Co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate

La comunicazione tra l'epitelio intestinale e il sistema immunitario residente nell'intestino è fondamentale per il mantenimento dell'omeostasi intestinale¹. Le interruzioni di queste interazioni sono associate a malattie sia locali che sistemiche, tra cui la malattia infiammatoria intestinale (IBD) e i tumori gastrointestinali². Un esempio notevole di un regolatore critico dell'omeostasi descritto più di recente proviene dallo studio delle cellule linfoidi innate (ILC), che sono emerse come attori chiave nel panorama immunitario intestinale³. Le ILC sono un gruppo di cellule immunitarie innate eterogenee che regolano l'omeostasi intestinale e orchestrano l'infiammazione in gran parte attraverso la segnalazione mediata da citochine⁴.

Le ILC murine sono ampiamente suddivise in sottotipi basati sul fattore di trascrizione, sul recettore e sui profili di espressione delle citochine⁵. Le ILC di tipo 1, che includono cellule natural killer citotossiche (NK) e ILC di tipo 1 simili a helper (ILC1), sono definite dall'espressione del fattore di trascrizione (eomesodermi) Eomes e della proteina T-box espresse rispettivamente nelle cellule T (T-bet)⁶ e secernono citochine associate all'immunità T helper di tipo 1 (T_{H H}1): interferone-γ (IFNγ) e fattore di necrosi tumorale (TNF), in risposta all'interleuchina (IL)-12, IL-15 e IL-18⁷. Durante l'omeostasi, gli ILC1 residenti nei tessuti secernono β del fattore di crescita trasformante (TGF-β) per guidare la proliferazione epiteliale e il rimodellamento della matrice⁸. Le ILC di tipo 2 (ILC2) rispondono principalmente all'infezione da elminti attraverso la secrezione di citochine associate a T helper di tipo 2 (T_H2): IL-4, IL-5 e IL-13 e sono caratterizzate dall'espressione del recettore orfano correlato all'acido retinoico (ROR) α (ROR-α)⁹ e della proteina legante GATA 3 (GATA-3)10,11,12 . Nei topi, gli ILC2 "infiammatori" intestinali sono ulteriormente caratterizzati dall'espressione del recettore simile alla lectina delle cellule killer (sottofamiglia G membro 1, KLRG)¹³ dove rispondono a IL-25^14,15 derivato dalle cellule del ciuffo epiteliali. Infine, le ILC di tipo 3, che includono cellule indurici del tessuto linfoide e ILC di tipo 3 simili a helper (ILC3), dipendono dal fattore di trascrizione ROR-γt¹⁶ e si raggruppano in gruppi che secernono il fattore stimolante la colonia di macrofagi dei granulociti (GM-CSF), IL-17 o IL-22 in risposta ai segnali locali IL-1β e IL-23¹⁷. Le cellule indurici del tessuto linfoide si raggruppano nei cerotti di Peyer e sono cruciali per lo sviluppo di questi organi linfoidi secondari durante lo sviluppo¹⁸, mentre gli ILC3 sono il sottotipo ILC più abbondante nella lamina propria dell'intestino tenue murino adulto. Uno dei primi sistemi di co-coltura di organoidi intestinali murini con ILC3 è stato sfruttato per separare l'impatto della citochina IL-22 sul trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 3 (STAT-3) mediato dalla ripetizione ricca di leucina contenente il recettore accoppiato alla proteina G 5 (Lgr5) ⁺ proliferazione delle cellule staminali intestinali¹⁹, un potente esempio di interazione rigenerativa ILC-epiteliale. Le ILC mostrano eterogeneità di impronta tra gli organi^20,21 e mostrano plasticità tra i sottoinsiemi in risposta alle citochine polarizzanti²². Ciò che guida queste impronte tessuto-specifiche e le differenze di plasticità, e quale ruolo svolgono in malattie croniche come IBD²³, rimangono argomenti interessanti che potrebbero essere affrontati utilizzando co-colture organoidiche.

Gli organoidi intestinali sono emersi come un modello di successo e affidabile per studiare l'epitelio intestinale^24,25. Questi sono generati dalla coltivazione di cellule staminali Lgr5⁺ epiteliali intestinali, o intere cripte isolate, che includono le cellule di Paneth come fonte endogena del membro della famiglia Wnt 3A (Wnt3a). Queste strutture 3D sono mantenute in idrogel sintetici²⁶ o in biomateriali che imitano la lamina propria basale, ad esempio la matrice extracellulare basale reticolante termica (TBEM), e sono ulteriormente integrate con fattori di crescita che imitano la nicchia circostante, in particolare il fattore di crescita epiteliale (EGF), l'inibitore della proteina morfogenetica ossea (BMP) Noggin e un Lgr5-ligando e Wnt-agonista R-Spondin1²⁷ . In queste condizioni, gli organoidi mantengono la polarità apico-basale epiteliale e ricapitolano la struttura cripto-villi dell'epitelio intestinale con cripte di cellule staminali in erba che si differenziano terminalmente in cellule assorbenti e secretorie al centro dell'organoide, che poi si riversano nello pseudolume interno da anoikis²⁸. Sebbene gli organoidi intestinali da soli siano stati estremamente vantaggiosi come modelli riduzionisti di sviluppo e dinamica epiteliale in isolamento^29,30, hanno un enorme potenziale futuro per capire come questi comportamenti sono regolati, influenzati o addirittura interrotti dal compartimento immunitario.

Nel seguente protocollo, viene descritto un metodo di co-coltura tra organoidi intestinali piccoli murini e ILC1 derivati dalla lamina propria, che è stato recentemente utilizzato per identificare come questa popolazione diminuisce inaspettatamente le firme intestinali dell'infiammazione e contribuisce invece ad aumentare la proliferazione epiteliale tramite TGF-β in questo sistema⁸.

Tutti gli esperimenti devono essere completati in conformità e conformità con tutte le linee guida normative e istituzionali pertinenti per l'uso animale. L'approvazione etica per lo studio descritto nel seguente articolo e video è stata acquisita in conformità e conformità con tutte le linee guida normative e istituzionali pertinenti per l'uso animale.

Tutti i topi sono stati abbattuti per lussazione cervicale secondo la procedura etica standard, condotta da individui addestrati. Prima del prelievo di organi e tessuti, l'affettamento dell'arteria femorale o la decapitazione sono stati condotti (a seconda del protocollo in questione) come valutazioni di conferma della morte. Gli animali sono stati alloggiati in condizioni specifiche prive di agenti patogeni (salvo diversa indicazione) presso un'unità commerciale accreditata e un'unità animale del King's College di Londra in conformità con il UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 (UK Home Office Project License (PPL: 70/7869 a settembre 2018; P9720273E da settembre 2018).

1. Stabilire organoidi intestinali murini

NOTA: Questa sezione del protocollo descrive la generazione di organoidi intestinali dall'intestino tenue murino. Le cripte vengono prima isolate dal tessuto, risospese in TBEM e quindi incubate con mezzi contenenti EGF, Noggin e R-Spondin (ENR). Stabilire organoidi intestinali murini è stato anche ben descritto altrove 24,25,27.

1. Posizionare TBEM su ghiaccio per scongelare (40 μL / pozzetto) e mettere una coltura tissutale standard trattata (si riferisce a piastre con una superficie idrofila e caricata negativamente) piastra a 24 pozzetti in un incubatore a 37 ° C per preriscaldare.
   NOTA: 500 μL di TBEM si scongelano in circa 2-4 ore; non lasciarlo a temperatura ambiente.
2. Preparare ~ 4 mL o 550 mL per pozzetto di terreno ENR aggiungendo EGF, Noggin e R-Spondin al mezzo basale (Tabella 1) e metterlo in un incubatore a 37 °C.
3. Abbattere un animale di 6-12 settimane e sezionare l'intestino tenue usando pinze e forbici da microdissezione. Metterlo in 15 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) sul ghiaccio.
4. Usando lo stomaco e il cieco come punti di orientamento, isolare la regione desiderata dell'intestino tenue (duodeno, digiuno o ileo). In questo protocollo, l'ileo è isolato.
5. Immergere l'intestino in PBS su una capsula di 10 cm² Petri sul ghiaccio. Usando la pinza, rimuovere il grasso delicatamente, ma completamente, dall'intestino.
6. Tagliare il tessuto longitudinalmente usando le forbici per microdissezione (preferibilmente con punte arrotondate per evitare perforazioni). Mantenere l'intestino immerso nella PBS, agitare per rimuovere la materia fecale e mantenere il lato mucoso fino a tracciare l'orientamento dei tessuti.
7. Trasferire il tessuto sul coperchio asciutto di una capsula di Petri su ghiaccio, posizionando il lato mucoso / villus intestinale verso l'alto. Tenendo un'estremità dell'intestino con una pinza, raschiare delicatamente via il muco usando il bordo angolato di un vetrino pulito.
8. Riempire la piastra con PBS ghiacciato e risciacquare il tessuto.
9. Pre-rivestire un tubo da 50 mL con PBS2 (PBS + 2% FCS; vedi Tabella 1) per prevenire l'adesione del tessuto alla plastica e aggiungere 10 ml di PBS ghiacciato a questo tubo. Tagliare l'intestino in piccoli segmenti (~2 mm) e trasferirli nel tubo da 50 ml preverniciato con PBS2.
10. Utilizzando una pipetta da 25 ml pre-rivestita con PBS2, pipettare i segmenti su e giù 5-10 volte per pulire i frammenti di tessuto.
11. Lasciare che i segmenti si depositino per 15-30 s, rimuovere e scartare il surnatante PBS e ripetere i passaggi 1.10 e 1.11 fino a quando la soluzione è limpida (circa 3-4 volte).
12. Lasciare che i segmenti si depositino e scartare il surnatante PBS. Aggiungere 30 ml di buffer di isolamento della cripta ghiacciata (Tabella 1).
13. Posizionare i tubi su un rullo orizzontale o un bilanciere a 30-60 giri / min (o delicato) per 30 minuti a 4 ° C. Non incubare a velocità più elevate, temperature più elevate o durata più lunga poiché le cripte si sposteranno prematuramente e diventeranno singole cellule con minore vitalità e resa.
    NOTA: Da questa fase in poi, tutte le procedure devono essere condotte in un ambiente asettico utilizzando materiali e reagenti sterili.
14. Lasciare che i segmenti intestinali si depositino alla base del tubo da 50 ml. Rimuovere il buffer di isolamento della cripta senza interrompere i segmenti stabilizzati e trasferirlo in un tubo da 50 ml sul ghiaccio.
    NOTA: se il processo di isolamento della cripta è stato troppo rigoroso, le cripte possono essere viste in questa frazione. Può quindi essere conservato come riserva, ma verrà scartato in modo ottimale alla fine del protocollo.
15. Aggiungere 20 ml di PBS ghiacciato ai segmenti intestinali. Utilizzando una pipetta da 25 ml pre-rivestita con PBS2, pipetta segmenti intestinali su e giù 5-8 volte.
16. Lascia che i segmenti si accontentino di 30 s. Pre-rivestire un tubo da 50 mL e una pipetta da 25 mL con PBS2. Usando questa pipetta, raccogliere il surnatante (frazione 1) nel tubo pre-rivestito da 50 ml e posizionare il tubo sul ghiaccio.
    NOTA: questa frazione serve a risciacquare il buffer di isolamento della cripta rimanente. Tuttavia, serve anche come ulteriore fase di controllo della qualità; se il pipettaggio è stato troppo vigoroso, le cripte saranno abbondanti in questa frazione di risciacquo, e se è stato troppo delicato, ci saranno pochissimi detriti in questa frazione. In modo ottimale, la frazione 1 viene scartata alla fine del protocollo, ma può essere utilizzata per produrre organoidi se sorgono problemi con le frazioni 2-4 ottenute di seguito.
17. Ripetere i passaggi 1,15 e 1,16 ma aggiungere 10 ml di PBS ghiacciato anziché 20 ml e posizionare il surnatante in un tubo fresco da 50 ml preverniciato con PBS2 (frazione 2).
18. Ripetere il passo 1,17 altre due volte, ma raggruppare il surnatante risultante con la frazione 2 (nello stesso tubo da 50 ml dal passaggio 1,17) per ottenere le frazioni 2-4. Questo singolo tubo da 50 ml dovrebbe contenere le cripte spostate in 30 ml di PBS ghiacciato.
19. Rimuovere un'aliquota di 50 μL dalle 2-4 frazioni raggruppate e posizionarla su un coperchio. Valutare la presenza di cripte epiteliali utilizzando un microscopio a luce invertita.
    NOTA: se le cripte non sono presenti, ripetere i passaggi 1.17 e 1.18 utilizzando più forza durante il pipettaggio fino a quando le cripte non vengono rilasciate. Assicurarsi che le cripte non siano state spostate prematuramente nel buffer di isolamento della cripta dal passaggio 1.14 o nella frazione 1 dal passaggio 1.16.
20. Pre-rivestire un filtro da 100 μm e un tubo da 50 ml con PBS2. Passare le frazioni di cripta raggruppate attraverso questo filtro e nel tubo pre-rivestito da 50 ml.
21. Spin down frazioni di cripta tese a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
22. Scartare il surnatante e risospendere le cripte in 10 ml di DMEM/F12 avanzato ghiacciato. Spostare le cripte in un tubo da 15 ml.
23. Spin down cripte a 210 x g per 5 minuti a 4 °C per rimuovere singole cellule e linfociti.
24. Cripte risospend in 1 mL di DMEM/F12 avanzato ghiacciato.
25. Rimuovere un'aliquota da 10 μL e posizionarla su un coperchio. Utilizzando un microscopio a luce invertita, contare il numero di cripte per determinare la concentrazione della cripta.
26. Calcola il volume richiesto per ~ 400 e ~ 1.500 cripte. Pre-rivestire una punta p1000 con PBS2 e utilizzare questa punta per pipettare i volumi richiesti (contenenti ~ 400 e ~ 1.500 cripte) in tubi separati da 1,5 ml.
27. Girare le cripte a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
28. Rimuovere il più possibile il surnatante e quindi risospesciare le cripte in 80 μL di TBEM posto su ghiaccio (punte di pipette pre-fredde a 4 °C per prevenire la gelificazione della matrice, che si verifica a 12 °C).
29. Rimuovere la piastra a 24 pozzetti, posizionata nel passaggio 1.1, dall'incubatore. Pipettare delicatamente 40 μL di cripte nel centro di un pozzo in un movimento lento e circolare per formare una struttura a cupola piatta ma 3D, o in tre piccole cupole separate.
    NOTA: La vitalità degli organoidi è la più bassa al centro della cupola dove nutrienti e gas permeano meno efficacemente³¹; pertanto, massimizzare la superficie esposta ai supporti mantenendo chiare strutture 3D è fondamentale.
30. Ripetere il passaggio 1.29 per creare un totale di due pozzi con una densità di ~ 200 cripte per pozzo e altri due pozzi con una densità di ~ 750 cripte per pozzetto. Posizionare direttamente la piastra in un incubatore (37 °C e 5% CO₂) per 15-20 min, avendo cura di non disturbare le cupole viscose ma ancora a matrice liquida.
31. Aggiungere 550 μL di mezzi ENR preriscaldati per pozzetto (dal punto 1.2) e incubare per 24 ore a 37 °C e 5% di CO_2. In questa fase, si suggerisce di integrare il mezzo ENR con 5 μM di agonista Wnt (CHIR 99021) e 5 μM di inibitore della Rho Chinasi (Y-27632) per le prime 24 ore di coltura post isolamento per migliorare la resa e l'efficienza della generazione di organoidi di cripte appena isolate dal tessuto.
    NOTA: le cripte dovrebbero chiudersi per formare strutture arrotondate entro 24 ore e le gemme della cripta dovrebbero apparire entro 2-4 giorni (Figura 1A).
32. Sostituire con mezzo ENR fresco alla fine dell'incubazione nel passaggio 1.31, e poi ogni ~ 2 giorni o quando l'indicatore di pH fenolico nel terreno di coltura diventa arancione pallido ma prima che diventi giallo.

2. Mantenimento degli organoidi intestinali murini

NOTA: Questa sezione del protocollo descrive il mantenimento e il passaggio di organoidi intestinali murini. Gli organoidi vengono prima raccolti e poi interrotti meccanicamente usando una punta p1000 piegata. Questo processo rompe grandi organoidi costituiti da numerose cripte in più frammenti più piccoli per l'espansione e rilascia cellule morte che si sono accumulate nella pseudolumen. Il mantenimento degli organoidi intestinali murini è stato anche ben descritto altrove 24,25,27. Tutte le procedure devono essere condotte in un ambiente asettico utilizzando materiali e reagenti sterili. Passaggio o espansione degli organoidi una volta ogni 4-5 giorni, prima che lo scoppio degli organoidi avvenga da un sostanziale accumulo di detriti nel lume organoide. Gli organoidi possono essere passati con un rapporto di 1:2-1:3 a seconda della densità organoide, che sarà ottimamente compresa tra 100-200 organoidi per pozzetto.

1. Come nei passaggi 1.1 e 1.2, scongelare TBEM sul ghiaccio (40 μL / pozzetto) e preparare il mezzo ENR (550 μL per pozzetto). Posizionare la piastra a 24 pozzetti trattata con coltura tissutale media e standard in un incubatore a 37 °C.
2. Rimuovere la piastra contenente organoidi dall'incubatrice. Scartare i media dal pozzo per essere passati.
3. Aggiungere 500 μL di DMEM/F12 avanzato ghiacciato al pozzo. Utilizzando una punta p1000 (pre-rivestita con media per evitare che gli organoidi si attacchino all'interno della punta), raccogliere gli organoidi in un tubo da 15 ml.
4. Risciacquare il fondo del pozzo con 250-300 μL di Advanced DMEM/F12 ghiacciato assicurandosi che non rimangano organoidi nel pozzo e raggruppare nel tubo da 15 ml contenente organoidi raccolti dal passaggio 2.3. Ripetere i passaggi 2.3 e 2.4 quando si passano più pozzetti e raggruppare gli organoidi da più pozzi nello stesso tubo da 15 ml.
5. Ridurre gli organoidi a 300 x g per 3 minuti a 4 °C.
6. Al momento della centrifugazione, assicurarsi che ci siano quattro frazioni visibili: una frazione di base con organoidi sani, una frazione di matrice centrale e chiara, una frazione di matrice contenente cellule singole e morte e uno strato superiore di surnatante contenente cellule singole e morte. Rimuovere il surnatante, la frazione di detriti e il più possibile il frammento di matrice chiara senza interrompere il pellet di organoidi.
7. Piegare delicatamente la punta di una punta della pipetta p1000 (curva di circa 2-5 mm). Pre-rivestire questa punta in PBS2 o Advanced DMEM/F12. Usando questa punta, pipettare gli organoidi su e giù 10-20 volte per interrompere meccanicamente gli organoidi e la matrice rimanente.
8. Girare verso il basso a 210 x g per 3 minuti a 4 °C.
9. Come nel passaggio 2.6, rimuovere il surnatante, la frazione di detriti e il maggior numero possibile di frammenti di matrice chiara senza interrompere il pellet delle cripte dissociate. Se cripte sane o piccoli organoidi non hanno formato un pellet trasparente, centrifugare di nuovo a 300 x g per 3 minuti a 4 °C.
10. Calcolare il volume richiesto di TBEM (80-120 μL per pozzetto di organoidi raccolti a seconda che venga utilizzato un rapporto di passaggio 1:2 o 1:3).
11. Risospesciare il pellet nel volume calcolato di TBEM e applicare 40 μL per pozzetto alla piastra preriscaldata a 24 pozzetti per formare una cupola. Posizionare direttamente la piastra nell'incubatore (37 °C; 5% CO₂) per 15-20 min.
12. Aggiungere 550 μL di mezzo ENR per pozzetto e incubare a 37 °C e 5% di CO₂. Controllare le colture per la formazione di organoidi dopo 24 ore_. Sostituire con ENR medio fresco ogni 2-3 giorni dopo il passaggio.

3. Isolamento delle cellule linfoidi innate della lamina propria dell'intestino tenue

NOTA: Questa sezione del protocollo descrive l'isolamento di ILC1 dalla lamina propria murina dell'intestino tenue dei topi reporter RORγt^GFP. Ciò comporta la rimozione delle cellule epiteliali, la digestione dei tessuti, la separazione del gradiente di densità dei linfociti e l'isolamento ILC1 tramite smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). L'isolamento FACS seguendo la strategia di gating in Figura 2 richiede il mastermix di colorazione extracellulare (Tabella 4), con i controlli di colorazione aggiuntivi descritti nella Tabella 2 e nella Tabella 3 per la macchina (Tabella 2) e la gating (Tabella 3) impostati. I topi reporter RORγt^GFP vengono utilizzati per isolare ILC1 vivo e puro e gate out RORγt^GFP+ ILC3. L'elaborazione tissutale per l'isolamento dei linfociti della lamina propria è stata anche ben descritta altrove³².

1. Lavorazione dei tessuti
   NOTA: il tessuto proveniente da singole repliche biologiche di animali è tenuto separato in questo protocollo. Questi campioni devono essere opportunamente etichettati e conservati sul ghiaccio ogni volta che è possibile. Tutti i reagenti ad eccezione degli enzimi digestivi devono essere autorizzati a raggiungere la temperatura ambiente per garantire una rapida digestione dei tessuti.
   1. Posizionare TBEM sul ghiaccio per scongelare (40 μL/pozzetto). Conservare una piastra standard a 24 pozzetti trattata con coltura tissutale in un incubatore a 37 °C per preriscaldare.
   2. Preparare un tampone fresco per la rimozione epiteliale e un tampone per la digestione (vedere Tabella 1). Preparare il mezzo isotonico a bassa densità di densità di viscosità (LVDGM) (90% LVDGM e 10% 10x PBS), il 40% isotonico LVDGM e l'80% isotonico LVDGM in tampone neutralizzante (Tabella 1).
   3. Abbattere un animale di 6-12 settimane, sezionare l'intestino tenue usando pinze e forbici da microdissezione e posizionare l'intestino in 15 ml di PBS sul ghiaccio.
   4. Immergere l'intestino in PBS su una capsula di 10 cm² Petri sul ghiaccio e utilizzare una pinza per rimuovere il grasso delicatamente ma completamente dall'intestino.
   5. Rimuovere i cerotti di Peyer (~ 5-10; correndo in una linea opposta alla linea del tessuto adiposo) usando le forbici da microdissezione per esaurire le cellule indurici del tessuto linfoide e le cellule B.
      NOTA: le macchie di Peyer sono assenti in Rag^-/- e in altri animali impoveriti di lignaggio. A differenza delle bolle d'aria, le patch di Peyer rimarranno al loro posto se spinte.
   6. Tagliare il tessuto longitudinalmente usando le forbici per microdissezione (preferibilmente con punte arrotondate per evitare perforazioni). Mantenendo l'intestino immerso nella PBS, agitare per rimuovere la materia fecale.
   7. Tagliare il tessuto in pezzi di 2-4 cm di lunghezza e trasferirli in un tubo da 50 ml.
   8. Aggiungere circa 20-40 ml di PBS ghiacciato e agitare vigorosamente per 5-15 s per rimuovere muco e detriti.
   9. Scartare il contenuto del tubo su una capsula di Petri fresca e sostituire i frammenti intestinali nello stesso tubo da 50 ml usando una pinza.
   10. Ripetere i passaggi 3.1.8 e 3.1.9 3-4 volte o fino a quando il PBS non è chiaro.
2. Rimozione dell'epitelio
   1. Metti i frammenti intestinali in una capsula di Petri fresca sul ghiaccio. Usando una pinza, raccogli i segmenti intestinali e rimuovi il liquido in eccesso picchiettando su una superficie asciutta.
   2. Tagliare il tessuto in pezzi di ~ 0,75-1 cm e trasferirli in un tubo fresco da 50 ml. Aggiungere 5-7 ml di tampone di rimozione epiteliale (Tabella 1). Vortice del tubo e assicurarsi che tutti i segmenti intestinali siano immersi nel tampone.
   3. Incubare i campioni a 37 °C con dondolo (100-150 giri/min) per 12-15 min. Vortice il tubo per 20-30 s.
   4. Ripetere ancora una volta i passaggi 3.2.1-3.2.3, scartando il surnatante torbido (la frazione contiene cellule epiteliali e intraepiteliali) e sostituendolo con un tampone di rimozione epiteliale fresco.
3. Digestione del tessuto
   1. Mancia il contenuto su una fresca capsula di Petri. Usando la pinza, raccogli i segmenti intestinali e tocca una superficie asciutta per scartare il liquido in eccesso. Metti i segmenti in una capsula di Petri fresca sul ghiaccio.
   2. Raggruppare i segmenti nel centro della capsula di Petri in una massa densa. Usando due bisturi o forbici affilate, triturare finemente il tessuto fino a raggiungere una consistenza viscosa che potrebbe passare attraverso una punta della pipetta p1000.
   3. Usando una pinzetta, posizionare il tessuto tritato in un tubo pulito da 50 ml. Risciacquare la capsula di Petri con 1-2 mL di tampone di digestione (Tabella 1) per raccogliere il tessuto rimanente e raggrupparlo nel tubo da 50 ml con il tessuto triturato.
   4. Aggiungere 5-7 ml di tampone di digestione al tessuto triturato e assicurarsi che tutto il tessuto sia raccolto sul fondo del tubo.
   5. Incubare i campioni a 37 °C, con dondolo medio (~100-150 giri/min) per 15 min. Vortice del tubo per 20-30 s ogni 5 minuti per aiutare la digestione.
   6. Mentre i campioni sono in incubazione, posizionare un filtro cellulare da 40 μm sopra una provetta fresca da 50 ml per ciascun campione. Rivestire i filtri con 1-2 mL di tampone neutralizzante (Tabella 1).
   7. Vortice i campioni per 20-30 s dopo che l'incubazione è terminata.
   8. Filtrare il tessuto parzialmente digerito attraverso il filtro rivestito da 40 μm nel tubo da 50 ml contenente tampone neutralizzante.
   9. Utilizzare una pinzetta per raccogliere il tessuto non digerito dal filtro da 40 μm e rimetterlo nel tubo da 50 ml in cui è stata eseguita la digestione, per il secondo ciclo di digestione. Rimuovere i filtri e risciacquarli con un tampone di digestione per rimuovere qualsiasi tessuto non digerito aderente al filtro.
   10. Una volta che il maggior numero possibile di tessuto non digerito è stato rimosso dal filtro e riposizionato nel tubo da 50 ml in cui è stata eseguita la digestione, sciacquare il filtro con un tampone neutralizzante da 1-2 ml sul tubo da 50 ml contenente il surnatante filtrato.
   11. Aggiungere 20-25 ml di tampone neutralizzante al surnatante filtrato e metterlo sul ghiaccio per mantenere la vitalità delle cellule isolate durante il secondo ciclo di digestione dei tessuti.
   12. Aggiungere altri 5-10 ml di tampone di digestione al tessuto non digerito e ripetere i passaggi 3.3.5-3.3.10, assicurandosi di filtrare il tessuto digerito nello stesso tubo utilizzato nel passaggio 3.3.8 (lo stesso filtro può anche essere riutilizzato). Risciacquare il filtro con tampone neutralizzante fino al raggiungimento della linea di 50 ml, quindi eliminare qualsiasi tessuto non digerito rimanente.
4. Isolamento dei linfociti per gradiente di densità
   1. Ruotare i supernatanti raccolti per ogni replica biologica a 500 x g per 10 minuti.
   2. Durante il passaggio 3.4.1, aggiungere 5 mL di LVDGM isotonico all'80% a un tubo da 15 mL per ogni replica biologica.
   3. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante dal tessuto filtrato e digerito. Risospesciare il pellet in 10 ml di LVDGM isotonico al 40%, assicurando che il pellet sia ben omogeneizzato e che non rimangano pezzi di grandi dimensioni.
   4. Impostando l'aiuto della pipetta alla sua impostazione più lenta, inclinare il tubo da 15 ml contenente l'80% di LVDGM isotonico e sovrapporre molto delicatamente i 10 mL di sospensione cellulare in LVDGM isotonico al 40% assicurando che la sospensione cellulare non si mescoli con la frazione dell'80%.
      NOTA: Se le frazioni dovessero accidentalmente mescolarsi, distribuire rapidamente i linfociti che hanno raggiunto la frazione dell'80% tra due tubi da 50 ml riempiti con PBS e centrifugare per 10 minuti a 500 x g. Quindi, scartare il surnatante e ripetere i passaggi 3.4.3-3.4.4.
   5. Ruotare i tubi a 900 x g e 20 °C, con l'accelerazione e la deaccelerazione impostate sull'impostazione più bassa per garantire che le frazioni non vengano interrotte. Centrifuga per 20 minuti (escluso il tempo di pausa).
      NOTA: Tutte le procedure da questa fase in poi devono essere condotte in una cappa di coltura tissutale asettica utilizzando materiali e reagenti sterili.
   6. Pre-rivestire un tubo da 50 mL per ogni campione con PBS2 e aggiungere 45 mL di PBS ghiacciato.
   7. Dopo la centrifugazione, rimuovere delicatamente lo strato superiore di detriti dal tubo da 15 ml. Rivestire una punta p1000 con PBS2 e utilizzarla per raccogliere l'interfase carica di linfociti tra i gradienti del 40% -80% nel tubo da 50 ml contenente 45 ml di PBS ghiacciato.
   8. Ruotare i tubi a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
   9. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet in 500 μL di tampone FACS (PBS, 2% FCS, 0,5 mM EDTA e 10 mM HEPES; vedere Tabella 1). Pre-rivestire un filtro da 40 μm con tampone FACS e utilizzarlo per filtrare la sospensione cellulare in un tubo di flusso. Risciacquare il tubo da 50 mL con ulteriori 500 μL di tampone FACS e filtrare nello stesso tubo di flusso.
   10. Rimuovere un'aliquota di 10 μL dal risultante 1 mL di sospensione cellulare. Contare la resa dei linfociti utilizzando un contatore cellulare o un emocitometro e calcolare la concentrazione cellulare per ciascun campione.
5. Preparazione del campione per la cernita - colorazione extracellulare
   NOTA: Gli anticorpi utilizzati nel mastermix di colorazione extracellulare, così come i reagenti per preparare il colorante di vitalità fissabile e la soluzione di blocco Fc, sono utilizzati in concentrazioni sufficienti per un massimo di 5 x 10⁶ celle per 100 μL. I volumi devono essere regolati di conseguenza. Affinché la compensazione della macchina FACS per ordinare ILC1, sono necessari controlli monocolore per ciascuno dei fluorofori nel mastermix di colorazione extracellulare. Per gli anticorpi, possono essere utilizzate perle di compensazione che contengono una popolazione di perline leganti anticorpi positivi e una popolazione di perline non leganti anticorpali negativi. Per il controllo del colorante di vitalità fissabile ultravioletto (UV) a colore singolo, è possibile utilizzare perline di compensazione che contengono popolazioni ammino-reattive (per segnale positivo) e non reattive (per segnale negativo). Non è consigliabile utilizzare cellule dal RORγt^GFPtopi reporter per il controllo del colorante di vitalità fissabile UV a colore singolo, poiché queste cellule conterranno un GFP⁺ segnale.
   1. Rimuovere una piccola aliquota di ~10 μL da ciascun campione e raggrupparla in un tubo di flusso separato contenente 250 μL di tampone FACS. Posizionare il tubo sul ghiaccio. Questo verrà utilizzato per il controllo non macchiato.
   2. Aggiungere 1 mL di PBS al volume rimanente nelle provette del campione. Centrifuga a 300-400 x g per 3-5 min.
   3. Preparare 200 μL di soluzione colorante di vitalità fissabile ai raggi UV per campione. Colorante di vitalità fissabile UV diluito (risospeso in DMSO seguendo le istruzioni del produttore) 1:500 in PBS (o seguendo le istruzioni del produttore).
   4. Scartare il surnatante e risospesciare i campioni in 200 μL di soluzione colorante di vitalità fissabile UV. Vorticare i tubi e incubare al buio a 4 °C per 10-15 min.
   5. Aggiungere 2 mL di tampone FACS ai tubi per spegnere il colorante di vitalità fissabile UV, vortice per 10 s e centrifugare i tubi a 300-400 x g per 3-5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante dai tubi centrifugati.
   6. Preparare 200 μL di soluzione di blocco Fc per campione (0,25 mg/mL di blocco Fc nel tampone FACS).
   7. Aggiungere 200 μL di soluzione di blocco Fc a ciascuno dei campioni dal punto 3.5.5, vortice per 10 s e incubare al buio a 4 °C per 10 minuti.
   8. Aggiungere 500 μL di tampone FACS a un tubo di flusso fresco. Rimuovere un'aliquota di 2-5 μL da ciascun campione e raggrupparla nel tubo per i controlli di fluorescenza meno uno (FMO).
   9. Ruotare il tubo FMO per 10 s e distribuirlo uniformemente (100 μL per tubo) in tubi a flusso fresco etichettati per ciascuno dei controlli FMO (Cocktail di linea FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO e NK1.1 FMO; vedere Tabella 3). Aggiungere tutti gli anticorpi tranne l'anticorpo di interesse per ciascun tubo (come descritto nella Tabella 3) e vortice per 10 s. Mettere da parte i comandi FMO al buio a 4 °C.
   10. Centrifugare i campioni (non controlli FMO) a 300-400 x g per 3-5 min a 4 °C.
   11. Preparare mastermix di colorazione extracellulare (200 μL per campione) con le diluizioni anticorpali finali come descritto nella Tabella 4. Regolare il volume di colorazione per la concentrazione cellulare appropriata (fino a 5 x 10⁶ celle per 100 μL) in base al conteggio delle cellule dal passaggio 3.4.10.
   12. Aggiungere il mastermix di colorazione extracellulare ai campioni, vortice per 10 s e metterli da parte al buio a 4 °C.
   13. Preparare un nuovo controllo monocolore per ogni anticorpo destinato ad essere utilizzato nella strategia di gating (Figura 2). Perle di compensazione degli anticorpi Vortex per 20 s, aggiungere 1 goccia di perline a un tubo di flusso, macchiare con 0,5 μL di anticorpo (come mostrato nella Tabella 2 o seguendo le istruzioni del produttore) e vortice per 10 s.
   14. Preparare un controllo monocolore del colorante di vitalità fissabile ai raggi UV utilizzando un kit di perline di compensazione ammino-reattive. Perle di compensazione ammino-reattive al vortice per 20 s, aggiungere 1 μL di colorante UV vivo/morto (come mostrato nella Tabella 2 o seguendo le istruzioni del produttore) e vortice per 10 s.
   15. Incubare i campioni, gli FMO e i controlli monocolore al buio per 30 minuti a 4 °C.
   16. Durante questo periodo, preparare i tubi per raccogliere le cellule selezionate. Aggiungere 400-500 μL del 10% fbS in provette Advanced DMEM/F12 a 1,5 mL per ciascun campione.
   17. Dopo l'incubazione, aggiungere 2 ml di PBS2 a ciascuno dei campioni, ai controlli FMO e ai controlli a colore singolo.
   18. Centrifugare i campioni, i controlli FMO e i controlli monocolore a 300-400 x g per 3-5 minuti a 4 °C.
   19. Scartare il surnatante da tutti i tubi centrifugati. Sospendere i campioni e i controlli FMO in 250 μL di tampone FACS e vortice per 10 s.
   20. Sospendere i controlli a colore singolo in 250 μL di PBS2. Aggiungere 1 goccia di perline amminiche non reattive al solo controllo monocolore del colorante di vitalità fissabile UV. Vortex tutti i controlli per 10 s.
   21. Le celle sono ora pronte per essere ordinate. Mantenere campioni, controlli FMO e controlli a colore singolo sul ghiaccio al buio quando possibile per migliorare la vitalità cellulare e prevenire la perdita di segnale da fotosbiancamento.

4. Co-coltura di piccoli organoidi intestinali con cellule linfoidi innate

NOTA: Questa sezione descrive la co-coltura di ILC1 intestinale murino ordinato (isolato seguendo il protocollo di cui al paragrafo 3) con organoidi murini a piccoli intestinali (descritti nei paragrafi 1 e 2). Gli organoidi devono essere utilizzati in modo ottimale 1-2 giorni dopo il passaggio. La co-coltura comporta la raccolta degli organoidi, l'aggiunta del numero appropriato di ILC1, la centrifugazione agli organoidi a pellet e ILC1 insieme e la riesuspensione in TBEM. Completa questa sezione il prima possibile una volta che ILC1 è stato isolato. Tutte le procedure devono essere condotte in un ambiente asettico utilizzando materiali e reagenti sterili.

1. Assicurarsi che TBEM dal passaggio 3.1.1 sia stato scongelato.
2. Raccogli gli organoidi di 1-2 giorni come descritto nei passaggi 2.3 e 2.4.
3. Sospendere il pellet organoide in 1 mL di DMEM/F12 avanzato freddo ghiacciato. Non piegare la punta p1000 come fatto durante il passaggio degli organoidi, poiché l'intenzione qui è quella di mantenere la struttura organoide per la co-coltura. Se necessario, posizionare gli organoidi in tubi separati da 1,5 ml rivestiti pbs2 su ghiaccio per un breve periodo da distribuire tra diverse condizioni di cocoltura.
   NOTA: iniziare la preparazione degli organoidi solo quando i campioni ILC sono pronti per la co-coltura; lavorare sul ghiaccio e rapidamente non appena gli organoidi sono stati raccolti per ridurre al minimo la morte delle cellule epiteliali.
4. Pre-rivestire un tubo da 1,5 ml con PBS2 per campione di replica ILC. Distribuire ~ 100-200 organoidi (circa 1 pozzetto di una piastra a 24 pozzetti) in ciascun tubo.
5. Pre-rivestire una punta p1000 in PBS2 e utilizzarla per valutare il volume di ILC1 dopo la purificazione FACS (250-300 μL + volume ordinato). Determinare la concentrazione di ILC1 per mL utilizzando il numero di celle registrate dall'ordinamento e determinare il volume richiesto.
6. Utilizzando la stessa punta p1000 rivestita PBS2, aggiungere non meno di 500 ILC1 al tubo da 1,5 ml rivestito PBS2 contenente gli organoidi. Se il numero di ILC1 prodotti dal tipo è inferiore a 500, aggiungere l'organoide direttamente al tubo contenente il tipo originale per ridurre al minimo la perdita di cellule dal trasferimento.
7. Spin down ILC1 e organoidi a 300 x g per 5 min a 4 °C. Se possibile, evitare centrifughe da tavolo di piccolo diametro, in quanto queste raggrupperanno le celle lungo il bordo dell'interno del tubo invece di creare un pellet sulla punta del tubo. Poiché i numeri di cella sono molto bassi, è imperativo ridurre al minimo la perdita di cellule durante questi passaggi.
8. Rimuovere lentamente e delicatamente il più possibile il surnatante senza disturbare il pellet (che potrebbe non essere visibile a occhio, specialmente nei controlli senza organoidi solo ILC). Posizionare il campione sul ghiaccio.
9. Sospendere il pellet freddo in 30 μL per pozzetto di TBEM. Tenendo il tubo su una superficie fredda (ad esempio, una piccola scatola di ghiaccio posta nella cappa di coltura del tessuto), mescolare gli organoidi e l'ILC almeno 10-15 volte per garantire una distribuzione uniforme. Triturare frequentemente ma delicatamente, per evitare di danneggiare gli organoidi e la formazione di bolle.
10. Applicare 30 μL per pozzetto di organoidi ILC in TBEM su una piastra preriscaldata a 24 o 48 pozzetti per formare una singola cupola. Posizionare direttamente la piastra nell'incubatore (37 °C e 5% CO₂) per 10-20 min.
    NOTA: si consiglia vivamente di impostare controlli solo ILC e solo organoidi per l'analisi a valle. Gli ILC1 sono rari, ma ^GFP-ILC2 può essere sostituito dai controlli di immunofluorescenza o di citometria a flusso FSC/SSC ove scientificamente appropriato.
11. Aggiungere 550 μL (per pozzetto) di mezzo ILC1 completo (ENR + IL-2 + IL-7 + IL-15 + 2-Mercaptoetanolo; vedere Tabella 1) con qualsiasi citochina sperimentale desiderata o anticorpi bloccanti e incubare a 37 °C e 5% CO₂ per 24 ore.
12. Dopo 24 ore, rimuovere delicatamente la piastra dall'incubatrice e lasciare che la piastra si sieda in una cappa di coltura tissutale per 1 minuto per garantire che i linfociti siano sistemati.
13. Rimuovere 200-250 μL di media e metterlo in un pozzo vuoto di una piastra a 24 pozzetti. Controllare questo surnatante con un microscopio invertito per assicurarsi che non siano stati rimossi i linfociti.
    1. Se il surnatante è chiaro, aggiungere 300 μL di mezzo ILC1 fresco alla co-coltura nel pozzo originale. Se i linfociti sono presenti nel surnatante, centrifugare a 300-400 x g per 3-5 minuti a 4 °C e risospendere in 300 μL di mezzo ILC1 fresco e aggiungerlo ai restanti 200-250 μL di terreno nel pozzetto originale. Assicurarsi di ricostituire i supporti ogni 1-2 giorni o quando il supporto diventa arancione pallido / giallo.
       NOTA: non lasciare evaporare il supporto in misura sufficiente da non rompere la superficie del supporto da parte della punta della cupola della matrice. Assicurarsi sempre che la matrice sia completamente sommersa. L'evaporazione eccessiva può essere evitata utilizzando pozzi centrali nelle piastre di coltura tissutale e aggiungendo ~ 600 μL di PBS ai pozzi circostanti. Le co-colture con ILC adulto sono stabili per 1-4 giorni, dopo di che gli organoidi che sono stati seminati senza gravi interruzioni si romperanno e saranno riseminati come nuove cripte. Se si analizza l'epitelio, si raccomanda di analizzare le colture entro 1-4 giorni dalla creazione di co-colture.
    2. Eseguire analisi a valle utilizzando l'immunofluorescenza, la citometria a flusso o la purificazione FACS delle popolazioni bersaglio in tampone di lisi per l'analisi dell'espressione genica mediante RNA-seq o RT-qPCR a singola cellula o massa, come descritto nel riferimento⁸.

Una volta completate con successo, le cripte appena isolate dovrebbero formare strutture di cripte in erba entro 2-4 giorni (Figura 1A). Le colture organoidi sane e robuste dovrebbero crescere attivamente e possono essere passate ed espanse come dettagliato nel protocollo.

Questo protocollo descrive l'isolamento dell'ILC1 dell'intestino tenue dalla linea di reporter transgenici murini RORγtGFP , che consente l'isolamento di ILC1 vivo mediante FACS (Figura 2). Utilizzando il protocollo qui descritto, l'intervallo di conteggio ILC1 previsto è di 350-3.500 celle isolate.

Dopo essere state seminate con organoidi, le co-colture possono essere visualizzate mediante immunocitochimica (Figura 3A-B). IlLC e cellule epiteliali possono anche essere analizzati mediante citometria a flusso, come dimostrato nella Figura 3C. ILC1 sovraregola l'epitelio CD44, come caratterizzato da citometria a flusso (Figura 4A-B) e immunocitochimica (Figura 4C). In particolare, ILC1 induce l'espressione della variante di giunzione CD44 v6 negli organoidi, come dimostrato da RT-qPCR (Figura 4D).

Tabella 1: Composizioni di supporti e buffer. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Controlli a colore singolo. Composizione di controlli monocolore per isolare la lamina propria ILC1 dell'intestino tenue utilizzando la strategia di gating definita nella Figura 2. I dettagli degli anticorpi utilizzati possono essere trovati nella Tabella dei materiali. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella 3: Mastermix di fluorescenza meno uno (FMO). Composizione di mastermix FMO per cocktail Lineage FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO e NK1.1 FMO. I mastermix FMO contengono tutti gli anticorpi utilizzati tranne l'anticorpo di interesse e sono utilizzati per colorare un'aliquota del campione. Il cocktail di lineage è definito come CD19, CD3e, CD5, Ly-6G / Ly-6C. I dettagli degli anticorpi utilizzati possono essere trovati nella Tabella dei materiali. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Tabella 4: Mastermix di colorazione extracellulare. Le concentrazioni sono regolate per la colorazione fino a 5 x 106 cellule in 200 μL di tampone FACS. I dettagli degli anticorpi utilizzati possono essere trovati nella Tabella dei materiali. Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Figura 1: Organoidi intestinali murini. Immagine rappresentativa di (A) organoidi intestinali generati con successo 2-3 giorni dopo il passaggio e (B) coltura infruttuosa. Barra della scala: 100 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Strategia di Gating per isolare gli ILC1 dalla lamina propria dell'intestino tenue dei topi reporter transgenici RORγtGFP . Grafico citometrico a flusso rappresentativo dell'isolamento di ILC1 dalla lamina propria dell'intestino tenue dei topi reporter transgenici RORγtGFP di FACS. Gli ILC1 sono definiti live, CD45+, Lin- (CD3, CD5, CD19, Ly6C), CD127+, KLRG1-, RORγt-, NKp46+ e NK1.1+. Rappresentante da N = >50 topi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Co-colture organoidi e ILC1. Immagini in campo luminoso (A), immagini al microscopio confocale (B) e grafici FACS (C) di organoidi intestinali piccoli (SIO) coltivati da soli (in alto) o con ILC1 (in basso) (rappresentativi di esperimenti con ILC1 da N = 3 topi). (B) La colorazione con CD45 illustra ILC1 e la proteina 1 (ZO-1) marca le cellule epiteliali negli organoidi. Barre della scala: 50 μm. (C) Precedentemente recintato su singole cellule vive. La molecola di adesione cellulare epiteliale (EpCAM) marca le cellule epiteliali intestinali (IEC) negli organoidi e CD45 marca ilC1. La figura è adattata dal riferimento8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Gli ILC1 in co-coltura con organoidi intestinali piccoli guidano l'upregulation di CD44 nelle cellule epiteliali intestinali. (A) Un grafico citometrico rappresentativo dell'espressione di CD44 in cellule epiteliali positive alla molecola di adesione cellulare epiteliale (EpCAM) (live, CD45-, EpCAM+) da piccoli organoidi intestinali (SIO) coltivati da soli (a sinistra) o con ILC1 per 4 giorni (a destra). (B) Quantificazione del flusso dell'espressione di CD44 in cellule epiteliali intestinali (IEC) (ILC1 da N = 5 topi). (C) Immagine rappresentativa al microscopio confocale della localizzazione di CD44 in d4 SIO da solo (a sinistra) o co-coltivato con ILC1 (a destra) (rappresentativo di N = 3 topi). Barre di scala: 50 μm. (D) RT-qPCR con primer specifici per esoni per le varianti di giunzione CD44 v4 e v6 (N = 3). Questa cifra è adattata dal riferimento8. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Gli autori non hanno conflitti di interesse.