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Articolo metodologico

Co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate

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DOI:

10.3791/63554

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23 marzo 2022

 ,  ,  , 
1Centre for Host-Microbiome Interactions, King’s College London, 2Wellcome Trust Cell Therapies and Regenerative Medicine Ph.D. Programme, King’s College London, 3Present address: Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, Cambridge University

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo offre istruzioni dettagliate per stabilire organoidi murini dell'intestino tenue, isolare le cellule linfoidi innate di tipo 1 dalla lamina propria dell'intestino tenue murino e stabilire co-colture tridimensionali (3D) tra entrambi i tipi di cellule per studiare le interazioni bidirezionali tra le cellule epiteliali intestinali e le cellule linfoidi innate di tipo 1.

Abstract

Complesse co-colture di organoidi con cellule immunitarie forniscono uno strumento versatile per interrogare le interazioni bidirezionali che sono alla base del delicato equilibrio dell'omeostasi della mucosa. Questi sistemi 3D e multicellulari offrono un modello riduzionista per affrontare le malattie multifattoriali e risolvere le difficoltà tecniche che sorgono quando si studiano tipi di cellule rare come le cellule linfoidi innate residenti nei tessuti (ILC). Questo articolo descrive un sistema murino che combina organoidi dell'intestino tenue e ILC di tipo 1 (ILC1) derivati dalla lamina propria dell'intestino tenue, che possono essere facilmente estesi ad altre POPOLAZIONI ILC o immunitarie. Le ILC sono una popolazione residente nei tessuti particolarmente arricchita nella mucosa, dove promuovono l'omeostasi e rispondono rapidamente a danni o infezioni. Le co-colture organoidi con ILC hanno già iniziato a far luce su nuovi moduli di segnalazione epiteliale-immunitaria nell'intestino, rivelando come diversi sottoinsiemi di ILC influiscono sull'integrità e sulla rigenerazione della barriera epiteliale intestinale. Questo protocollo consentirà ulteriori indagini sulle interazioni reciproche tra cellule epiteliali e immunitarie, che hanno il potenziale per fornire nuove informazioni sui meccanismi dell'omeostasi e dell'infiammazione della mucosa.

Introduzione

La comunicazione tra l'epitelio intestinale e il sistema immunitario residente nell'intestino è fondamentale per il mantenimento dell'omeostasi intestinale1. Le interruzioni di queste interazioni sono associate a malattie sia locali che sistemiche, tra cui la malattia infiammatoria intestinale (IBD) e i tumori gastrointestinali2. Un esempio notevole di un regolatore critico dell'omeostasi descritto più di recente proviene dallo studio delle cellule linfoidi innate (ILC), che sono emerse come attori chiave nel panorama immunitario intestinale3. Le ILC sono un gruppo di cellule immunitarie innate eterogenee che regolano l'omeostasi intestinale e orchestrano l'infiammazione in gran parte attraverso la segnalazione mediata da citochine4.

Le ILC murine sono ampiamente suddivise in sottotipi basati sul fattore di trascrizione, sul recettore e sui profili di espressione delle citochine5. Le ILC di tipo 1, che includono cellule natural killer citotossiche (NK) e ILC di tipo 1 simili a helper (ILC1), sono definite dall'espressione del fattore di trascrizione (eomesodermi) Eomes e della proteina T-box espresse rispettivamente nelle cellule T (T-bet)6 e secernono citochine associate all'immunità T helper di tipo 1 (TH H1): interferone-γ (IFNγ) e fattore di necrosi tumorale (TNF), in risposta all'interleuchina (IL)-12, IL-15 e IL-187. Durante l'omeostasi, gli ILC1 residenti nei tessuti secernono β del fattore di crescita trasformante (TGF-β) per guidare la proliferazione epiteliale e il rimodellamento della matrice8. Le ILC di tipo 2 (ILC2) rispondono principalmente all'infezione da elminti attraverso la secrezione di citochine associate a T helper di tipo 2 (TH2): IL-4, IL-5 e IL-13 e sono caratterizzate dall'espressione del recettore orfano correlato all'acido retinoico (ROR) α (ROR-α)9 e della proteina legante GATA 3 (GATA-3)10,11,12 . Nei topi, gli ILC2 "infiammatori" intestinali sono ulteriormente caratterizzati dall'espressione del recettore simile alla lectina delle cellule killer (sottofamiglia G membro 1, KLRG)13 dove rispondono a IL-2514,15 derivato dalle cellule del ciuffo epiteliali. Infine, le ILC di tipo 3, che includono cellule indurici del tessuto linfoide e ILC di tipo 3 simili a helper (ILC3), dipendono dal fattore di trascrizione ROR-γt16 e si raggruppano in gruppi che secernono il fattore stimolante la colonia di macrofagi dei granulociti (GM-CSF), IL-17 o IL-22 in risposta ai segnali locali IL-1β e IL-2317. Le cellule indurici del tessuto linfoide si raggruppano nei cerotti di Peyer e sono cruciali per lo sviluppo di questi organi linfoidi secondari durante lo sviluppo18, mentre gli ILC3 sono il sottotipo ILC più abbondante nella lamina propria dell'intestino tenue murino adulto. Uno dei primi sistemi di co-coltura di organoidi intestinali murini con ILC3 è stato sfruttato per separare l'impatto della citochina IL-22 sul trasduttore di segnale e attivatore della trascrizione 3 (STAT-3) mediato dalla ripetizione ricca di leucina contenente il recettore accoppiato alla proteina G 5 (Lgr5) + proliferazione delle cellule staminali intestinali19, un potente esempio di interazione rigenerativa ILC-epiteliale. Le ILC mostrano eterogeneità di impronta tra gli organi20,21 e mostrano plasticità tra i sottoinsiemi in risposta alle citochine polarizzanti22. Ciò che guida queste impronte tessuto-specifiche e le differenze di plasticità, e quale ruolo svolgono in malattie croniche come IBD23, rimangono argomenti interessanti che potrebbero essere affrontati utilizzando co-colture organoidiche.

Gli organoidi intestinali sono emersi come un modello di successo e affidabile per studiare l'epitelio intestinale24,25. Questi sono generati dalla coltivazione di cellule staminali Lgr5+ epiteliali intestinali, o intere cripte isolate, che includono le cellule di Paneth come fonte endogena del membro della famiglia Wnt 3A (Wnt3a). Queste strutture 3D sono mantenute in idrogel sintetici26 o in biomateriali che imitano la lamina propria basale, ad esempio la matrice extracellulare basale reticolante termica (TBEM), e sono ulteriormente integrate con fattori di crescita che imitano la nicchia circostante, in particolare il fattore di crescita epiteliale (EGF), l'inibitore della proteina morfogenetica ossea (BMP) Noggin e un Lgr5-ligando e Wnt-agonista R-Spondin127 . In queste condizioni, gli organoidi mantengono la polarità apico-basale epiteliale e ricapitolano la struttura cripto-villi dell'epitelio intestinale con cripte di cellule staminali in erba che si differenziano terminalmente in cellule assorbenti e secretorie al centro dell'organoide, che poi si riversano nello pseudolume interno da anoikis28. Sebbene gli organoidi intestinali da soli siano stati estremamente vantaggiosi come modelli riduzionisti di sviluppo e dinamica epiteliale in isolamento29,30, hanno un enorme potenziale futuro per capire come questi comportamenti sono regolati, influenzati o addirittura interrotti dal compartimento immunitario.

Nel seguente protocollo, viene descritto un metodo di co-coltura tra organoidi intestinali piccoli murini e ILC1 derivati dalla lamina propria, che è stato recentemente utilizzato per identificare come questa popolazione diminuisce inaspettatamente le firme intestinali dell'infiammazione e contribuisce invece ad aumentare la proliferazione epiteliale tramite TGF-β in questo sistema8.

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Protocollo

Tutti gli esperimenti devono essere completati in conformità e conformità con tutte le linee guida normative e istituzionali pertinenti per l'uso animale. L'approvazione etica per lo studio descritto nel seguente articolo e video è stata acquisita in conformità e conformità con tutte le linee guida normative e istituzionali pertinenti per l'uso animale.

Tutti i topi sono stati abbattuti per lussazione cervicale secondo la procedura etica standard, condotta da individui addestrati. Prima del prelievo di organi e tessuti, l'affettamento dell'arteria femorale o la decapitazione sono stati condotti (a seconda del protocollo in questione) come valutazioni di conferma della morte. Gli animali sono stati alloggiati in condizioni specifiche prive di agenti patogeni (salvo diversa indicazione) presso un'unità commerciale accreditata e un'unità animale del King's College di Londra in conformità con il UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 (UK Home Office Project License (PPL: 70/7869 a settembre 2018; P9720273E da settembre 2018).

1. Stabilire organoidi intestinali murini

NOTA: Questa sezione del protocollo descrive la generazione di organoidi intestinali dall'intestino tenue murino. Le cripte vengono prima isolate dal tessuto, risospese in TBEM e quindi incubate con mezzi contenenti EGF, Noggin e R-Spondin (ENR). Stabilire organoidi intestinali murini è stato anche ben descritto altrove 24,25,27.

  1. Posizionare TBEM su ghiaccio per scongelare (40 μL / pozzetto) e mettere una coltura tissutale standard trattata (si riferisce a piastre con una superficie idrofila e caricata negativamente) piastra a 24 pozzetti in un incubatore a 37 ° C per preriscaldare.
    NOTA: 500 μL di TBEM si scongelano in circa 2-4 ore; non lasciarlo a temperatura ambiente.
  2. Preparare ~ 4 mL o 550 mL per pozzetto di terreno ENR aggiungendo EGF, Noggin e R-Spondin al mezzo basale (Tabella 1) e metterlo in un incubatore a 37 °C.
  3. Abbattere un animale di 6-12 settimane e sezionare l'intestino tenue usando pinze e forbici da microdissezione. Metterlo in 15 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) sul ghiaccio.
  4. Usando lo stomaco e il cieco come punti di orientamento, isolare la regione desiderata dell'intestino tenue (duodeno, digiuno o ileo). In questo protocollo, l'ileo è isolato.
  5. Immergere l'intestino in PBS su una capsula di 10 cm2 Petri sul ghiaccio. Usando la pinza, rimuovere il grasso delicatamente, ma completamente, dall'intestino.
  6. Tagliare il tessuto longitudinalmente usando le forbici per microdissezione (preferibilmente con punte arrotondate per evitare perforazioni). Mantenere l'intestino immerso nella PBS, agitare per rimuovere la materia fecale e mantenere il lato mucoso fino a tracciare l'orientamento dei tessuti.
  7. Trasferire il tessuto sul coperchio asciutto di una capsula di Petri su ghiaccio, posizionando il lato mucoso / villus intestinale verso l'alto. Tenendo un'estremità dell'intestino con una pinza, raschiare delicatamente via il muco usando il bordo angolato di un vetrino pulito.
  8. Riempire la piastra con PBS ghiacciato e risciacquare il tessuto.
  9. Pre-rivestire un tubo da 50 mL con PBS2 (PBS + 2% FCS; vedi Tabella 1) per prevenire l'adesione del tessuto alla plastica e aggiungere 10 ml di PBS ghiacciato a questo tubo. Tagliare l'intestino in piccoli segmenti (~2 mm) e trasferirli nel tubo da 50 ml preverniciato con PBS2.
  10. Utilizzando una pipetta da 25 ml pre-rivestita con PBS2, pipettare i segmenti su e giù 5-10 volte per pulire i frammenti di tessuto.
  11. Lasciare che i segmenti si depositino per 15-30 s, rimuovere e scartare il surnatante PBS e ripetere i passaggi 1.10 e 1.11 fino a quando la soluzione è limpida (circa 3-4 volte).
  12. Lasciare che i segmenti si depositino e scartare il surnatante PBS. Aggiungere 30 ml di buffer di isolamento della cripta ghiacciata (Tabella 1).
  13. Posizionare i tubi su un rullo orizzontale o un bilanciere a 30-60 giri / min (o delicato) per 30 minuti a 4 ° C. Non incubare a velocità più elevate, temperature più elevate o durata più lunga poiché le cripte si sposteranno prematuramente e diventeranno singole cellule con minore vitalità e resa.
    NOTA: Da questa fase in poi, tutte le procedure devono essere condotte in un ambiente asettico utilizzando materiali e reagenti sterili.
  14. Lasciare che i segmenti intestinali si depositino alla base del tubo da 50 ml. Rimuovere il buffer di isolamento della cripta senza interrompere i segmenti stabilizzati e trasferirlo in un tubo da 50 ml sul ghiaccio.
    NOTA: se il processo di isolamento della cripta è stato troppo rigoroso, le cripte possono essere viste in questa frazione. Può quindi essere conservato come riserva, ma verrà scartato in modo ottimale alla fine del protocollo.
  15. Aggiungere 20 ml di PBS ghiacciato ai segmenti intestinali. Utilizzando una pipetta da 25 ml pre-rivestita con PBS2, pipetta segmenti intestinali su e giù 5-8 volte.
  16. Lascia che i segmenti si accontentino di 30 s. Pre-rivestire un tubo da 50 mL e una pipetta da 25 mL con PBS2. Usando questa pipetta, raccogliere il surnatante (frazione 1) nel tubo pre-rivestito da 50 ml e posizionare il tubo sul ghiaccio.
    NOTA: questa frazione serve a risciacquare il buffer di isolamento della cripta rimanente. Tuttavia, serve anche come ulteriore fase di controllo della qualità; se il pipettaggio è stato troppo vigoroso, le cripte saranno abbondanti in questa frazione di risciacquo, e se è stato troppo delicato, ci saranno pochissimi detriti in questa frazione. In modo ottimale, la frazione 1 viene scartata alla fine del protocollo, ma può essere utilizzata per produrre organoidi se sorgono problemi con le frazioni 2-4 ottenute di seguito.
  17. Ripetere i passaggi 1,15 e 1,16 ma aggiungere 10 ml di PBS ghiacciato anziché 20 ml e posizionare il surnatante in un tubo fresco da 50 ml preverniciato con PBS2 (frazione 2).
  18. Ripetere il passo 1,17 altre due volte, ma raggruppare il surnatante risultante con la frazione 2 (nello stesso tubo da 50 ml dal passaggio 1,17) per ottenere le frazioni 2-4. Questo singolo tubo da 50 ml dovrebbe contenere le cripte spostate in 30 ml di PBS ghiacciato.
  19. Rimuovere un'aliquota di 50 μL dalle 2-4 frazioni raggruppate e posizionarla su un coperchio. Valutare la presenza di cripte epiteliali utilizzando un microscopio a luce invertita.
    NOTA: se le cripte non sono presenti, ripetere i passaggi 1.17 e 1.18 utilizzando più forza durante il pipettaggio fino a quando le cripte non vengono rilasciate. Assicurarsi che le cripte non siano state spostate prematuramente nel buffer di isolamento della cripta dal passaggio 1.14 o nella frazione 1 dal passaggio 1.16.
  20. Pre-rivestire un filtro da 100 μm e un tubo da 50 ml con PBS2. Passare le frazioni di cripta raggruppate attraverso questo filtro e nel tubo pre-rivestito da 50 ml.
  21. Spin down frazioni di cripta tese a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
  22. Scartare il surnatante e risospendere le cripte in 10 ml di DMEM/F12 avanzato ghiacciato. Spostare le cripte in un tubo da 15 ml.
  23. Spin down cripte a 210 x g per 5 minuti a 4 °C per rimuovere singole cellule e linfociti.
  24. Cripte risospend in 1 mL di DMEM/F12 avanzato ghiacciato.
  25. Rimuovere un'aliquota da 10 μL e posizionarla su un coperchio. Utilizzando un microscopio a luce invertita, contare il numero di cripte per determinare la concentrazione della cripta.
  26. Calcola il volume richiesto per ~ 400 e ~ 1.500 cripte. Pre-rivestire una punta p1000 con PBS2 e utilizzare questa punta per pipettare i volumi richiesti (contenenti ~ 400 e ~ 1.500 cripte) in tubi separati da 1,5 ml.
  27. Girare le cripte a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
  28. Rimuovere il più possibile il surnatante e quindi risospesciare le cripte in 80 μL di TBEM posto su ghiaccio (punte di pipette pre-fredde a 4 °C per prevenire la gelificazione della matrice, che si verifica a 12 °C).
  29. Rimuovere la piastra a 24 pozzetti, posizionata nel passaggio 1.1, dall'incubatore. Pipettare delicatamente 40 μL di cripte nel centro di un pozzo in un movimento lento e circolare per formare una struttura a cupola piatta ma 3D, o in tre piccole cupole separate.
    NOTA: La vitalità degli organoidi è la più bassa al centro della cupola dove nutrienti e gas permeano meno efficacemente31; pertanto, massimizzare la superficie esposta ai supporti mantenendo chiare strutture 3D è fondamentale.
  30. Ripetere il passaggio 1.29 per creare un totale di due pozzi con una densità di ~ 200 cripte per pozzo e altri due pozzi con una densità di ~ 750 cripte per pozzetto. Posizionare direttamente la piastra in un incubatore (37 °C e 5% CO2) per 15-20 min, avendo cura di non disturbare le cupole viscose ma ancora a matrice liquida.
  31. Aggiungere 550 μL di mezzi ENR preriscaldati per pozzetto (dal punto 1.2) e incubare per 24 ore a 37 °C e 5% di CO2. In questa fase, si suggerisce di integrare il mezzo ENR con 5 μM di agonista Wnt (CHIR 99021) e 5 μM di inibitore della Rho Chinasi (Y-27632) per le prime 24 ore di coltura post isolamento per migliorare la resa e l'efficienza della generazione di organoidi di cripte appena isolate dal tessuto.
    NOTA: le cripte dovrebbero chiudersi per formare strutture arrotondate entro 24 ore e le gemme della cripta dovrebbero apparire entro 2-4 giorni (Figura 1A).
  32. Sostituire con mezzo ENR fresco alla fine dell'incubazione nel passaggio 1.31, e poi ogni ~ 2 giorni o quando l'indicatore di pH fenolico nel terreno di coltura diventa arancione pallido ma prima che diventi giallo.

2. Mantenimento degli organoidi intestinali murini

NOTA: Questa sezione del protocollo descrive il mantenimento e il passaggio di organoidi intestinali murini. Gli organoidi vengono prima raccolti e poi interrotti meccanicamente usando una punta p1000 piegata. Questo processo rompe grandi organoidi costituiti da numerose cripte in più frammenti più piccoli per l'espansione e rilascia cellule morte che si sono accumulate nella pseudolumen. Il mantenimento degli organoidi intestinali murini è stato anche ben descritto altrove 24,25,27. Tutte le procedure devono essere condotte in un ambiente asettico utilizzando materiali e reagenti sterili. Passaggio o espansione degli organoidi una volta ogni 4-5 giorni, prima che lo scoppio degli organoidi avvenga da un sostanziale accumulo di detriti nel lume organoide. Gli organoidi possono essere passati con un rapporto di 1:2-1:3 a seconda della densità organoide, che sarà ottimamente compresa tra 100-200 organoidi per pozzetto.

  1. Come nei passaggi 1.1 e 1.2, scongelare TBEM sul ghiaccio (40 μL / pozzetto) e preparare il mezzo ENR (550 μL per pozzetto). Posizionare la piastra a 24 pozzetti trattata con coltura tissutale media e standard in un incubatore a 37 °C.
  2. Rimuovere la piastra contenente organoidi dall'incubatrice. Scartare i media dal pozzo per essere passati.
  3. Aggiungere 500 μL di DMEM/F12 avanzato ghiacciato al pozzo. Utilizzando una punta p1000 (pre-rivestita con media per evitare che gli organoidi si attacchino all'interno della punta), raccogliere gli organoidi in un tubo da 15 ml.
  4. Risciacquare il fondo del pozzo con 250-300 μL di Advanced DMEM/F12 ghiacciato assicurandosi che non rimangano organoidi nel pozzo e raggruppare nel tubo da 15 ml contenente organoidi raccolti dal passaggio 2.3. Ripetere i passaggi 2.3 e 2.4 quando si passano più pozzetti e raggruppare gli organoidi da più pozzi nello stesso tubo da 15 ml.
  5. Ridurre gli organoidi a 300 x g per 3 minuti a 4 °C.
  6. Al momento della centrifugazione, assicurarsi che ci siano quattro frazioni visibili: una frazione di base con organoidi sani, una frazione di matrice centrale e chiara, una frazione di matrice contenente cellule singole e morte e uno strato superiore di surnatante contenente cellule singole e morte. Rimuovere il surnatante, la frazione di detriti e il più possibile il frammento di matrice chiara senza interrompere il pellet di organoidi.
  7. Piegare delicatamente la punta di una punta della pipetta p1000 (curva di circa 2-5 mm). Pre-rivestire questa punta in PBS2 o Advanced DMEM/F12. Usando questa punta, pipettare gli organoidi su e giù 10-20 volte per interrompere meccanicamente gli organoidi e la matrice rimanente.
  8. Girare verso il basso a 210 x g per 3 minuti a 4 °C.
  9. Come nel passaggio 2.6, rimuovere il surnatante, la frazione di detriti e il maggior numero possibile di frammenti di matrice chiara senza interrompere il pellet delle cripte dissociate. Se cripte sane o piccoli organoidi non hanno formato un pellet trasparente, centrifugare di nuovo a 300 x g per 3 minuti a 4 °C.
  10. Calcolare il volume richiesto di TBEM (80-120 μL per pozzetto di organoidi raccolti a seconda che venga utilizzato un rapporto di passaggio 1:2 o 1:3).
  11. Risospesciare il pellet nel volume calcolato di TBEM e applicare 40 μL per pozzetto alla piastra preriscaldata a 24 pozzetti per formare una cupola. Posizionare direttamente la piastra nell'incubatore (37 °C; 5% CO2) per 15-20 min.
  12. Aggiungere 550 μL di mezzo ENR per pozzetto e incubare a 37 °C e 5% di CO2. Controllare le colture per la formazione di organoidi dopo 24 ore. Sostituire con ENR medio fresco ogni 2-3 giorni dopo il passaggio.

3. Isolamento delle cellule linfoidi innate della lamina propria dell'intestino tenue

NOTA: Questa sezione del protocollo descrive l'isolamento di ILC1 dalla lamina propria murina dell'intestino tenue dei topi reporter RORγtGFP. Ciò comporta la rimozione delle cellule epiteliali, la digestione dei tessuti, la separazione del gradiente di densità dei linfociti e l'isolamento ILC1 tramite smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza (FACS). L'isolamento FACS seguendo la strategia di gating in Figura 2 richiede il mastermix di colorazione extracellulare (Tabella 4), con i controlli di colorazione aggiuntivi descritti nella Tabella 2 e nella Tabella 3 per la macchina (Tabella 2) e la gating (Tabella 3) impostati. I topi reporter RORγtGFP vengono utilizzati per isolare ILC1 vivo e puro e gate out RORγtGFP+ ILC3. L'elaborazione tissutale per l'isolamento dei linfociti della lamina propria è stata anche ben descritta altrove32.

  1. Lavorazione dei tessuti
    NOTA: il tessuto proveniente da singole repliche biologiche di animali è tenuto separato in questo protocollo. Questi campioni devono essere opportunamente etichettati e conservati sul ghiaccio ogni volta che è possibile. Tutti i reagenti ad eccezione degli enzimi digestivi devono essere autorizzati a raggiungere la temperatura ambiente per garantire una rapida digestione dei tessuti.
    1. Posizionare TBEM sul ghiaccio per scongelare (40 μL/pozzetto). Conservare una piastra standard a 24 pozzetti trattata con coltura tissutale in un incubatore a 37 °C per preriscaldare.
    2. Preparare un tampone fresco per la rimozione epiteliale e un tampone per la digestione (vedere Tabella 1). Preparare il mezzo isotonico a bassa densità di densità di viscosità (LVDGM) (90% LVDGM e 10% 10x PBS), il 40% isotonico LVDGM e l'80% isotonico LVDGM in tampone neutralizzante (Tabella 1).
    3. Abbattere un animale di 6-12 settimane, sezionare l'intestino tenue usando pinze e forbici da microdissezione e posizionare l'intestino in 15 ml di PBS sul ghiaccio.
    4. Immergere l'intestino in PBS su una capsula di 10 cm2 Petri sul ghiaccio e utilizzare una pinza per rimuovere il grasso delicatamente ma completamente dall'intestino.
    5. Rimuovere i cerotti di Peyer (~ 5-10; correndo in una linea opposta alla linea del tessuto adiposo) usando le forbici da microdissezione per esaurire le cellule indurici del tessuto linfoide e le cellule B.
      NOTA: le macchie di Peyer sono assenti in Rag-/- e in altri animali impoveriti di lignaggio. A differenza delle bolle d'aria, le patch di Peyer rimarranno al loro posto se spinte.
    6. Tagliare il tessuto longitudinalmente usando le forbici per microdissezione (preferibilmente con punte arrotondate per evitare perforazioni). Mantenendo l'intestino immerso nella PBS, agitare per rimuovere la materia fecale.
    7. Tagliare il tessuto in pezzi di 2-4 cm di lunghezza e trasferirli in un tubo da 50 ml.
    8. Aggiungere circa 20-40 ml di PBS ghiacciato e agitare vigorosamente per 5-15 s per rimuovere muco e detriti.
    9. Scartare il contenuto del tubo su una capsula di Petri fresca e sostituire i frammenti intestinali nello stesso tubo da 50 ml usando una pinza.
    10. Ripetere i passaggi 3.1.8 e 3.1.9 3-4 volte o fino a quando il PBS non è chiaro.
  2. Rimozione dell'epitelio
    1. Metti i frammenti intestinali in una capsula di Petri fresca sul ghiaccio. Usando una pinza, raccogli i segmenti intestinali e rimuovi il liquido in eccesso picchiettando su una superficie asciutta.
    2. Tagliare il tessuto in pezzi di ~ 0,75-1 cm e trasferirli in un tubo fresco da 50 ml. Aggiungere 5-7 ml di tampone di rimozione epiteliale (Tabella 1). Vortice del tubo e assicurarsi che tutti i segmenti intestinali siano immersi nel tampone.
    3. Incubare i campioni a 37 °C con dondolo (100-150 giri/min) per 12-15 min. Vortice il tubo per 20-30 s.
    4. Ripetere ancora una volta i passaggi 3.2.1-3.2.3, scartando il surnatante torbido (la frazione contiene cellule epiteliali e intraepiteliali) e sostituendolo con un tampone di rimozione epiteliale fresco.
  3. Digestione del tessuto
    1. Mancia il contenuto su una fresca capsula di Petri. Usando la pinza, raccogli i segmenti intestinali e tocca una superficie asciutta per scartare il liquido in eccesso. Metti i segmenti in una capsula di Petri fresca sul ghiaccio.
    2. Raggruppare i segmenti nel centro della capsula di Petri in una massa densa. Usando due bisturi o forbici affilate, triturare finemente il tessuto fino a raggiungere una consistenza viscosa che potrebbe passare attraverso una punta della pipetta p1000.
    3. Usando una pinzetta, posizionare il tessuto tritato in un tubo pulito da 50 ml. Risciacquare la capsula di Petri con 1-2 mL di tampone di digestione (Tabella 1) per raccogliere il tessuto rimanente e raggrupparlo nel tubo da 50 ml con il tessuto triturato.
    4. Aggiungere 5-7 ml di tampone di digestione al tessuto triturato e assicurarsi che tutto il tessuto sia raccolto sul fondo del tubo.
    5. Incubare i campioni a 37 °C, con dondolo medio (~100-150 giri/min) per 15 min. Vortice del tubo per 20-30 s ogni 5 minuti per aiutare la digestione.
    6. Mentre i campioni sono in incubazione, posizionare un filtro cellulare da 40 μm sopra una provetta fresca da 50 ml per ciascun campione. Rivestire i filtri con 1-2 mL di tampone neutralizzante (Tabella 1).
    7. Vortice i campioni per 20-30 s dopo che l'incubazione è terminata.
    8. Filtrare il tessuto parzialmente digerito attraverso il filtro rivestito da 40 μm nel tubo da 50 ml contenente tampone neutralizzante.
    9. Utilizzare una pinzetta per raccogliere il tessuto non digerito dal filtro da 40 μm e rimetterlo nel tubo da 50 ml in cui è stata eseguita la digestione, per il secondo ciclo di digestione. Rimuovere i filtri e risciacquarli con un tampone di digestione per rimuovere qualsiasi tessuto non digerito aderente al filtro.
    10. Una volta che il maggior numero possibile di tessuto non digerito è stato rimosso dal filtro e riposizionato nel tubo da 50 ml in cui è stata eseguita la digestione, sciacquare il filtro con un tampone neutralizzante da 1-2 ml sul tubo da 50 ml contenente il surnatante filtrato.
    11. Aggiungere 20-25 ml di tampone neutralizzante al surnatante filtrato e metterlo sul ghiaccio per mantenere la vitalità delle cellule isolate durante il secondo ciclo di digestione dei tessuti.
    12. Aggiungere altri 5-10 ml di tampone di digestione al tessuto non digerito e ripetere i passaggi 3.3.5-3.3.10, assicurandosi di filtrare il tessuto digerito nello stesso tubo utilizzato nel passaggio 3.3.8 (lo stesso filtro può anche essere riutilizzato). Risciacquare il filtro con tampone neutralizzante fino al raggiungimento della linea di 50 ml, quindi eliminare qualsiasi tessuto non digerito rimanente.
  4. Isolamento dei linfociti per gradiente di densità
    1. Ruotare i supernatanti raccolti per ogni replica biologica a 500 x g per 10 minuti.
    2. Durante il passaggio 3.4.1, aggiungere 5 mL di LVDGM isotonico all'80% a un tubo da 15 mL per ogni replica biologica.
    3. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante dal tessuto filtrato e digerito. Risospesciare il pellet in 10 ml di LVDGM isotonico al 40%, assicurando che il pellet sia ben omogeneizzato e che non rimangano pezzi di grandi dimensioni.
    4. Impostando l'aiuto della pipetta alla sua impostazione più lenta, inclinare il tubo da 15 ml contenente l'80% di LVDGM isotonico e sovrapporre molto delicatamente i 10 mL di sospensione cellulare in LVDGM isotonico al 40% assicurando che la sospensione cellulare non si mescoli con la frazione dell'80%.
      NOTA: Se le frazioni dovessero accidentalmente mescolarsi, distribuire rapidamente i linfociti che hanno raggiunto la frazione dell'80% tra due tubi da 50 ml riempiti con PBS e centrifugare per 10 minuti a 500 x g. Quindi, scartare il surnatante e ripetere i passaggi 3.4.3-3.4.4.
    5. Ruotare i tubi a 900 x g e 20 °C, con l'accelerazione e la deaccelerazione impostate sull'impostazione più bassa per garantire che le frazioni non vengano interrotte. Centrifuga per 20 minuti (escluso il tempo di pausa).
      NOTA: Tutte le procedure da questa fase in poi devono essere condotte in una cappa di coltura tissutale asettica utilizzando materiali e reagenti sterili.
    6. Pre-rivestire un tubo da 50 mL per ogni campione con PBS2 e aggiungere 45 mL di PBS ghiacciato.
    7. Dopo la centrifugazione, rimuovere delicatamente lo strato superiore di detriti dal tubo da 15 ml. Rivestire una punta p1000 con PBS2 e utilizzarla per raccogliere l'interfase carica di linfociti tra i gradienti del 40% -80% nel tubo da 50 ml contenente 45 ml di PBS ghiacciato.
    8. Ruotare i tubi a 300 x g per 5 minuti a 4 °C.
    9. Scartare il surnatante e risospesciare il pellet in 500 μL di tampone FACS (PBS, 2% FCS, 0,5 mM EDTA e 10 mM HEPES; vedere Tabella 1). Pre-rivestire un filtro da 40 μm con tampone FACS e utilizzarlo per filtrare la sospensione cellulare in un tubo di flusso. Risciacquare il tubo da 50 mL con ulteriori 500 μL di tampone FACS e filtrare nello stesso tubo di flusso.
    10. Rimuovere un'aliquota di 10 μL dal risultante 1 mL di sospensione cellulare. Contare la resa dei linfociti utilizzando un contatore cellulare o un emocitometro e calcolare la concentrazione cellulare per ciascun campione.
  5. Preparazione del campione per la cernita - colorazione extracellulare
    NOTA: Gli anticorpi utilizzati nel mastermix di colorazione extracellulare, così come i reagenti per preparare il colorante di vitalità fissabile e la soluzione di blocco Fc, sono utilizzati in concentrazioni sufficienti per un massimo di 5 x 106 celle per 100 μL. I volumi devono essere regolati di conseguenza. Affinché la compensazione della macchina FACS per ordinare ILC1, sono necessari controlli monocolore per ciascuno dei fluorofori nel mastermix di colorazione extracellulare. Per gli anticorpi, possono essere utilizzate perle di compensazione che contengono una popolazione di perline leganti anticorpi positivi e una popolazione di perline non leganti anticorpali negativi. Per il controllo del colorante di vitalità fissabile ultravioletto (UV) a colore singolo, è possibile utilizzare perline di compensazione che contengono popolazioni ammino-reattive (per segnale positivo) e non reattive (per segnale negativo). Non è consigliabile utilizzare cellule dal RORγtGFPtopi reporter per il controllo del colorante di vitalità fissabile UV a colore singolo, poiché queste cellule conterranno un GFP+ segnale.
    1. Rimuovere una piccola aliquota di ~10 μL da ciascun campione e raggrupparla in un tubo di flusso separato contenente 250 μL di tampone FACS. Posizionare il tubo sul ghiaccio. Questo verrà utilizzato per il controllo non macchiato.
    2. Aggiungere 1 mL di PBS al volume rimanente nelle provette del campione. Centrifuga a 300-400 x g per 3-5 min.
    3. Preparare 200 μL di soluzione colorante di vitalità fissabile ai raggi UV per campione. Colorante di vitalità fissabile UV diluito (risospeso in DMSO seguendo le istruzioni del produttore) 1:500 in PBS (o seguendo le istruzioni del produttore).
    4. Scartare il surnatante e risospesciare i campioni in 200 μL di soluzione colorante di vitalità fissabile UV. Vorticare i tubi e incubare al buio a 4 °C per 10-15 min.
    5. Aggiungere 2 mL di tampone FACS ai tubi per spegnere il colorante di vitalità fissabile UV, vortice per 10 s e centrifugare i tubi a 300-400 x g per 3-5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante dai tubi centrifugati.
    6. Preparare 200 μL di soluzione di blocco Fc per campione (0,25 mg/mL di blocco Fc nel tampone FACS).
    7. Aggiungere 200 μL di soluzione di blocco Fc a ciascuno dei campioni dal punto 3.5.5, vortice per 10 s e incubare al buio a 4 °C per 10 minuti.
    8. Aggiungere 500 μL di tampone FACS a un tubo di flusso fresco. Rimuovere un'aliquota di 2-5 μL da ciascun campione e raggrupparla nel tubo per i controlli di fluorescenza meno uno (FMO).
    9. Ruotare il tubo FMO per 10 s e distribuirlo uniformemente (100 μL per tubo) in tubi a flusso fresco etichettati per ciascuno dei controlli FMO (Cocktail di linea FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO e NK1.1 FMO; vedere Tabella 3). Aggiungere tutti gli anticorpi tranne l'anticorpo di interesse per ciascun tubo (come descritto nella Tabella 3) e vortice per 10 s. Mettere da parte i comandi FMO al buio a 4 °C.
    10. Centrifugare i campioni (non controlli FMO) a 300-400 x g per 3-5 min a 4 °C.
    11. Preparare mastermix di colorazione extracellulare (200 μL per campione) con le diluizioni anticorpali finali come descritto nella Tabella 4. Regolare il volume di colorazione per la concentrazione cellulare appropriata (fino a 5 x 106 celle per 100 μL) in base al conteggio delle cellule dal passaggio 3.4.10.
    12. Aggiungere il mastermix di colorazione extracellulare ai campioni, vortice per 10 s e metterli da parte al buio a 4 °C.
    13. Preparare un nuovo controllo monocolore per ogni anticorpo destinato ad essere utilizzato nella strategia di gating (Figura 2). Perle di compensazione degli anticorpi Vortex per 20 s, aggiungere 1 goccia di perline a un tubo di flusso, macchiare con 0,5 μL di anticorpo (come mostrato nella Tabella 2 o seguendo le istruzioni del produttore) e vortice per 10 s.
    14. Preparare un controllo monocolore del colorante di vitalità fissabile ai raggi UV utilizzando un kit di perline di compensazione ammino-reattive. Perle di compensazione ammino-reattive al vortice per 20 s, aggiungere 1 μL di colorante UV vivo/morto (come mostrato nella Tabella 2 o seguendo le istruzioni del produttore) e vortice per 10 s.
    15. Incubare i campioni, gli FMO e i controlli monocolore al buio per 30 minuti a 4 °C.
    16. Durante questo periodo, preparare i tubi per raccogliere le cellule selezionate. Aggiungere 400-500 μL del 10% fbS in provette Advanced DMEM/F12 a 1,5 mL per ciascun campione.
    17. Dopo l'incubazione, aggiungere 2 ml di PBS2 a ciascuno dei campioni, ai controlli FMO e ai controlli a colore singolo.
    18. Centrifugare i campioni, i controlli FMO e i controlli monocolore a 300-400 x g per 3-5 minuti a 4 °C.
    19. Scartare il surnatante da tutti i tubi centrifugati. Sospendere i campioni e i controlli FMO in 250 μL di tampone FACS e vortice per 10 s.
    20. Sospendere i controlli a colore singolo in 250 μL di PBS2. Aggiungere 1 goccia di perline amminiche non reattive al solo controllo monocolore del colorante di vitalità fissabile UV. Vortex tutti i controlli per 10 s.
    21. Le celle sono ora pronte per essere ordinate. Mantenere campioni, controlli FMO e controlli a colore singolo sul ghiaccio al buio quando possibile per migliorare la vitalità cellulare e prevenire la perdita di segnale da fotosbiancamento.

4. Co-coltura di piccoli organoidi intestinali con cellule linfoidi innate

NOTA: Questa sezione descrive la co-coltura di ILC1 intestinale murino ordinato (isolato seguendo il protocollo di cui al paragrafo 3) con organoidi murini a piccoli intestinali (descritti nei paragrafi 1 e 2). Gli organoidi devono essere utilizzati in modo ottimale 1-2 giorni dopo il passaggio. La co-coltura comporta la raccolta degli organoidi, l'aggiunta del numero appropriato di ILC1, la centrifugazione agli organoidi a pellet e ILC1 insieme e la riesuspensione in TBEM. Completa questa sezione il prima possibile una volta che ILC1 è stato isolato. Tutte le procedure devono essere condotte in un ambiente asettico utilizzando materiali e reagenti sterili.

  1. Assicurarsi che TBEM dal passaggio 3.1.1 sia stato scongelato.
  2. Raccogli gli organoidi di 1-2 giorni come descritto nei passaggi 2.3 e 2.4.
  3. Sospendere il pellet organoide in 1 mL di DMEM/F12 avanzato freddo ghiacciato. Non piegare la punta p1000 come fatto durante il passaggio degli organoidi, poiché l'intenzione qui è quella di mantenere la struttura organoide per la co-coltura. Se necessario, posizionare gli organoidi in tubi separati da 1,5 ml rivestiti pbs2 su ghiaccio per un breve periodo da distribuire tra diverse condizioni di cocoltura.
    NOTA: iniziare la preparazione degli organoidi solo quando i campioni ILC sono pronti per la co-coltura; lavorare sul ghiaccio e rapidamente non appena gli organoidi sono stati raccolti per ridurre al minimo la morte delle cellule epiteliali.
  4. Pre-rivestire un tubo da 1,5 ml con PBS2 per campione di replica ILC. Distribuire ~ 100-200 organoidi (circa 1 pozzetto di una piastra a 24 pozzetti) in ciascun tubo.
  5. Pre-rivestire una punta p1000 in PBS2 e utilizzarla per valutare il volume di ILC1 dopo la purificazione FACS (250-300 μL + volume ordinato). Determinare la concentrazione di ILC1 per mL utilizzando il numero di celle registrate dall'ordinamento e determinare il volume richiesto.
  6. Utilizzando la stessa punta p1000 rivestita PBS2, aggiungere non meno di 500 ILC1 al tubo da 1,5 ml rivestito PBS2 contenente gli organoidi. Se il numero di ILC1 prodotti dal tipo è inferiore a 500, aggiungere l'organoide direttamente al tubo contenente il tipo originale per ridurre al minimo la perdita di cellule dal trasferimento.
  7. Spin down ILC1 e organoidi a 300 x g per 5 min a 4 °C. Se possibile, evitare centrifughe da tavolo di piccolo diametro, in quanto queste raggrupperanno le celle lungo il bordo dell'interno del tubo invece di creare un pellet sulla punta del tubo. Poiché i numeri di cella sono molto bassi, è imperativo ridurre al minimo la perdita di cellule durante questi passaggi.
  8. Rimuovere lentamente e delicatamente il più possibile il surnatante senza disturbare il pellet (che potrebbe non essere visibile a occhio, specialmente nei controlli senza organoidi solo ILC). Posizionare il campione sul ghiaccio.
  9. Sospendere il pellet freddo in 30 μL per pozzetto di TBEM. Tenendo il tubo su una superficie fredda (ad esempio, una piccola scatola di ghiaccio posta nella cappa di coltura del tessuto), mescolare gli organoidi e l'ILC almeno 10-15 volte per garantire una distribuzione uniforme. Triturare frequentemente ma delicatamente, per evitare di danneggiare gli organoidi e la formazione di bolle.
  10. Applicare 30 μL per pozzetto di organoidi ILC in TBEM su una piastra preriscaldata a 24 o 48 pozzetti per formare una singola cupola. Posizionare direttamente la piastra nell'incubatore (37 °C e 5% CO2) per 10-20 min.
    NOTA: si consiglia vivamente di impostare controlli solo ILC e solo organoidi per l'analisi a valle. Gli ILC1 sono rari, ma GFP-ILC2 può essere sostituito dai controlli di immunofluorescenza o di citometria a flusso FSC/SSC ove scientificamente appropriato.
  11. Aggiungere 550 μL (per pozzetto) di mezzo ILC1 completo (ENR + IL-2 + IL-7 + IL-15 + 2-Mercaptoetanolo; vedere Tabella 1) con qualsiasi citochina sperimentale desiderata o anticorpi bloccanti e incubare a 37 °C e 5% CO2 per 24 ore.
  12. Dopo 24 ore, rimuovere delicatamente la piastra dall'incubatrice e lasciare che la piastra si sieda in una cappa di coltura tissutale per 1 minuto per garantire che i linfociti siano sistemati.
  13. Rimuovere 200-250 μL di media e metterlo in un pozzo vuoto di una piastra a 24 pozzetti. Controllare questo surnatante con un microscopio invertito per assicurarsi che non siano stati rimossi i linfociti.
    1. Se il surnatante è chiaro, aggiungere 300 μL di mezzo ILC1 fresco alla co-coltura nel pozzo originale. Se i linfociti sono presenti nel surnatante, centrifugare a 300-400 x g per 3-5 minuti a 4 °C e risospendere in 300 μL di mezzo ILC1 fresco e aggiungerlo ai restanti 200-250 μL di terreno nel pozzetto originale. Assicurarsi di ricostituire i supporti ogni 1-2 giorni o quando il supporto diventa arancione pallido / giallo.
      NOTA: non lasciare evaporare il supporto in misura sufficiente da non rompere la superficie del supporto da parte della punta della cupola della matrice. Assicurarsi sempre che la matrice sia completamente sommersa. L'evaporazione eccessiva può essere evitata utilizzando pozzi centrali nelle piastre di coltura tissutale e aggiungendo ~ 600 μL di PBS ai pozzi circostanti. Le co-colture con ILC adulto sono stabili per 1-4 giorni, dopo di che gli organoidi che sono stati seminati senza gravi interruzioni si romperanno e saranno riseminati come nuove cripte. Se si analizza l'epitelio, si raccomanda di analizzare le colture entro 1-4 giorni dalla creazione di co-colture.
    2. Eseguire analisi a valle utilizzando l'immunofluorescenza, la citometria a flusso o la purificazione FACS delle popolazioni bersaglio in tampone di lisi per l'analisi dell'espressione genica mediante RNA-seq o RT-qPCR a singola cellula o massa, come descritto nel riferimento8.

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Risultati

Una volta completate con successo, le cripte appena isolate dovrebbero formare strutture di cripte in erba entro 2-4 giorni (Figura 1A). Le colture organoidi sane e robuste dovrebbero crescere attivamente e possono essere passate ed espanse come dettagliato nel protocollo.

Questo protocollo descrive l'isolamento dell'ILC1 dell'intestino tenue dalla linea di reporter transgenici murini RORγtGFP , che consente l'isolamento di ILC1 vivo mediante FACS (

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Discussione

Questo protocollo descrive i metodi per stabilire organoidi murini dell'intestino tenue, isolando il raro ILC1 riducendo al minimo la perdita di linfociti durante il protocollo di dissociazione intestinale e stabilendo co-colture tra questi due compartimenti. Ci sono molti passaggi per questo protocollo, e mentre alcuni sono specifici per ILC1, questo approccio può essere applicato ad altri tipi di cellule immunitarie intestinali e le configurazioni di co-coltura possono essere adattate in modo modulare per soddisfare le...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse.

Ringraziamenti

E.R. riconosce una borsa di dottorato dal Wellcome Trust (215027 / Z / 18 / Z). G.M.J. riconosce una borsa di dottorato dal Wellcome Trust (203757 / Z / 16 / A). D.C. riconosce un dottorato di ricerca. studentship dal NIHR GSTT BRC. J.F.N. riconosce una borsa di studio Marie Skłodowska-Curie, una borsa di studio King's Prize, una borsa di studio RCUK / UKRI Rutherford Fund (MR / R024812 / 1) e un Seed Award in Science dal Wellcome Trust (204394 / Z / 16 / Z). Ringraziamo anche il team principale della citometria a flusso BRC con sede presso il Guy's Hospital. I topi reporter Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 sono stati un generoso dono di G. Eberl (Institut Pasteur, Parigi, Francia). I topi CD45.1 C57BL/6 sono stati gentilmente somministrati da T. Lawrence (King's College London, Londra) e P. Barral (King's College London, Londra).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Reagents
2-MercaptoethanolGibco21985023
Anti-mouse CD45 (BV510)BioLegend103137
Anti-mouse NK1.1 (PE)Thermo Fisher Scientific12-5941-83
B-27 Supplement (50X), senza sieroGibco17504044
CD127 Anticorpo monoclonale (APC)Thermo Fisher Scientific17-1271-82
CD19 Anticorpo monoclonale (eFluor 450)Thermo Fisher Scientific48-0193-82
CD3e anticorpo monoclonale (eFluor 450)Thermo Fisher Scientific48-0051-82
CD5 anticorpo monoclonale (eFluor 450)Thermo Fisher Scientific48-0031-82
CHIR99021Tocris4423/10
COLLAGENASI D, 500MGMerck11088866001
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Lalinea cellulare è stata utilizzata per raccogliere il surnatante RSpondin1 condizionato, la linea cellulare e l'accordo di trasferimento dei materiali sono stati forniti dal Consiglio di amministrazione della Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD, PhD, Stanford University)
DISPASE II (PROTEASI NEUTRA, GRADO II)Merck4942078001
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12)Gibco11320033
DNASE I, GRADE IIMerck10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X)Gibco21969-035
Ethilenediamine Tetraacetato AcidThermo Fisher ScientificBP2482-100
FC block2B ScientificBE0307
Siero fetale bovino, qualificato, inattivatoGibco10500064
GlutaMAX (100X)Gibco3050-038
Soluzione salina bilanciata di Hanks (10X)Gibco14065056
HBSS (1X)Gibco12549069
HEK-293T- mNoggin-Fc Lalinea cellulare Cells è stata utilizzata per raccogliere il surnatante Noggin condizionato, una linea cellulare acquisita attraverso un accordo di trasferimento di materiali con l'Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, Paesi Bassi, e si basa sulla pubblicazione di Farin, Van Es e Clevers Gastroenterology (2012).
Soluzione tampone HEPES (1M)Gibco15630-056
KLRG1 (PerCP eFluor-710)Thermo Fisher Scientific46-5893-82
Kit colorante per cellule morte blu fissabile vivo/morto, per eccitazione UVThermo Fisher ScientificL23105
Anticorpo monoclonale Ly-6G/Ly-6C (eFluor 450)Thermo Fisher Scientific48-5931-82
Matrigel Fattore di crescita Matrice della membrana basale ridotta, senza rosso fenolo, senza LDEVCorning356231
N-2 Supplement (100X)Gibco17502048
N-acetilcisteina (500mM)MerckA9165
NKp46 Anticorpo monoclonale (PE Cianina7)Thermo Fisher25-3351-82
PBS (1 X) 7,2 pHThermo Fisher Scientific12549079
PBS (10X)Gibco70013032
PercollCytiva17089101
EGF umano ricombinante, R& Proteine prive di animali D SystemsAFL236
Proteina umana ricombinante IL-15 GMP, FCR& D Systems247-GMP
IL-2 umano ricombinante (senza carrier)BioLegend589106
Topo ricombinante IL-7 (senza carrier)R& D Systems407-ML-005/CF
UltraComp eBeadsThermo Fisher Scientific01-2222-42
Y-27632 dicloridrato (inibitore ROCK)Bio-techne1254
Plastics
50 mL provettaFalcon10788561
1,5 mLEppendorf30121023
Pippette da 10 mLStarLabE4860-0010
Provetta da 15 mLFalcon11507411
Pippette da 25 mLStarLabE4860-0025
p10 punte PippetteStarLabS1121-3810-C
P1000 punte PippetteStarLabI1026-7810
p200 punte PippetteStarLabE1011-0921
Piastra a 24 pozzetti trattata per coltura tissutale standardFalcon353047
Equipment
CentrifugeEppendorf5810 R
Incubatore a CO2 e temperatura controllataEppendorfGalaxy 170 R/S
Flow Assisted Cellular SorterBD equipmentFACS Aria II
Agitatore riscaldatoStuart EquipmentSI500
Ice box-
Microscopio a luce invertitaThermo Fisher ScientificEVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)
p10 pippetteEppendorf3124000016
p1000 pippetteEppendorf3124000063
p200 pippetteEppendorf3124000032
Pippette gunEppendorf4430000018
Ghiaccio bagnato--
Anticorpo monoclonale

Riferimenti

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