tanque experimental debe mantenerse estrictamente bajo una temperatura controlada de 28 ± 1.0 ° C utilizando un calentador comercial, y el nivel de agua se mantuvo alrededor de 12 cm de profundidad durante todo el experimento. Las paredes del tanque se cubrieron con papel blanco para crear contraste entre el sujeto de prueba y la arena experimental, así como para reducir los estímulos externos que pueden causar una reacción no solicitada de los sujetos de prueba45. Los peces de cada grupo fueron probados individualmente de acuerdo con la práctica estándar actual para la investigación neuroconductual del pez cebra23,37,46. Dada la propensión del pez cebra a las interacciones sociales, existe la preocupación de que el aislamiento durante el período de prueba pueda afectar su comportamiento47. Sin embargo, la configuración experimental actual se limitó a un máximo de 10 min por ensayo y se encontró que este corto período de aislamiento no tenía ningún efecto sobre la actividad locomotora del pez cebra adulto48. Con el fin de proporcionar una recolección precisa de datos para el estudio conductual, la evaluación se realizó seleccionando aleatoriamente el pez cebra de diferentes grupos experimentales (es decir, alternando dos peces cebra del grupo de lesiones simuladas y 6-OHDA hasta n = 6) durante la prueba de tanque abierto49. Los videos grabados se analizaron utilizando un sistema de seguimiento de video que se usa comúnmente para el seguimiento del comportamiento de los roedores. Como el pez cebra es un modelo animal emergente, las pruebas de comportamiento realizadas con pez cebra generalmente se adaptan de la literatura científica establecida sobre roedores50. Aquí, demostramos la capacidad del software de seguimiento de video para rastrear automáticamente el pez cebra en el ámbito experimental y calcular efectivamente los parámetros deseados. El software de seguimiento de video se destacó del otro software disponible debido a la variedad de archivos de video compatibles con el software, las versiones regulares de paquetes de actualización y el soporte proporcionado para diferentes sistemas operativos51.

Una de las limitaciones de los modelos de EP basados en animales existentes es la falta de similitudes mecanicistas que imiten el deterioro motor observado después de la pérdida neuronal dopaminérgica en la sustancia negra pars compacta del cerebro humano52. Sin embargo, la aparición del modelo de EP basado en el pez cebra adulto puede abordar esta limitación particular. Como se observó en el presente estudio, la velocidad de natación reducida correspondió a nuestros hallazgos celulares previos, por lo que más del 85% de pérdida neuronal dopaminérgica en el diencéfalo ventral del modelo de pez cebra adulto inducido por 6-OHDA tres días después de la lesión22. Parece que se requiere una ablación específica de las neuronas dopaminérgicas en esta área de interés para interrumpir la señalización motora descendente del cerebro, causando lentitud en el movimiento53. L. J. Caldwell, et al.23 que realizaron la inyección de ICV de 6-OHDA en el tectum óptico (punto de entrada), por ejemplo, observaron solo cambios en el comportamiento de aparcajo y apareamiento del pez cebra. La ablación de DpN en Dn ventral es crucial ya que la población de DpN en el Dn de pez cebra adulto actúa como la única fuente de dopamina para las neuronas motoras del pez cebra. Esto es análogo a la sustancia negra humana54. El presente estudio también observó una velocidad de natación más rápida y una distancia más larga recorrida por el pez cebra lesionado en puntos de tiempo posteriores a la posesión, lo que indica una restauración continua y, en última instancia, completa de la señalización de dopamina que gobierna el comportamiento de natación del pez cebra. Estos hallazgos validaron así la capacidad de las neuronas dopaminérgicas recién regeneradas para recuperar sus actividades funcionales en el pez cebra adulto lesionado.

La ruta de aplicación actual de 6-OHDA implicaba un paradigma de inyección ligeramente invasivo que requería la inserción de microcapilares profundos en el cerebro, hacia el área de la lesión de Dn ventral. Este método es ligeramente laborioso en comparación con la inyección periférica y debe realizarse dentro de los 3 minutos por pez para reducir el riesgo de mortalidad después de la inyección. Como tal, se requiere la práctica previa de la inyección de ICV para garantizar que el método se pueda realizar dentro de la duración crítica en el área objetivo (Dn). Para lograr una evaluación locomotora válida del pez cebra adulto, la prueba de tanque abierto se limita a solo 4 h de período de evaluación por día. Por lo tanto, se requiere una planificación previa en un marco experimental que involucra a un gran número de animales, por lo que se debe asignar tiempo adicional para garantizar que la configuración cumpla con los requisitos mínimos para cada registro (por ejemplo, temperatura y profundidad del agua). Esta planificación es especialmente crucial en experimentos basados en el tiempo, como el del estudio actual, ya que cada registro debe realizarse en el punto de tiempo previsto. La configuración experimental actual se limitó al estudio de dos parámetros de natación que evaluaron específicamente la función motora del pez cebra. Sin embargo, otros parámetros de comportamiento, como el cardumen y el comportamiento similar a la ansiedad, requirieron otras configuraciones experimentales y diferentes métodos analíticos. En resumen, este es un método reproducible y útil para estudiar el proceso de neurorregeneración de DpN en peces cebra adultos inducidos por 6-OHDA que pueden proporcionar información importante sobre las estrategias de tratamiento de reemplazo celular contra la EP.

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Disclosures

Los autores declaran que no hay conflictos de intereses.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por el Ministerio de Educación Superior de Malasia bajo el Programa de Becas de Investigación Fundamental [600-IRMI / FRGS 5/3 (033/2019)].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
6-Hydroxydopamine (6-OHDA) Sigma-Aldrich, Missouri, USA 162957
Ascorbic acid Thermo Fisher Scientific, California, USA FKC#A/8882/53
Disposable pasteur pipette, 3 mL Thermo Fisher Scientific, California, USA FB55348
Microcentrifuge tube, 0.2 mL Eppendorf, Hamburg, Germany 30124332
Nice conical flask, 100 mL Evergreen Engineering & Resources, Semenyih, Malaysia SumYau0200
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich, Missouri, USA P4417
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich, Missouri, USA S5761
Sodium chloride Merck, Darmstadt, Germany 106404
Stereomicroscope Nikon, Tokyo, Japan SMZ745
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich, Missouri, USA E10521
Equipment
ANY-maze software Stoelting Co., Illinois, USA - version 7.0; video tracking software
Cubis II Micro Lab Balance Sartorius, Göttingen, Germany SE 2
FemtoJet IV microinjector Eppendorf, Hamburg, Germany 5192000035
Femtotip II, sterile injection capillary Eppendorf, Hamburg, Germany 5242957000
InjectMan 4 micromanipulator Eppendorf, Hamburg, Germany 5192000027
LED Portable Lamp MR. DIY, Selangor, Malaysia 9023251 20 mAh
PELCO Pro Superalloy, offset, fine tips Ted Pella, California, USA 5367-12NM
Shanda aquarium heater Yek Fong Aquarium, Selangor, Malaysia SDH-228
Thermometer Sera Precision, Heinsberg, Germany 52525
Video camera Nikon, Tokyo, Japan D3100

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References

  1. Dorsey, E. R., et al. regional, and national burden of Parkinson's disease, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 17 (11), 939-953 (2018).
  2. Maserejian, N., Vinikoor-Imler, L., Dilley, L. Estimation of the 2020 global population of Parkinson's Disease (PD). Movement Disorder Council. 35 (1), 198 (2020).
  3. Hirsch, L., Jette, N., Frolkis, A., Steeves, T., Pringsheim, T. The Incidence of Parkinson's Disease: A Systematic Review and Meta-Analysis. Neuroepidemiology. 46 (4), 292-300 (2016).
  4. Przedborski, S. The two-century journey of Parkinson disease research. Nature Review Neuroscience. 18 (4), 251-259 (2017).
  5. Cookson, M. R. Disease-Modifying Targets in Neurodegenerative Disorders. , Academic Press. Ch. 6 157-174 (2017).
  6. Jamebozorgi, K., et al. Cellular and molecular aspects of Parkinson treatment: Future therapeutic perspectives. Molecular Neurobiology. 56 (7), 1-13 (2018).
  7. Parmar, M., Grealish, S., Henchcliffe, C. The future of stem cell therapies for Parkinson disease. Nature Review Neuroscience. 21 (1), 1-13 (2020).
  8. Foltynie, T. Can Parkinson's disease be cured by stimulating neurogenesis. Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 978-980 (2015).
  9. Winner, B., Winkler, J. Adult neurogenesis in neurodegenerative diseases. Cold Spring Harbour Perspect Biology. 7 (4), 021287 (2015).
  10. Huang, C., et al. Nerve guidance conduits from aligned nanofibers: improvement of nerve regeneration through longitudinal nanogrooves on a fiber surface. ACS Applied Materials & Interfaces. 7 (13), 7189-7196 (2015).
  11. Alunni, A., Bally-Cuif, L. A comparative view of regenerative neurogenesis in vertebrates. Development. 143 (5), 741-753 (2016).
  12. Dietz, V., Schwab, M. E. From the rodent spinal cord injury model to human application: promises and challenges. Journal of Neurotrauma. 34 (9), 1826-1830 (2017).
  13. La Rosa, C., Bonfanti, L. Brain plasticity in mammals: An example for the role of comparative medicine in the neurosciences. Frontiers in Veterinary Science. 5 (274), 1-8 (2018).
  14. Ferretti, P., Prasongchean, W. Neural Stem Cells in Development, Adulthood and Disease. , Springer. 1-21 (2015).
  15. Vijayanathan, Y., et al. Adult endogenous dopaminergic neuroregeneration against Parkinson's Disease: Ideal animal models. Neurotoxicity Research. 39 (2), 504-532 (2021).
  16. Vaz, R. L., Outeiro, T. F., Ferreira, J. J. Zebrafish as an animal model for drug discovery in Parkinson's disease and other movement disorders: a systematic review. Frontier Neuroscience. 9, 347 (2018).
  17. Nie, S., et al. Small molecule TrkB agonist deoxygedunin protects nigrostriatal dopaminergic neurons from 6-OHDA and MPTP induced neurotoxicity in rodents. Neuropharmacology. 99, 448-458 (2015).
  18. Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Research. 318 (1), 215-224 (2004).
  19. Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson's disease. Bioessays. 24 (4), 308-318 (2002).
  20. Anichtchik, O. V., Kaslin, J., Peitsaro, N., Scheinin, M., Panula, P. Neurochemical and behavioural changes in zebrafish Danio rerio after systemic administration of 6-hydroxydopamine and 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine. Journal of Neurochemistry. 88 (2), 443-453 (2004).
  21. Fiametti, L. O., Correa, C. N., Castro, L. M. d Peptide profile of zebrafish brain in a 6-OHDA-induced Parkinson model. Zebrafish. 18 (1), 55-65 (2021).
  22. Vijayanathan, Y., et al. 6-OHDA-lesioned adult zebrafish as a useful Parkinson's disease model for dopaminergic neuroregeneration. Neurotoxicity Research. 32 (3), 496-508 (2017).
  23. Caldwell, L. J., et al. Regeneration of dopaminergic neurons in adult zebrafish depends on immune system activation and differs for distinct populations. Journal of Neuroscience. 39 (24), 4694-4713 (2019).
  24. Zupanc, G. K., Hinsch, K., Gage, F. H. Proliferation, migration, neuronal differentiation, and long-term survival of new cells in the adult zebrafish brain. Journal of Comparative Neurology. 488 (3), 290-319 (2005).
  25. Lawrence, C. The husbandry of zebrafish (Danio rerio): a review. Aquaculture Research. 269 (1-4), 1-20 (2007).
  26. Reed, B., Jennings, M. Guidance on the Housing and Care of Zebrafish Danio rerio. Royal Society for the Prevention of Cruelty to Animals (RSPCA). , 7-53 (2011).
  27. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
  28. Altenhofen, S., et al. Tebuconazole alters morphological, behavioral and neurochemical parameters in larvae and adult zebrafish (Danio rerio). Chemosphere. 180, 483-490 (2017).
  29. Bridi, D., Altenhofen, S., Gonzalez, J. B., Reolon, G. K., Bonan, C. D. Glyphosate and Roundup alter morphology and behavior in zebrafish. Toxicology. 392, 32-39 (2017).
  30. Wright, D., Krause, J. Repeated measures of shoaling tendency in zebrafish (Danio rerio) and other small teleost fishes. Nature Protocols. 1 (4), 1828-1831 (2006).
  31. Pienaar, I. S., Götz, J., Feany, M. B. Parkinson's disease: insights from non-traditional model organisms. Progress in Neurobiology. 92 (4), 558-571 (2010).
  32. Becker, T., Becker, C. G. Axonal regeneration in zebrafish. Current Opinion in Neurobiology. 27, 186-191 (2014).
  33. Collymore, C., Tolwani, A., Lieggi, C., Rasmussen, S. Efficacy and safety of 5 anesthetics in adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (2), 198-203 (2014).
  34. Katz, E. M., et al. The stability and efficacy of tricaine methanesulfonate (MS222) solution after long-term storage. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 59 (4), 393-400 (2020).
  35. Thiele, S. L., Warre, R., Nash, J. E. Development of a unilaterally-lesioned 6-OHDA mouse model of Parkinson's disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3234 (2012).
  36. Neiffer, D. L., Stamper, M. A. Fish sedation, analgesia, anesthesia, and euthanasia: considerations, methods, and types of drugs. Institute for Laboratory Animal Research. 50 (4), 343-360 (2009).
  37. Barbosa Júnior, A., et al. Zebrafish Protocols for Neurobehavioral Research. 66, Springer. 323-330 (2012).
  38. Cocchiaro, J. L., Rawls, J. F. Microgavage of zebrafish larvae. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (72), e4434 (2013).
  39. Stewart, A., et al. Modeling anxiety using adult zebrafish: a conceptual review. Neuropharmacology. 62 (1), 135-143 (2012).
  40. Sykes, D. J., Suriyampola, P. S., Martins, E. P. Recent experience impacts social behavior in a novel context by adult zebrafish (Danio rerio). PLOS ONE. 13 (10), 0204994 (2018).
  41. Collymore, C., Tolwani, R. J., Rasmussen, S. The behavioral effects of single housing and environmental enrichment on adult zebrafish (Danio rerio). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (3), 280-285 (2015).
  42. Grossman, L., et al. Characterization of behavioral and endocrine effects of LSD on zebrafish. Behavioural Brain Research. 214 (2), 277-284 (2010).
  43. Stewart, A., et al. Homebase behavior of zebrafish in novelty-based paradigms. Behavioural Processes. 85 (2), 198-203 (2010).
  44. Abozaid, A., Tsang, B., Gerlai, R. The effects of small but abrupt change in temperature on the behavior of larval zebrafish. Physiology and Behavior. 227, 113169 (2020).
  45. Sekhar, M., Singh, R., Bhat, A., Jain, M. Feeding in murky waters: acclimatization and landmarks improve foraging efficiency of zebrafish (Danio rerio) in turbid waters. Biology Letters. 15 (7), 1-5 (2019).
  46. Valcarce, D. G., Martínez-Vázquez, J. M., Riesco, M. F., Robles, V. Probiotics reduce anxiety-related behavior in zebrafish. Heliyon. 6 (5), 03973 (2020).
  47. Tunbak, H., Vazquez-Prada, M., Ryan, T. M., Kampff, A. R., Dreosti, E. Whole-brain mapping of socially isolated zebrafish reveals that lonely fish are not loners. eLife. 9, 55863 (2020).
  48. Shams, S., Seguin, D., Facciol, A., Chatterjee, D., Gerlai, R. Effect of social isolation on anxiety-related behaviors, cortisol, and monoamines in adult zebrafish. Behavioral Neuroscience. 131 (6), 492-504 (2017).
  49. Burghardt, G. M., et al. Perspectives - Minimizing observer bias in behavioral studies: A review and recommendations. Ethology. 118 (6), 511-517 (2012).
  50. Kalueff, A. V., et al. Towards a comprehensive catalog of zebrafish behavior 1.0 and beyond. Zebrafish. 10 (1), 70-86 (2013).
  51. Franco-Restrepo, J. E., Forero, D. A., Vargas, R. A. A review of freely available, open-source software for the automated analysis of the behavior of adult zebrafish. Zebrafish. 16 (3), 223-232 (2019).
  52. Beal, M. F. Parkinson's disease: a model dilemma. Nature. 466 (7310), 8-10 (2010).
  53. Jha, U., Thirumalai, V. Neuromodulatory selection of motor neuron recruitment patterns in a visuomotor behavior increases speed. Current Biology. 30 (5), 788-801 (2020).
  54. Reimer, M. M., et al. Dopamine from the brain promotes spinal motor neuron generation during development and adult regeneration. Developmental Cell. 25 (5), 478-491 (2013).

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Neurociencia Número 178
Evaluación locomotora del modelo de enfermedad de Parkinson basado en pez cebra adulto inducido por 6-hidroxidopamina
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Md Hamzah, N., Lim, S. M.,… More

Md Hamzah, N., Lim, S. M., Vijayanathan, Y., Lim, F. T., Abdul Majeed, A. B., Tan, M. P., Ramasamy, K. Locomotor Assessment of 6-Hydroxydopamine-induced Adult Zebrafish-based Parkinson's Disease Model. J. Vis. Exp. (178), e63355, doi:10.3791/63355 (2021).

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