Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Elektrofysiologiska metoder för mätning av fotopigmentnivåer i Drosophila Photoreceptors

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63514
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Medical Neurobiology, Faculty of Medicine and the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences (ELSC), Hebrew University

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att elektrofysiologiskt karakterisera bistabila fotopigment: (i) utnyttja laddningsförskjutningarna inom fotopigmentmolekylerna efter fotonabsorption och deras enorma mängd i fotoreceptorerna, och (ii) utnyttja absorptionsspektraskillnaderna mellan rhodopsin och metarhodopsin fotopigmenttillstånd. Dessa protokoll är användbara för att screena för mutationer som påverkar bistabila fotopigmentsystem.

Abstract

Drosophila G-proteinkopplade fotopigmentet rhodopsin (R) består av ett protein (opsin) och en kromofor. Aktiveringsprocessen för rhodopsin initieras av fotonabsorptionsinducerande isomerisering av kromoforen, vilket främjar konformationsförändringar av opsin och resulterar i ett andra mörkstabilt fotopigmenttillstånd (metarhodopsin, M). Undersökning av detta bistabila fotopigment med slumpmässig mutagenes kräver enkla och robusta metoder för screening av mutanta flugor. Därför har flera metoder för att mäta minskningar av funktionella fotopigmentnivåer utformats. En sådan metod utnyttjar laddningsförskjutningarna i fotopigmentet efter fotonabsorption och de enorma mängder fotopigmentmolekyler som uttrycks i fotoreceptorerna. Denna elektriska signal, som kallas den tidiga receptorpotentialen (eller tidig receptorström), mäts med en mängd olika elektrofysiologiska metoder (t.ex. elektroretinogram och helcellsinspelningar) och är linjärt proportionell mot funktionella fotopigmentnivåer. Fördelarna med denna metod är det höga signal-brusförhållandet, direkt linjär mätning av fotopigmentnivåer och oberoende av fototransduktionsmekanismer nedströms till rhodopsin eller metarhodopsinaktivering. En ytterligare elektrofysiologisk metod som kallas långvarig depolariserande afterpotential (PDA) utnyttjar bistabiliteten hos Drosophila fotopigment och absorptionsspektrala skillnaderna mellan flug R- och M-pigmenttillstånd. PDA induceras av intensivt blått ljus, omvandlar mättande mängder rhodopsin till metarhodopsin, vilket resulterar i misslyckande av ljusresponsavslutning under en längre tid i mörker, men det kan avslutas med metarhodopsin till rhodopsinomvandling med intensivt orange ljus. Eftersom PDA är en robust signal som kräver massiv fotopigmentomvandling, leder även små defekter i fotopigmentets biogenes till lätt upptäckt onormal PDA. Faktum är att defekta PDA-mutanter ledde till identifiering av nya signalproteiner som är viktiga för fototransduktion.

Introduction

Det ljusaktiverade rhodopsinet (R), som är en G-proteinkopplad receptor (GPCR), består av ett 7 transmembranprotein (opsin) och en kromofor. I Drosophila melanogaster (fruktfluga) inducerar fotonabsorption isomerisering av 11-cis-3-OH-retinal kromofor till all-trans-3-OH-retinal 1, vilket främjar konformationsförändringen av rhodopsin till metarhodopsin (M, figur 1A). Till skillnad från ryggradsdjur rhodopsin dissocierar inte den dominerande fraktionen av ryggradslösa djurkromofor från opsin, vilket resulterar i det fysiologiskt aktiva mörkstabila pigmenttillståndet M. I sin tur inducerar ytterligare fotonabsorption genom all-trans-3-OH-retinal kromofor isomerisering av kromoforen 2,3, vilket genererar R-pigmenttillståndet med 11-cis-3-OH-retinal kromofor. R-tillståndet är ett mörkt, stabilt och fysiologiskt icke-aktivt fotopigment. Förutom den extremt snabba fotonregenereringsvägen för kromofor4, ungefär som ryggradsdjursfotopigment, finns en alternativ enzymatisk långsam väg för kromoforregenerering hos ryggradslösa djur, där några av stadierna utförs i retinala celler som omger fotoreceptorcellerna 5,6.

Drosophila medför stora fördelar som modellorganism för att studera ryggradslösa fotoreceptorer. I synnerhet har preparatets tillgänglighet och förmågan att tillämpa molekylär genetik gjort Drosophila till ett kraftfullt modellsystem7. Därför har flera in vivo- och ex vivo-experimentella metoder för att studera fototransduktion i allmänhet och fotopigmentnivåer i synnerhet fastställts. Den enklaste in vivo-metoden utnyttjar det relativt stora extracellulära inspelade spänningssvaret på ljus i Drosophila-ögat. Följaktligen framkallar ljusstimulering ett elektriskt spänningssvar i hela ögat som kan mätas med hjälp av extracellulär elektroretinograminspelning (ERG), vilket är ~ 3 storleksordningar större än ERG-svaret på ljus hos ryggradsdjurens ögon 8,9. Drosophila ERG-svaret är robust och lätt att erhålla, vilket gör det till en bekväm metod för att identifiera avvikelser i ljusrespons på grund av mutationer. ERG-svaret på ljus härrör huvudsakligen från fotoreceptorerna, pigmentcellerna (glia) och sekundära neuroner i lamina (se figur 1B). Huvudkomponenterna i ERG är (i) fotoreceptorernas extracellulära spänningsrespons, (ii) "på" och "av" transienterna i början och slutet av ljusstimulansen som härrör från lamina-neuronerna (figur 2A, infälld, ON, OFF), (iii) det långsamma svaret från gliacellerna (figur 2A, infällning, pilar) och (iv) det korta och övergående svaret, till följd av laddningsförskjutning under aktivering av fotopigment som föregår ON-transienten10 (figur 2C [infälld], D, E). Detta korta svar består av två faser (M1 och M2, figur 2C [infälld]) och kan endast induceras genom extremt stark ljusstimulering, som samtidigt aktiverar miljontals fotopigmentmolekyler. Det observeras varken under blå stimulering (figur 2D, blått spår) eller hos mutanter med mycket reducerade fotopigmentnivåer (figur 2E, rött spår), men dess amplitud förbättras milt i en mutant som avskaffar PLC-aktivitet (figur 2E, orange spår). M1-fasen är en typisk ERP för flugan som härrör från aktiveringen av M i fotoreceptorerna. M1-fasen, som har en positiv polaritet (intracellulärt), frigör en neurotransmittor på normalt sätt i en teckeninverterande synaps och aktiverar lamina-neuronerna, som svarar på fotoreceptordepolariseringen genom att generera den synaptiskt förstärkta M2-fasen. Således återspeglar både M1- och M2-faserna M-aktivering10,11.

Depolariseringen av fotoreceptorn genererar den hornhinnepositiva "på" -transienten, som härrör från den teckeninverterande synapsen mellan fotoreceptoraxonen och monopolarneuronerna i lamina10,11 (Figur 1B). Den långsamma ökningen och sönderfallet av ERG härrör från depolariseringen av pigmentcellerna (figur 2A, infälld, pilar) främst på grund av K + efflux från fotoreceptorcellerna12 via de övergående receptorpotentialen (TRP) och TRP-liknande (TRPL) kanaler 13,14,15. Dessa långsamma kinetiska komponenter maskerar och förvränger till stor del vågformen för fotoreceptorresponsen jämfört med intracellulära eller helcellsinspelningar av fotoreceptorns svar på ljus 9,10. Vid mycket starka belysningar kan dessutom ett ytterligare transientsvar, som föregår och delvis smälter samman med "på"-transienten observeras (figur 2C [infälld],D,E). Denna signal härstammar direkt från den massiva aktiveringen avfotopigmentet 10.

Flera ljusregimprotokoll som använder neutral densitet (ND) och färgfilter, samt starka lysande blixtar, har utvecklats för att undersöka ögat i allmänhet och fototransduktionskaskaden i synnerhet. Dessa protokoll har också använts för att undersöka egenskaperna hos fotopigmentet.

Intensitets-responsprotokollet mäter toppamplituden för ERG-spänningsresponsen för hela ögat till ökande ljusintensiteter (figur 2A,B). Detta protokoll hjälper till att upptäcka förändringar i fotoreceptorcellernas känslighet för ljus9.

Det långvariga depolariserande afterpotential -protokollet (PDA) utnyttjar skillnaderna i absorptionsspektra av rhodopsin och metarhodopsin som möjliggör, i Drosophila, en massiv fotopigmentomvandling av R till dess fysiologiskt aktiva och mörkstabila mellanliggande M-tillstånd2. I ERG-spänningssvaret ges en relativt kort puls av mättande ljus och det resulterande spänningssvaret registreras. Under detta tillstånd uppnås ett tak (reverseringspotential) av depolariseringssignalen eftersom aktivering av en bråkdel av en procent av den enorma mängden rhodopsinmolekyler (~ 1 x 108) är tillräcklig för att nå taket. Närvaron av fototransduktionskomponenterna i stort överflöd säkerställer att detta tak kommer att nås även i mutanter med en signifikant minskning av koncentrationen eller subtil funktionsfel hos fototransduktionskomponenterna. Denna situation utesluter isoleringen av dessa mutanter. introducerade PDA-screening7 och sökte ett pålitligt och avslöjande test för att isolera visuella mutanter. I Drosophila åstadkoms PDA-svaret genom att genetiskt avlägsna det röda screeningpigmentet, vilket möjliggör fotopigmentomvandling, och applicering av blått ljus, som företrädesvis absorberas av rhodopsin (figur 3A) och därmed resulterar i en stor nettoomvandling av R till M-fotopigmenttillståndet. Fototransduktionsavslutning störs vid fotopigmentets nivå av en stor nettoomvandling av R till M, vilket i sin tur resulterar i ihållande excitation långt efter att ljuset har stängts av (figur 2C, figur 4A [överst]). Under PDA-perioden är fotoreceptorerna mindre känsliga för efterföljande testljus och är delvis desensibiliserade (inaktiverade). PDA upptäcker även mindre defekter i rhodopsinbiogenes och testar fotoreceptorcellens maximala kapacitet för att upprätthålla excitation under en längre period. Eftersom det strikt beror på närvaron av höga koncentrationer av rhodopsin, gör det lätt poäng för bristfällig påfyllning av fototransduktionskomponenterna. Anmärkningsvärt nog har PDA-skärmen gett många nya och mycket viktiga visuella mutanter (granskade i Pak et al.7). Således är PDA-mutanterna isolerade av Pak et al.7 fortfarande extremt användbara för att analysera det drosophila visuella systemet.

PDA induceras i Drosophila genom att mätta blått ljus, vilket resulterar i kontinuerlig depolarisering långt efter ljusförskjutning (figur 4A [överst]). Efter att ha mättat PDA-inducerande blått ljus förblir de perifera fotoreceptorerna (R1-6) kontinuerligt aktiva i mörkret med sin maximala kapacitet och når mättnad. Ytterligare mättande blåljus under handdatorn ger inget ytterligare svar i R1-6-celler på många sekunder utan inducerar ett svar i R7-8-celler som läggs ovanpå handdatorn. De överlagrade svaren förklaras av de olika absorptionsspektra av fotopigmenten uttryckta i dessa celler (R7-8)16. Handdatorn kan undertryckas genom fotokonvertering av M tillbaka till R med mättande orange ljus (figur 4A [överst]). Handdatorns förmåga att föra fotoreceptorcellerna till sin maximala aktiva kapacitet, en situation som inte kan uppnås med intensivt vitt ljus, förklarar varför det har varit ett viktigt verktyg för att screena för visuella mutanter av Drosophila. Detta beror på att det möjliggör detektering av även mindre defekter i proteiner som är involverade i biogenesen av normala fotopigmentnivåer17,18. Två grupper av defekta PDA-mutanter har isolerats: varken inaktivering eller efterpotential (nina) mutanter och inaktivering men inte efterpotential (ina) mutanter. Fenotypen för den förra är en brist på en PDA och tillhörande inaktivering som härrör från en stor minskning av fotopigmentnivåerna (figur 4A [mitten]). Fenotypen för den senare visar inaktivering men ingen mörk depolarisering efter blått ljus på grund av en fortfarande okänd mekanism i mutanten med normala rhodopsinnivåer men saknar proteiner som interagerar med TRP-kanalerna (figur 4A [botten]).

PDA uppstår från skillnaden i mängden fotopigment i förhållande till arrestin (ARR2), som binder och avslutar M-aktivitet 19,20,21 (figur 1A). I Drosophila-fotoreceptorer är mängden fotopigment ungefär femfaldigt större än mängden ARR219. Således är ARR2-nivåerna otillräckliga för att inaktivera alla M-molekyler som genereras av en stor nettofotokonvertering av R till M, vilket lämnar ett överskott av M ständigt aktivt i mörkret 17,19,20,22,23. Denna mekanism förklarar elimineringen av PDA-svaret genom mutationer eller genom karotenoid deprivation24,25, vilket orsakar en minskning av fotopigmentnivån, men påverkar inte arrestinnivåerna. Dessutom står denna förklaring också för fenotyperna av noll ARR2 (arr23) mutant allel21, där PDA kan uppnås vid ~ 10 gånger dimmerblå ljusintensiteter 19,20,21 (figur 4B, C). PDA är inte en unik egenskap hos flugfotoreceptorer, och den förekommer i alla testade arter som har mörk stabil M med ett absorptionsspektrum som skiljer sig från R-tillståndet, vilket möjliggör tillräcklig fotokonvertering av fotopigmentet från R till M-tillståndet. En grundligt undersökt art där PDA-fenomenologin upptäcktes är barnacle (Balanus) fotoreceptor, där absorptionsspektrumet för R-tillståndet är i en längre våglängd än M-tillståndet2 (Figur 3B). Följaktligen, till skillnad från situationen i flugan, i havstulpanen, inducerar orange-rött ljus en PDA, medan blått ljus undertrycker PDA2.

Det tidiga receptorpotentialprotokollet (ERP) utnyttjar laddningsförskjutningen som uppstår under R- eller M-aktivering. Det visuella pigmentet är en integrerad del av ytmembranet i signalfacket hos både ryggradsdjur och ryggradslösa membran3. Följaktligen åtföljs aktiveringsprocessen i vilken fotopigmentmolekylerna förändras från ett mellanliggande tillstånd till nästa av en laddningsförskjutning 4,26. Eftersom fotopigmentmolekylerna är elektriskt inriktade parallellt med membrankapacitansen4, genererar en snabb synkroniserad konformationsförändring en snabb polarisationsförändring av ytmembranet, som hos flugor sker i signalfacket som består av en stapel av ~ 30 000-50 000 mikrovilli som kallas rabdomere. Denna polarisation släpps sedan passivt genom cellkroppens membrankapacitans tills cellmembranet är lika polariserat. ERP är den extracellulära registreringen av laddningsförskjutningen. Den intracellulärt inspelade ERP manifesterar den extracellulära ERP integrerad av tidskonstanten för cellmembranet 4,27,28. Strömmen som aktiveras av den visuella pigmentladdningsförskjutningen kan också mätas i helcellsspänningskläminspelningar29,30 (figur 5A-D), med den stora fördelen (i tidiga receptorströminspelningar (ERC) att minimera effekten av membrankapacitans på signalens kinetik.

Protokollavsnittet beskriver hur man utför ERG-mätningar från Drosophila eye9 och ERC-mätningar med helcellsinspelningar från Drosophila isolerade ommatidia31,32. Vi beskriver också specifika protokoll som används för att undersöka fototransduktion i allmänhet och fotopigment i synnerhet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Mätning av intensitetsresponsförhållandet, långvarig depolariserande efterpotential (PDA) och den tidiga receptorpotentialen (ERP) med hjälp av elektroretinogrammet

  1. Lämpliga uppfödningsförhållanden för beredning av D. melanogaster
    1. Höj D. melanogasterflugor i flaskor som innehåller standard gul majs som innehåller mat i en inkubator som hålls vid en temperatur av 24 ° C och i en 12 h mörk / ljus cykel
    2. Håll flugflaskorna i mörker minst 24 timmar före experimentet.
  2. Allmän inställning
    1. Förbered inspelningspipetter genom att dra 1 mm x 0,58 mm (O.D x I.D) fiberfyllda borosilikatglaskapillärer (figur 6L, O). Pipetternas motstånd bör vara 5-10 MΩ; alla lämpliga avdragare kan användas.
    2. Täck två silvertrådar med AgCl2 och sätt in 0,25 mm silvertråd i 3 M KCl-lösning ansluten till en skräddarsydd 5 V strömförsörjning.
    3. Sätt in varje belagd silvertråd i elektrodhållarna (figur 6N).
    4. Fyll glaskapillären med filtrerad Ringers lösning (se tabell 1) med en långsträckt spetsspruta (figur 6M).
    5. Sätt in trådelektroden i glaskapillären. Se till att lösningen i kapillären är i kontakt med silvertråden.
    6. Sätt i elektrodhållarna (figur 7P, N) i de två elektrodmikromanipulatorerna (figur 7G).
  3. Förfarande för att förbereda flugan för elektriska inspelningar
    OBS: För att hålla flugan under mörkanpassade förhållanden, använd endast svagt rött ljusbelysning under följande steg.
    1. Bedöva flugorna i flaskan med CO2-gas med hjälp av flugsovsystemet (figur 6A, B) och häll dem i sovbehållaren.
    2. Välj en fluga och håll den försiktigt vid vingen med en skarp pincett. Täck resten av flugorna med en petriskål.
    3. Placera flugan på flughållaren i rätt orientering -liggande på sidan, med ryggen mot handen (figur 6P).
    4. Slå PÅ lödkolvens strömförsörjning. Ställ in strömmen på ~2,25 A. Denna ström bör värma 0,25 mm platina-iridiumfilamentet till ~55-56 °C (se Tilläggsfil).
    5. Placera en droppe vax med låg smälttemperatur (~55–56 °C) på lödkolven (figur 6F).
    6. Lyft flugan från vingarna med hjälp av pincett och fäst vingarna på flughållaren (figur 6I) med lödkolven.
    7. Anslut flugans rygg till stativytan med vax med lödkolven (figur 6P).
    8. Sänk lödkolvens spets på benens sammanfogningspunkt och smält vaxet för att täcka alla ben tillsammans (figur 6P).
    9. Placera en liten droppe vax mellan huvudet och ryggen i nackområdet (figur 6P).
      OBS: Var särskilt försiktig för att undvika överhettning av flughuvudet. Se till att flugan är ordentligt fixerad och inte kan röra sig under experimentet. mindre rörelser kan skapa artefakter i inspelningarna. Se till att luftrörsöppningarna (andningsinlopp) i bröstkorgen och buken inte är täckta med vax.
    10. Placera flughållaren (figur 7Q) i en mörk Faraday-bur på ett magnetblock (figur 7I) och se till att flugan är ~ 5 mm från ljusstyrningens ände (figur 7L).
    11. Placera inspelningselektroden (figur 7P) ovanför flugans öga och jordelektroden (figur 7N) över flugans övre rygg med hjälp av mikromanipulatorerna.
    12. Sätt in jordelektroden på baksidan av flugan med hjälp av mikromanipulatorerna.
    13. Sätt in inspelningselektroden i den yttre periferin av flugans öga, helst med hjälp av mikromanipulatorerna.
      OBS: Efter att elektroden har satts in i ögat kommer en liten grop att observeras; dra elektroden uppåt utan att ta bort den från ögat tills grop försvinner. Elektroderna kan också nedsänkas i små droppar elektrodgelé applicerade vid bålen och ögat.
  4. Protokoll för intensitet och respons
    1. Placera ett orange filter (590 kantfilter) framför högtrycks Xenon-lampan. Använd ett stort (sex storleksordningar) dämpande neutraldensitetsfilter (ND).
    2. Vänta 60 s i mörkret och ge en 5 s ljuspuls.
    3. Byt ut ND-filtret mot ett mindre dämpande ND-filter i steg om en storleksordning.
    4. Vänta 60 s i mörkret och ge en andra 5 s ljuspuls.
    5. Upprepa steg 1.4.1.-1.4.4, gradvis öka ljusintensiteten med mindre dämpande ND-filter (den sista pulsen ska genereras utan något ND-filter alls). Se till att använda serien av ND-filter i rätt riktning, från stor dämpning och nå låg dämpning.
  5. PDA-protokoll (detta protokoll kan endast utföras på vitögda flugor)
    1. Ge en ljuspuls på 5 s med maximal intensitet med ett orange filter (590 kantfilter, för att konvertera maximalt fotopigment till R-tillstånd).
    2. Byt ut det orange filtret mot ett bredbandsblått (BP450/40 nm) filter och ge tre 5 s ljuspulser med maximal intensitet.
      OBS: Det är också möjligt att ge en lång kontinuerlig maximal intensitet blå ljuspuls tills ett spänningssvar i stabilt tillstånd uppnås.
    3. Vänta 60 s i mörkret, byt ut det blå filtret mot det tidigare orange filtret och ge två 5 s ljuspulser med 60 s intervaller.
  6. ERP/M-potentialprotokoll för mätning av fotojämviktsspektrumet för M (detta protokoll kan endast utföras på vitögda flugor10,25)
    1. Ge en kontinuerlig blå (bandpass (BP) 450/40 nm) ljuspuls tills den når ett spänningssvar i stabilt tillstånd, vilket omvandlar den maximala mängden fotopigment från R-tillståndet till M-tillståndet för R1-6-celler.
    2. Ge en kort (<3 ms) intensiv ljusblixt med en våglängd mellan 350-700 nm (det kända absorptionsspektrumet för R1-6-celler fotopigment) med hjälp av smala (~ 20 nm) bandpassfilter och mät toppamplituden för M1-fasen av M-potentiella svaret (vilket återspeglar metarhodopsinabsorptionen vid denna specifika våglängd vid fotojämvikt10,25).
      OBS: För synkron aktivering av en stor pool av fotopigmentmolekyler krävs en kort, intensiv ljusblixt så att fotoninnehållet packas på kort tid. M-potentialen består av två komponenter: M1 (hornhinnanegativ fas), som återspeglar laddningsförskjutningen av metarhodopsin i fotoreceptorn, och M2 (hornhinnepositiv fas11,33), vilket återspeglar det förstärkta M1-svaret hos fotoreceptorerna i lamina 9,10,11 . Var och en av dessa komponenter kan identifieras och mätas. Det är dock att föredra att mäta M1-potentialen eftersom det är en direkt linjär manifestation av M-nivåerna. Om M2 används, se till att dess amplitud ligger inom det linjära intervallet genom att använda mild karotenoid deprivation24,25.
    3. Ge en kontinuerlig blå (BP450/40 nm) ljuspuls igen, följt av en kort (<1 ms) intensiv ljusblixt med en annan våglängd.
    4. Upprepa detta protokoll tills hela absorptionsspektrumet för M vid fotojämvikt täcks.

2. ERC-protokoll för mätning av åtgärdsspektrumet för R- och M-tillstånden för R1-6-celler med hjälp av spänningskläminspelningar i hela cellen

OBS: För ett detaljerat protokoll för användning av spänningskläminspelningar i hela celler, se Katz et al.34. M-potentialen använder ERG för att mäta aktiveringen av M-tillståndet endast eftersom bidraget från R-tillståndet undertrycks av membrankapacitansen. Däremot mäter ERC aktiveringen av både R (positiv ERC) och M (negativ ERC) tillstånd eftersom spänningskläminspelningar tar bort effekten av membrankapacitans (se inledning).

  1. Konvertera fotopigmentet till önskat tillstånd (R eller M). För R till M-omvandling, anpassa först flugorna med en kort (<1 ms) adaptiv blå (BP450/40 nm) blixt. För M till R-konvertering, ge en kort adaptiv orange (OG590 kantfilter) blixt.
  2. Ge en kort ljusblixt (<1 ms) med en våglängd mellan 350-700 nm och mät den maximala negativa eller positiva amplituden för ERC-svaret, vilket återspeglar M / R-absorptionen vid denna specifika våglängd.
    OBS: För synkron aktivering av en stor pool av fotopigmentmolekyler krävs en kort, intensiv ljusblixt för att packa fotoninnehållet på kort tid. Den maximala fotopigmentomvandlingen från R till M med blå blixt kan nå ~ 80% av de totala fotopigmentmolekylerna på grund av överlappningen i absorptionsspektrumet för R och M (figur 3A). Därför, vid våglängder under ~ 550 nm, har ERC två komponenter: en negativ fas som återspeglar metarhodopsins svar och en positiv fas som återspeglar svaret från det återstående rhodopsinet. ERC beror linjärt på ljusintensiteten (figur 5D). Följaktligen, för att härleda spektralkänsligheten hos R- och M-tillstånd, måste varje fas av ERC normaliseras vid de olika våglängderna för lika energi29.
  3. Upprepa steg 2.1.-2.2. med hjälp av blixtar med olika våglängder.
  4. Plotta den normaliserade positiva och negativa ERC som en funktion av våglängden.
    OBS: Den starka ljusblixten inducerar en massiv ström genom de ljuskänsliga kanalerna som leder till metabolisk stress på fotoreceptorn, vilket i sin tur orsakar ljusoberoende kanalöppning. ERC är överlagd på denna konstitutiva ström.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 2 exemplifierar robustheten och lättheten i att använda ERG-tekniken. Den är robust eftersom den registreras i den praktiskt taget intakta flugan med en enkel teknik för extracellulära spänningsinspelningar som kräver en enkel elektrofysiologisk inställning. Robustheten manifesteras genom att erhålla inspelningar av ljussvar med relativt stora amplituder (i millivoltområdet) även när mutationer kraftigt minskar eller snedvrider ljusresponsen. Därför kan även en oerfaren experimenterare använda den mycket enkla experimentella installationen och lära sig att få meningsfulla resultat på några dagar. Huvudsyftet med tekniken som är utformad för att mäta fotopigmentnivåer uppnås genom extremt förenklade metoder för PDA (Figur 2C) och ERP (Figur 2C-E). Alternativet, nämligen mikrospektrofotometri, kräver dyr optisk utrustning och betydande utbildning och skicklighet (figur 3B). ERC (figur 5A-D), även om det är tekniskt utmanande, är mindre känsligt för cellbevarande; det kännetecknas av ett högt signal-brusförhållande och eliminering av membrankapacitans.

Figure 1
Figur 1: Den fotokemiska cykeln: aktivering och deaktivering av fotopigmentet. Multipel fosforylering av M med rhodopsinkinas och efterföljande bindning av arrestin 2 (ARR2) inaktiverar M. Orange ljus (vågig röd pil) fotokonverterar icke-fosforylerad M tillbaka till R. Det icke-fosforylerade M aktiverar heterotrimert G-protein (Gqαβγ), vilket orsakar dissociation av Gqα från Gqβγ och utbyte av bunden BNP med cytoplasmatisk GTP. Gqα-GTP aktiverar sedan fosfolpas C (PLC), som hydrolyserar PIP2 till diacylglycerol (DAG) och inositoltrisfosfat (IP3), vilket aktiverar TRP / TRPL-kanalerna på ett fortfarande oklart sätt. Ca2+ kalmodulinberoende kinas (CaMKII) fosforylerar M pp-ARR2-komplexet och genomgår clathrinberoende endocytos och nedbrytning. Belysning med orange ljus (vågig röd pil) fotokonverterar M pp-ARR2-komplexet till fosforylerat R (Rpp), vilket frigör ARR2 till cytosolen. Fosforylerad R (Rpp) genomgår defosforylering av rhodopsinfosfataset (rdgC), vilket ger R redo för en annan cykel av fotopigmentet. (B) Djupprofil för ERG för vitögd fluga till en 1 s vit stimulans (mittkolumn) eller en vit stroboskopblixt (höger kolumn). Stimuli indikeras med staplar eller prickar under spåren. Spåren är ordnade vertikalt i djupordning, med det övre spåret registrerat ~ 10 μm under hornhinnan, med varje efterföljande inspelning 25 μm djupare än den sista. Till vänster finns en kamera lucida ritning av en motsvarande sektion genom ett annat öga, vilket indikerar näthinna, källarmembran (BM), laminär skal, laminära patroner (snittade snett) och medullarskal. Denna siffra har modifierats från Stephenson och Pak11. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Elektroretinograminspelningar (ERG) av ljussvar av vitögd vild typ (w1118) och mutant Drosophila som visar förhållandet mellan intensitet och respons, långvarig depolariserande efterpotential (PDA) och metarhodopsinpotential (M-potential). (A) Intensitet-responsförhållandet för en WT -fluga (w1118) erhållen av en serie orange lampor (OG590 kantfilter, den totala energin som avges från ljusstyrningens kant med hjälp av det orange filtret var 4 mW) med ökande ljusintensitet angiven i -log-skalan. Indraget visar det angivna svaret på en snabbare tidsskala. Infälld: Huvudkomponenterna i ERG är fotoreceptorns extracellulära spänningssvar (receptorpotential), "på" och "av" transienterna (ON, OFF-svar) i början och slutet av ljusstimulansen och det långsamma svaret från gliacellerna (pilar). (B) Den genomsnittliga toppamplituden för ERG-svaren plottas som en funktion av relativ ljusintensitet. (C) ERP för en WT -fluga (w1118) erhölls genom applicering av mättande blått (BP450/4 nm, den totala energin som emitterades från kanten av ljusstyrningen med det blå filtret var 1 mW) ljus som ursprungligen inducerar en PDA. ERP (infälld) erhölls genom en följande intensiv (~ 70 J, 2 ms varaktighet) grön blixt (pil, bredbands 550 nm störningsfilter), vilket undertryckte handdatorn. Infälld: de olika komponenterna i ERP inkluderar hornhinnans negativa M1-potential och den positiva M2-potentialen, som indikerat. En rest på transient ("ON" -svar) indikeras också. (D-E) Fotopigmentomvandling krävs för induktion av M-potentialen: (D) M-potential erhölls genom en grön (bredbands 550 nm interferensfilter) blixt efter blå anpassning men inte med en blå (BP450/4 nm) blixt efter blå anpassning i WT (w1118) fluga. (E) Protokollet för D upprepades i WT (w1118 , svart spår) och två mutanta flugor (PLC null mutant, norpAP24, orange spår och hypomorf rhodopsin mutant, ninaEP318, rött spår). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Absorptionsspektra för fluga och havstulpanfotopigment. (A) Relativa absorptionsspektra för flugrodopsin (R) och metarhodopsin (M) beräknade från fotometriska mätningar av differensspektrumet och fotojämviktsspektrumet. Denna siffra har modifierats från Selinger och Minke35. (B) Två Dartnall-nomogram med toppvåglängder vid 492 nm respektive 532 nm, med ett förhållande mellan toppabsorptionen på 1,63:1. Skillnaden mellan dessa kurvor ger den bästa passformen till det differensspektrum som mäts från ocelli hos havstulpanen Balanus eborneus, erhållet genom transmissionsmätningar i intervallet 400-650 nm efter mättande monokromatisk blå (442 nm) och orange (596 nm) anpassning. Denna figur har modifierats från Minke och Kirschfeld36. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: PDA-fenotypen för nina-, ina- och Arr2-mutanterna . (A) Protokollet för induktion och undertryckande av PDA i Drosophila. PDA-induktionsprotokollet består av en initial belysning med maximal intensitet orange ljuspuls (590 kantfilter, den totala energin som emitteras från kanten av ljusstyrningen med det orange filtret var 4 mW, orange stapel) följt av applicering av tre pulser med maximal intensitet blått ljus (2: a och 3: e pulserna är för verifiering av att nå den maximala PDA, BP450/40 nm filter, den totala energin som emitterades från kanten av ljusstyrningen med det blå filtret var 1 mW, tre blå staplar). PDA-undertryckande erhölls genom applicering av den orange ljuspulsen följt av appliceringen av ett ytterligare orange ljus (två orange staplar). PDA-induktions- och undertryckningsprotokollet upprepades i den vitögda mutanten av den strukturella genen av R1-6 fotopigment, ninaEP318 7 (mitten). PDA-induktions- och undertryckningsprotokollet upprepades också i den vitögda nollmutanten av det ögonspecifika proteinkinaset C (PKC32) inaCP209 (botten). (B) En jämförelse mellan mängden blått ljus som krävs för induktion av en handdator mellan vitögd WT (W1118) och null Arr2 mutant (Arr23). Ett tåg av alternerande orange (mättande 590 kantfilter) och blå (BP450/40 nm) ljuspulser med ökande ljusintensiteter (ND i relativ -logskala). Vid blått ljus med -log 1 intensitet induceras en handdator (överst). Paradigmet för toppspåret upprepades i Arr23-mutanten som visade att handdatorn inducerades vid det blå ljuset med ~ 10 gånger dimmerljus (-log 2) intensitet (botten). (C) Ett tåg med svaga (-log 2) blåljuspulser med konstant intensitet misslyckades med att inducera en handdator i W1118-flygning (vänster), medan samma tåg med svagt blått ljus inducerade en handdator av 1st ljuspuls i Arr23-mutanten (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: Patch-clamp helcellsinspelningar av ljussvar av isolerade ommatidier, inspelade från vitögd WT (w1118), som visar generering av tidig receptorström (ERC) och dess intensitet-responsförhållande. (A) Patch-clamp helcellsinspelningar från isolerat ommatidium av WT-fluga (w1118) av bifasisk ERC-respons med latens under mikrosekund. Ljusstimulansen består av en intensiv (~ 220 J, 0,8 ms varaktighet) blå ljusblixt (bredbandsfilter med toppabsorption vid 425 nm, pil) stimulering applicerad efter stark anpassning till gulgrön (bredbandsfilter med toppabsorption vid 546 nm ljus, svart spår). Vid ljusets början observeras en snabbt negativ elektrisk artefakt. Den negativa fasen uppstår genom aktiveringen av M, och den positiva fasen uppstår genom aktiveringen av R. Aktiveringen av den ljusinducerade strömmen (LIC) manifesteras av den fördröjda negativa fasen som uppstår genom öppningen av de ljuskänsliga kanalerna. NinaEI17 null mutant visade brist på ERC-svar på samma ljusblixt applicerad på isolerat ommatidium (rött spår). (B) ERC-mätning av Rh1-fotopigment registrerade från samma cell som (A). Det svarta spåret visar monofasiskt negativt svar (M-tillstånd) på orange blixtstimulering av WT -flugan (w1118) efter stark anpassning till blått ljus. (C) Prov av bifasiska ERC-spår uppmätta från en enda fotoreceptorcell av transgen Drosophila (opn4;ninaEI17) som ektopiskt uttrycker möss melanopsinfotopigment (opn4) i R1-6 flygfotoreceptorer som svar på ökande intensiteter hos vita blixtljus (i en relativ -log I-skala; ND indikerar neutrala densitetsfilter). Blixtens början indikeras av pilen. (D) Ökningen av ljusintensiteten manifesterades av en linjär ökning av ERC-amplituden för opn4;ninaEI17. Ett diagram över den genomsnittliga toppamplituden för den negativa fasen av ERC-svar (logskala) som en funktion av relativ ljusintensitet (I/Imax, även i logskala). Den kontinuerliga raka linjen representerar en linjär regressionskurva som bäst passar experimentpunkterna (R2 = 0,99, felstaplar är SEM, n = 5). Denna siffra har modifierats från Yasin et al.29. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6: Verktyg och anordningar som krävs för flugfixering och registrering av pipettförberedelser. (B) Pedal för flygsömnsystem. C) Kall ljuskälla. (D) Stereoskopiskt mikroskop; E) Vaxfilamentvärmare. F) Lödkolv. G) Pedal för vaxglödgarantvärmare. H) Grov pincett. (I) Magnetiskt flugställ; (J) Vax med låg smälttemperatur; (K) Känsliga våtservetter; L) Vertikal pipettdragare. (M) Spruta med långsträckt spets; N) Elektrodhållare. O) Borosilikat glaskapillärer. (P) Fast fluga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 7
Figur 7: Översikt över ERG-inställningen. (B) Dator; C) A/D-omvandlare. (D) Förstärkare; (E) Stereoskopiskt mikroskop; (F) Mikromanipulator (mekanisk fin); G) Mikroelektrodförförstärkare med huvudsteg. H) Vibrationsdämpande tabell. (I) På / Av magnetblock; (J) Mikromanipulator (mekanisk grov); (K) Faraday bur; (L) Ljusguide från Xenon ljuskälla; (M) Ljusstyrning från blixtljussystem; N) Jordelektrodhållare. O) Ljusdetektor. (P) Inspelning av elektrodhållare; Q) Magnetiskt flugstativ. (R) Xenonlampans strömförsörjning. (S) Färg- och ND-filter står; T) Optisk bänk. (U) Blixtlampa system; (V) Slutardrivrutin; (W) Lampans strömförsörjning. (X) Xenon blixtljussystem Klicka här för att se en större version av denna figur.

Ringers lösning
Reagens Koncentration (mM)
NaCl 130
KCl 2
MgCl2 5
CaCl2 2
HEPES 10
pH-titrering till 7,15 med NaOH och HCl

Tabell 1: Sammansättning av Ringers lösning.

Kompletterande fil 1: Kretsschema för vaxsmältregulatorn. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den största fördelen med att använda Drosophila-fotoreceptorpreparatet är dess tillgänglighet, lättheten och noggrannheten i ljusstimulering och, viktigast av allt, förmågan att tillämpa kraften i molekylär genetik7. Omfattande genetiska studier har etablerat Drosophila som ett extremt användbart modellsystem för genetisk dissektion av komplexa biologiska processer7. Den relativt enkla strukturen hos Drosophila -genomet (bestående av endast fyra kromosomer, inklusive X- och Y -könskromosomerna, två större autosomala element, kromosomerna 2 och 3 och den lilla pricken fjärde kromosomen), enkel tillväxt och snabb generationstid (~ 2 veckor vid 24 ° C) gör Drosophila lämplig för screening av ett stort antal mutageniserade enskilda flugor. Dessutom blir isolering och underhåll av någon isolerad mutation möjlig på grund av generering av balancerkromosomer, innehållande dominerande markörer och flera inversioner, vilket förhindrar rekombination med de inhemska kromosomerna. De tillgängliga molekylära verktygen har gjort det möjligt att studera in vitro-modifierade genprodukter i deras ursprungliga cellulära miljö37. Denna kraftfulla metodik har producerat en uppsjö av mutanta flugor med defekter i nya proteiner som annars hade varit svåra att förutsäga7.

Den stora fördelen med att använda ERG för mätningar av fotopigmentnivåer och ljuskänslighet är dess enkelhet och användarvänlighet och stora signal-brusförhållande. Nackdelen med att använda ERG är dess heterogena cellulära ursprung, vilket snedvrider vågformen av ljusresponsen som härrör från fotoreceptorerna9. Den största fördelen med spänningsklämma helcellsinspelningar är förmågan att härleda konduktansförändring genom att mäta förhållandet mellan ström och spänning (I-V). Öppningen och stängningen av TRP- och TRPL-kanalerna under och efter belysningen återspeglas av denna mätning13. Dessutom erhålls ett högt signal-brusförhållande på grund av inspelningspipettens låga motstånd (~ 10 MΩ) och mätningen av strömmar, vilket möjliggör tillförlitliga mätningar av kvantstötar (enfotonsvar), vilket är användbart för att kalibrera den effektiva ljusintensiteten38. En stor nackdel med patch-clamp helcellsinspelningar är att medan ERG-inspelningar kan bibehållas i timmar även under extrema ljusintensiteter, är det svårt att utföra tillförlitliga patch-clamp helcellsinspelningar i mer än 15-30 min, och svagt ljusstimulering krävs för långvariga inspelningar. För att erhålla helcellsinspelningar krävs direktkontakt mellan inspelningspipetten och fotoreceptormembranet. Direktkontakt uppnås genom att avlägsna pigmentcellerna (glial) som omger ommatidia34 (figur 1B). Avlägsnande av pigmentceller orsakar metabolisk stress eftersom fotoreceptorcellen inte kan syntetisera de metaboliter som krävs för produktion av adenosintrifosfat (ATP), vilket stör metabolisk tillförsel39. Eftersom TRP- och TRPL-kanaler är sårbara för anoxi och lätt öppnas spontant i mörkret på grund av ATP-utarmning, innebär användningen av isolerad ommatidia stora svårigheter40,12. Hela proceduren måste göras under svagt rött ljus eftersom ljusresponsen inducerar en stor förbrukning av ATP34.

De flesta mutationerna i fototransduktionskaskaden inducerar en minskning av ljuskänsligheten. Denna minskning av ljuskänsligheten kan lätt detekteras av en skärm baserat på mätning av förhållandet mellan intensitet och respons. Intensitets-responsparadigmer uppnås genom upprepade ljusstimuleringar med ökande intensitet på en logaritmisk skala. Ökande (och inte minskande) intensiteter av orange ljus krävs för att förhindra anpassning till ljus. ERG (M-potential) och PDA är mycket enkla metoder för att mäta fotopigmentnivåer. Alternativet, nämligen mikrospektrofotometri36, kräver dyr optisk utrustning och betydande utbildning och skicklighet.

Sammanfattningsvis är ERG ett enkelt att tillämpa men relativt felaktigt verktyg. Helcellsinspelning31 är korrekt för att mäta fotopigmentnivåer med hjälp av ERC, och det är viktigt för att kompensera för erg: s felaktighet och begränsningar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar ingen intressekonflikt.

Acknowledgments

Denna forskning stöddes av bidrag från Israel Science Foundation (ISF) och United States-Israel Binational Science Foundation (BSF). Vi tackar Anatoly Shapochnikov för konstruktionen av vaxfilamentvärmaren.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 mL syringe with elongated tip Figure 6M
1 rough tweezers Dumont #5, Standard 0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 condenser lenses
A/D converter Molecular Device Digidata 1200 Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C
Amplifier Almost perfect electronics Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D
Anti-vibration Table Newport VW-3036-OPT-01 Figure 7H
Capillaries Harvard Apparatus Borosilicate glass capillaries 1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)
Clampex Molecular Device Software
CO2 tank
Cold light source Schott KL1500 LCD Figure 6C
Delicate wipers Kimtech Kimwipes (Figure 6K)
Electrode holder Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)
Faraday cage Home made Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)
Filter (Color) Schott OG590, Edge filter Figure 7S
Filter (Color) Schott BP450/40 nm Figure 7S
Filter (Color) Blazers 550 nm Figure 7S
Filter (Color) for cold light source Schott RG630 Figure 6C
Filter (Heat) Schott KG3 Figure 7S
Filters (Neutral density filter) Chroma 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 Figure 7S
Flash Lamp system Honeywell Figure 7U
Fly sleeper system with injector Inject + matic Figure 6A-B
Lamp power supply PTI LPS-220 Figure 7W
Light detector Home made Phototransistor (Figure 7O)
Light guide 3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)
Light source High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)
Low temperature melting wax Home made Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J)
Magnetic stand for flies Home made Figure 6I and Figure 7Q
Microelectrode preamplifier system with head-stage Almost perfect electronics Impedance tester (Figure 7G)
Micromanipulator (mechanical coarse) Tritech Research, Narishige M-2
Micromanipulator (mechanical fine) Leitz Microsystems Leitz Mechanical Micromanipulator Figure 7F
pCLAMP Molecular Device Software
Petri dish 60 mm
Pulse generator AMPI Master 8 Figure 7A
Redux cream for electrocardiography Parker Laboratories Redux Electrolyte Crème
Shutter driver Uniblitz, Vincent Associates VCM-D1 Single Channel Uni-stable Figure 7V
Shutter system Uniblitz, Vincent Associates LS2 2 mm Uni-stable Shutters Figure 7V
Silver Wire Warner Instruments 0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament 0.25 mm diameter (Figure 6F)
Stereoscopic zoom Microscope Nikon SMZ-2B Figure 6D
Stereoscopic zoom Microscope Wild Wild M5 With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)
Syringe filters Millex 22 µm PVDF filter
Vertical pipette puller Sutter/ Narishige Model P-97/PP-830 Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)
Wax filament heater Home made See figure S1 (Figure 6E-G)
Xenon Flash Lamp system Dr. Rapp OptoElectronic JML-C2 Figure 7X

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vogt, K., Kirschfeld, K. Chemical identity of the chromophores of fly visual pigment. Naturwissenschaften. 77, 211-213 (1984).
  2. Hillman, P., Hochstein, S., Minke, B. Transduction in invertebrate photoreceptors: role of pigment bistability. Physiological Reviews. 63 (2), 668 (1983).
  3. Hamdorf, K. Handbook of Sensory Physiology. Comparative Physiology and Evolution of Vision in Invertebrates. Autrum, H. 7, Springer-Verlag. 145-224 (1979).
  4. Gagné, S., Roebroek, J. G., Stavenga, D. G. Enigma of early receptor potential in fly eyes. Vision Research. 29 (12), 1663-1670 (1989).
  5. Pak, W. L., Shino, S., Leung, H. T. PDA (prolonged depolarizing afterpotential)-defective mutants: the story of nina's and ina's--pinta and santa maria, too. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 216-237 (2012).
  6. Wang, X., Wang, T., Jiao, Y., von, L. J., Montell, C. Requirement for an enzymatic visual cycle in Drosophila. Current Biology. 20 (2), 93-102 (2010).
  7. Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
  8. Pak, W. L. Neurogenetics, Genetic Approaches to the Nervous System. Breakfield, X. , Elsevier, North-Holland. 67-99 (1979).
  9. Minke, B. Light-induced reduction in excitation efficiency in the trp mutant of Drosophila. The Journal of General Physiology. 79, 361-385 (1982).
  10. Minke, B., Kirschfeld, K. Fast electrical potentials arising from activation of metarhodopsin in the fly. The Journal of General Physiology. 75 (4), 381-402 (1980).
  11. Stephenson, R. S., Pak, W. L. Heterogenic components of a fast electrical potential in Drosophila compound eye and their relation to visual pigment photoconversion. The Journal of General Physiology. 75 (4), 353-379 (1980).
  12. Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (15), 5748-5755 (2000).
  13. Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
  14. Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
  15. Phillips, A. M., Bull, A., Kelly, L. E. Identification of a Drosophila gene encoding a calmodulin-binding protein with homology to the trp phototransduction gene. Neuron. 8, 631-642 (1992).
  16. Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induced response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. Journal of Comparative Physiology. 98, 345-355 (1975).
  17. Selinger, Z., Doza, Y. N., Minke, B. Mechanisms and genetics of photoreceptors desensitization in Drosophila flies. Biochimica et Biophysica Acta. 1179, 283-299 (1993).
  18. Minke, B. The history of the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) and its role in genetic dissection of Drosophila phototransduction. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 106-117 (2012).
  19. Satoh, A. K., et al. Arrestin translocation is stoichiometric to rhodopsin isomerization and accelerated by phototransduction in Drosophila photoreceptors. Neuron. 67 (6), 997-1008 (2010).
  20. Byk, T., Bar Yaacov, M., Doza, Y. N., Minke, B., Selinger, Z. Regulatory arrestin cycle secures the fidelity and maintenance of the fly photoreceptor cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1907-1911 (1993).
  21. Dolph, P. J., et al. Arrestin function in inactivation of G protein-coupled receptor rhodopsin in vivo. Science. 260, 1910-1916 (1993).
  22. Belusic, G., Pirih, P., Stavenga, D. G. Photoreceptor responses of fruitflies with normal and reduced arrestin content studied by simultaneous measurements of visual pigment fluorescence and ERG. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 196 (1), 23-35 (2010).
  23. Stavenga, D. G., Hardie, R. C. Metarhodopsin control by arrestin, light-filtering screening pigments, and visual pigment turnover in invertebrate microvillar photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 197 (3), 227-241 (2011).
  24. Stark, W. S., Zitzmann, W. G. Isolation of adaptation mechanisms and photopigment spectra by vitamin A deprivation. Journal of Comparative Physiology. 105, 15-27 (1976).
  25. Minke, B., Kirschfeld, K. The contribution of a sensitizing pigment to the photosensitivity spectra of fly rhodopsin and metarhodopsin. The Journal of General Physiology. 73, 517-540 (1979).
  26. Cone, R. A., Cobbs, W. H. Rhodopsin cycle in the living eye of the rat. Nature. 221 (5183), 820-822 (1969).
  27. Murakami, M., Pak, W. L. Intracellularly recorded early receptor potential of the vertebrate photoreceptors. Vision Research. 10 (10), 965-975 (1970).
  28. Hodgkin, A. L., Obryan, P. M. Internal recording of the early receptor potential in turtle cones. The Journal of Physiology. 267 (3), 737-766 (1977).
  29. Yasin, B., et al. Ectopic expression of mouse melanopsin in Drosophila photoreceptors reveals fast response kinetics and persistent dark excitation. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3624-3636 (2017).
  30. Hardie, R. C. Photolysis of caged Ca 2+ facilitates and inactivates but does not directly excite light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 15, 889-902 (1995).
  31. Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing Papers of a Biological Character. Royal Society (Great Britain). 245, 203-210 (1991).
  32. Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium-dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
  33. Pak, W. L., Lidington, K. J. Fast electrical potential from a long-lived, long-wavelength photoproduct of fly visual pigment. The Journal of General Physiology. 63 (6), 740-756 (1974).
  34. Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. Electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627 (2017).
  35. Selinger, Z., Minke, B. Inositol lipid cascade of vision studied in mutant flies. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 53, 333-341 (1988).
  36. Minke, B., Kirschfeld, K. Microspectrophotometric evidence for two photoconvertible states of visual pigments in the barnacle lateral eye. The Journal of General Physiology. 71, 37-45 (1978).
  37. Ranganathan, R., Harris, W. A., Zuker, C. S. The molecular genetics of invertebrate phototransduction. Trends in Neurosciences. 14, 486-493 (1991).
  38. Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. The Journal of Physiology. 524, 179-194 (2000).
  39. Dimitracos, S. A., Tsacopoulos, M. The recovery from a transient inhibition of the oxidative metabolism of the photoreceptors of the drone (Apis mellifera). Journal of Experimental Biology. 119, 165-181 (1985).
  40. Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca 2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).

Tags

Neurovetenskap utgåva 184
Elektrofysiologiska metoder för mätning av fotopigmentnivåer i <em>Drosophila</em> Photoreceptors
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gutorov, R., Katz, B., Minke, B.… More

Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors. J. Vis. Exp. (184), e63514, doi:10.3791/63514 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter