Summary
Proteomisk dysreglering spelar en viktig roll i spridningen av diffust infiltrerande gliom, men flera relevanta proteiner förblir oidentifierade. Digital rumslig bearbetning (DSP) erbjuder en effektiv metod med hög genomströmning för att karakterisera det differentiella uttrycket av kandidatproteiner som kan bidra till invasion och migration av infiltrativa gliom.
Abstract
Diffust infiltrerande gliom är förknippade med hög sjuklighet och dödlighet på grund av tumörspridningens infiltrativa natur. De är morfologiskt komplexa tumörer, med en hög grad av proteomisk variabilitet över både själva tumören och dess heterogena mikromiljö. Den maligna potentialen hos dessa tumörer förbättras av dysreglering av proteiner som är involverade i flera viktiga vägar, inklusive processer som upprätthåller cellulär stabilitet och bevarar mikromiljöns strukturella integritet. Även om det har gjorts många bulk- och encelliga gliomanalyser, finns det en relativ brist på rumslig stratifiering av dessa proteomiska data. Att förstå skillnader i rumslig fördelning av tumorigena faktorer och immuncellpopulationer mellan den inneboende tumören, invasiva kanten och mikromiljön ger värdefull insikt i mekanismerna bakom tumörproliferation och förökning. Digital rumslig profilering (DSP) representerar en kraftfull teknik som kan ligga till grund för dessa viktiga flerskiktsanalyser.
DSP är en metod som effektivt kvantifierar proteinuttryck inom användarspecificerade rumsliga regioner i ett vävnadsprov. DSP är idealiskt för att studera differentialuttrycket av flera proteiner inom och mellan regioner med distinktion, vilket möjliggör flera nivåer av kvantitativ och kvalitativ analys. DSP-protokollet är systematiskt och användarvänligt, vilket möjliggör anpassad rumslig analys av proteomiska data. I detta experiment konstrueras vävnadsmikroarrayer från arkiverade glioblastomkärnbiopsier. Därefter väljs en panel av antikroppar som riktar sig mot proteiner av intresse i provet. Antikropparna, som är prekonjugerade till UV-fotokleaverbara DNA-oligonukleotider, inkuberas sedan med vävnadsprovet över natten. Under fluorescensmikroskopivisualisering av antikropparna definieras regioner av intresse (ROI) inom vilka man kvantifierar proteinuttryck med proverna. UV-ljus riktas sedan mot varje ROI och klyver DNA-oligonukleotiderna. Oligonukleotiderna mikroaspirateras och räknas inom varje ROI, vilket kvantifierar motsvarande protein på rumslig basis.
Introduction
Diffust infiltrerande gliom är den vanligaste typen av malign hjärntumör hos vuxna och är alltid dödliga. Benägenheten för gliomceller att migrera i stor utsträckning i hjärnan är en stor terapeutisk utmaning. Mekanismen genom vilken de sprider sig innebär riktad migration och okontrollerad invasion. Invasiva gliomceller har visat sig uppvisa tropism och migration längs vita substanskanaler1, med ny forskning som implicerar demyelinering av dessa kanaler som en aktiv, protumorigenisk egenskap2. Invasion förmedlas av en epitel-till-mesenkymal övergång, där gliomceller förvärvar mesenkymala egenskaper genom att minska uttrycket av gener som kodar för extracellulära matrisproteiner och celladhesionsmolekyler, förstärka migration och underlätta förökning genom tumörmikromiljön 3,4,5.
På molekylär nivå har störningar av flera proteiner som ger cellulär stabilitet och gränssnitt med immunogena komponenter visats6. Infiltrativa gliom är kända för att genomgå undertryckande av proteiner med anti-apoptotiska (t.ex. PTEN) egenskaper7. De överuttrycker också proteiner som främjar undvikande av värdens immunsvar (t.ex. PD1 / PDL1)8. Dysregleringen av dessa komplexa vägar ökar tumorigeniciteten och ökar malign potential.
Inom prover av invasivt gliom var syftet att utvärdera det differentiella uttrycket av proteiner som är nyckeln till celltillväxt, överlevnad och spridning, och till mikromiljöstrukturell integritet mellan invasiva och icke-invasiva komponenter. Dessutom försökte vi studera differentiell reglering av proteiner med en aktiv immunogen roll och erbjuda insikt i mekanismen genom vilken komprometterade värdimmunförsvar kan förbättra gliomens proliferativa och invasiva potential. Detta är särskilt relevant med tanke på den senaste tidens bredd av forskning som visar hur immunmarkörer och drivkrafter för dysreglering vid malignitet kan fungera som mål för immunterapi. Att identifiera livskraftiga terapeutiska mål bland de många proteiner som är involverade i immunövervakning och reaktivitet kräver ett mycket känsligt och omfattande tillvägagångssätt.
Med tanke på det stora utbudet av kandidatproteiner som kan studeras sökte vi en metod som liknar immunhistokemi men med förbättrad databehandlingseffektivitet. Inom cancerbiologi har DSP vuxit fram som en kraftfull teknik med viktiga fördelar jämfört med alternativa verktyg för proteomisk analys och kvantifiering. Kännetecknet för DSP är dess multiplexeringsförmåga med hög genomströmning, vilket möjliggör samtidig studie av flera olika proteiner i ett prov, vilket markerar en viktig skillnad från standard men lägre plexteknologier såsom immunohistokemi (IHC)9,10. Multiplexfunktionen hos DSP äventyrar inte dess trohet som ett kvantitativt och analytiskt verktyg, vilket framgår av studier som jämför DSP med IHC. När DSP används för proteomisk kvantifiering av icke-småcelliga lungcancerprover har DSP till exempel visat sig ha liknande resultat som IHC11. Dessutom erbjuder DSP anpassningsbar regional specifikation, där användare manuellt kan definiera regioner där de ska utföra proteomisk analys. Detta ger en fördel jämfört med multiplexmetoder för hela sektioner10,12. I en enda bearbetningsrunda erbjuder DSP således flera lager av analys genom att kartlägga flera proteinmål över flera regioner av intresse.
DSP har applikationer i flera olika patologiska miljöer. DSP är särskilt fördelaktigt vid onkologisk analys, eftersom rumslig variation kan korrelera med cellulär transformation och differentiellt proteinuttryck. Till exempel har DSP använts för att jämföra den proteomiska profilen för bröstcancer med den intilliggande tumörmikromiljön. Detta har viktiga konsekvenser för att förstå den naturliga historien om denna tumör och dess progression, liksom potentiellt svar på behandling13. Ytterligare sammanhang som illustrerar DSP: s mångsidighet inkluderar rumslig kvantifiering av proteindiversitet i prostatacancer14, associering av immuncellmarköruttryck med sjukdomsprogression i skivepitelcancer i huvud och nacke15 och demonstration av en epitel-mesenkymal gradient av proteinuttryck som skiljer metastatisk från primär klarcellig äggstockscancer16 . Genom att implementera DSP karakteriserar vi den rumsliga topografin hos proteiner som kan påverka tumorigenes och invasion av gliom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet som beskrivs nedan följer riktlinjerna från Dartmouth-Hitchcock Human Research Ethics Committee. Informerat samtycke erhölls från de patienter vars vävnadsprover inkluderades i denna studie. Se avsnittet Materialförteckning för mer information om alla material, reagenser, utrustning och programvara som används i detta protokoll.
1. Förberedelse av rutschkana17
- Hämta eller förbered formalinfixerad, paraffinbäddad vävnad från diffust infiltrerande gliom av mänsklig vuxentyp.
OBS: I detta experiment användes paraffininbäddade block av biopsier från tre patienter med glioblastom. - Skapa ett tma-block (tissue microarray). Ta flera 2 mm kärnor från varje biopsi och lägg dem i ett enda TMA-block (figur 1, överst). Skär sektioner från TMA-blocket vid 4 μm och montera på glasskivor. Placera varje bild inuti glidhållarens packning. Inkubera objektsglaset vid 60 °C i 30 minuter.
2. Halvautomatisk förberedelse av IHC-system och programvarukonfiguration (för laddning och körning av objektbilder)17
- Ställ in reagenserna. Klicka på knappen Reagent Setup . Klicka på Lägg till på fliken Inställningar .
- Registrera en tvättbuffert genom att skriva ett namn för den i fältet Namn . Välj Underordnad i fältet Typ . Klicka på Spara.
- Registrera en blockeringslösning genom att upprepa samma steg som ovan (ändrat efter behov, t.ex. i fältet Namn ), men välja Primär antikropp i fältet Typ . Välj önskade protokoll i listrutorna för Standard Staining Protocol och Default HIER Protocol. Välj ett standardalternativ för enzymprotokoll om du vill (den här rutan lämnades tom i det aktuella protokollet). Klicka på Spara.
- Registrera detektionssystemet, som består av ett streckkodat reagensbehållarfack. Skanna streckkoden.
- Börja ange information om reagenssystemet i fönstret Lägg till forskningsreagenssystem . Ange ett Namn för detekteringssystemet.
- Skriv ett förfallodatum. Markera den första raden i reagensdiagrammet och skanna streckkoden för en ny reagensbehållare på 30 ml, då streckkoden fylls i rad 1.
- Placera behållaren i läge 1 i detektionssystemet. Välj namnet på tvättbufferten i listrutan i kolumnen Reagens och klicka på Lägg till. Upprepa dessa steg för att lägga till ytterligare reagenser i efterföljande rader, inklusive blockeringslösningen.
- Ställ in proteinprotokollet för IHC. Klicka på Protocol Setup. Markera raden som motsvarar önskat protokoll och klicka på Kopiera. Ange Namn och fyll i andra relevanta fält i fönstret Redigera protokollegenskaper.
- Markera rutan för Visa tvättsteg. Kontrollera att fälten Inc (min) och DispenseType är korrekta för varje reagens (10 min för blockeringslösningen, 0 min för tvättbufferten och 150 μl för varje dispensetyp). Klicka på Spara.
- Förbered studien. Fyll behållaren i läge 1 med en tvättbuffert. Fyll 150 μL per glas och 5 ml dödvolym; Lämna locket öppet. Upprepa dessa steg för behållaren i position 2, som ska fyllas med en blockerande lösning. Denna behållare ska ha 150 μl per objektglas och 350 μl dödvolym.
- Ladda reagensbehållaren på maskinen. Tillåt att systemet utför containerigenkänning och volymbekräftelseåtgärder. Klicka på Slide Setup | Lägg till studie. Ange studie-ID och studienamn och välj 150 μl under Dispensera volym | önskat protokoll i rullgardinsmenyn Beredningsprotokoll (Bake and Dewax föreslås). Markera studien och klicka på Lägg till bild.
- Välj testvävnad under vävnadstyp | 150 μl under Dispensera volym | Singel och rutin från listrutorna Färgningsläge . Välj en process (IHC för den aktuella studien) | Namnet på blockeringslösningen i listrutan i fältet Markör | IHC DSP-protokoll i färgningsfältet på fliken Protokoll | * Baka och avvaxa för beredning | *HIER 20 min med ER1 för HIER. Lämna fältet Enzym tomt.
- Upprepa den här processen för varje bild. Klicka på Stäng när du är klar och klicka sedan på Skriv ut etiketter. Kontrollera alla bildetiketter som ännu inte skrivits ut för aktuell studie och klicka på Skriv ut. Fäst etiketter på bildernas överkanter.
- Ladda och kör bilder. Ladda bilderna på glidfacket och se till att provet och etiketten är vända uppåt. Placera täckplattorna över bilderna och se till att bilderna är orienterade med flikar längst ner. Ladda glidfacken på instrumentet.
- Tryck på LED-knappen för att sänka facket och låt instrumentet börja skanna och känna igen bilder. Klicka på Start-knappen för att starta experimentet.
- Avsluta experimentet. Tryck på LED-knappen när den blinkar grönt, vilket indikerar att körningen är klar. Ta bort brickan från instrumentet och lyft försiktigt täckplattorna från varje bild. Placera bilderna i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS), ta bort överflödig buffert och skissera varje vävnadssektion med en hydrofob penna för att skapa en hydrofob barriär.
3. Antikroppsinkubation och kärnfärgning17
- Välj en panel med antikroppar för att lokalisera antigener av intresse (se tabell 1 för antikroppar som används i detta experiment).
OBS: Varje antikropp har redan konjugerats till en DNA-oligonukleotid med ett UV-fotokleaverbart segment (PC-oligo) som unikt identifierar det (indexering av oligos, figur 2). - Gör en fungerande antikropp-PC-oligolösning genom att för varje objektglas tillsätta 8 μL av varje antikropp (utspädd 1:40) i panelen. Använd det blockerande reagenset som spädningsmedel för att nå den slutliga volymen på 200 μl för varje objektsglas. Inkubera över natten vid 4 °C (figur 3, steg 1).
OBS: Morfologiska markörer, biologiska färgämnen eller fluorescerande märkta antikroppar kan också tillsättas till lösningen i detta steg. - Nästa dag, placera bilden i en Coplin-burk och tvätta 3 x 10 min i 1x TBS-T. Postfix i 4% paraformaldehyd i 30 min vid rumstemperatur, följt av 2 x 5 min i 1x TBS-T.
- Tillsätt SYTO13 kärnfläck (utspädd 1:10 i 1x TBS) i 15 min vid rumstemperatur. Tvätta 2x med 1x TBS-T och förvara sedan bilden i 1x TBS-T.
4. Fluorescensvisualisering, ROI-identifiering och UV-fotoklyvning på DSP-instrumentet17
- När du har hållit muspekaren över datainsamlingen i Kontrollcenter väljer du Ny/Fortsätt kör.
- Placera bilden i skjuthållaren med etiketten mot användaren. Sänk ner glidbrickans klämma och se till att vävnaden är synlig i det långsträckta fönstret. Tillsätt 6 ml buffert S.
- Följ anvisningarna i Kontrollcenter. Zooma mellan olika axlar med X- och Y-reglagen för att avgränsa ett område för skanning. Välj Skanna. Låt skanningen fortsätta tills hela det definierade målområdet har avbildats.
- Generera en 20x bild. Definiera avkastningen på investeringen antingen automatiskt eller manuellt (bild 3, steg 2). För att följa detta protokoll, välj tre lika stora, cirkulära ROI (diameter på 250 μm) för varje vävnadskärna (figur 4, botten).
ROI: er kan anpassas i storlek och form. Flera ROI kan väljas inom varje avsnitt. I det här experimentet definieras cirkulära ROI manuellt. - Godkänn ROI:erna genom att klicka på knappen Avsluta skanningsarbetsyta . Vänta tills UV-ljuset klyver oligos från antikropparna.
- När rengöringsinstrumentprocessen har slutförts väljer du Ny datainsamling för att fortsätta med de aktuella bilderna eller plattan. Annars väljer du Ta bort bilder och mikroplatta.
- Öppna fönstret Slutför plattan genom att dubbelklicka på skyltikonområdet längst ned till höger i Kontrollcenter. Om partinumret för hybridiseringspaketet (Hyb) (Hyb) är känt anger du numret och klickar på Uppdatera (valfritt under det här steget). Klicka på Slutför.
- Lossa glidhållaren och uppsamlingsplattan genom att följa anvisningarna. Förvara bilderna i TBS-T. Om bilderna inte kommer att användas under lång tid, täck dem med ett vattenhaltigt medium och täckglas.
5. Avläsning av protein17
- Använd en permeabel tätning och torka aspiraterna vid 65 °C i en termisk cykel med toppen öppen. Tillsätt 7 μl dietylpyrokarbonatbehandlat vatten och blanda. Inkubera vid RT i 10 minuter och snurra sedan ner snabbt.
- Välj lämpliga Probe R- och Probe U-ekvationer från tabell 2 för att vägleda skapandet av sond-/buffertblandningen. Baserat på antalet Hyb-koder som är nödvändiga för hybridisering i det aktuella experimentet, använd ekvation (1) enligt nedan. Blanda och snurra ner snabbt.
# Hyb-koder Sond R Arbetspool Probe U Arbetspool Hybridiseringsbuffert n = _______ (n × 8 μL) = _____ μL + (n × 8 μL) = ______ μL + (n × 80 μL) = _____ μL (1) - Tillsätt 84 μL sond/buffertblandning till varje Hyb-kodpaket som ska användas. Svep för att blanda och snurra ner. I en ny 96-brunns hybridiseringsplatta, tillsätt 8 μL av varje Hyb Code Master Mix i alla de 12 brunnarna i den angivna raden.
- Överför 7 μL från DSP-uppsamlingsplattan till motsvarande brunn i hybridiseringsplattan. Blanda försiktigt. Värmetäta och utför en snabb snurrning. Inkubera sedan över natten vid 67 °C. Kyl plattan på is och gör en snabb snurrning.
- Slå samman hybprodukterna från varje brunn i ett bandrör och rör försiktigt varje brunn 5x för att blanda. Täck remsröret och snurra ner. Frys in eventuella återstående opoolade hybprodukter vid -80 °C. Ladda remsrören i analyssystemet.
- Spara CDF-filen på en USB-enhet och överför sedan data från DSP-instrumentet till Digital Analyzer. Slutför installationen genom att utföra följande steg.
- Ladda förbrukningsvaror och poolade prover på förberedelsestationen. På skärmen trycker du på Starta bearbetning. Välj Hög känslighet, följt av Nästa. Tryck på Välj alla för antalet brunnar med prover | Avsluta | Nästa på e-postavisering | Börja.
- När förberedelsestationen är klar, försegla patronen och överför den till den digitala analysatorn. Tryck på Starta räkning, välj Scenposition, tryck på Ladda befintlig CDF-fil och välj tidigare uppladdad fil. Tryck på Klar, välj scenposition igen, tryck på Klar | Börja köra programmet.
- Spara den zippade filen för reporterräkningskonverteringsfilerna från analyssystemet till en USB-enhet och sätt sedan in enheten i DSP-maskinen. I DSP Control Center håller du muspekaren över Datainsamling och klickar sedan på Ladda upp antal. Välj relevant zippad fil.
6. Analys av data17
- Klicka på Poster i DSP Control Center. Om du vill visa genomsökningar i kön väljer du Lägg till valda genomsökningar i kö | Min analyskö. Välj Ny studie från kö när du har hovrat över alternativet Dataanalys i Kontrollcenter.
- Välj QC från Aktivitetsfältets alternativ. Fortsätt med standardvärdena eller justera om du vill. Välj Kör QC och granska resultatrutnätet. Klicka på Kör QC för att fortsätta och skapa en ny datauppsättning och normalisera värdena till de positiva hybridiseringskontrollerna.
- Importera de nya taggarna till en XLSX-fil. Välj Hantera anteckningar i fönstret Genomsökningar och ladda sedan ned en mall, infoga taggarna och importera filen.
- VALFRITT: När du har kört QC justerar du data ytterligare med andra verktygsfältsalternativ. Använd verktyg i fönstret Visualiseringar för att rita transformerade data.
- Navigera i den grå listrutan med parametrar för att komponera varje diagram i fönstret Visualiseringar . Välj ett visst område i ett diagram för att visualisera motsvarande markerade segment i fönstret Genomsökningar och högerklicka för att generera taggar eller grupper. I Sammanfattning av datauppsättning granskar du diagram från Normalisering, Skalning och andra alternativ för analys och visning.
- Spara en visualisering genom att välja ikonen för att spara; granska visualiseringar som redan har sparats under Sammanfattning. Välj knappen Exportera (.svg) för att exportera en visualisering i .svg format. Exportera data som en visualisering baseras på genom att klicka på knappen Exportera (.xlsx). Exportera alla data som finns i en specifik datauppsättning genom att hålla muspekaren över datauppsättningens namn i det andra fönstret och klicka på exportikonen .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 visar de representativa resultaten från ett DSP-experiment utfört på prover av glioblastom. En värmekarta presenteras som illustrerar en av metoderna för att fånga data visuellt med DSP-programvaran. Rader representerar proteinmål, och varje kolumn motsvarar en region av intresse. Ett färgintervall av blått till rött betecknar lågt respektive högt uttryck. Färgvariation inom en rad återspeglar regional protein heterogenitet och föreslår en möjlig rumslig koppling med differentiellt proteinuttryck. Till exempel i det nuvarande experimentet är S100 och CD56 universellt höga eftersom de är neurala markörer.
Markörer med mest variation inkluderade B7-H3, Ki-67, CD44 och fibronektin. Dessa markörer har viktiga samband med tumörproliferation, migration respektive metastasering. Det är därför rimligt att de skulle uppvisa regional variation mellan prover av malign kärna, malign invasion och icke-malign vävnad. Numerisk datarepresentation är också möjlig; en fil som innehåller uttrycksvärdet för varje proteinmarkör i en ROI i tabellform kan exporteras för matematisk och statistisk analys. Detta uttrycksvärde produceras av den digitala räkningsfunktionen som är tillgänglig via DSP, som kvantifierar de mikroaspirerade PC-oligos inom varje ROI (figur 1 och figur 2).
Figur 1: Definiera regioner av intresse för vävnadsmikroarray från glioblastombiopsier. Topp-, hematoxylin- och eosinfärgad sektion av vävnadsmikroarray innehållande flera kärnbiopsier med en diameter på 2 mm från totalt tre glioblastompatienter. Botten, regioner av intresse definierade på fluorescensbild. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Fotokleaverbara oligonukleotider. Antikropps- eller antisense-oligonukleotidprober för protein- respektive RNA-mål är kovalent kopplade till oligonukleotider med fotokleaverbara länkar. Vävnadssektioner är färgade med sonderna. UV-ljus riktas sedan mot ROI för att frigöra PC-oligos, som räknas digitalt. Denna siffra ändrades från9, med tillstånd från Springer Nature (copyright 2020). Förkortningar: PC-oligos = fotokleaverbara oligonukleotider; ROI = regioner av intresse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: DSP-procedur. 1) Vävnadsbehandling: En vävnadsglas färgas med oligokonjugerade antikropps- eller RNA-sonder. 2) ROI-val: Vävnadsglaset avbildas och ROI avgränsas, antingen manuellt eller automatiskt baserat på vissa fluorescensmönster. 3) Klyvning av konjugerade oligonukleotider: UV-ljus riktas mot ROI: erna, vilket resulterar i klyvning av de fotokleaverbara oligonukleotiderna. 4) PC-oligo-samling: PC-oligoerna sugs in i ett mikrokapillärrör. 5) Plätering: Aspirerade PC-oligos deponeras i en mikrotiterplatta. 6) Upprepa: Steg 3-5 upprepas för varje ROI; Mellan varje cykel utförs noggrann tvättning. 7) Kvantifiering: Rumsligt upplösta pooler av PC-oligos kan hybridiseras till fluorescerande streckkoder; detta möjliggör digital räkning av upp till cirka 1 miljon bindningshändelser per ROI. Alternativt kan PC-oligos kvantifieras via NGS, där hela mikrotiterplattan samlas i ett enda rör och sekvenseras. Läsningarna översätts sedan till digitala räkningar och mappas tillbaka till deras ursprungliga ROI, vilket skapar en visuell karta över protein- eller RNA-uttryck inom varje vävnadssektion. Denna siffra ändrades från9, med tillstånd från Springer Nature (copyright 2020). Förkortningar: DSP = digital rumslig bearbetning; PC-oligos = fotokleaverbara oligonukleotider; ROI = regioner av intresse; NGS = nästa generations sekvensering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Bild 4: Representativ värmekarta från ett DSP-experiment. Kolumner representerar enskilda regioner av intresse. Rader representerar ett proteinmål. Lågt uttryck visas i blått och högt uttryck visas i rött. Förkortning: DSP = digital rumslig bearbetning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| GeoMx immuncellprofilering - mänsklig | Pan-tumör modul |
| PD-1 | MART1 |
| CD68 | NY-ESO-1 |
| HLA-DR | S100B |
| Ki-67 | Bcl-2 |
| Beta-2 mikroglobulin | EpCAM |
| CD11c | Hennes2 |
| CD20 | Pten |
| CD3 | ER-alfa |
| CD4 | PR |
| CD45 | |
| CD56 | |
| CD8 | |
| CTLA4 | |
| GZMB | |
| PD-L1 | |
| Panck | |
| SMA | |
| Fibronectin | |
| Rb IgG | |
| Ms IgG1 | |
| Ms IgG2a | |
| Histon H3 | |
| S6 | |
| GAPDH |
Tabell 1: Ett representativt prov av proteiner som kan bedömas med hjälp av fördesignade antikroppspaneler.
| Sond U arbetspool | ||||||
| Modul 2 Sond R | Andra moduler | DEPC-behandlat vatten (mikroliter) | total volym (mikroliter) | Sond U Master Stock (mikroliter) | DEPC-behandlat vatten (mikroliter) | Total volym |
| 2 | ... | 16.5 | 2 | 14.5 | 16.5 | |
| 4 | ... | 33 | 4 | 29 | 33 | |
| 6 | ... | 49.5 | 6 | 43.5 | 49.5 | |
| 8 | ... | 66 | 8 | 58 | 66 |
Tabell 2: Hybridiseringskoder och arbetspooler för sond R och sond U. Förkortning: hyb = hybridisering; DEPC = dietylpyrokarbonat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Med tanke på mångfalden av proteiner som potentiellt kan påverka gliomens aggressivitet och uppfattningen att flera av dessa proteiner förblir oupptäckta, är en proteinkvantifieringsmetod med hög genomströmning ett idealiskt tekniskt tillvägagångssätt. Dessutom, med tanke på att rumsliga data i onkologiska prover ofta korrelerar med differentiellt uttryck18, möjliggör införlivande av rumslig profilering i proteinkvantifieringsmetoden en effektivare analys.
DSP: s höga genomströmningsmetod gör det också möjligt att använda den i ett hagelgevärsliknande tillvägagångssätt, vilket är idealiskt för att upptäcka potentiella nya biomarkörer för sjukdom och svar på terapi. I två studier av melanom användes DSP för att utvärdera svaren på kombinationsbehandling med ipilimumab och nivolumab jämfört med nivolumab monoterapi19 och på neoadjuvant kombinationsbehandling med ipilimumab och nivolumab jämfört med standardadjuvansbehandling20. I båda studierna visade DSP-profilering av en mängd olika proteinmål efter behandling differentiellt relativt uttryck av viktiga immunologiska markörer, vilket tyder på en roll för potentiella biomarkörer för terapeutiskt svar.
DSP underlättar också bestämningen av den ultimata patologiska betydelsen av komplexa processer på molekylär nivå. Till exempel är ett särdrag hos invasiva gliom deras benägenhet att migrera direkt genom den extracellulära matrisen (ECM), och deras migrationsväg styrs ofta av kärl- och vitsubstanskanaler 1,2. Variabilitet i proteinuttryck av vävnadsmikromiljön är ett kännetecken för epitel-till-mesenkymal övergång som driver invasion. Flera studier har undersökt hur gliom kan uppreglera matrismetalloproteinaser (MMP), vilket resulterar i nedbrytning av omgivande ECM och ökad invasivitet21,22,23. Genom att visualisera och kvantifiera den kumulativa, nedströmseffekten av denna differentiella reglering ger DSP en omfattande, holistisk analys.
En viktig determinant för gliomens maligna potential är deras förmåga att interagera med och manipulera värdens immunförsvar. I likhet med andra solida tumörer använder gliom en mängd olika mekanismer för att undvika värdimmunövervakning och störa aktiveringen av proteiner som är kritiska för att montera ett immunsvar. De senaste framstegen inom immunonkologi har fokuserat på att identifiera immunogena proteiner som uttrycks eller utnyttjas av tumörer. I spetsen för denna utveckling är användningen av T-celler för att detektera immunologiskt aktiva tumörantigener mot vilka onkolytiska virus kan riktas 24,25, och utvecklingen av kontrollpunktshämmare mot T-cellhämmande proteiner (t.ex. PD1 / PDL1 och CTLA4) för att förstärka värdimmunitet mot tumörer 26,27 . Andra stromapopulationer som har en framträdande roll i gliommikromiljön inkluderar makrofager, mikrovaskulära endotelceller, immunceller och en nyligen identifierad subpopulation som kallas "gliomassocierade stromaceller" (GASC)28. Interaktionerna mellan dessa celler och kemokiner, cytokiner och komponenter i ECM har viktiga konsekvenser för tumörproliferation, invasion och svar på behandling och fungerar därmed som viktiga mål för regional kvantifiering och jämförelse genom tekniker som DSP.
DSP-protokollet är användarvänligt och möjliggör flera lager av anpassning. Eftersom mycket av kvantifieringsprocessen är automatiserad är de viktigaste användarberoende stegen inriktade på att uppnå högsta möjliga känslighet och specificitet för måldetektering. Viktiga steg i protokollet inkluderar således bestämning av en fläck för initial fluorescerande visualisering av provet, avgränsning av ROI och val av antikroppspanelerna.
Vid utformning av ett färgningsprotokoll är det viktigt att först identifiera ett mål som sannolikt kommer att visa kvantifierbara skillnader mellan olika regioner i provet, vilket motsvarar en kritisk egenskap eller beteende hos ursprungsvävnaden. Därefter måste en agent som effektivt binder målet väljas. Till exempel, om man hoppas kunna visualisera regioner av hyperplasi eller nukleär atypi, kan H&E eller en kärnfläck väljas; Alternativt, om man syftar till att visualisera förändringar i uttrycket av en gen som är känd för att vara associerad med maligna eller premalignanta vävnader, kan en fluoroforkonjugerad antikropp väljas. Tumörcellerna själva kan märkas specifikt i fallet med IDH1-R132H mutanta tumörer. Det nuvarande protokollet kan modifieras genom tillsats av fluorescerande märkt IDH1-R132H som en morfologisk markör (protokollsteg 3.2). Upp till fyra fläckar per prov får användas. När visualisering av den färgade vävnaden har inträffat utses ROI. Valet av avkastning på investeringen bör återspegla var betydande skillnader i proteinmåluttryck förväntas uppstå. Viktiga överväganden när du väljer ROI inkluderar storlek (10-600 μm diameter), form (cirkel, rektangel eller användarritad) och segmentering (ytterligare avgränsning av underregioner inom en enda ROI, vilket ger ytterligare ett potentiellt analyslager). Dessa variabler bör optimeras för att mest effektivt fånga rumslig variation i måluttryck som förväntas baserat på den valda antikroppspanelen.
Valet av antikroppspanel är av avgörande betydelse, eftersom differentiellt antikroppsuttryck i slutändan fungerar som studiens slutpunkt. När du utför detta steg är det viktigt att överväga vilka markörer som kan uppvisa uttryck som korrelerar antingen positivt eller negativt med steg längs spektrumet av tumörutveckling, från godartad, till preinvasiv, till invasiv eller malign. Det är också viktigt att noggrant överväga egenskaper hos både ursprungsvävnaden och tumörtypen, eftersom båda dessa egenskaper kan påverka uttrycket av vissa markörer.
Eftersom mycket av processen är automatiserad beror eventuella brister i proceduren i allmänhet på maskinvaru- eller programvarufel, vilket ger begränsad felsökningskapacitet för användare. Problem som kan uppstå inkluderar avbrott i det inbyggda kvalitetskontrollmåttet (QC) (utformat för att flagga och potentiellt utelämna data som tyder på lågt signal-brusförhållande, lågt antal och otillräcklig måldetektering), avvikande programuppdateringar och procedurproblem (t.ex. för tidig avslutning av olika steg). För dessa problem rekommenderas att användaren kontaktar tillverkaren för fjärrsupport. Alternativt, om användaren stöter på inneboende dataproblem (t.ex. lågt antal kärnor totalt sett, låg variation i uttryck mellan ROI), kan de överväga att upprepa tidigare steg i proceduren (t.ex. ompoolning av data från den ursprungliga TMA, omdefiniering av ROI). Det är också viktigt att överväga variationer i vävnadstäthet som en potentiell sammanslutning av antigenproduktion och därmed antikroppsuttryck; Därför bör vävnader med liknande densiteter sträva efter att väljas ut för analys.
Kontrollåtgärder är inbyggda i protokollet. Programmet ger både en intern positiv och negativ kontroll som tar hänsyn till variationer i hybridisering av PC-oligos till de fluorescerande streckkoderna. Hushållningsproteiner erbjuder en annan positiv kontroll som dessutom kan fungera som en normaliseringsfaktor på grundval av cellularitet.
Förmågan att definiera ROI inom vilka kvantifiering sker är grunden för DSP: s rumsliga profileringsförmåga. Denna anpassningsbara avgränsning av ROI markerar ett kritiskt och distinkt steg i protokollet. Alternativet att skapa en ROI så liten som en enda cell möjliggör regional precision i protein- eller nukleinsyrakvantifiering, och möjligheten att definiera flera ROI och kvantifiera deras innehåll tillsammans genom multiplexanalys ger en metod med hög genomströmning.
När ROI väljs för att representera patologiskt distinkta regioner inom ett gliomprov (t.ex. nekrotisk, perivaskulär) kan proteomisk profilering och regional jämförelse avslöja mekanismer för tumörutbredning och progression. Till exempel har IHC använts för att regionalt kvantifiera hypoxiinducerbar faktor (HIF-1α) uttryck i glioblastomprover och har avslöjat högre uttryck nära nekrotiska områden jämfört med perivaskulära zoner29. Detta överensstämmer med flera studier som indikerar en roll för hypoxi i tumorigenesen av gliom.
Regional variation har också studerats i stor utsträckning bland immuncellkomponenter i tumörmikromiljön. Makrofager/mikroglia utgör den dominerande immuncellpopulationen i gliom och har studerats omfattande på regional basis. Subpopulationer av tumörassocierade makrofager (TAM) har visat sig spela olika roller i tumörprogression beroende på deras placering i tumören och mikromiljön. De inom tumörinvasiv kant bryta ner källarmembranet, främja spridning; de i hypoxiska områden utövar en angiogen effekt, vilket underlättar tillväxten; de i närheten av tumörvaskulatur utsöndrar EGF och associerade faktorer för att rikta stromala tumörceller mot blodkärl, vilket driver metastaser30. Dessa kritiska, rumsligt beroende egenskaper visar värdet av regionala proteomiska data i cancerbiologi och representerar en viktig ytterligare tillämpning av DSP på karakteriseringen av immuncellpopulationer inom en tumör och dess mikromiljö.
Tekniken har några begränsningar, inklusive kostnad och det relativt lilla antalet mål som finns tillgängliga i kärnantikroppspanelerna. Dessutom, även om subcellulär upplösning inte är möjlig med DSP, kommer det att vara möjligt med kommande ny teknik31. Trots dessa begränsningar är DSP en kraftfull teknik för vissa typer av riktade, tidigare obesvarbara frågor inom gliomcellbiologi. Denna innovativa teknik utgör en exceptionell möjlighet att avslöja nya biologiska perspektiv genom exakt bedömning av olika proteinmål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att avslöja.
Acknowledgments
Författarna erkänner stödet från Laboratoriet för klinisk genomik och avancerad teknik vid institutionen för patologi och laboratoriemedicin vid Dartmouth Hitchcock Health System. Författarna erkänner också patologins delade resurs vid Dartmouth Cancer Center med NCI Cancer Center Support Grant 5P30 CA023108-37.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BOND Research Detection System | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | DS9455 | Open detection system containing open containers in a reagent tray |
| BOND Wash | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | AR950 | 10X concentrated buffer solution for washing fixed tissue |
| Buffer W | NanoString, Seattle, WA | contact company | Blocking reagent |
| Cy3 conjugation kit | Abcam, Cambridge, UK | AB188287 | Cy3 fluorescent antibody conjugation kit |
| GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) | NanoString, Seattle, WA | contact company | System for imaging and characterizing protein and RNA targets |
| GeoMx DSP Instrument BufferKit | NanoString, Seattle, WA | 100471 | Buffer kit for GeoMX DSP (including buffers for sample processing and preparation) |
| GeoMx Hyb Code Pack_Protein | NanoString, Seattle, WA | 121300401 | Controls for running GeoMX DSP experiemtns |
| GeoMx Immune Cell Panel (Imm Cell Pro_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300101 | Protein module with targets for human immune cells and immuno-oncologic targets |
| GeoMx Pan-Tumor Panel (Pan-Tumor_Hs) | NanoString, Seattle, WA | 121300105 | Protein module with targets for multiple human tumor types and for markers of epithelial-mesenchymal transition |
| GeoMx Protein Slide Prep FFPE | NanoString, Seattle, WA | 121300308 | Sample preparation reagents for GeoMX DSP protein analysis |
| LEICA Bond RX | Leica Biosystems, Wetzlar, Germany | contact company | Fully automated IHC stainer |
| Master Kit--12 reactions | NanoString, Seattle, WA | 100052 | Materials and reagents for use with the nCounter Analysis system |
| nCounter Analysis System | NanoString, Seattle, WA | contact company | Automated system for multiplex target expression quantification (to be used with GeoMx DSP) |
| TMA Master II | 3DHistech Ltd., Budapest, Hungary | To create the tissue microarray block |
References
- Pedersen, P. H., et al. Migratory patterns of lac-z transfected human glioma cells in the rat brain. International Journal of Cancer. 62 (6), 767-771 (1995).
- Wang, J., et al. Invasion of white matter tracts by glioma stem cells is regulated by a NOTCH1-SOX2 positive-feedback loop. Nature Neuroscience. 22 (1), 91-105 (2019).
- Iwadate, Y.
- Tao, C., et al. Genomics and prognosis analysis of epithelial-mesenchymal transition in glioma. Frontiers in Oncology. 10, 183 (2020).
- Cuddapah, V. A., Robel, S., Watkins, S., Sontheimer, H. A neurocentric perspective on glioma invasion. Nature Reviews Neuroscience. 15 (7), 455-465 (2014).
- Barthel, L., et al. Glioma: molecular signature and crossroads with tumor microenvironment. Cancer and Metastasis Reviews. 1 (1), 53-75 (2021).
- Ziegler, D. S., Kung, A. L., Kieran, M. W.
- Berghoff, A. S., et al. Programmed death ligand 1 expression and tumor-infiltrating lymphocytes in glioblastoma. Neuro-Oncology. 17 (8), 1064-1075 (2015).
- Merritt, C. R., et al. Multiplex digital spatial profiling of proteins and RNA in fixed tissue. Nature Biotechnology. 38 (5), 586-599 (2020).
- Van, T. M., Blank, C. U. A user's perspective on GeoMxTM digital spatial profiling. Immuno-Oncology Technology. 1, 11-18 (2019).
- Garcia-Pardo, M., Calles, A. ROS-1 NSCLC therapy resistance mechanism. Precision Cancer Medicine. , Online (2021).
- Ye, L., et al. Digital spatial profiling of individual glomeruli from patients with anti-neutrophil cytoplasmic autoantibody-associated glomerulonephritis. Frontiers in Immunology. 13, 831253 (2022).
- Bergholtz, H., et al. Best practices for spatial profiling for breast cancer research with the GeoMx digital spatial profiler. Cancers. 13 (17), 4456 (2021).
- Brady, L., et al. Inter- and intra-tumor heterogeneity of metastatic prostate cancer determined by digital spatial gene expression profiling. Nature Communications. 12 (1), 1426 (2021).
- Kulasinghe, A., et al. Highly multiplexed digital spatial profiling of the tumor microenvironment of head and neck squamous cell carcinoma patients. Frontiers in Oncology. 10, 607349 (2021).
- Wang, D. Y. -T., et al. Case study: Digital spatial profiling of metastatic clear cell carcinoma reveals intra-tumor heterogeneity in epithelial-mesenchymal gradient. bioRxiv. , (2021).
- GeoMx DSP. Automated slide preparation user manual. GeoMx DSP. , nanoString Technologies. Seattle, Washington. (2022).
- Allam, M., Cai, S., Coskun, A. F. Multiplex bioimaging of single-cell spatial profiles for precision cancer diagnostics and therapeutics. NPJ Precision Oncology. 4, 11 (2020).
- Wolchok, J. D., et al. Overall survival with combined nivolumab and ipilimumab in advanced melanoma. New England Journal of Medicine. 377 (14), 1345-1356 (2017).
- Blank, C. U., et al. Neoadjuvant versus adjuvant ipilimumab plus nivolumab in macroscopic stage III melanoma. Nature Medicine. 24 (11), 1655-1661 (2018).
- Matthews, R. T., et al. Brain-enriched hyaluronan binding (BEHAB)/brevican cleavage in a glioma cell line is mediated by a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs (ADAMTS) family member. Journal of Biological Chemistry. 275 (30), 22695-22703 (2000).
- Paganetti, P. A., Caroni, P., Schwab, M. E. Glioblastoma infiltration into central nervous system tissue in vitro: involvement of a metalloprotease. Journal of Cell Biology. 107, 2281-2291 (1988).
- Beliën, A. T., Paganetti, P. A., Schwab, M. E. Membrane-type 1 matrix metalloprotease (MT1-MMP) enables invasive migration of glioma cells in central nervous system white matter. Journal of Cell Biology. 144 (2), 373-384 (1999).
- Coulie, P. G., Vanden Eynde, B. J., vander Bruggen, P., Boon, T. Tumour antigens recognized by T lymphocytes: At the core of cancer immunotherapy. Nature Reviews Cancer. 14 (2), 135-146 (2014).
- Finn, O. J. Vaccines for cancer prevention: a practical and feasible approach to the cancer epidemic. Cancer Immunology Research. 2 (8), 708-713 (2014).
- Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
- Chen, L., Han, X. Anti-PD-1/PD-L1 therapy of human cancer: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 125 (9), 3384-3391 (2015).
- Cai, X., et al. Glioma-Associated stromal cells stimulate glioma malignancy by regulating the tumor immune microenvironment. Frontiers in Oncology. 11, 672928 (2021).
- Ishii,, et al. Histological characterization of the tumorigenic "peri-necrotic niche" harboring quiescent stem-like tumor cells in glioblastoma. PLoS One. 11 (1), 0147366 (2016).
- Lewis, C. E., Pollard, J. W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Research. 66 (2), 605-612 (2006).
- NanoString. CosMx Spatial Molecular Imager: True Single-Cell In Situ Solution. NanoString. , (2022).
