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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Kokultur von murinen Dünndarm-Epithelorganoiden mit angeborenen lymphatischen Zellen

Published: March 23, 2022 doi: 10.3791/63554
Automatic Translation
*1,2, *1,2,3, 1, 1
1Centre for Host-Microbiome Interactions, King’s College London, 2Wellcome Trust Cell Therapies and Regenerative Medicine Ph.D. Programme, King’s College London, 3Present address: Wellcome Trust/Cancer Research UK Gurdon Institute, Cambridge University
* These authors contributed equally

Summary

Dieses Protokoll bietet detaillierte Anweisungen zur Etablierung von murinen Dünndarmorganoiden, zur Isolierung angeborener Lymphzellen des Typs 1 aus der murinen Dünndarmlamina propria und zur Etablierung von 3-dimensionalen (3D) Kokulturen zwischen beiden Zelltypen, um bidirektionale Wechselwirkungen zwischen Darmepithelzellen und angeborenen lymphatischen Typ-1-Zellen zu untersuchen.

Abstract

Komplexe Co-Kulturen von Organoiden mit Immunzellen bieten ein vielseitiges Werkzeug, um die bidirektionalen Wechselwirkungen zu hinterfragen, die das empfindliche Gleichgewicht der Schleimhauthomöostase untermauern. Diese multizellulären 3D-Systeme bieten ein reduktionistisches Modell für die Behandlung multifaktorieller Erkrankungen und die Lösung technischer Schwierigkeiten, die bei der Untersuchung seltener Zelltypen wie geweberesidenten angeborenen lymphatischen Zellen (ILCs) auftreten. Dieser Artikel beschreibt ein murines System, das Dünndarmorganoide und von Dünndarmlamina propria abgeleitete helferähnliche Typ-1-ILCs (ILC1s) kombiniert, die leicht auf andere ILC- oder Immunpopulationen ausgedehnt werden können. ILCs sind eine gewebeansässige Population, die besonders in der Schleimhaut angereichert ist, wo sie die Homöostase fördern und schnell auf Schäden oder Infektionen reagieren. Organoide Co-Kulturen mit ILCs haben bereits begonnen, neue epitheliale Immunsignalmodule im Darm zu beleuchten und zu zeigen, wie verschiedene ILC-Untergruppen die Integrität und Regeneration der Darmepithelbarriere beeinflussen. Dieses Protokoll wird weitere Untersuchungen über reziproke Wechselwirkungen zwischen Epithel- und Immunzellen ermöglichen, die das Potenzial haben, neue Einblicke in die Mechanismen der Schleimhauthomöostase und -entzündung zu liefern.

Introduction

Die Kommunikation zwischen dem Darmepithel und dem darmresidenten Immunsystem ist für die Aufrechterhaltung der Darmhomöostase von zentraler Bedeutung1. Störungen dieser Wechselwirkungen sind sowohl mit lokalen als auch mit systemischen Erkrankungen verbunden, einschließlich entzündlicher Darmerkrankungen (IBD) und Magen-Darm-Krebs2. Ein bemerkenswertes Beispiel für einen kürzlich beschriebenen kritischen Regulator der Homöostase stammt aus der Untersuchung angeborener lymphatischer Zellen (ILCs), die sich als Schlüsselfiguren in der intestinalen Immunlandschaftherauskristallisiert haben 3. ILCs sind eine Gruppe heterogener angeborener Immunzellen, die die intestinale Homöostase regulieren und Entzündungen weitgehend durch Zytokin-vermittelte Signalgebung orchestrieren4.

Murine ILCs sind grob in Subtypen unterteilt, basierend auf Transkriptionsfaktor-, Rezeptor- und Zytokinexpressionsprofilen5. Typ-1-ILCs, zu denen zytotoxische Natural Killer (NK)-Zellen und helferähnliche Typ-1-ILCs (ILC1s) gehören, werden durch die Expression des Transkriptionsfaktors (Eomesodermin) Eomes und T-Box-Proteins, die in T-Zellen (T-bet)6 exprimiert werden, sowie Sekretionszytokine, die mit T-Helfer-Typ-1 (TH1) assoziiert sind, definiert: Interferon-γ (IFNγ) und Tumornekrosefaktor (TNF) als Reaktion auf Interleukin (IL)-12, IL-15 und IL-187. Während der Homöostase sezernieren geweberesidente ILC1s den transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF-β), um die Epithelproliferation und den Matrixumbauvoranzutreiben 8. Typ-2-ILCs (ILC2s) reagieren in erster Linie auf eine Helmintheninfektion über die Sekretion von T-Helfer-Typ-2 (TH2)-assoziierten Zytokinen: IL-4, IL-5 und IL-13, und sind durch die Expression von Retinsäure-assoziierten Orphan-Rezeptoren (ROR) α (ROR-α)9 und GATA Binding Protein 3 (GATA-3)10,11,12 gekennzeichnet. . Bei Mäusen sind intestinale "entzündliche" ILC2s weiter durch die Expression des Killerzell-lektinähnlichen Rezeptors (Unterfamilie G Member 1, KLRG)13 gekennzeichnet, wo sie auf epitheliale Büschelzell-abgeleitete IL-2514,15 reagieren. Schließlich sind Typ-3-ILCs, zu denen lymphatische Gewebeinduktorzellen und helferähnliche Typ-3-ILCs (ILC3s) gehören, vom Transkriptionsfaktor ROR-γt16 abhängig und gruppieren sich in Gruppen, die entweder Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-Stimulierungsfaktor (GM-CSF), IL-17 oder IL-22 als Reaktion auf lokale IL-1β- und IL-23-Signale17 absondern. Lymphoide Gewebeinduktorzellen gruppieren sich in Peyer-Pflastern und sind entscheidend für die Entwicklung dieser sekundären lymphatischen Organe während der Entwicklung18, während ILC3s der am häufigsten vorkommende ILC-Subtyp im erwachsenen murinen Dünndarmlamina propria sind. Eines der frühesten murinen Darm-Organoid-Co-Kultursysteme mit ILC3s wurde genutzt, um den Einfluss des Zytokins IL-22 auf den Signalwandler und den Aktivator der Transkription 3 (STAT-3) zu zerlegen, der den Leucin-Rich Repeat Containing G Protein Coupled Receptor 5 (Lgr5) + die Proliferation von Darmstammzellen19 vermittelt, ein starkes Beispiel für eine regenerative ILC-Epithel-Interaktion. ILCs zeigen eine Abdruck-Heterogenität zwischen den Organen 20,21 und eine Plastizität zwischen Teilmengen als Reaktion auf polarisierende Zytokine22. Was diese gewebespezifischen Abdrücke und Plastizitätsunterschiede antreibt und welche Rolle sie bei chronischen Erkrankungen wie IBD23 spielen, bleiben spannende Themen, die mit organoiden Co-Kulturen adressiert werden könnten.

Darmorganoide haben sich als erfolgreiches und zuverlässiges Modell zur Untersuchung des Darmepithels24,25 herausgestellt. Diese werden durch Kultivierung von intestinalen epithelialen Lgr5+-Stammzellen oder ganzen isolierten Krypten erzeugt, zu denen Paneth-Zellen als endogene Quelle des Wnt-Familienmitglieds 3A (Wnt3a) gehören. Diese 3D-Strukturen werden entweder in synthetischen Hydrogelen26 oder in Biomaterialien beibehalten, die die basale lamina propria nachahmen, zum Beispiel der Thermal-Crosslinking Basal Extracellular Matrix (TBEM), und werden durch Wachstumsfaktoren ergänzt, die die umgebende Nische nachahmen, insbesondere Epithelial Growth Factor (EGF), der Bone Morphogenetic Protein (BMP)-Inhibitor Noggin und ein Lgr5-Ligander und Wnt-Agonist R-Spondin127 . Unter diesen Bedingungen halten Organoide die epitheliale apiko-basale Polarität aufrecht und rekapitulieren die Krypta-Zotten-Struktur des Darmepithels mit knospenden Stammzellkrypten, die sich im Zentrum des Organoids endgültig in absorbierende und sekretorische Zellen differenzieren, die dann durch Anoikis28 in das innere Pseudolumen abgeworfen werden. Obwohl Darmorganoide allein als reduktionistische Modelle der Epithelentwicklung und -dynamik in Isolation von großem Vorteil waren29,30, bergen sie ein enormes zukünftiges Potenzial, um zu verstehen, wie diese Verhaltensweisen vom Immunkompartiment reguliert, beeinflusst oder sogar gestört werden.

Im folgenden Protokoll wird eine Methode der Kokultur zwischen murinen Dünndarmorganoiden und von Lamina propria abgeleiteten ILC1s beschrieben, die kürzlich verwendet wurde, um zu identifizieren, wie diese Population unerwartet die Darmsignaturen von Entzündungen verringert und stattdessen zu einer erhöhten Epithelproliferation über TGF-β in diesem System beiträgt8.

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Protocol

Alle Versuche müssen in Übereinstimmung mit allen relevanten regulatorischen und institutionellen Richtlinien für die Tiernutzung durchgeführt werden. Die ethische Genehmigung für die im folgenden Artikel und Video beschriebene Studie wurde in Übereinstimmung mit allen relevanten regulatorischen und institutionellen Richtlinien für die Tiernutzung eingeholt.

Alle Mäuse wurden durch Zervixdislokation nach dem ethischen Standardverfahren gekeult, das von geschulten Personen durchgeführt wurde. Vor der Organ- und Gewebeentnahme wurde das Schneiden der Oberschenkelarterie oder die Enthauptung (entsprechend dem vorliegenden Protokoll) als bestätigende Beurteilung des Todes durchgeführt. Die Tiere wurden unter spezifisch-pathogenfreien Bedingungen (sofern nicht anders angegeben) in einer akkreditierten kommerziellen Einheit und einer Tiereinheit des King's College London gemäß dem UK Animals (Scientific Procedures) Act 1986 (UK Home Office Project License (PPL: 70/7869 to September 2018; P9720273E vom September 2018).

1. Etablierung muriner Dünndarmorganoide

HINWEIS: Dieser Abschnitt des Protokolls beschreibt die Erzeugung von Darmorganoiden aus dem murinen Dünndarm. Krypten werden zuerst aus Gewebe isoliert, in TBEM resuspendiert und dann mit Medien inkubiert, die EGF, Noggin und R-Spondin (ENR) enthalten. Die Etablierung muriner Dünndarmorganoide wurde auch an anderer Stelle gut beschrieben24,25,27.

  1. TBEM zum Auftauen (40 μL/Well) auf Eis legen und eine mit einer Standardgewebekultur behandelte Standard-Gewebekultur-behandelte (bezieht sich auf Platten mit hydrophiler und negativ geladener Oberfläche) 24-Well-Platte in einen 37 °C-Inkubator zum Vorwärmen legen.
    HINWEIS: 500 μL TBEM tauen in ca. 2-4 h auf; Lassen Sie es nicht bei Raumtemperatur stehen.
  2. Bereiten Sie ~ 4 ml oder 550 ml ENR-Medium pro Vertiefung auf, indem Sie EGF, Noggin und R-Spondin in das Basalmedium geben (Tabelle 1) und in einen 37 °C-Inkubator geben.
  3. Cullen Sie ein 6-12 Wochen altes Tier und sezieren Sie den Dünndarm mit einer Pinzette und einer Mikrodissektionsschere. Legen Sie es in 15 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf Eis.
  4. Verwenden Sie den Magen und das Caecum als Orientierungspunkte, um die gewünschte Region des Dünndarms (Zwölffingerdarm, Jejunum oder Ileum) zu isolieren. In diesem Protokoll ist das Ileum isoliert.
  5. Tauchen Sie den Darm in PBS auf eine 10 cm2 große Petrischale auf Eis. Entfernen Sie mit einer Pinzette sanft, aber vollständig Fett aus dem Darm.
  6. Schneiden Sie das Gewebe längs mit einer Mikrodissektionsschere (vorzugsweise mit abgerundeten Spitzen, um Perforation zu vermeiden). Halten Sie den Darm in PBS getaucht, schütteln Sie, um Fäkalien zu entfernen, und halten Sie die Schleimseite aufrecht, um die Gewebeorientierung zu verfolgen.
  7. Gewebe auf den trockenen Deckel einer Petrischale auf Eis geben und die Darmschleimhaut/den Zotten mit der Seite nach oben legen. Halten Sie ein Ende des Darms mit einer Pinzette und kratzen Sie den Schleim vorsichtig mit der abgewinkelten Kante eines sauberen Glasobjektträgers ab.
  8. Füllen Sie die Platte mit eiskaltem PBS und spülen Sie das Gewebe ab.
  9. Beschichten Sie ein 50-ml-Röhrchen mit PBS2 (PBS + 2% FCS; siehe Tabelle 1), um eine Anhaftung des Gewebes am Kunststoff zu verhindern, und fügen Sie diesem Röhrchen 10 ml eiskaltes PBS hinzu. Schneiden Sie den Darm in kleine (~ 2 mm) Segmente und geben Sie sie in das 50-ml-Rohr, das mit PBS2 vorbeschichtet ist.
  10. Mit einer mit PBS2 vorbeschichteten 25-ml-Pipette pipettieren Sie die Segmente 5-10 Mal auf und ab, um die Gewebefragmente zu reinigen.
  11. Lassen Sie die Segmente 15-30 s einpendeln, entfernen und verwerfen Sie den PBS-Überstand und wiederholen Sie die Schritte 1.10 und 1.11, bis die Lösung klar ist (ungefähr 3-4 mal).
  12. Lassen Sie die Segmente absetzen und verwerfen Sie den PBS-Überstand. Fügen Sie 30 ml eiskalten Krypta-Isolationspuffer hinzu (Tabelle 1).
  13. Platzieren Sie die Rohre auf einer horizontalen Rolle oder Wippe bei 30-60 U / min (oder sanft) für 30 min bei 4 ° C. Inkubieren Sie nicht mit höheren Geschwindigkeiten, höheren Temperaturen oder längerer Dauer, da sich die Krypten vorzeitig lösen und zu einzelnen Zellen mit geringerer Lebensfähigkeit und Ausbeute werden.
    HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt sollten alle Verfahren in einer aseptischen Umgebung mit sterilen Materialien und Reagenzien durchgeführt werden.
  14. Lassen Sie die Darmsegmente an der Basis der 50-ml-Röhre absetzen. Entfernen Sie den Krypto-Isolationspuffer, ohne die abgesetzten Segmente zu stören, und übertragen Sie ihn in eine 50-ml-Röhre auf Eis.
    HINWEIS: Wenn der Krypto-Isolationsprozess zu streng war, können Krypten in diesem Bruchteil gesehen werden. Es kann daher als Reserve aufbewahrt werden, wird aber am Ende des Protokolls optimal verworfen.
  15. Fügen Sie 20 ml eiskaltes PBS zu Darmsegmenten hinzu. Mit einer 25-ml-Pipette, die mit PBS2 vorbeschichtet ist, pipettieren Sie Darmsegmente 5-8 Mal auf und ab.
  16. Lassen Sie die Segmente mit 30 s zufrieden sein. Beschichten Sie ein 50-ml-Rohr und eine 25-ml-Pipette mit PBS2. Sammeln Sie mit dieser Pipette den Überstand (Fraktion 1) in das vorbeschichtete 50-ml-Rohr und legen Sie das Rohr auf Eis.
    HINWEIS: Dieser Bruch dient dazu, den verbleibenden Krypto-Isolationspuffer wegzuspülen. Es dient jedoch auch als zusätzlicher Qualitätskontrollschritt; Wenn das Pipettieren zu stark war, werden Krypten in dieser Spülfraktion reichlich vorhanden sein, und wenn es zu sanft war, wird es in dieser Fraktion sehr wenig Ablagerungen geben. Optimalerweise wird Bruch 1 am Ende des Protokolls verworfen, aber er kann verwendet werden, um Organoide herzustellen, wenn Probleme mit den unten erhaltenen Brüchen 2-4 auftreten.
  17. Wiederholen Sie die Schritte 1.15 und 1.16, fügen Sie jedoch 10 ml eiskaltes PBS anstelle von 20 ml hinzu und legen Sie den Überstand in ein frisches 50-ml-Rohr, das mit PBS2 vorbeschichtet ist (Fraktion 2).
  18. Wiederholen Sie Schritt 1.17 noch zweimal, aber poolen Sie den resultierenden Überstand mit Bruchteil 2 (in die gleiche 50-ml-Röhre aus Schritt 1.17), um die Brüche 2-4 zu erhalten. Diese einzelne 50-ml-Röhre sollte die gelösten Krypten in 30 ml eiskaltem PBS enthalten.
  19. Entfernen Sie ein 50 μL Aliquot aus den gepoolten 2-4 Fraktionen und legen Sie es auf ein Deckglas. Beurteilen Sie das Vorhandensein von Epithelkrypten mit einem invertierten Lichtmikroskop.
    HINWEIS: Wenn keine Krypten vorhanden sind, wiederholen Sie die Schritte 1.17 und 1.18 mit mehr Kraft während des Pipettierens, bis die Krypten freigegeben werden. Stellen Sie sicher, dass Krypten nicht vorzeitig im Krypto-Isolationspuffer aus Schritt 1.14 oder in Bruchteil 1 aus Schritt 1.16 entfernt wurden.
  20. Beschichten Sie ein 100-μm-Sieb und ein 50-ml-Rohr mit PBS2. Führen Sie die gepoolten Kryptenfraktionen durch dieses Sieb und in das vorbeschichtete 50-ml-Rohr.
  21. Gespannte Kryptenfraktionen bei 300 x g für 5 min bei 4 °C nach unten drehen.
  22. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Krypten in 10 ml eiskaltem Advanced DMEM/F12. Bewegen Sie die Krypten in eine 15-ml-Röhre.
  23. Spin Down Krypten bei 210 x g für 5 min bei 4 °C, um einzelne Zellen und Lymphozyten zu entfernen.
  24. Suspendieren Sie Krypten in 1 ml eiskaltem Advanced DMEM/F12.
  25. Entfernen Sie ein 10 μL Aliquot und legen Sie es auf ein Deckglas. Zählen Sie mit einem inversen Lichtmikroskop die Anzahl der Krypten, um die Kryptenkonzentration zu bestimmen.
  26. Berechnen Sie das Volumen, das für ~ 400 und ~ 1.500 Krypten benötigt wird. Beschichten Sie eine p1000-Spitze mit PBS2 und verwenden Sie diese Spitze, um die erforderlichen Volumina (mit ~ 400 und ~ 1.500 Krypten) in separate 1,5-ml-Röhren zu pipettieren.
  27. Drehen Sie die Krypten bei 300 x g für 5 Minuten bei 4 ° C herunter.
  28. Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich und suspendieren Sie dann die Krypten in 80 μL TBEM, die auf Eis gelegt wurden (vorkühle Pipettenspitzen bei 4 ° C, um eine Matrixgelierung zu verhindern, die bei 12 ° C auftritt).
  29. Entfernen Sie die in Schritt 1.1 platzierte 24-Well-Platte aus dem Inkubator. Pipettieren Sie vorsichtig 40 μL Krypten in der Mitte eines Brunnens in einer langsamen, kreisförmigen Bewegung, um eine flache, aber 3D-Kuppelstruktur zu bilden, oder in drei separate kleine Kuppeln.
    HINWEIS: Die Lebensfähigkeit der Organoide ist die niedrigste in der Mitte der Kuppel, wo Nährstoffe und Gase weniger effektiv eindringen31; Daher ist die Maximierung der Oberfläche, die Medien ausgesetzt ist, bei gleichzeitiger Beibehaltung klarer 3D-Strukturen von entscheidender Bedeutung.
  30. Wiederholen Sie Schritt 1.29, um insgesamt zwei Brunnen mit einer Dichte von ~ 200 Krypten pro Bohrung und zwei weitere Bohrlöcher mit einer Dichte von ~ 750 Krypten pro Bohrloch zu erstellen. Legen Sie die Platte direkt für 15-20 min in einen Inkubator (37 °C und 5% CO2) und achten Sie darauf, die viskosen, aber dennoch flüssigen Matrixkuppeln nicht zu stören.
  31. 550 μL vorgewärmtes ENR-Medium pro Vertiefung (ab Schritt 1.2) zugeben und 24 h bei 37 °C und 5 %CO2 inkubieren. In diesem Stadium wird empfohlen, ENR-Medium mit 5 μM Wnt-Agonist (CHIR 99021) und 5 μM Rho-Kinase-Inhibitor (Y-27632) für die ersten 24 h Kultur nach der Isolierung zu ergänzen, um die Ausbeute und Effizienz der Organoiderzeugung von frisch aus Gewebe isolierten Krypten zu verbessern.
    HINWEIS: Krypten sollten sich innerhalb von 24 Stunden schließen, um abgerundete Strukturen zu bilden, und Kryptenknospen sollten innerhalb von 2-4 Tagen erscheinen (Abbildung 1A).
  32. Ersetzen Sie durch frisches ENR-Medium am Ende der Inkubation in Schritt 1.31 und dann alle ~ 2 Tage oder wenn der Phenol-pH-Indikator im Kulturmedium blassorange wird, aber bevor er gelb wird.

2. Aufrechterhaltung von murinen Dünndarmorganoiden

HINWEIS: Dieser Abschnitt des Protokolls beschreibt die Aufrechterhaltung und den Übergang von murinen Dünndarmorganoiden. Organoide werden zuerst geerntet und dann mechanisch mit einer gebogenen p1000-Spitze aufgebrochen. Dieser Prozess zerlegt große Organoide, die aus zahlreichen Krypten bestehen, zur Expansion in mehrere kleinere Fragmente und setzt tote Zellen frei, die sich im Pseudolumen angesammelt haben. Die Erhaltung des murinen Dünndarmorganoids wurde auch an anderer Stelle gut beschrieben24,25,27. Alle Verfahren sollten in einer aseptischen Umgebung mit sterilen Materialien und Reagenzien durchgeführt werden. Passage oder Erweiterung der Organoide einmal alle 4-5 Tage, bevor das Platzen der Organoide durch eine erhebliche Ansammlung von Trümmern im Organoidlumen erfolgt. Organoide können in einem Verhältnis von 1:2-1:3 durchgelassen werden, abhängig von der Organoiddichte, die optimal zwischen 100-200 Organoiden pro Bohrung liegt.

  1. Wie in den Schritten 1.1 und 1.2 wird TBEM auf Eis (40 μL/Well) aufgetaut und ENR-Medium (550 μL pro Well) vorbereitet. Legen Sie die mit der mittleren und Standardgewebekultur behandelte 24-Well-Platte in einen 37 °C-Inkubator.
  2. Entfernen Sie die Platte, die Organoide enthält, aus dem Inkubator. Entsorgen Sie die Medien aus dem Brunnen, der durchgelassen werden soll.
  3. Fügen Sie dem Bohrloch 500 μL eiskaltes Advanced DMEM/F12 hinzu. Verwenden Sie eine p1000-Spitze (vorbeschichtet mit Medien, um zu vermeiden, dass Organoide im Inneren der Spitze haften bleiben) und ernten Sie die Organoide in ein 15-ml-Rohr.
  4. Spülen Sie den Boden des Bohrlochs mit 250-300 μL eiskaltem Advanced DMEM/F12 ab, um sicherzustellen, dass keine Organoide im Bohrloch verbleiben, und lassen Sie sich in das 15-ml-Rohr mit geernteten Organoiden aus Schritt 2.3 einschließen. Wiederholen Sie die Schritte 2.3 und 2.4, wenn Sie mehrere Vertiefungen passieren, und legen Sie die Organoide aus mehreren Vertiefungen in derselben 15-ml-Röhre zusammen.
  5. Spin-Down-Organoide bei 300 x g für 3 min bei 4 °C.
  6. Stellen Sie bei der Zentrifugation sicher, dass vier sichtbare Fraktionen vorhanden sind: eine Basenfraktion mit gesunden Organoiden, eine zentrale und klare Matrixfraktion, eine Matrixfraktion mit einzelnen und toten Zellen und eine obere Überstandsschicht mit einzelnen und toten Zellen. Entfernen Sie den Überstand, die Trümmerfraktion und so viel wie möglich vom klaren Matrixfragment, ohne das Organoidpellet zu stören.
  7. Biegen Sie vorsichtig die Spitze einer p1000 Pipettenspitze (ca. 2-5 mm Biegung). Beschichten Sie diese Spitze in PBS2 oder Advanced DMEM/F12. Mit dieser Spitze pipettieren Sie die Organoide 10-20 Mal auf und ab, um die Organoide und die verbleibende Matrix mechanisch zu stören.
  8. Bei 4 °C mit 210 x g für 3 min nach unten drehen.
  9. Entfernen Sie wie in Schritt 2.6 den Überstand, den Trümmeranteil und so viel wie möglich vom klaren Matrixfragment, ohne das Pellet dissoziierter Krypten zu stören. Wenn gesunde Krypten oder kleine Organoide kein klares Pellet gebildet haben, zentrifen Sie erneut bei 300 x g für 3 min bei 4 °C.
  10. Berechnen Sie das erforderliche TBEM-Volumen (80-120 μL pro Vertiefung der geernteten Organoide, je nachdem, ob ein Durchgangsverhältnis von 1:2 oder 1:3 verwendet wird).
  11. Schwebe das Pellet im berechneten TBEM-Volumen und trage 40 μL pro Vertiefung auf die vorgewärmte 24-Well-Platte auf, um eine Kuppel zu bilden. Legen Sie die Platte direkt in den Inkubator (37 °C; 5% CO2) für 15-20 min.
  12. 550 μL ENR-Medium pro Vertiefung zugeben und bei 37 °C und 5 %CO2 inkubieren. Überprüfen Sie Kulturen auf Organoidbildung nach 24 h. Ersetzen Sie es alle 2-3 Tage nach der Passage durch frisches ENR-Medium.

3. Isolierung von angeborenen lymphatischen Zellen der Dünndarmlamina propria

HINWEIS: Dieser Abschnitt des Protokolls beschreibt die Isolierung von ILC1 aus den murinen Dünndarmlamina propria der RORγtGFP-Reportermäuse. Dies beinhaltet die Entfernung von Epithelzellen, die Gewebeverdauung, die Dichtegradiententrennung von Lymphozyten und die ILC1-Isolierung durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS). Die FACS-Isolierung nach der Gating-Strategie in Abbildung 2 erfordert den extrazellulären Färbe-Mastermix (Tabelle 4) mit den zusätzlichen Färbesteuerungen, die in Tabelle 2 und Tabelle 3 für die Maschine (Tabelle 2) und das Gating (Tabelle 3) beschrieben sind. Die RORγt GFP-Reportermäuse werden verwendet, um lebende, reine ILC1 zu isolieren und RORγtGFP+ ILC3 auszuschalten. Die Gewebeverarbeitung zur Isolierung von Lamina propria-Lymphozyten wurde auch an anderer Stellegut beschrieben 32.

  1. Gewebeverarbeitung
    HINWEIS: Gewebe aus einzelnen biologischen Tierreplikaten wird in diesem Protokoll getrennt gehalten. Diese Proben sollten entsprechend gekennzeichnet und wann immer möglich auf Eis gehalten werden. Alle Reagenzien mit Ausnahme von Verdauungsenzymen sollten Raumtemperatur erreichen dürfen, um eine schnelle Gewebeverdauung zu gewährleisten.
    1. TBEM zum Auftauen auf Eis legen (40 μL/Well). Bewahren Sie eine mit einer Standardgewebekultur behandelte 24-Well-Platte in einem 37 °C-Inkubator auf, um sie vorzuwärmen.
    2. Frischen Epithelentfernungspuffer und Verdauungspuffer vorbereiten (siehe Tabelle 1). Bereiten Sie isotonisches niedrigviskoses Dichtegradientenmedium (LVDGM) (90% LVDGM und 10% 10x PBS), 40% isotonisches LVDGM und 80% isotonisches LVDGM im neutralisierenden Puffer vor (Tabelle 1).
    3. Cullen Sie ein 6-12 Wochen altes Tier, zerlegen Sie den Dünndarm mit einer Pinzette und einer Mikrodissektionsschere und legen Sie den Darm in 15 ml PBS auf Eis.
    4. Tauchen Sie den Darm in PBS auf eine 10 cm2 große Petrischale auf Eis und verwenden Sie eine Pinzette, um Fett sanft, aber vollständig aus dem Darm zu entfernen.
    5. Entfernen Sie Peyers Pflaster (~ 5-10; laufen in einer Linie gegenüber der Linie des Fettgewebes) mit einer Mikrodissektionsschere, um lymphatische Gewebeinduktorzellen und B-Zellen zu erschöpfen.
      HINWEIS: Peyers Pflaster fehlen bei Rag-/- und anderen Linientieren. Im Gegensatz zu Luftblasen bleiben Peyers Patches an Ort und Stelle, wenn sie angestoßen werden.
    6. Schneiden Sie das Gewebe längs mit einer Mikrodissektionsschere (vorzugsweise mit abgerundeten Spitzen, um Perforation zu vermeiden). Halten Sie den Darm in PBS getaucht, schütteln Sie, um Fäkalien zu entfernen.
    7. Schneiden Sie das Gewebe in 2-4 cm lange Stücke und geben Sie sie in eine 50 ml Röhre.
    8. Fügen Sie ca. 20-40 ml eiskaltes PBS hinzu und schütteln Sie es kräftig für 5-15 s, um Schleim und Ablagerungen zu entfernen.
    9. Entsorgen Sie den Inhalt der Tube auf eine frische Petrischale und ersetzen Sie Darmfragmente mit einer Pinzette in die gleiche 50-ml-Röhre.
    10. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.8 und 3.1.9 3-4 Mal oder bis der PBS klar ist.
  2. Entfernung von Epitheln
    1. Darmfragmente in eine frische Petrischale auf Eis geben. Nehmen Sie mit einer Pinzette Darmsegmente auf und entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, indem Sie auf eine trockene Oberfläche tippen.
    2. Schneiden Sie das Gewebe in ~ 0,75-1 cm große Stücke und geben Sie sie in eine frische 50 ml Röhre. Fügen Sie 5-7 ml epithelialen Entfernungspuffer hinzu (Tabelle 1). Wirbeln Sie die Röhre ein und stellen Sie sicher, dass alle Darmsegmente in den Puffer eingetaucht sind.
    3. Die Proben bei 37 °C mit Schaukeln (100-150 U/min) für 12-15 min bebrüten. Wirbeln Sie die Röhre für 20-30 s.
    4. Wiederholen Sie die Schritte 3.2.1-3.2.3 noch einmal, indem Sie den trüben Überstand (Fraktion enthält Epithel- und intraepitheliale Zellen) verwerfen und durch frischen epithelialen Entfernungspuffer ersetzen.
  3. Verdauung des Gewebes
    1. Kippen Sie den Inhalt auf eine frische Petrischale. Nehmen Sie mit einer Pinzette die Darmsegmente auf und tippen Sie auf eine trockene Oberfläche, um überschüssige Flüssigkeit zu entsorgen. Die Segmente in eine frische Petrischale auf Eis legen.
    2. Gruppieren Sie die Segmente in der Mitte der Petrischale zu einer dichten Masse. Zerkleinern Sie das Gewebe mit zwei Skalpellen oder einer scharfen Schere fein, bis es eine viskose Konsistenz erreicht, die durch eine p1000-Pipettenspitze gelangen könnte.
    3. Legen Sie das gehackte Gewebe mit einer Pinzette in ein sauberes 50-ml-Rohr. Spülen Sie die Petrischale mit 1-2 ml Verdauungspuffer (Tabelle 1), um das verbleibende Gewebe zu sammeln und es in der 50 ml Tube mit dem zerkleinerten Gewebe zu sammeln.
    4. Fügen Sie dem zerkleinerten Gewebe 5-7 ml Verdauungspuffer hinzu und stellen Sie sicher, dass das gesamte Gewebe am Boden der Röhre gesammelt wird.
    5. Die Proben bei 37 °C mit mittlerer Schaukelung (~100-150 U/min) für 15 min bebrüten. Wirbeln Sie die Röhre für 20-30 s alle 5 Minuten, um die Verdauung zu unterstützen.
    6. Während die Proben inkubieren, legen Sie für jede Probe ein 40-μm-Zellsieb auf ein frisches 50-ml-Röhrchen. Beschichten Sie die Filter mit 1-2 ml Neutralisationspuffer (Tabelle 1).
    7. Wirbeln Sie die Proben für 20-30 s vor, nachdem die Inkubation beendet ist.
    8. Filtern Sie das teilweise verdaute Gewebe durch den beschichteten 40-μm-Filter in das 50-ml-Röhrchen mit neutralisierendem Puffer.
    9. Verwenden Sie eine Pinzette, um unverdautes Gewebe aus dem 40-μm-Filter zu sammeln und es für die zweite Verdauungsrunde wieder in das 50-ml-Rohr zu legen, in dem die Verdauung durchgeführt wurde. Entfernen Sie Filter und spülen Sie sie mit Verdauungspuffer aus, um unverdautes Gewebe, das am Filter haftet, zu entfernen.
    10. Sobald so viel unverdautes Gewebe wie möglich aus dem Filter entfernt und wieder in das 50-ml-Röhrchen gegeben wurde, in dem die Verdauung durchgeführt wurde, spülen Sie den Filter mit 1-2 ml Neutralisationspuffer über das 50-ml-Röhrchen, das den gefilterten Überstand enthält.
    11. Fügen Sie dem gefilterten Überstand 20-25 ml neutralisierenden Puffer hinzu und legen Sie ihn auf Eis, um die Lebensfähigkeit isolierter Zellen während der zweiten Runde der Gewebeverdauung aufrechtzuerhalten.
    12. Fügen Sie dem unverdauten Gewebe weitere 5-10 ml Verdauungspuffer hinzu und wiederholen Sie die Schritte 3.3.5-3.3.10, wobei sicherzustellen ist, dass das verdaute Gewebe in dasselbe Röhrchen gefiltert wird, das in Schritt 3.3.8 verwendet wurde (derselbe Filter kann auch wiederverwendet werden). Spülen Sie den Filter mit neutralisierendem Puffer, bis die 50-ml-Linie erreicht ist, und entsorgen Sie dann das verbleibende unverdaute Gewebe.
  4. Lymphozytenisolierung durch Dichtegradienten
    1. Drehen Sie die gesammelten Überstände für jede biologische Replik bei 500 x g für 10 min.
    2. In Schritt 3.4.1 werden für jede biologische Replikation 5 ml 80 % isotonisches LVDGM in ein 15-ml-Rohr gegeben.
    3. Nach der Zentrifugation den Überstand aus dem gefilterten, verdauten Gewebe entsorgen. Resuspendiert das Pellet in 10 ml 40% isotonischem LVDGM, um sicherzustellen, dass das Pellet gut homogenisiert ist und keine großen Brocken zurückbleiben.
    4. Stellen Sie die Pipettenhilfe auf die langsamste Stufe ein, kippen Sie das 15-ml-Rohr mit 80% isotonischem LVDGM und überlagern Sie die 10 ml Zellsuspension sehr vorsichtig in 40% isotonisches LVDGM, um sicherzustellen, dass sich die Zellsuspension nicht mit der 80% -Fraktion vermischt.
      HINWEIS: Sollten sich die Fraktionen jemals versehentlich vermischen, verteilen Sie schnell Lymphozyten, die die 80% -Fraktion erreicht haben, zwischen zwei 50-ml-Röhrchen, die mit PBS gefüllt sind, und zentrifugieren Sie für 10 min bei 500 x g. Verwerfen Sie dann den Überstand und wiederholen Sie die Schritte 3.4.3-3.4.4.
    5. Drehen Sie die Rohre bei 900 x g und 20 °C, wobei die Beschleunigung und Debeschleunigung auf die niedrigste Einstellung eingestellt ist, um sicherzustellen, dass die Fraktionen nicht gestört werden. Zentrifuge für 20 min (ohne Pausenzeit).
      HINWEIS: Alle Verfahren ab diesem Schritt sollten in einer aseptischen Gewebekulturhaube mit sterilen Materialien und Reagenzien durchgeführt werden.
    6. Beschichten Sie ein 50-ml-Röhrchen für jede Probe mit PBS2 vor und fügen Sie 45 ml eiskaltes PBS hinzu.
    7. Entfernen Sie nach der Zentrifugation vorsichtig die obere Schmutzschicht aus dem 15-ml-Röhrchen. Beschichten Sie eine p1000-Spitze mit PBS2 und verwenden Sie sie, um die lymphozytenbeladene Interphase zwischen den 40% -80% Gradienten in das 50-ml-Röhrchen mit 45 ml eiskaltem PBS zu sammeln.
    8. Drehen Sie die Röhrchen bei 300 x g für 5 min bei 4 °C.
    9. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in 500 μL FACS-Puffer (PBS, 2% FCS, 0,5 mM EDTA und 10 mM HEPES; siehe Tabelle 1). Beschichten Sie einen 40-μm-Filter mit FACS-Puffer vor und filtern Sie damit die Zellsuspension in ein Durchflussrohr. Spülen Sie das 50-ml-Rohr mit einem zusätzlichen 500-μL-FACS-Puffer aus und filtern Sie es in dasselbe Durchflussrohr.
    10. Entfernen Sie ein 10 μL Aliquot aus der resultierenden 1 ml Zellsuspension. Zählen Sie die Lymphozytenausbeute mit einem Zellzähler oder Hämozytometer und berechnen Sie die Zellkonzentration für jede Probe.
  5. Probenvorbereitung für die Sortierung - extrazelluläre Färbung
    HINWEIS: Die Antikörper, die im extrazellulären Färbe-Mastermix verwendet werden, sowie die Reagenzien zur Herstellung des fixierbaren Viability-Farbstoffs und der Fc-Blocklösung werden in Konzentrationen verwendet, die für bis zu 5 x 10 ausreichen.6 Zellen pro 100 μL. Die Volumina sollten entsprechend angepasst werden. Für die FACS-Maschinenkompensation zum Sortieren von ILC1 sind einfarbige Kontrollen für jeden der Fluorophore im extrazellulären Färbe-Mastermix erforderlich. Für die Antikörper können Kompensationsperlen verwendet werden, die eine positive Antikörperbindungsperlenpopulation und eine negative Antikörper-unverbindliche Perlenpopulation enthalten. Für die ultraviolette (UV) fixierbare Viabilitätsfarbstoff-Einfarbstoff-Einfarbesteuerung können Kompensationsperlen, die aminreaktive (für positive Signale) und nicht-reaktive (für negative Signal) Populationen enthalten, verwendet werden. Es wird nicht empfohlen, Zellen aus dem RORγtGFPReportermäuse für den UV-fixierbaren Viabilitätsfarbstoff Single Color Control, da diese Zellen ein GFP enthalten+ Signal.
    1. Entfernen Sie ein kleines Aliquot von ~ 10 μL aus jeder Probe und sammeln Sie es in einem separaten Durchflussröhrchen, das 250 μL FACS-Puffer enthält. Stellen Sie die Röhre auf Eis. Dies wird für die unbefleckte Kontrolle verwendet.
    2. Fügen Sie 1 ml PBS zum verbleibenden Volumen in den Probenröhrchen hinzu. Zentrifuge bei 300-400 x g für 3-5 min.
    3. Bereiten Sie 200 μL UV-fixierbare Viabilitätsfarbstofflösung pro Probe vor. Verdünnter UV-fixierbarer Vitalitätsfarbstoff (in DMSO gemäß den Anweisungen des Herstellers resuspendiert) 1:500 in PBS (oder gemäß den Anweisungen des Herstellers).
    4. Verwerfen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Proben in 200 μL UV-fixierbarer Lebensfähigkeitsfarbstofflösung. Wirbeln Sie die Röhren und inkubieren Sie im Dunkeln bei 4 °C für 10-15 min.
    5. Fügen Sie 2 ml FACS-Puffer zu den Röhrchen hinzu, um den UV-fixierbaren Lebensfähigkeitsfarbstoff abzuschrecken, 10 s zu wirbeln und zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300-400 x g für 3-5 min bei 4 ° C. Entsorgen Sie den Überstand aus den zentrifugierten Röhrchen.
    6. Bereiten Sie 200 μL Fc-Blocklösung pro Probe vor (0,25 mg/ml Fc-Block im FACS-Puffer).
    7. Jeder der Proben aus Schritt 3.5.5 werden 200 μl Fc-Blocklösung hinzugefügt, 10 s im Dunkeln bei 4 °C inkubiert.
    8. 500 μL FACS-Puffer in ein frisches Durchflussrohr geben. Entfernen Sie ein 2-5 μL Aliquot aus jeder Probe und sammeln Sie es in der Tube für die Fluoreszenz minus eins (FMO) Kontrollen.
    9. Wirbeln Sie das FMO-Rohr für 10 s auf und verteilen Sie es gleichmäßig (100 μL pro Röhrchen) in frische Durchflussröhren, die für jede der FMO-Kontrollen (Lineage Cocktail FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO und NK1.1 FMO; siehe Tabelle 3) gekennzeichnet sind. Fügen Sie alle Antikörper mit Ausnahme des Antikörpers von Interesse zu jedem Röhrchen (wie in Tabelle 3 beschrieben) und Wirbel für 10 s hinzu. Stellen Sie die FMO-Bedienelemente im Dunkeln bei 4 °C beiseite.
    10. Zentrifugieren Sie die Proben (nicht FMO-Kontrollen) bei 300-400 x g für 3-5 min bei 4 °C.
    11. Es wird ein extrazellulärer Färbe-Mastermix (200 μL pro Probe) mit den abschließenden Antikörperverdünnungen gemäß Tabelle 4 hergestellt. Passen Sie das Färbevolumen für die entsprechende Zellkonzentration (bis zu 5 x 106 Zellen pro 100 μL) in Abhängigkeit von der Zellzahl aus Schritt 3.4.10 an.
    12. Fügen Sie den Proben einen extrazellulären Färbe-Mastermix hinzu, wirbeln Sie sie 10 s lang ein und legen Sie sie im Dunkeln bei 4 ° C beiseite.
    13. Bereiten Sie für jeden Antikörper, der für die Gating-Strategie verwendet werden soll, eine frische Einzelfarbkontrolle vor (Abbildung 2). Vortex-Antikörperkompensationsperlen für 20 s, fügen Sie 1 Tropfen Perlen zu einem Durchflussrohr hinzu, färben Sie mit 0,5 μL Antikörper (wie in Tabelle 2 gezeigt oder nach den Anweisungen des Herstellers) und Vortex für 10 s.
    14. Bereiten Sie eine UV-fixierbare Lebensfähigkeitsfarbstoff-Einfarbkontrolle mit einem amin-reaktiven Kompensationsperlen-Kit vor. Vortexamin-reaktive Kompensationsperlen für 20 s, fügen 1 μL lebenden/toten UV-Farbstoff hinzu (wie in Tabelle 2 gezeigt oder gemäß den Anweisungen des Herstellers) und Vortex für 10 s.
    15. Inkubieren Sie die Samples, FMOs und einfarbigen Regler im Dunkeln für 30 min bei 4 °C.
    16. Bereiten Sie während dieser Zeit Röhrchen vor, um die sortierten Zellen zu sammeln. Geben Sie 400-500 μL von 10% FBS in Advanced DMEM/F12 bis 1,5 ml Röhrchen für jede Probe.
    17. Fügen Sie nach der Inkubation 2 ml PBS2 zu jedem der Samples, FMO-Steuerelemente und einzelnen Farbsteuerelemente hinzu.
    18. Zentrifugieren Sie die Proben, FMO-Kontrollen und Einzelfarbsteuerungen bei 300-400 x g für 3-5 min bei 4 °C.
    19. Entsorgen Sie den Überstand aus allen zentrifugierten Röhrchen. Resuspendieren Sie die Proben und FMO-Kontrollen in 250 μL FACS-Puffer und Wirbel für 10 s.
    20. Setzen Sie die einzelnen Farbregler in 250 μL PBS2 wieder auf. Fügen Sie 1 Tropfen nicht reaktive Aminperlen zu UV fixierbaren Lebensfähigkeitsfarbstoff nur Einzelfarbkontrolle hinzu. Wirbeln Sie alle Bedienelemente für 10 s ein.
    21. Die Zellen können nun sortiert werden. Halten Sie Proben, FMO-Kontrollen und einfarbige Kontrollen auf Eis im Dunkeln, wann immer dies möglich ist, um die Zelllebensfähigkeit zu verbessern und Signalverluste durch Photobleichen zu verhindern.

4. Kokultur von Dünndarmorganoiden mit angeborenen lymphatischen Zellen

HINWEIS: In diesem Abschnitt wird die Kokultur von sortiertem murinem Dünndarm-ILC1 (isoliert nach dem Protokoll in Abschnitt 3) mit murinen Dünndarmorganoiden (beschrieben in den Abschnitten 1 und 2) beschrieben. Organoide sollten optimal 1-2 Tage nach der Passage verwendet werden. Co-Kultur beinhaltet die Ernte der Organoide, die Zugabe der entsprechenden Anzahl von ILC1, die Zentrifugierung von Pellet-Organoiden und ILC1 zusammen und die Resuspendierung in TBEM. Schließen Sie diesen Abschnitt so schnell wie möglich ab, sobald ILC1 isoliert wurde. Alle Verfahren sollten in einer aseptischen Umgebung mit sterilen Materialien und Reagenzien durchgeführt werden.

  1. Stellen Sie sicher, dass TBEM aus Schritt 3.1.1 aufgetaut wurde.
  2. Ernten Sie 1-2 Tage alte Organoide, wie in den Schritten 2.3 und 2.4 beschrieben.
  3. Resuspendiert das Organoid-Pellet in 1 ml kaltem, eiskaltem Advanced DMEM/F12. Biegen Sie die p1000-Spitze nicht wie beim Passieren der Organoide, da hier die Organoidstruktur für die Kokultur beibehalten werden soll. Bei Bedarf legen Sie die Organoide für kurze Zeit in separate PBS2-beschichtete 1,5-ml-Röhrchen auf Eis, um sie zwischen verschiedenen Co-Kulturbedingungen zu verteilen.
    HINWEIS: Beginnen Sie erst mit der Vorbereitung von Organoiden, wenn ILC-Proben für die Kokultur bereit sind. Arbeiten Sie auf Eis und schnell, sobald Organoide geerntet wurden, um den Tod von Epithelzellen zu minimieren.
  4. Beschichten Sie ein 1,5-ml-Röhrchen mit PBS2 pro ILC-Replikatprobe. Verteilen Sie ~ 100-200 Organoide (ungefähr 1 Well einer 24-Well-Platte) in jede Röhre.
  5. Beschichten Sie eine p1000-Spitze in PBS2 vor und verwenden Sie sie, um das Volumen von ILC1s nach der FACS-Reinigung (250-300 μL + sortiertes Volumen) zu bewerten. Bestimmen Sie die Konzentration von ILC1 pro ml anhand der Anzahl der aus der Sortierung aufgezeichneten Zellen und bestimmen Sie das erforderliche Volumen.
  6. Mit der gleichen PBS2-beschichteten p1000-Spitze fügen Sie dem PBS2-beschichteten 1,5-ml-Röhrchen, das die Organoide enthält, nicht weniger als 500 ILC1 hinzu. Wenn die Anzahl der ILC1s, die aus der Sortierung gewonnen werden, weniger als 500 beträgt, fügen Sie das Organoid direkt zu dem Röhrchen hinzu, das die ursprüngliche Sortierung enthält, um den Verlust von Zellen durch den Transfer zu minimieren.
  7. Drehen Sie ILC1 und Organoide bei 300 x g für 5 min bei 4 °C aus. Wenn möglich, vermeiden Sie Tischzentrifugen mit kleinem Durchmesser, da diese die Zellen entlang der Kante des Rohrinnenraums bündeln, anstatt ein Pellet an der Spitze des Rohres zu erzeugen. Da die Zellzahlen sehr niedrig sind, ist es unerlässlich, den Verlust von Zellen während dieser Schritte zu minimieren.
  8. Entfernen Sie langsam und vorsichtig so viel wie möglich vom Überstand, ohne das Pellet zu stören (das möglicherweise nicht mit dem Auge sichtbar ist, insbesondere bei reinen ILC-Kontrollen ohne Organoid). Legen Sie die Probe auf Eis.
  9. Resuspendiert das kalte Pellet in 30 μL pro TBEM-Vertiefung. Während Sie das Röhrchen auf einer kalten Oberfläche halten (z. B. eine kleine Eisschachtel in der Gewebekulturhaube), mischen Sie die Organoide und ILC mindestens 10-15 Mal, um eine gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Trituieren Sie häufig, aber sanft, um eine Beschädigung der Organoide und die Bildung von Blasen zu vermeiden.
  10. Tragen Sie 30 μL ILC-Organoide in TBEM pro Vertiefung auf eine vorgewärmte 24- oder 48-Well-Platte auf, um eine einzelne Kuppel zu bilden. Legen Sie die Platte direkt in den Inkubator (37 °C und 5% CO2) für 10-20 min.
    HINWEIS: Es wird dringend empfohlen, nur ILC- und Organoid-Steuerelemente für die nachgelagerte Analyse einzurichten. ILC1 sind selten, aber GFP-ILC2 kann durch Immunfluoreszenz- oder FSC / SSC-Durchflusszytometriekontrollen ersetzt werden, wenn dies wissenschaftlich angemessen ist.
  11. 550 μL (pro Well) vollständiges ILC1-Medium (ENR + IL-2 + IL-7 + IL-15 + 2-Mercaptoethanol; siehe Tabelle 1) mit beliebigen experimentellen Zytokinen oder blockierenden Antikörpern zugeben und bei 37 °C und 5% CO2 für 24 h inkubieren.
  12. Nach 24 h die Platte vorsichtig aus dem Inkubator entfernen und die Platte 1 Minute in einer Gewebekulturhaube sitzen lassen, um sicherzustellen, dass sich die Lymphozyten absetzen.
  13. Entfernen Sie 200-250 μL Medien und legen Sie sie in eine leere Vertiefung einer 24-Well-Platte. Überprüfen Sie diesen Überstand mit einem inversen Mikroskop, um sicherzustellen, dass keine Lymphozyten entfernt wurden.
    1. Wenn der Überstand klar ist, fügen Sie der Kokultur im ursprünglichen Bohrloch 300 μL frisches ILC1-Medium hinzu. Wenn Lymphozyten im Überstand vorhanden sind, zentrifugieren Sie bei 300-400 x g für 3-5 min bei 4 °C und resuspendieren Sie in 300 μL frischem ILC1-Medium und fügen Sie dies den verbleibenden 200-250 μL Medien im ursprünglichen Vertiefungsraum hinzu. Stellen Sie sicher, dass Sie die Medien alle 1-2 Tage auffüllen oder wenn die Medien blass-orange / gelb werden.
      HINWEIS: Lassen Sie das Medium nicht so stark verdampfen, dass die Spitze der Matrixkuppel die Oberfläche des Mediums bricht. Stellen Sie immer sicher, dass die Matrix vollständig untergetaucht ist. Übermäßige Verdunstung kann vermieden werden, indem zentrale Vertiefungen in den Gewebekulturplatten verwendet und den umgebenden Bohrlöchern ~ 600 μL PBS hinzugefügt werden. Co-Kulturen mit adultem ILC sind für 1-4 Tage stabil, danach reißen die Organoide, die ohne größere Unterbrechung ausgesät wurden, und säen als neue Krypten neu. Bei der Analyse des Epithels wird empfohlen, die Kulturen innerhalb von 1-4 Tagen nach der Etablierung von Kokulturen zu analysieren.
    2. Führen Sie nachgelagerte Analysen mit Immunfluoreszenz, Durchflusszytometrie oder FACS-Aufreinigung von Zielpopulationen in Lysepuffer für die Genexpressionsanalyse durch Einzelzell- oder Massen-RNA-seq oder RT-qPCR durch, wie in Referenz8 beschrieben.

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Representative Results

Nach erfolgreichem Abschluss sollten frisch isolierte Krypten innerhalb von 2-4 Tagen knospende Kryptenstrukturen bilden (Abbildung 1A). Gesunde und robuste Organoidkulturen sollten aktiv wachsen und können wie im Protokoll beschrieben durchlaufen und erweitert werden.

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung von Dünndarm-ILC1 aus der RORγtGFP murine transgenen Reporterlinie, die die Isolierung von lebendem ILC1 durch FACS ermöglicht (Abbildung 2). Unter Verwendung des hier beschriebenen Protokolls beträgt der erwartete ILC1-Zählbereich 350-3.500 isolierte Zellen.

Nach der Aussaat mit Organoiden können Co-Kulturen durch Immunzytochemie sichtbar gemacht werden (Abbildung 3A-B). ILCs und Epithelzellen können auch durch Durchflusszytometrie analysiert werden, wie in Abbildung 3C gezeigt. ILC1 reguliert epitheliales CD44 hoch, gekennzeichnet durch Durchflusszytometrie (Abbildung 4A-B) und Immunzytochemie (Abbildung 4C). Insbesondere induziert ILC1 die Expression der CD44 v6-Spleißvariante in Organoiden, wie durch RT-qPCR gezeigt (Abbildung 4D).

Tabelle 1: Medien- und Pufferzusammensetzungen Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Einfarbige Steuerelemente Zusammenstellung von Einzelfarbkontrollen zur Isolierung von Dünndarmlamina propria ILC1 unter Verwendung der in Abbildung 2 definierten Gating-Strategie. Einzelheiten zu den verwendeten Antikörpern finden Sie in der Materialtabelle. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 3: Fluoreszenz minus eins (FMO) Mastermixe. Komposition von FMO-Mastermixen für Lineage Cocktail FMO, CD127 FMO, KLRG1 FMO, NKp46 FMO und NK1.1 FMO. FMO-Mastermixe enthalten alle verwendeten Antikörper mit Ausnahme des interessierenden Antikörpers und werden verwendet, um ein Probenaliquot zu färben. Lineage Cocktail ist definiert als CD19, CD3e, CD5, Ly-6G/Ly-6C. Einzelheiten zu den verwendeten Antikörpern finden Sie in der Materialtabelle. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 4: Extrazellulärer Färbe-Mastermix. Die Konzentrationen sind für die Färbung von bis zu 5 x 106 Zellen in 200 μL FACS-Puffer angepasst. Einzelheiten zu den verwendeten Antikörpern finden Sie in der Materialtabelle. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Figure 1
Abbildung 1: Murine Dünndarmorganoide. Repräsentatives Bild von (A) erfolgreich erzeugten Dünndarmorganoiden 2-3 Tage nach der Passage und (B) erfolgloser Kultur. Maßstabsbalken: 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 2
Abbildung 2: Gating-Strategie zur Isolierung von ILC1s aus den Dünndarmlamina propria der transgenen RORγtGFP-Reportermäuse. Repräsentatives durchflusszytometrisches Diagramm der ILC1-Isolierung aus den Dünndarmlamina propria der transgenen RORγtGFP-Reportermäuse von FACS. ILC1s sind definiert als live, CD45+, Lin- (CD3, CD5, CD19, Ly6C), CD127+, KLRG1-, RORγt-, NKp46+ und NK1.1+. Vertreter von N = >50 Mäuse. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 3
Abbildung 3: Organoid- und ILC1-Kokulturen. Hellfeldbilder (A), konfokale Mikroskopiebilder (B) und FACS-Diagramme (C) von Dünndarmorganoiden (SIO), die allein (oben) oder mit ILC1s (unten) kultiviert wurden (repräsentativ für Experimente mit ILC1s von N = 3-Mäusen). (B) Die Färbung mit CD45 veranschaulicht ILC1s und Zonula occludens Protein 1 (ZO-1) markiert Epithelzellen in Organoiden. Maßstabsstäbe: 50 μm. (C) Zuvor auf einzelnen, lebenden Zellen ausgerichtet. Epithelial cellular adhesion molecule (EpCAM) markiert Darmepithelzellen (IEC) in Organoiden und CD45 markiert ILC1s. Die Abbildung ist der Referenz8 entnommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Figure 4
Abbildung 4: ILC1s in Co-Kultur mit Dünndarmorganoiden treiben die Regulierung von CD44 in Darmepithelzellen voran. (A) Ein repräsentativer zytometrischer Diagramm der CD44-Expression in epithelialen zellulären Adhäsionsmolekülen (EpCAM) positiven Epithelzellen (lebend, CD45-, EpCAM+) aus Dünndarmorganoiden (SIO), die allein (links) oder mit ILC1s für 4 Tage (rechts) kultiviert wurden. (B) Durchflussquantifizierung der CD44-Expression in Darmepithelzellen (IEC) (ILC1s von N = 5 Mäusen). (C) Repräsentatives konfokales Mikroskopiebild der CD44-Lokalisation in d4 SIO allein (links) oder kokultiviert mit ILC1s (rechts) (repräsentativ für N = 3 Mäuse). Maßstabsstäbe: 50 μm. (D) RT-qPCR mit exonspezifischen Primern für die CD44-Spleißvarianten v4 und v6 (N = 3). Diese Abbildung ist der Referenz8 entnommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die Methoden zur Etablierung von murinen Dünndarmorganoiden, zur Isolierung seltener ILC1 durch Minimierung des Verlusts von Lymphozyten während des intestinalen Dissoziationsprotokolls und zur Etablierung von Kokulturen zwischen diesen beiden Kompartimenten. Es gibt viele Schritte zu diesem Protokoll, und während einige spezifisch für ILC1s sind, kann dieser Ansatz auf andere intestinale Immunzelltypen angewendet werden, und Co-Kultur-Setups können modular an individuelle Forschungsfragen angepasst werden. Mehrere kritische Schritte (von denen nicht abgewichen werden sollte) sowie Richtlinien zur Fehlerbehebung für die technisch anspruchsvolleren Elemente dieses Protokolls werden hier hervorgehoben.

Die Verwendung von murinen Dünndarmorganoiden aus einzelnen Lgr5+-eGFP-Darmstammzellen etabliertsich zunehmend 33,34; In diesem Protokoll wird jedoch vorgeschlagen, intakte, ganze Krypten von Lieberkuehn von CD45.1-Tieren zu isolieren. Intakte Krypten erholen sich nicht nur schneller als einzelne Lgr5+-Zellen, sondern die Verwendung von CD45.1-Tieren ohne GFP-Reporter stellt sicher, dass keine kreuzkontaminierenden CD45.2+-ILCs aus den Organoid-Co-Kulturen analysiert werden und ist kompatibel mit der Verwendung von Immunzellen, die einen GFP-basierten Reporter enthalten. Nach der Erfahrung der Autoren übertragen sich nach 1-3 Passagen der Organoide keine mesenchymalen oder Immunzellen. Die Verwendung von CD45.2 oder anderen Tieren zur Etablierung von Organoiden ist daher völlig akzeptabel. Wenn während des Organoid-Aufbaus in Schritt 1.1.19 keine Krypten vorhanden sind, kann ein strengeres manuelles Schütteln erforderlich sein, um die intakten Krypten zu entfernen. Umweltfaktoren wie die Umgebungstemperatur (z. B. ob das Verfahren im Sommer oder im Winter durchgeführt wird) können den Inkubationszeiten während der Dissoziation eine gewisse Variabilität verleihen. Die Aussaatdichte von Krypten wirkt sich auf den anfänglichen Organoidbildungsertrag aus; Es wird daher empfohlen, mindestens zwei verschiedene Dichten zu säen, um den Erfolg zu gewährleisten (z. B. 200-750 hier vorgeschlagen, aber dieser Bereich kann basierend auf individuellen Bedürfnissen angepasst werden).

Einmal etabliert, sind intestinale Organoidkulturen sowohl zwischen Linien, die aus demselben Mausstamm stammen, entlang des Magen-Darm-Trakts (z. B. Zwölffingerdarm versus Ileum) und sogar innerhalb desselben Brunnens von Organoidkulturenheterogen 35,36. Obwohl sich herausstellte, dass dieses Protokoll über viele verschiedene Chargen von Organoiden robust ist, könnte diese Heterogenität zur Datenvariabilität beitragen. Es empfiehlt sich, mit der Organoidwartung (Passaging und Medienwechsel) konsistent zu sein, um technisches Rauschen durch phänotypisch irrelevante Daten zu reduzieren. Dazu gehört auch, mit der Zeitleiste für die Voraussaat und mit der Kraft konsistent zu sein, die zur Dissoziierung von Organoiden verwendet wird. Es wird auch empfohlen, die gleiche Basalmatrix für Experimente zu verwenden, die verglichen werden, und für Experimente, die mit biologischen Replikaten von Organoiden von verschiedenen Tieren durchgeführt werden (wenn finanziell und technisch machbar), um sicherzustellen, dass die Ergebnisse robust reproduzierbar sind.

Bei der Etablierung von Kokulturen ist das Verhältnis von Immun- zu Epithelzellen eine kritische Überlegung, die auf der Grundlage der Forschungsfragen optimiert werden muss. Wenn der Einfluss von Epithelzellen auf ILC abgefragt wird, muss die Anzahl der ausgesäten Organoide ausreichen, um die gesamte ILC zu sättigen. Umgekehrt können bei der Beurteilung der Auswirkungen von ILC auf das Epithel unterschiedliche ILC/Epithel-Verhältnisse zu unterschiedlichen phänotypischen Ergebnissen führen, die differentielle Zustände der ILC-Untergruppenanreicherung in der Schleimhaut widerspiegeln. Die Lebensfähigkeit von ILC1 wird in der Kultur gut aufrechterhalten, und die Population wird eine leichte Expansion erfahren, wobei ~ 500 ILC1 und 100 Dünndarmorganoide (SIO) im Durchschnitt eine 2-3-fache Expansion erfahren. Diese Ausbeute wird jedoch durch zusätzliche Behandlungen beeinflusst, wobei sich die TGF-Neutralisation verbessert und die p38-Hemmung die absolute Anzahl von ILC1 nach Kokultur8 verringert. Jeder unerwartete Verlust von mehr als 50 % der ausgesäten ILC1-Zahlen kann entweder auf ein unausgewogenes Verhältnis von ILC1 zu SIO (Erhöhung der Anzahl der ausgesäten Krypten), eine SIO-Kontamination (sicherstellen, dass der Antibiotika-Cocktail funktioniert und den Überstand auf Mykoplasmen testen) oder auf Qualitätsprobleme in den Zytokinbeständen zurückzuführen sein, wobei ILC1 besonders empfindlich auf einen Mangel an IL-2 oder IL-15 reagiert. Co-Kultur-Überstände von konzentrierten 96- oder 48-Well-Platten wurden erfolgreich für ELISAs verwendet. Bei der Dissoziation von Co-Kulturen wird empfohlen, Zellen nach einem 20-minütigen sanften Trypsinersatz mit DNase zu inkubieren oder eine EDTA-basierte Dissoziation an einzelnen Zellen durchzuführen, um eine Zellverklumpung durch beschädigte Epithelzellen zu verhindern.

Eine Stärke dieses Protokolls besteht darin, dass es reduktionistische Kulturbedingungen mit komplexen Zelltypen in Einklang bringt. Das Verhalten anderer ILC-Untergruppen in diesen Kulturen kann jedoch von Faktoren abhängen, die in diesem speziellen Protokoll nicht vorhanden sind. Zum Beispiel wurde IL-23 im Lindemans-Protokoll, das für ILC3-Kokulturen verwendet wird, zusätzlich zu Co-Kulturmedien ergänzt, um die ILC3-Wartung und -Aktivierung zu unterstützen8. IL-15 erwies sich als besonders wichtig für die Aufrechterhaltung von ILC1 in dem in diesem Protokoll beschriebenen Kokultursystem, das mit früheren Berichten über ILC1 übereinstimmte, das dieses Zytokin für die Homöostase benötigte, jedoch nicht für die Entwicklung6. Um ILC zu aktivieren oder ILC2s zu warten, muss das Wachstumsmedium möglicherweise weiter optimiert werden. Darüber hinaus regulieren andere zelluläre Kompartimente im Darm, abgesehen vom Epithel, ILCs. Zum Beispiel ist bekannt, dass Darmneuronen ILC2s teilweise durch die Aktivität von sezernierten Neuropeptidenmodulieren 37. Mikrobielle Faktoren beeinflussen auch den ILC-Phänotyp38. Diese Einschränkung könnte durch die Zugabe dieser Elemente, z. B. Zytokine, Peptide oder mikrobielle Faktoren, in das Kokultursystem überwunden werden. Dies könnte sogar die Abfrage der Interaktion zwischen ILCs und mehreren zellulären Kompartimenten in einer reduktionistischen Umgebung ermöglichen. Nach dieser Logik ist es von entscheidender Bedeutung, dass antibiotische/antimykotische Reagenzien vor der Etablierung von Kokulturen hinzugefügt und häufig zu organoiden Medien aufgefüllt werden. Es ist auch wichtig, dass alle Kulturen in aseptischen Umgebungen durchgeführt werden, da jede Kulturkontamination (z. B. Pilzwachstum oder Mykoplasmen) wahrscheinlich die antigenunspezifischen ILCs aktivieren und signifikante Phänotypen erzeugen würde, die in nicht kontaminierten Kulturen möglicherweise nicht vorhanden sind. Aus diesem Grund wird der Entzug von antibiotischen/mykotischen Reagenzien auch in den Co-Kulturen nicht empfohlen, da festgestellt wurde, dass sie keine nachteiligen Auswirkungen auf das Epithel oder die ILCs haben.

Diese Methode bietet eine einzigartige Möglichkeit, Signalmodule zwischen ILCs und dem Darmepithel zu charakterisieren, so dass die Biologie beider Kompartimente untersucht werden kann. Im Vergleich zu anderen in vitro Methoden, die aus einem einzigen Zelltyp bestehen, ist das hier vorgestellte System eher mit der In-vivo-Physiologie vergleichbar und ermöglicht es, mehrere potentielle Signalmechanismen zwischen Epithelzellen und ILCs abzufragen. Andere Methoden der In-vitro-ILC-Kultur beruhen überwiegend auf stromalen Feederzelllinien, wie OP9 oder OP9-DL139. Diese Linie stammt von neugeborenen Mauskalvarien, die nicht repräsentativ für die Darmumgebung sind. Während diese bisher den Goldstandard für die Aufrechterhaltung von ILCs in vitro darstellten, leiden sie bei ihrer Anwendung auf das Verständnis der Auswirkungen von ILC auf das Epithel unter erheblichen Einschränkungen.

Das hier beschriebene Kokulturprotokoll zwischen murinen Dünndarmorganoiden und aus Lamina propria gewonnenen ILCs hat bedeutende Forschungsanwendungen. Dieses System der Kokultur wurde bereits verwendet, um die Rolle von ILC1-abgeleitetem TGF-β bei der Expansion von CD44+ Epithelkrypten8 zu bestimmen, was zum Verständnis der Epitheldynamik bei entzündlichen Darmerkrankungen beiträgt. Diese Studien tragen zu einer wachsenden Literatur bei, die die entscheidende Bedeutung der Epithel-ILC-Signalgebung bei intestinaler Homöostase und Entzündunguntermauert 3.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Acknowledgments

E.R. bestätigt ein Ph.D. Stipendium des Wellcome Trust (215027/Z/18/Z). G.M.J. würdigt ein Ph.D. Stipendium des Wellcome Trust (203757/Z/16/A). D.C. erkennt eine Doktorandenschaft von der NIHR GSTT BRC an. J.F.N. würdigt ein Marie-Skłodowska-Curie-Stipendium, ein King's Prize-Stipendium, ein RCUK/UKRI Rutherford Fund-Stipendium (MR/R024812/1) und einen Seed Award in Science vom Wellcome Trust (204394/Z/16/Z). Wir danken auch dem BRC-Durchflusszytometrie-Kernteam am Guy's Hospital. Rorc(γt)-GfpTG C57BL/6 Reportermäuse waren ein großzügiges Geschenk von G. Eberl (Institut Pasteur, Paris, Frankreich). CD45.1 C57BL/6 Mäuse wurden freundlicherweise von T. Lawrence (King's College London, London) und P. Barral (King's College London, London) gegeben.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023
Anti-mouse CD45 (BV510) BioLegend 103137
Anti-mouse NK1.1 (PE) Thermo Fisher Scientific 12-5941-83
B-27 Supplement (50X), serum free Gibco 17504044
CD127 Monoclonal Antibody (APC) Thermo Fisher Scientific 17-1271-82
CD19 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0193-82
CD3e Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0051-82
CD5 Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-0031-82
CHIR99021 Tocris 4423/10
COLLAGENASE D, 500MG Merck 11088866001
Cultrex HA- RSpondin1-Fc HEK293T Cells Cell line was used to harvest conditioned RSpondin1 supernatant, the cell line and Materials Transfer Agreement was provided by the Board of Trustees of the Lelands Stanford Junior University (Calvin Kuo, MD,PhD, Stanford University)
DISPASE II (NEUTRAL PROTEASE, GRADE II) Merck 4942078001
DMEM/F12 (1:1) (1X) Dulbecco's Modified Eagle Medium Nutrient Mixture F-12 (Advanced DMEM/F12) Gibco 11320033
DNASE I, GRADE II Merck 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (1X) Gibco 21969-035
Ethilenediamine Tetraacetate Acid Thermo Fisher Scientific BP2482-100
FC block 2B Scientific BE0307
Fetal Bovine Serum, qualified, hear inactivated Gibco 10500064
GlutaMAX (100X) Gibco 3050-038
Hanks' Balanced Salt Solution (10X) Gibco 14065056
HBSS (1X) Gibco 12549069
HEK-293T- mNoggin-Fc Cells Cell line was used to harvest conditioned Noggin supernatant, cell line acquired through Materials Transfer Agreement with the Hubrecth Institute, Uppsalalaan8, 3584 CT Utrecht, The Netherlands, and is based on the publication by Farin, Van Es, and Clevers Gastroenterology (2012).
HEPES Buffer Solution (1M) Gibco 15630-056
KLRG1 Monoclonal Antibody (PerCP eFluor-710) Thermo Fisher Scientific 46-5893-82
Live/Dead Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation Thermo Fisher Scientific L23105
Ly-6G/Ly-6C Monoclonal Antibody (eFluor 450) Thermo Fisher Scientific 48-5931-82
Matrigel Growth Factor Reduced Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free Corning 356231
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502048
N-acetylcysteine (500mM) Merck A9165
NKp46 Monoclonal Antibody (PE Cyanine7) Thermo Fisher 25-3351-82
PBS (1 X) 7.2 pH Thermo Fisher Scientific 12549079
PBS (10X) Gibco 70013032
Percoll Cytiva 17089101
Recombinant Human EGF, Animal-Free Protein R&D Systems AFL236
Recombinant Human IL-15 GMP Protein, CF R&D Systems 247-GMP
Recombinant Human IL-2 (carrier free) BioLegend 589106
Recombinant Mouse IL-7 (carrier free) R&D Systems 407-ML-005/CF
UltraComp eBeads Thermo Fisher Scientific 01-2222-42
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) Bio-techne 1254
Plastics
50 mL tube Falcon 10788561
1.5 mL tube Eppendorf 30121023
10 mL pippette StarLab E4860-0010
15 mL tube Falcon 11507411
25 mL pippette StarLab E4860-0025
p10 pippette tips StarLab S1121-3810-C
p1000 pippette tips StarLab I1026-7810
p200 pippette tips StarLab E1011-0921
Standard tissue culture treated 24-well plate Falcon 353047
Equipment
Centrifuge Eppendorf 5810 R
CO2 and temperature controled incubator Eppendorf Galaxy 170 R/S
Flow Assisted Cellular Sorter BD equipment FACS Aria II
Heated shaker Stuart Equipment SI500
Ice box - -
Inverted light microscope Thermo Fisher Scientific EVOS XL Core Imaging System (AMEX1000)
p10 pippette Eppendorf 3124000016
p1000 pippette Eppendorf 3124000063
p200 pippette Eppendorf 3124000032
Pippette gun Eppendorf 4430000018
Wet ice - -

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References

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Immunologie und Infektion Ausgabe 181
Kokultur von murinen Dünndarm-Epithelorganoiden mit angeborenen lymphatischen Zellen
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