Summary
本方案演示了在 卵中伤害胚胎雏鸡角膜所涉及的不同步骤。再生或完全恢复的角膜可以在伤口手术后使用各种细胞和分子技术分析再生潜力。
Abstract
雏鸡胚胎角膜伤口表现出完全和快速再生的显着能力，而成年受伤的角膜由于纤维化瘢痕形成而失去透明度。受伤胚胎角膜的组织完整性内在恢复，没有可检测到的疤痕形成。鉴于其可及性和易于操作性，雏鸡胚胎是研究无疤痕角膜伤口修复的理想模型。该协议展示了在 卵中伤害胚胎雏鸡角膜所涉及的不同步骤。首先，卵子在胚胎早期年龄开窗以进入眼睛。其次，对胚胎外膜进行一系列 卵内 物理操作，以确保在发育的后期阶段保持对眼睛的访问，对应于角膜的三个细胞层形成的时间。第三，穿透外上皮层和前基质的线性角膜伤口是使用显微外科刀制成的。在伤口手术之后，可以使用各种细胞和分子技术分析再生过程或完全恢复的角膜的再生潜力。迄今为止使用该模型的研究表明，受伤的胚胎角膜显示角质形成细胞分化的激活，ECM蛋白协调重塑为其天然的三维宏观结构，并被角膜感觉神经充分重新支配。将来，内源性或外源性因素对再生过程的潜在影响可以通过使用发育生物学技术（例如组织移植，电穿孔，逆转录病毒感染或珠子植入）来分析角膜愈合。目前的策略将胚胎雏鸡确定为阐明协调无疤痕角膜伤口愈合的分子和细胞因子的关键实验范例。
Introduction
角膜是眼睛最外层的透明组织，透射和折射有利于视力的光。在成人角膜中，角膜基质的损伤或感染导致快速而强大的伤口愈合反应，其特征在于角质形成细胞增殖，纤维化，导致细胞因子诱导的细胞凋亡的炎症增加，修复肌成纤维细胞的产生以及细胞外基质（ECM）的整体重塑1，2.损伤后，这种角膜组织修复导致不透明的疤痕组织，降低角膜透明度并阻塞光线通过，从而扭曲视力，在最严重的情况下，导致角膜失明3。因此，显然需要开发可靠的动物模型来解决伤口愈合的复杂性，并确定负责伤口闭合和组织再生的细胞和分子因素。
迄今为止，大多数检查角膜伤口愈合的研究都使用了产后4 或成年动物模型1，2，5，6，7。虽然这些研究在理解角膜伤口愈合反应和疤痕形成机制方面取得了重大进展，但这些愈合模型中受损的角膜组织未能完全再生，从而限制了它们识别负责完全概括损伤后角膜形态和结构的分子因素和细胞机制的实用性。相比之下，用刀在胚胎雏鸡角膜中产生的胎儿伤口具有以无疤痕的方式完全愈合的内在能力8。具体而言，胚胎雏鸡角膜表现出非纤维再生，细胞外基质结构和神经支配模式8，9的完全概括。
本方案描述了在 卵中伤害胚胎雏鸡角膜的一系列步骤。首先，卵子在胚胎早期年龄开窗，以促进胚胎的进入。其次，对胚胎外膜进行一系列 卵内 物理操作，以确保在发育的后期阶段保持对眼睛的访问，对应于角膜的三个细胞层形成并且需要伤口的时间。第三，使用显微外科刀制作穿透角膜上皮并进入前基质的线性中央角膜切口。在伤口手术之后，可以使用各种细胞和分子技术分析再生过程或完全恢复的角膜的再生潜力。
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Protocol
该协议中使用的鸡蛋菌株是白色里窝那，所有动物程序都得到了伊利诺伊卫斯理大学机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 雏鸡蛋的孵化
- 产卵后将卵保持在~10°C长达1周以停止发育。当准备开始雏鸡胚胎发育时，用室温水饱和的无绒湿巾（参见 材料表）擦拭整个蛋壳，以除去污垢和碎屑。
- 确保蛋壳经过消毒。用蘸有70%乙醇的无绒湿巾擦拭整个鸡蛋表面。快速擦去乙醇以干燥鸡蛋，避免乙醇通过蛋壳吸收到胚胎中。
- 将鸡蛋水平排列在托盘上。标记卵子的顶部以表示胚胎的预期位置。在38°C加湿的孵化器中水平孵化蛋，激活摇摆功能。
2. 将卵子开窗以准备膜解剖
- 在胚胎发育的第三天（E3）从孵化器中取出卵。用蘸有70%乙醇的无绒湿巾对鸡蛋的顶部进行消毒。将蛋壳表面的乙醇干燥。
注意：为了确保在开窗过程中不会延迟发育，移除了6-12个鸡蛋，并在这些鸡蛋上快速进行了手术，而剩余的鸡蛋则留在孵化器中。 - 将鸡蛋水平放置在安全的鸡蛋架中（参见 材料表）。使用解剖剪刀的尖锐端，在蛋壳顶部靠近鸡蛋的尖头处创建一个小洞。
注意：这个孔将有助于去除蛋白，这是将蛋黄和胚胎从内部蛋壳表面掉落所必需的。对于鸡蛋持有人，使用纸浆鸡蛋填充物，鸡蛋在其中运输。 - 通过孔（步骤2.2），插入18 G斜角皮下注射针。将针头推到鸡蛋的底部内表面，针头的斜面朝向鸡蛋的尖端（例如，远离蛋黄的预期位置和靠近鸡蛋中间的胚胎），从鸡蛋中取出2-3毫升蛋白并丢弃。
注意：如果一个人的针头在此步骤中划伤胚胎或其相关的脉管系统，则会导致血液与蛋白一起吸出。这将导致胚胎死亡。此外，如果在此步骤中蛋黄与蛋白一起无意中被吸出，则胚胎将不存活。在任何一种情况下，如果胚胎不能立即用于其他目的，则应丢弃卵子。 - 用用70%乙醇轻轻蘸湿的无绒湿巾清洁孔周围的蛋壳表面，然后擦干。用透明胶带密封用于去除蛋白的孔。
- 用解剖剪刀的尖锐端，在标记部位的蛋壳顶部打第二个“窗口”孔（步骤1.3）。确保剪刀不要延伸到蛋壳中太远，以避免接触和损坏胚胎或胚胎脉管系统，这些血管系统通常位于第二个孔的正下方的卵子内。
- 使用弯曲的虹膜镊子，将“窗口”孔加宽，直径约为2-3厘米，并作为壳下发育胚胎的“窗口”。
- 将镊子的一端插入孔中，使其与蛋壳平行并紧密并置。将另一个镊子末端放在蛋壳外，小心地将两个镊子的末端捏在一起，使它们断裂并取出蛋壳的小块。继续破碎并去除蛋壳碎片，直到留下一个2-3厘米的窗口直接覆盖胚胎。
注意：胚胎不直接产在步骤2.6中形成的孔下方的卵子。不能使用，因为即将进行的膜解剖将难以完成。即使水平摇晃卵子，由于胚胎的位置不佳，大约10%的卵子也无法使用。这些胚胎可用于其他目的。
- 将镊子的一端插入孔中，使其与蛋壳平行并紧密并置。将另一个镊子末端放在蛋壳外，小心地将两个镊子的末端捏在一起，使它们断裂并取出蛋壳的小块。继续破碎并去除蛋壳碎片，直到留下一个2-3厘米的窗口直接覆盖胚胎。
- 为了限制细菌污染，通过窗口孔（例如，在鸡蛋中）加入含有青霉素/链霉素抗生素（50 U / mL青霉素和50μg/ mL青霉素，50 U / mL青霉素和50μg/ mL链霉素）的CaCl 2.2H和0.23g Hb 20，通过窗口孔（例如，加入鸡蛋中）的林格氏溶液（8g /mL NaCl，0.37g KCl和0.23g/mL）。 见材料表）。
- 使用透明胶带密封窗孔。通过将胶带的一角对准孔的长轴上，然后将胶带压到距离孔边缘约1-2厘米的壳上来执行鸡蛋密封。
- 继续密封开口，直到一侧留下一圈悬挂的胶带。将两块胶带压在一起，在孔上形成一个圆顶形状，然后将悬挂胶带的翻盖按到壳上以完成鸡蛋的密封。
注意：鸡蛋需要在E2或E3处开窗。根据经验，在E2之前开窗会导致胚胎活力低下。此外，通过E4，胚胎和胚胎外膜附着在蛋壳10上，并且任何试图在E4或以后开窗的尝试都经常导致胚胎损伤或胚胎外血管撕裂，任何一种事件都会导致胚胎死亡的结果。
- 继续密封开口，直到一侧留下一圈悬挂的胶带。将两块胶带压在一起，在孔上形成一个圆顶形状，然后将悬挂胶带的翻盖按到壳上以完成鸡蛋的密封。
- 将“窗口”蛋放回孵化器进行进一步发育。确保将种蛋保持水平并关闭孵化器的摇动功能。
- 重复步骤 2.2.-2.9。对于每个鸡蛋。
3. 胚胎外膜的显微解剖
- 从培养箱中取出 E5.5 窗口蛋。用无菌解剖剪刀将胶带从窗户上切开，露出胚胎。
- 使用解剖显微镜通过窗户观察胚胎及其胚胎外膜。如有必要，使用剪刀或弯曲的虹膜镊子加宽窗户，使胚胎在窗户下方位置良好，注意不要损坏胚胎脉管系统。
- 加入两滴含有青霉素/链霉素抗生素的林格氏溶液，以滋润胚胎并对卵子进行灭菌。
- 使用解剖显微镜确保胚胎处于适当的发育阶段（汉堡汉密尔顿阶段27，〜E5.5）11，12 并定位羊膜（ACM）和绒毛膜腔输卵管膜（CAM）的位置。
注意：在此阶段，胚胎被ACM包围，ACM由羊膜和覆盖的绒毛膜融合并部分覆盖，高度血管化的尿囊从胚胎的肠道区域延伸并与覆盖的绒毛膜融合形成CAM11，12。ACM没有严重的血管化，这使得人们可以解剖这些膜以暴露胚胎而不会损害血管并伤害胚胎。 - 在此阶段进行胚胎外膜解剖（E5.5）。
注意：E5.5是进行胚胎外膜解剖的理想时间。在CAM形成之前更早地解剖膜（例如，在E4处）会降低胚胎在后期阶段的可及性11。此外，在E5.5处，胚胎仅被高度血管化的CAM部分覆盖，但在接下来的1-2天内，CAM迅速包裹并阻止进一步进入胚胎11，12。因此，随着血管撕裂的风险增加，E6或更晚的膜解剖具有挑战性。- 使用一对灭菌的细镊子轻轻抓住ACM并将其从胚胎中拉出。然后使用灭菌的微解剖剪刀在前肢正上方的ACM上切一个孔，该孔从前肢上覆的膜延伸到覆盖头部的膜。
注意：此步骤可松弛绒毛膜和羊膜，从而使它们更容易抓住，并在后续步骤中用镊子进一步解剖。参见 图1 ，了解如何通过蛋壳窗口解剖膜的有用示意图。
- 使用一对灭菌的细镊子轻轻抓住ACM并将其从胚胎中拉出。然后使用灭菌的微解剖剪刀在前肢正上方的ACM上切一个孔，该孔从前肢上覆的膜延伸到覆盖头部的膜。
- 使用两对精细的无菌镊子在ACM和CAM之间的两个相邻位置（例如，前肢上方的切口与CAM最近的边缘之间的区域）轻轻地抓住羊膜。
- 小心地移动每对镊子，两个镊子都牢牢地抓住羊膜，彼此远离，一对背向胚胎，另一对在腹侧移动。
注意：此运动用于进一步撕裂羊膜，同时还将ACM（由一对镊子相对于胚胎在背侧方向拉动）和CAM（由另一对镊子相对于胚胎在腹侧方向拉动）分开。 - 当CAM不再覆盖胚胎并且从胚胎肠道到CAM的同囊动脉和静脉时，确保膜分离，并且很容易看到。
- 小心地移动每对镊子，两个镊子都牢牢地抓住羊膜，彼此远离，一对背向胚胎，另一对在腹侧移动。
- 使用灭菌的细镊子解剖并去除覆盖胚胎的任何残留的羊膜。最常见的是，剩余的羊膜将部分覆盖胚胎的尾部一半。
- 使用灭菌的镊子，抓住胚胎中颅区附近的羊膜，并小心地将羊膜相对于胚胎的尾部方向拉向早期移位的CAM。胚胎现在将完全暴露，CAM的进一步生长将主要发生在远离发育中的胚胎的地方。
注意：请参阅 图1 ，了解膜解剖后暴露的胚胎将如何出现的有用示意图。另外，请参阅以前发布的报告11 ，了解步骤 3.3.-3.6 的有用逻辑示意图。
- 使用灭菌的镊子，抓住胚胎中颅区附近的羊膜，并小心地将羊膜相对于胚胎的尾部方向拉向早期移位的CAM。胚胎现在将完全暴露，CAM的进一步生长将主要发生在远离发育中的胚胎的地方。
- 加入几滴含有青霉素/链霉素抗生素的林格氏溶液，以滋润胚胎并对卵子进行灭菌。
- 使用透明胶带重新密封窗孔，如步骤 2.8 中所述。将蛋放回孵化器进行进一步发育，保持蛋水平并保持孵化器的摇摆功能失活。
- 重复步骤 3.1.-3.8。对于每个鸡蛋。
注意：上述E5.5处的胚胎外膜解剖将允许通过E7进入胚胎，这是可以进行8，9损伤的时间。通过E8，CAM组织的持续生长开始覆盖胚胎的颅骨区域，从而阻止进一步进入角膜。如果想要在较旧的E8-E9角膜中进行伤口，则可以将生长的CAM相对于胚胎重新定位腹侧（步骤3.10.）。如果有人想在E7处受伤，步骤3.10。没有必要进行，可以继续进行步骤4，角膜损伤。 - 从培养箱中取出E7卵，其胚外膜先前在E5.5处解剖（步骤3.1.-3.8）。用灭菌的镊子抓住任何与CAM融合的可用羊膜组织，并沿着相对于胚胎的腹侧方向轻轻地将羊膜从胚胎的颅骨区域拉开。
注意：由于从胚胎移走的羊膜融合到CAM，生长和高度血管化的CAM将跟随羊膜抓住的镊子并远离颅骨区域。每天重复此步骤，以不断将CAM从胚胎中移开，直到胚胎处于所需的伤口年龄。
4. 角膜损伤
- 从培养箱中获取卵子，以便在所需的胚胎年龄E7-E9处进行伤口。用无菌解剖剪刀将胶带从窗户上切开，露出胚胎。加入几滴含有青霉素/链霉素抗生素的林格氏溶液，以滋润胚胎并对卵子进行灭菌。
- 使用微解剖刀做一个横跨右眼角膜范围的切口（由于胚胎在卵子中产卵的方式，左眼无法进入，但可以作为非受伤的对照），该切口与脉络膜裂缝平行并符合（图1）。第一个切口将穿过角膜上皮。
- 使用微解剖刀再次将角膜撕裂与第一切口相同的位置2倍以上（例如，总共三次切口，切口2和切口3与切口1）11在角膜中的位置相同。第二次撕裂将穿过基底膜，第三次将穿透前基质。
注意：如果胚胎已沉淀在解剖的CAM下，则可以使用灭菌的弯曲虹膜镊子小心地将头部从CAM下方移出。将弯曲的虹膜镊子放在头部下方，与头部左侧接触。将整个头部固定在闭合的弯曲虹膜镊子上，并在CAM周围和上方轻轻抬起头部。为了帮助提高生存能力，使用弯曲的虹膜镊子的类似技术，在手术后将胚胎塞回CAM下，以促进CAM的适当生长。
- 使用微解剖刀再次将角膜撕裂与第一切口相同的位置2倍以上（例如，总共三次切口，切口2和切口3与切口1）11在角膜中的位置相同。第二次撕裂将穿过基底膜，第三次将穿透前基质。
- 加入3-4滴含有青霉素/链霉素抗生素的林格氏溶液，以滋润胚胎并对卵子进行灭菌。
- 用透明胶带重新密封窗孔，然后返回培养箱，使鸡蛋保持水平。让胚胎发育，角膜伤口愈合所需的时间（例如，0.5-11天），然后通过斩首对胚胎进行人道安乐死。
- 使用弯曲的虹膜镊子从漂浮在Ringer盐水溶液培养皿中的安乐死胚胎中收获眼睛，方法是轻轻抓住眼睛的后侧，眼睛和面组织相遇的地方，并小心地将整个眼睛抬离并脱离面部组织。
- 用细镊子在整个眼睛的后部戳一个小孔（3-5厘米），并将整个眼睛固定在4°C的4%多聚甲醛中过夜，并轻度搅拌。
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Representative Results
在E5.5处对ACM和CAM进行早期解剖以暴露发育中的胚胎的颅骨区域之后， 在卵中 进行了一系列跨越E7中心角膜的撕裂伤（图1）。研究角膜再生的理想伤口发生在三次撕裂伤之后，每次撕裂伤都在角膜的同一位置进行。第一次撕裂伤穿过角膜上皮，而第二次和第三次撕裂分别穿透下面的基底膜和前基质。为了获得理想的伤口，使用锋利的微解剖刀（参见 材料表）并在进行撕裂伤时施加正确的压力至关重要（图2，参见理想伤口）。施加太轻的压力将导致浅伤口撕裂角膜上皮而没有充分穿透前基质（图2，见浅伤口）。然而，施加过多的压力会导致整个范围的伤口穿透整个基质并将房水暴露于外部环境（图2，见全范围伤口）。
进行适当的撕裂切口会产生理想的伤口（图2），该伤口最初扩大（伤口后0-3天）8 （图3）。据推测，通过伤口E7鸡角膜发生的伤口扩大阶段与这个胚胎阶段8的眼睛大小的快速扩张有关。从E4到E10的眼睛生长速度明显快于从E10到孵化的眼睛生长。眼睛生长的这些早期快速阶段归因于眼压（IOP）依赖性生长升高13。因此，眼睛的快速生长速度加上升高的IOP很可能在愈合过程的早期阶段（伤口后0-3天）促进伤口回缩，这是胚胎角膜伤口愈合进展所独有的。之后，发生上皮再生和新组织形成（伤口后4-9天），最终在伤口8 后11天以无疤痕的方式闭合伤口（图3A）。
通过使用标记富含层粘连蛋白的基底膜的层粘连蛋白抗体染色横截面，并用核标记DAPI对切片进行反染色，可以进一步分析伤口深度和再生，该标记通过角膜上皮8揭示伤口的范围。最近受伤的角膜（0 dpw）和那些处于再生过程早期的角膜（3 dpw）显示伤口穿透了上皮层和基底膜，正如角膜上皮内核标志物DAPI的破裂染色和没有层粘连蛋白抗体染色所证明的那样，这标志着角膜上皮和下层基质 8之间富含层粘连蛋白的基底膜（图3B).然而，用DAPI和层粘连蛋白抗体染色的11个dpw角膜的横截面显示完全愈合的角膜，该角膜已被重新上皮化，并且在再生伤口8 的部位含有连续的富含层粘连蛋白的基底膜（图3B）。
角膜切口后，通过对切片的受伤角膜组织进行免疫组织化学检查，完成了伤口愈合过程的详细表征。细胞外基质蛋白纤连蛋白和替奈司星与上皮和角质形成细胞迁移到愈合的成人角膜伤口14，15有关。细胞外基质蛋白，纤连蛋白和替纳辛的时空定位在愈合伤口内是明显的，并且发现在与角膜再上皮化（伤口后5天）相对应的时间点升高8 （图4）。这种分析表明纤连蛋白和替那辛对伤口闭合的重要性，特别是它们参与上皮细胞迁移和存活，与成人角膜伤口的这种功能一致16，17。
从E8-E9开始，角膜被三叉神经纤维密集支配，三叉神经纤维从胭骨周围神经环发出，并通过前基质穿过前基质，因为它们通过E1218，19，20向角膜中心和角膜上皮突出。由于该模型中的角膜伤口是在E7处形成的，在神经投影到角膜之前不久，该模型进一步研究了角膜神经在侮辱后导航愈合角膜时。通过使用全山免疫组织化学来追踪具有抗β神经小管蛋白（Tuj1）抗体21的角膜神经，很明显神经暂时受到直接并列受伤的中央角膜的愈合角膜组织（受伤后5天）8 （图5A，B）。尽管早期受到抑制，但角膜神经最终将完全愈合的角膜组织（伤口后11天）支配到与分期匹配的未受伤对照（E18C）相似的密度水平和相似的模式（图5C，D）。
引人注目的是，完全上皮化的角膜组织以非纤维化，无疤痕的方式愈合，显示出正常胶原组织结构的完全概括。如第二代谐波成像22，23所证明的那样，贯穿中心角膜伤口区域不同深度的胶原纤维束正交排列，与非损伤中心角膜组织的天然宏观结构相匹配 9（图6）。
图1： 卵内 胚外膜夹层和角膜损伤的示意图。 在E5.5处，通过解剖ACM和CAM膜并将羊膜和尿囊定位在远离发育中的眼睛的地方，胚胎的颅骨区域暴露。当中央角膜受伤时，将卵子密封并孵育至E7，使用弯曲的镊子作为胚胎头的摇篮，因为显微外科刀的尖端在中央角膜上切口。伤口平行于脉络膜裂隙（星号）。为了确保切口的深度到达前基质，需要用刀同时进行三次切割，每个切割都处于相同的相对位置，一个在另一个之上。比例尺 = 1 mm。该图是在参考文献8，11的许可下改编的。 请点击此处查看此图的大图。
图2：卵子中产生的伤口的变化（A）在E5.5处进行膜解剖后，右眼可以在卵子中接近。（黑白）在跨越角膜范围的不同程度撕裂伤后立即拍摄的卵子胚胎的图像，并且与脉络膜裂缝一致（cf）。（B）在施加弱压力的三次撕裂伤之后，可以看到浅伤口。箭头标记角膜中的一个部位，其中上皮已被剪切但前基质尚未穿透。箭头表示前基质已被穿透的小角膜区域。（C）在施加理想压力的三次撕裂伤之后，可以看到理想的伤口。箭头表示横跨角膜整个范围的伤口，其中前基质已被穿透。（D）在施加过大压力的三次撕裂伤之后，可以看到整个范围的伤口，并且房水已暴露于外部环境。简称：tca，颞睫状动脉;cf， 脉络膜裂;CAM，绒毛膜。请点击此处查看此图的大图。
图3：伤口愈合进展 （A）与阶段匹配对照相比，受伤角膜愈合的进展从伤口（0 dpw）和伤口后16小时（hrpw）到受伤后3-11天（dpw）显示。箭头勾勒出伤口的背侧和腹侧最边缘，表示伤口扩张期（0-3 dpw），然后是渐进性伤口闭合（5-11 dpw）。（B） 在 0、3 和 11 dpw 处切割的 DAPI（蓝色）和层粘连蛋白（红色）染色的受损角膜。支架显示受伤区域的范围，显示伤口扩张3 dpw，E11完全修复上皮化角膜。星号表示角膜的愈合区域。比例尺为 （A） 1 毫米，（B） 100 微米。该图是在参考文献8的许可下改编的。 请点击此处查看此图的大图。
图4：受伤角膜的组织学分析。 横截面通过 （A） 3 dpw 和 （B） 5 dpw。DAPI 染色（蓝色）损伤的角膜揭示了纤连蛋白（FN，红色）和特纳辛-C（TN-C，绿色）的定位。（A）和（B）中的括号表示受伤地区。比例尺：100微米。缩写： ep， 上皮;斯特，基质;内皮。该图是在参考文献8的许可下改编的。 请点击此处查看此图的大图。
图 5：受伤角膜的神经支配 （A-D） 抗β神经小管 （Tuj1） 全囊免疫染色后角膜神经的可视化 （B） 5 dpw 和 （D） 11 dpw 角膜，以及 （A） 阶段匹配的 E12 （E12C，阶段匹配 5 dpw） 和 （C） E18 对照组（E18C，阶段匹配 11 dpw）。（B）5 dpw角膜中的虚线表示伤口的程度。直接靠近伤口的括号区域表示角膜区域暂时排斥神经并积极进行上皮再皮化。（乙）通过直接靠近开放性伤口的愈合角膜组织的光学扫描显示延伸到组织（箭头）和上皮神经皮带（箭头）的罕见基质神经束。（三、四）完全再生的角膜在11 dpw处显示出与阶段匹配对照相似的神经支配模式和相似的神经密度。简称：w，伤口。该图是在参考文献8的许可下改编的。请点击此处查看此图的大图。
图6：已愈合的胚胎角膜中的胶原蛋白超微结构 （A）使用第二代谐波成像（SGH）对完全愈合的10 dpw角膜和阶段匹配对照进行En面扫描。扫描深度范围为角膜前表面的2-66μm（0μm是最前基质），并列在相应图像的左侧。每个图像的插图对应于该特定扫描深度的中心伤口区域的快速傅里叶变换分析。（B）手动分段堆叠的二维快速傅里叶变换分析，表示受伤和阶段匹配的对照角膜内的胶原组织。比例尺 = 50 μm。该图是在参考文献9的许可下改编的。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
雏鸡是研究胎儿无疤痕角膜伤口修复的理想模型系统。与哺乳动物不同，在整个发育过程中，使用 卵8或 前卵 策略24很容易获得雏鸡。胚胎雏鸡角膜比啮齿动物角膜大得多，近50%的颅骨体积专用于眼睛25，使其非常适合物理操作，例如受伤。此外，鸡蛋全年都很容易买到，通常来自当地农场，而且具有成本效益，只需要一个温水的孵化器来支持发展。
该协议报告了一系列使胚胎雏鸡角膜受伤的程序。胚胎雏鸡角膜上的伤口完全再生，使天然角膜结构完全概括，没有可检测到的疤痕。这项技术使胚胎雏鸡成为阐明协调无疤痕角膜伤口愈合的分子和细胞因子的重要动物模型。
尽管本文描述的胎儿伤口愈合模型固有的明确承诺，但值得注意的是，胎儿和成人角膜伤口愈合之间存在明显差异。胚胎角膜表达生长因子和形态发生信号，这些信号在成人组织中沉默或不存在26。此外，受伤的成年角膜组织表现出纤维化并形成瘢痕组织，可能是由于细胞因子和生长因子27介导的炎症反应增强，这些细胞因子在胚胎阶段被抑制或尚未建立。角膜组织内这种与年龄相关的差异可能会使完全恢复成年损伤组织的努力复杂化。然而，确定调节胎儿无疤痕伤口愈合的关键分子因子和基质蛋白将为促进更具恢复性愈合过程的疗法铺平道路，减少疤痕并更好地概括正常组织结构。
这里描述的伤口方法建立在Spurlin等人11 首次开发的技术之上，该技术旨在获得 卵 获得晚期雏鸡胚胎（例如，>E6）。通过使卵子开窗并解剖远离颅骨区域的胚胎外膜，胚胎眼可以进入E7阶段。正如我们之前报道的那样，羊膜和绒毛膜的去除和移位分别不影响胚胎发育11。暴露的胚胎是可行的，并且易于进行物理操作。在这个阶段，角膜有三个不同的层（上皮，基质和内皮），使其适合在线性切口进入前基质后的伤口愈合研究。需要注意的是，由于随着时间的推移，尿囊生长的增加，进入眼睛最终在E8处被遮挡。为了规避这个问题，如果希望进入后期眼睛进行伤口，我们发现可以通过对胚胎外膜进行日常操作（例如，在E7，E8等处）来维持对眼睛的访问，其中将尿囊小心地重新定位远离颅骨区域，以确保其生长方向远离胚胎。这使得角膜在这些后期阶段（例如，在神经支配后）受伤。
总体而言，该技术中的胚胎活力和存活率取决于几个因素，例如确保维持无菌和水合的卵子环境，同时进一步注意不要对胚胎血管或尿囊造成损害。在开窗之前，应用乙醇对整个鸡蛋表面进行灭菌，以保持无菌状态。这是因为通常含有微生物的小蛋壳碎片通常会在开窗过程中落入鸡蛋中。同样，所有涉及开窗、膜解剖和制作角膜切口的工具都必须在乙醇中彻底冲洗，并在使用前干燥或火焰灭菌。此外，每当胚胎暴露于外部环境时，都应将抗生素添加到卵子中。胚胎在开窗后保持适当的水合作用也更加重要。必须非常小心地确保窗户用胶带完全密封，并且没有气隙。鉴于胶带保持完全粘附在蛋壳表面并完全密封孔的重要性，在应用胶带之前，需要清洁和干燥孔周围的蛋壳表面。最后，当务之急是不要无意中切开血管，并且储存胚胎液体废物的尿囊在解剖胚胎外膜期间不会受损，因为其中任何一种对胚胎都是致命的。需要注意的是，当对绒毛膜和羊膜的较小撕裂时，胚胎活力更高，尽管撕裂必须足够大以使胚胎外膜远离颅骨区域。如果在从高质量卵子中解剖和去除膜的过程中采取这些仔细的步骤，人们可以预期几乎所有的胚胎都能在开窗手术中存活（约99%），而〜40%的暴露胚胎存活到E9，〜30%存活到E1211。根据我们的经验，伤口E7-E9膜解剖胚胎的角膜对胚胎的活力几乎没有影响，并且充足的胚胎通过E18保持存活，此时角膜伤口完全愈合。
实现穿过角膜上皮并穿透前基质的伤口对于产生可靠和可重复的结果至关重要。需要高质量的微解剖刀，以便施加很少的压力。使用一对弯曲的虹膜镊子可以帮助轻轻地抱住头部，因为用另一只手做撕裂伤。通过这种方式，弯曲的虹膜镊子用作支撑，使角膜在受伤期间保持静止。伤口对基质的渗透是可变的，特别是在学习时，但随着研究人员学习打破角膜上皮的感觉和外观，它变得更具可重复性。正如人们所学习的那样，在横截面上观察受伤的角膜可能会有所帮助，以便可以评估伤口穿透角膜基质的深度（参见 图3B ，了解角膜撕裂后紧随其后的横截面角膜显示理想伤口深度的示例）。
当与经典的发育生物学技术（如组织移植和磁珠植入）或现代基因操作方法（如DNA电穿孔和逆转录病毒感染）相结合时，这种角膜再生的动物模型有望揭示损伤后实现角膜组织完全恢复所需的分子因素和细胞机制。此外，该动物模型可用于测试外源性治疗化合物增强角膜再生的潜在用途。
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Disclosures
作者对本手稿中提供的信息没有竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了伊利诺伊卫斯理大学向TS提供的艺术和学术发展补助金的支持，部分资金来自NIH-R01EY022158（PL）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 18 G hypodermic needle | Fisher Scientific | 14-826-5D | |
| 30 degree angled microdissecting knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Molecular Probes | D1306 | |
| 5 mL syringe | Fisher Scientific | 14-829-45 | |
| Alexa Fluor labelled secondary antibodies | Molecular Probes | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2-H20) | Sigma | C8106 | |
| Chicken egg trays | GQF | O246 | |
| Dissecting Forceps, Fine Tip, Serrated | VWR | 82027-408 | |
| Dissecting scissors, sharp tip | VWR | 82027-578 | |
| Iris 1 x 2 Teeth Tissue Forceps, Full Curved | VWR | 100494-908 | |
| Kimwipes | Sigma | Z188956 | |
| Microdissecting Scissors | VWR | 470315-228 | |
| Mouse anti-fibronectin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | B3/D6 | |
| Mouse anti-laminin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3H11 | |
| Mouse antineuron-specific β-tubulin (Tuj1, IgG2a) | Biolegend | 801213 | |
| Mouse anti-tenascin (IgG1) | Developmental Studies Hybridoma Bank | M1-B4 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma | P4333 | |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma | P5405 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP358 | |
| Sportsman 1502 egg incubator | GQF | 1502 | |
| Tear by hand packaging (1.88 inch width) | Scotch | n/a |
References
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