Biology

使用光学镊子和散焦显微镜定量分析红细胞的粘弹性

Published: March 25, 2022 doi: 10.3791/63626

Lucas Barreto*^1,2, Fran Gomez*^1,2, Pedro S. Lourenço^1,2, Douglas G. Freitas^1,2, Juliana Soares^1,3, Clemilson Berto-Junior^4,5, Ubirajara Agero⁶, Nathan B. Viana^1,2, Bruno Pontes^1,2,3,7

¹Centro Nacional de Biologia Estrutural e Bioimagem - CENABIO, Universidade Federal do Rio de Janeiro, ²Instituto de Física, Programa de Pós-graduação Multidisciplinar em Física Aplicada, Universidade Federal do Rio de Janeiro, ³Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas Biofísica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, ⁴Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro - Campus Macaé, ⁵Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Endocrinologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, ⁶Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Física, Universidade Federal de Minas Gerais, ⁷Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro

* These authors contributed equally

Summary

本文描述了一种基于光学镊子和散焦显微镜的集成协议，以测量细胞的流变特性。该方案在研究不同生理病理条件下红细胞的粘弹性特性方面具有广泛的适用性。

Abstract

红细胞的粘弹性性已经通过一系列技术进行了研究。但是，报告的实验数据各不相同。这不仅归因于细胞的正常变异性，还归因于细胞反应方法和模型的差异。在这里，采用使用光学镊子和散焦显微镜的集成协议来获得频率范围为1 Hz至35 Hz的红细胞流变特征。虽然光学镊子用于测量红细胞复合弹性常数，但散焦显微镜能够获得细胞高度分布、体积及其形状因子的参数，该参数允许将复杂的弹性常数转换为复杂的剪切模量。此外，应用软玻璃流变学模型，可以获得两种模量的缩放指数。开发的方法允许探索红细胞的机械行为，表征其粘弹性参数，在明确定义的实验条件下获得，用于几种生理和病理条件。

Introduction

成熟的红细胞（RBC），也称为红细胞，在通过人体最窄的毛细血管时能够延长其大小的两倍以上¹。这种能力归因于它们在承受外部载荷时独特的变形能力。

近年来，不同的研究在红细胞表面表征了这一特征²^，³。描述材料在外部载荷下的弹性和粘性响应的物理领域称为流变学。通常，当施加外力时，产生的变形取决于材料的性质，可分为存储能量的弹性变形或耗^散能量的粘性变形4。所有细胞，包括红细胞，都表现出粘弹性行为;换句话说，能量既被储存又被耗散。因此，电池的粘弹性响应可以通过其复剪切模量 G*（ω） = G'（ω） + iG“（ω）来表征，其中 G' （ω）是与其弹性行为相关的存储模量，G”（ω）是与其粘度相关的损耗模量⁴.此外，现象学模型已被用于描述细胞响应，其中最常用的一种称为软玻璃流变模型⁵，其特征在于复剪切模量随负载频率的幂律依赖性。

基于单细胞的方法已被采用来表征红细胞的粘弹性，通过施加力和测量位移作为^{施加载荷的}函数2^，³。然而，对于复杂的剪切模量，在文献中找不到的结果很少。使用动态光散射，报告的RBC存储和损耗模量值在0.01-1 Pa之间变化，频率范围为1-100 Hz⁶。通过使用光学磁扭曲细胞术，获得了明显的复合弹性模量⁷，并且为了比较目的，声称乘法因子可能澄清差异。

最近^{，建立了一种}基于光学镊子（OT）和散焦显微镜（DM）的新方法，作为定量绘制人红细胞在时间依赖性负荷下的剪切模量的存储和损失的集成工具8^，⁹。此外，使用软玻璃流变模型来拟合结果并获得表征红细胞⁸^，⁹的幂律系数。

总体而言，开发的方法⁸^，⁹（其协议将在下面详细描述）通过使用形状因子F _f的测量值来阐明以前的差异，该测量值将力和变形与RBC表面的应力和应变相关联，并且可以用作一种新的诊断方法，能够定量确定从具有不同血液的个体获得的红细胞的粘弹性参数和软玻璃状特征病症。使用下面描述的方案进行这种表征，可能会为从机械生物学角度理解红细胞的行为开辟新的可能性。

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Protocol

人类血液样本由成年男性和女性志愿者根据里约热内卢联邦大学研究伦理委员会批准的协议（协议2.889.952）提供，并在巴西平台注册，CAAE编号为88140418.5.0000.5699。向所有志愿者发出书面同意书，并从所有志愿者那里收集了同意书。患有任何血红蛋白病和/或服用受控药物的人被排除在外。整个过程遵循研究所伦理委员会批准的指导方针。

1. 样品架的制备

为每个样品架获取两个盖玻片（24 mm x 60 mm和24 mm x 32 mm;厚度= 0.13-0.17 mm）和一个橡胶圈（直径= 10 mm;厚度= 2 mm）。
将硅脂倒在橡胶圈表面上，以覆盖整个周边的方式。
将橡胶圈放在盖玻片上，润滑脂面朝向盖玻片。等待5分钟以正确附着，然后样品架准备接受细胞培养物。
注意：此外，也可以使用商业或自制玻璃底餐具，如前所述¹⁰.

2. 细胞培养

注意：以下步骤描述了如何从人体血液中获取健康的红细胞。重要的是，在每次实验之前新鲜制备样品。

在含有 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na 2 HPO 4、1.8 mM KH₂PO₄、10 mM 葡萄糖的 250 μL 1x 磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液中稀释 20 μL 血液，并补充有 1 mg/mL 牛血清白蛋白（BSA）。
在室温下以200× g 离心2分钟后，使用移液管吸出上清液并将细胞沉淀重悬于1mL的1x PBS / BSA溶液中。在缓冲液中洗涤细胞2次。
使用血细胞仪计算细胞密度，并在步骤1中制备的样品架中接种50，000至100，000个细胞。等待10-15分钟，非特异性细胞附着在盖玻片上;等待时间不会影响细胞。
向样品中加入 0.2 μL 10% v/v 聚苯乙烯球溶液（半径 = 1.52 ± 0.02 μm），用于进一步的 OT 实验。通过在显微镜下观察样品来确认正确混合。
细胞接种后，只需将第二个盖玻片放在橡胶圈上方（无需添加润滑脂进行附着），关闭设置，然后完成样品制备。样品已准备好进行显微镜分析和操作。

3. 光学镊子显微镜设置

注意：OT是使用高度聚焦的激光束来捕获微观物体并测量皮克顿范围内的力和纳米尺度的位移的工具。使用的OT激光器（1064nm波长）必须正确对准，如前所述¹⁰。

简而言之，使用至少两个相距几厘米（至少10-20厘米）的镜子，将线偏振激光束引向倒置显微镜的后门。精确对准激光束以直线进入显微镜（图1）。
然后，使用安装在显微镜中的二向色镜反射激光束，使其平行于物镜的轴线并进入其后门中心附近的透镜。这将聚焦激光以创建光学陷阱（图1）。
接下来，要使用 OT 测量力，请校准系统以获得疏水阀刚度（κ_OT）。有关OT校准程序的更详细说明，请参阅¹⁰ 。一旦找到 κ_OT，OT系统就可以进行流变实验了。

4. DM设置

注意：DM是一种基于明场的光学显微镜技术，如果显微镜略微散焦，则透明物体可见¹¹^，¹²。这种技术已被应用于获得红细胞^形状13。用于OT系统的相同显微镜可用于DM，通过3D重建获得高度轮廓。

通过执行科勒照明¹⁴ 来调整显微镜照明系统，为了获得更好的分辨率，完全打开聚光镜-光阑进行实验。
使用压电定位系统在所有坐标上以纳米精度替换样品。在所有轴上执行压电系统的自动校准。完成所有程序后，显微镜系统即可进行DM实验。

5. 基于OT的流变实验与分析

注意：流变学实验包括观察细胞对不同频率的小振荡的反应。

实验
1. 使用 OT 系统，用 OT 激光捕获球体，然后将球体压在靠近顶面和靠近细胞边缘的细胞表面上，将其连接到红细胞上。使用显微镜进行此步骤。然后，捕获另一个球体并重复相同的连接过程，但现在将其连接到靠近细胞的盖玻片上。附着在盖玻片上的球体是参考珠（图2），这是跟踪压电陶瓷位移并与RBC球进行比较所必需的。
2. 在开始测量之前，请确保所选细胞与盖玻片很好地连接，并且红细胞和参比球体分别粘附在红细胞表面和盖玻片上。目视识别非粘附细胞，因为它们会随着时间的推移而移动，尽管粘附率很高（约80%-90%）。
3. 将振幅ξ 0 = 0.500 ± 0.001 μm 和 1 Hz、7 Hz、14 Hz、21 Hz、28 Hz 和 35 Hz 变化频率的正弦函数添加到压电载物台软件中，角频率 ω 分别为 6.3 rad/s、169 rad/s、88 rad/s、132 rad/s、176 rad/s 和 220 rad/s，使用压电软件，如前所述⁸^，⁹。
4. 使用压电载物台，按下开始按钮以允许压电位移并将RBC球保持在陷阱中，使用先前设置的正弦函数将样品提交到运动周期中。使用能够以790帧/秒或更高的速度生成图像的相机来记录样品移动。实验示意图如图 2所示。
5. 当样品呈正弦运动时，激活OT以捕获附着在RBC表面的球体。无论选择何种温度进行实验，室温，37°C或其他温度，都要仔细监测温度以避免测量过程中的变化。用于产生OT的红外（1064 nm）激光几乎不会对细胞造成损坏或加热。
分析
1. 使用 ImageJ 分析在正弦运动期间获得的图像，以找到每个球体随时间推移的质心位置。
  注意：这些数据允许生成能够显示两个球体之间的相位和幅度差异的图。这些信息对于获得红细胞的粘弹性响应至关重要。
2. 要获取每个球体的质心，请打开 ImageJ 软件。导入在正弦运动期间获得的整个影片。
3. 在 “图像 ”选项卡中，单击“ 调整”，然后选择“ 阈值”。阈值窗口将打开。选择 B&W。这将使背景变为白色，将球体变为黑色。
4. 使用直方图下方的两个滚动条调整阈值，以便两个球体都以最大像素量显示。
5. 通过单击“ 文件>矩形”选择参考球体。绘制一个矩形以选择球体。在一个图像中选择参考球体后，请确保矩形在影片的所有其他图像中也正确选择了相同的球体。
6. 然后，在“ 分析 ”选项卡中，单击“ 设置测量 值”并选择 “质心 ”选项。
7. 再次单击“分析”选项卡，然后选择“分析粒子”。将打开一个新窗口。定义尺寸和圆度（取决于球体半径）。选中以下框显示结果和清除结果。最后，单击“确定”以处理所有图像。
8. 将出现一个新窗口，其中包含一个以 xy 坐标表示质量中心的表。将这些坐标值另存为.txt文件。对附着在 RBC 曲面上的另一个球体重复此过程。
9. 要获得两个球体的振幅和相位差异，请打开分析软件。导入之前获取的.txt文件。
10. 创建一个包含三列的新表。在第一列（c0）中，添加帧数，在第二列（c1）中，添加参考球体的 x 坐标，在第三列（c2）中，添加附加到 RBC 曲面的球体的 x 坐标。
  注意：在本例中，由于正弦运动仅在 x 轴上执行，因此只需对两个球体使用 x 坐标。
11. 接下来，将帧与时间相关联。单击 窗口>公式条目。将打开一个名为公式输入的新窗口。在此窗口中，可以设置八个不同的方程，每个方程都在一个特定的键中（从 F1 到 F8）。
12. 选择 F1，键入以下公式：
  c 3 = c0 / （相机帧率）
  单击运行。这将在表中为某个时间创建一个新列（第 4 列）。
13. 将每帧的 x 坐标值减去其各自的平均值。为此，请在公式条目上指定任意两个键，并为每个键键入以下公式：
  c 4 = （c 1 - 平均值（c 1））和 c 5 = （c 2 - 平均值（c2））
  单击 “运行 ”按钮。结果将分别出现在第 5 列和第 6 列中，用于参考和 RBC 球体。
14. 将质心值从像素转换为千分尺。为此，请在公式条目上使用另一个键并键入以下公式：
  c 4 = c 4 / 转换数
  对第 5 列重复相同的过程。
  注意：使用千分尺/尺子获取转换，并使用与测量相同的显微镜设置（包括相同的物镜）获得其图像。此过程可以在显微镜校准期间执行。从而获得像素/微米关系。
15. 生成一个图，其中两个球体的质心在 y 轴上，时间在 x 轴上。为此，请单击图 库>线性和散点。将打开一个新窗口。选择 x 轴的时间列，然后在 y 轴中选择参考球体和 RBC 球体的质心列（以微米为单位）。
16. 在图中，仅选择与第一个角频率（6.3 rad/s）相关的数据。使用 图 3 中指示的工具。
17. 定义用于调整参考球体数据曲线的方程。为此，请单击“ 曲线拟合”>“常规”和“Fit1”，选择与参考球体位置相关的数据框，然后单击“ 定义”。将打开一个新窗口来定义方程。参考球体的位置 ξ（t）描述如下：
  ξ（t） = ξ₀cos（ωt）
  其中 ξ 是样品的正弦运动，ω 是角频率， t 是以 s 为单位的时间。将此方程转换为分析软件，它将如下所示：
  ，其中 m1 为 ξ，m2 为 f，m0 是时间 t，m3 是 t = 0 时余弦函数的相位。
18. 估计图中 m1、m2 和 m3 的值。定义公式后，单击“ 确定”。数据将根据方程拟合，曲线和一个小方块将出现在图表中，其值为 m1、m2 和 m3。
19. 定义调整 RBC 球体数据曲线的公式。为此，请单击“ 曲线拟合”>“常规”并 定义将调整数据曲线的方程。RBC 球体的位置 ρ（t）由下式给出：
  
  其中ξ'是异相幅度，φ是异相角。将此公式转接到分析软件，它将如下所示：
  ，其中 m1、m2 和 m3 是在参考球体的曲线拟合中获得的值。M4 是 ξ'，M5 是φ。
20. 从图中估计 m4 和 m5 的值。定义公式后，单击“ 确定”。数据将根据方程拟合，图形中将出现一条曲线和一个小方块，其值为 m4 和 m5。
21. 接下来，创建一个新表，将从曲线拟合获得的数据添加到各自的列中。为以下参数定义五个不同的列：角频率、振幅（参考球体）、初始时间、振幅（RBC 球体）和异相角。对所有其他频率执行相同的过程。
22. 使用以下公式求存储（K'）和损耗常数（K“）：
  
  其中 κ OT 是 _OT弹性常数，β是斯托克斯阻力系数。将方程转置到分析软件，它将如下所示：
  和
  
  ，其中 β 和 κ_OT需要替换为系统中的值。
23. 在图形上绘制结果，使用 k 的 x 轴和 K' 的 y 轴（图 4）。

6. DM实验和分析，以获得整体电池外形尺寸

视频采集
1. 使用软件沿xy方向移动压电平台，以搜索附着在盖玻片上的隔离电池。捕获已知直径的聚苯乙烯球并将其附着到RBC表面。使用压电平台，稍微移动被捕获的磁珠，也附着在红细胞表面上，以使细胞变形，然后将磁珠附着在盖玻片上。
  注意：也可以使用OT测量中的同一单元格。
2. 更改 z 轴位置以查找聚焦图像，其中焦点平面位于所选单元格的中间。此图像呈现的对比度较小，单元格中心的灰度级别等于单元格外部的灰度级别（背景）。
3. 当位置固定时，使用相机软件以 25 fps 的帧速率以 8 位和 256 像素 x 256 像素创建包含约 5，000 张图像的整个单元的电影。然后，将z轴位置向下或向上移动2μm以获得所选细胞的散焦图像。重复这些参数以针对这种情况创建影片。
4. 最后，在不更改z轴位置的情况下，搜索没有单元格的区域以重复相同的过程并创建图像背景的电影。
对比图像采集
1. 将三部电影中的每部转换为三张平均图像。使用 ImageJ，选择其中一个影片，单击“ 图像>堆栈”> Z 投影 ，然后选择“ 平均强度 ”选项。对其它影片重复此过程以获取其各自的图像。
2. 将所有获得的图像从 8 位更改为浮点 32 位。使用 ImageJ，单击 图像>键入 > 32 位。然后，单击 分析>设置测量 值并选择 平均灰度值 选项。最后，再次单击 “分析>度量”。
3. 接下来，点击 处理>图像计算器 并将聚焦图像除以背景图像。对于此结果，乘以聚焦图像的灰度的平均值。通过单击“ 数学>>乘法”来获取平均值。
4. 要获得平均值，请选择聚焦图像，然后单击 “分析>测量”。对于代表性图像，灰度的平均值为 69，199。对散焦图像重复上述步骤。在本例中，灰度的平均值为 69，231。图5 显示了手术前后的聚焦和散焦图像。
5. 在操作过程中，图像可能会失去视觉对比度。为了更好地可视化图像，请单击图像>调整 >亮度/对比度 并选择自动选项。
6. 接下来，要查找图像对比度，请使用以下关系：
  ，其中N _Img 是细胞的灰度级别，N₀是细胞外的灰度级别，并且是对应于取决于相机的零光强度灰度的常量参数。
7. 要找到值 B，请使用功率计测量光强度。对于光强度的每个值，必须录制一个视频;因此，不同的强度值可能与不同的灰度水平有关。最后，获得线性拟合并将B与零光强度¹⁵相关联。
8. 找到 N₀ 的值，单击多边 形选择 图标并绘制一个多边形，如图 6 所示。然后，单击分析选项卡并选择测量以查找所选区域的平均灰度。每个图像由一组像素组成，每个像素具有一定的灰度级别。由于构成图像的所有像素而产生的所有灰度级别的集合对应于 N_Img。
9. 使用对比方程确定 N _Img - N_o，并通过选择“数学>减法”>执行此值。将结果除以 N₀ - B。最后，找到聚焦（C 0）和散焦图像（C1）的对比度。
获取高度剖面图
1. 为了获得高度剖面，使用已经描述的方法¹³。简而言之，使用哈特利变换（FHT）获得红细胞厚度。在 ImageJ 中，单击“ 处理 FFT”>“FFT 选项”>然后选择“FHT”。
2. 使用 过程>数学 减去 ImageJ 中的图像 C0 和 C1 > 减去以获得以下过程的图像，C= C0 - C1。
3. 对于图像 C，单击“ 处理 FFT”>>“FFT 选项”，然后选择“ FHT ”以执行图像的 Hartley 变换。然后，使用定制的插件除以空间频率^{q 2} 除以 DivideQ2。点击 插件>划分Q2。
  注意：必须将文件 DivideQ2.class 复制到安装 ImageJ 的插件目录中。该插件作为.class文件（补充文件 1）提供，以包含在 ImageJ 的插件文件夹中。
4. 然后，使用 处理>FFT>FFT执行逆变换FHT，以获得灰度与单元格高度成比例的图像。
5. 最后，单击“ 数学过程”> “乘法”>使用以下常量将生成的图像相乘：
  
  这是根据图像、样品和实验装置的特征定义的¹³.这里，n = 1.51是油折射率，p = 0.0721μm是图像的微米和像素之间的关系，Δ n = 0.058是RBC和水介质折射率之间的差异，聚焦和散焦图像之间的距离（Z f1 - Z _f2）=2μm，以及图像的大小， N 2 = 256 像素²。
6. 使用生成的图像获得高度剖面图（图7）。生成的图像在 ImageJ 中用于观察不同的高度轮廓。这取决于黄色垂直线在单元格中的放置位置，例如，在 图 7 中，获得了受垂直线限制的高度轮廓，通过按 Ctrl + K 观察这一点。
外形尺寸
1. 找到包含 RBC 高度剖面的图像后，使用 2 μm 散焦对比度在 ImageJ 中创建一组两个图像。单击“ 图像>堆栈”，然后选择“ 要堆叠的图像”选项。要查找外形规格，请使用 ImageJ 自定义宏来分析堆栈。ImageJ 自定义宏可作为 补充文件 2 下载。
  注意：程序使用散焦图像来确定单元格边缘。然后，它使用包含高度剖面图的图像确定每个水平位置的周长。除了边之外，它还确定周长以及周长的反转。反周长值的总和乘以像素厚度，对应于外形规格的反比。
2. 在程序中插入像素/微米关系。从显微镜物镜校准实验中获得该值。在使用的示例中，该值为 13.87 像素/μm。
3. 选择水平起始位置以将黄线放在堆栈的第一个图像中。在单元格开始之前开始线条，并将其绘制到单元格的垂直边界之外。在示例中，黄线的长度为 153 像素，初始位置介于 i = 70、y1 = 80 和 i = 70 以及 y2 = 195 之间。然后，水平移动黄线，直到最终位置为 f = 245、y1 = 80 和 f = 245，y2 = 195。
4. 最后，要查找单元格边缘、周长和周长的反转，请选择“宏”选项卡，然后单击“运行宏”。宏将提供一个表，其中包含边缘位置、周长和周长的反转，以及所分析单元格的图像。检查此图像的边缘是否与图 7 的边缘相似，否则，请重复该过程。
5. 使用周长倒数的总和来查找外形规格⁸。

7. 软玻璃流变模型及实验分析

在表格中组织实验数据
1. 通过单击 “文件 ”选项卡在分析软件中创建新表。为以下参数确定 10 个不同的列（从 c0 到 c9）：使用的角频率（rad/s）：c0;为每个角频率获得的 K' （pN/μm）值：c1; 错误K'： c2; K“ （pN/μm）值为每个角频率获得：c3; 错误“：c4;每个角频率获得 的G'（Pa）值：c5; 错误'： c6;为每个角频率获得 的G“ （Pa）值：c7; ErrG“：c8 和 F_f 及其各自的误差：c9（图 8）。使用以下公式填充以下列：
  c5 = （3 x c1） / （8 x 1.28 x 0.087）
  c6 = （3 / （8 x 0.087 x 1.28）） x sqrt （c2^2 + （c1 x 0.01 / 1.28）^2 + （c1 x 0.008 / 0.087） ^ 2）
  c7 = （3 x c3） / （8 x 1.28 x 0.087）
  C8 = （3 / （8 x 0.087 x C4）） x sqrt （C4^2 + （C3 x 0.01 / 1.28）^2 + （C3 x 0.008 / 0.087）^2）
绘制曲线 G' （ω）与 G“ （ω）
1. 要在分析软件中生成曲线 G' （ω）与 G“ （ω），请使用上表中的数据。单击图库>线性，然后选择散点图格式。
2. 将打开一个新窗口。选择 G “ 列作为 x 轴，选择 G' 列作为 y 轴。最后，点击绘图按钮获取图形。
3. 要在绘图中添加误差线，请单击“绘图”窗口，然后单击“绘图>误差线”。将打开一个新窗口。首先，标记 Y 错误选项。将打开另一个名为“错误栏设置”的窗口。
4. 单击“ 值的百分比”，选择“ 数据列”，然后单击 “ErrG”列。最后，点击 OK > 绘图，将出现 y 值的误差线。对 x 轴值重复相同的过程，现在通过选择 X Err 方块 和 ErrG 的正确列。最终的图将类似于 图 9 中所示的图。
将参数拟合到软玻璃流变学模型
注意：数据分析分为两部分：1）曲线拟合G'（ω）与G“（ω）图，得到参数Γ和G_m;2）曲线拟合G'（ω）和G“（ω）作为频率ω的函数，得到幂律指数α。
1. 曲线拟合 G' （ω）与 G“ （ω）图，以获得参数 Γ 和 G_m。
  1. 单击 “曲线拟合 ”选项卡，选择 “Fit1”。将打开一个新窗口。选择 正方形 ，然后单击定义按钮。将出现一个名为“常规曲线拟合定义”的窗口。键入以下公式：
    米1 + 米0/米2
    其中 m1 = 61.576;m2 = 1，允许误差为 1 x ^10-5。这里 m0 代表 G“，m1 代表 G_m ，m2 代表 Γ。
    注意：对于 m1 和 m2，有必要在曲线拟合定义期间估计它们各自的值。上述估计基于所示的示例实验。在实验中，根据图中观察到的值估计数字。
  2. 单击两个窗口中的 OK 按钮，将出现配件，如图 10 所示 - 一条黑色曲线。检查 m1 和 m2 的正确值，这些值列在与图一起出现的曲线拟合表中。
2. 曲线拟合 G' 和 G“ 作为角频率 ω 的函数
  1. 接下来，创建另外两个图，即 G ' 作为 ω 的函数和 G' 作为 ω 的函数。如前所述，仅将误差线放在 y 轴上。
  2. 重复曲线拟合过程，但现在在“ 曲线拟合选择”中，选择 G“ 选项，然后在 ”一般拟合>曲线定义“中，编写以下公式：
    
    在这种情况下，当ω = 6.3 rad/s时，m1估计为G“（ω）= 23.683 Pa的值;m2 估计为 0.5（请记住，m2 是指数α，在 0 和 1 之间变化）。根据图 10 中 m2 的结果插入 Γ = 2.0293 的值。
  3. 标记选项重量数据。完成所有这些过程后，单击 OK，将出现类似于图 11 中的曲线拟合 - 将出现一条蓝色曲线。将显示 α、α = 0.63 ± 0.02 和 G 0、G 0 = （3.7 ± _0.3）Pa 的值。使用这些值拟合下一条曲线 G' （ω）。
  4. 单击下一条曲线，重复曲线拟合过程，但现在在 一般拟合曲线定义中，编写以下方程：
    
    在这种情况下，m3 只是确认先前获得的值的估计值α。当 ω = 6.3 rad/s 时，使用 G ₀ = 3.703 和 G' （ω） = 23.683 Pa 的值。
  5. 同样，添加 1 x ^10-5 作为允许的误差，并标记选项 重量数据。完成所有这些过程后，单击 OK，曲线拟合类似于 图 11 中的曲线拟合 - 将出现一条绿色曲线。

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Representative Results

图 1 显示了用于流变测量的 OT 系统的原理图。图2显示了两个球体的微流变学实验示意图，还显示了代表性的RBC。图3显示了两个球体振幅随时间变化的典型曲线，当正弦运动由压电级产生时。当参考球体（图3 - 红色曲线）随着载物台移动而振荡时，RBC球体（图3 - 蓝色曲线）以不同的幅度和相位振荡。通过测量这些参数，可以确定样品中不同红细胞的复弹性常数K*（ω）。图4显示了存储弹性常数K'（ω）与损失弹性常数K“（ω）函数的典型图。观察到的线性依赖性表明，红细胞表面可以被认为是一种柔软的玻璃状材料。接下来，为了获得整体单元外形尺寸F_f，需要DM程序，图5、图6和图7包括一些所需的步骤。然后，要将力和变形转换为应力和应变，必须将K*（ω）转换为G*（ω）。

复数RBC弹性常数定义为K*（ω）= K'（ω）+ iK“（ω）。此外，K*（ω）与RBC复合剪切模量G*（ω）=G'（ω）+iG“（ ω）有关。G' （ω）和 G“ （ω）分别是 RBC 剪切存储量和损耗模量。K* （ω）和 G* （ω）之间的关系由下式给出：

Equation 12

如前所述， F_f 是取决于 RBC 几何形状的形状因子，ζ是 RBC 膜厚度，先前确定为 ζ = （0.087 ± 0.009）μm⁸^，¹⁵。

此外，存储 G' （ω）和 G“ （ω）损失剪切模量分别与存储 K' （ω）和损失 K” （ω）弹性常数相关，通过方程⁸^，⁹

Equation 13 和 Equation 14

要分别求出 G' （ω）和 G“ （ω）的标准误差，Err G' 和 Err G”，请使用不确定性传播方程和 K' （ω）和 K“ （ω）的结果，根据以下等式⁸^，⁹：

Equation 15
Equation 16 .

根据软玻璃流变学理论，红细胞的行为类似于粘弹性材料，如乳液、糊状物和浆料⁸^，⁹ ，它们的储存和损耗模量遵循以下公式：
Equation 17

因此， Equation 18 其中G _m是细胞膜剪切模量，G 0是低频储能模量，Γ是比率 Equation 19 ，α是软玻璃流变模型的幂律指数，ω₀= 1 rad/s⁸^，⁹。

使用了 F_f 和 RBC 表面厚度ζ的值（估计为 87 ± 8 nm⁸，⁹^，¹⁵）。结果如图 8、图 9 和图 10 所示。同样，G'和G“之间的线性依赖关系符合RBC表面可以建模为软玻璃状材料的假设。此外，从该图的线性拟合中，可以获得G _m的值，并且通过将该值引入G的软玻璃流变曲线拟合“，确定G₀和α的值（图11 - 蓝色曲线）。此外，在使用获得的G ₀结果并将其添加到G'的软玻璃流变曲线拟合中后，在误差线内导出相同的指数值（图11 - 绿色曲线）。

图1：OT显微镜的示意图。整个系统建立在防振台上。激光使用至少两个不同的二向色镜（白色）对准，并使用另一个二向色镜（浅蓝色）指向显微镜物镜的后门。压电载物台和连接到计算机的数字科学相机也是必要的。请点击此处查看此图的大图。

图 2：微流变学实验示意图。 参考球体（深灰色）附着在盖玻片上，红细胞球体（蓝色）附着在红细胞表面（红色）并被OT捕获（激光打开时由桃子三角形指示）。 ρ 是 RBC 球体在陷阱中的平衡位置;ξ 是样品的正弦运动， x 是细胞变形。原理图是在Biorender中创建的。请点击此处查看此图的大图。

图 3：当压电级产生正弦运动时，两个球体随时间推移的振幅（μm）的图。参考球体（红色曲线）随着载物台运动而振荡，而RBC球体（蓝色曲线）以不同的振幅和相位振荡。右侧的绿色箭头表示数据选择工具，而黄色箭头表示缩放选择工具。请点击此处查看此图的大图。

图 4：RBC 微流变学结果。 将弹性常数存储为样品中不同红细胞的损失弹性常数的函数（n = 来自三个不同样品的 n = 10 个不同细胞）。数据点表示K ' （y轴）和 K“ （x轴）的平均值及其各自的误差线（平均值的标准误差），这是针对实验装置中使用的每个角频率获得的。请点击此处查看此图的大图。

图 5：应用于红细胞的 DM 。（A）散焦图像，大小 = 2 μm。（B）聚焦图像。（C）背景图像。将每个图像（A）和（B）除以背景图像（C），然后乘以每个图像的平均灰度值，可以得到图像（D）和（E）。比例尺：5 μm。请点击此处查看此图的大图。

图 6：背景灰度级别 N₀。 在ImageJ（A）中打开代表性图像后，选择一个区域（RBC单元格周围的黄色几何图形），用于获得背景灰度和结果（B）的平均值。要在 A 中执行黄色选择，请使用图像 J 的多边形选择工具（用绿色箭头表示）。请点击此处查看此图的大图。

图 7：变形红细胞的高度剖面。 沿图像的垂直黄线（右）表示的高度剖面图（左）。请点击此处查看此图的大图。

图 8：分析软件中典型结果表的代表性屏幕截图。请点击此处查看此图的大图。

图 9：RBC 粘弹性参数。 将剪切模量存储为样品中不同红细胞的损失剪切模量的函数（n = 来自三个不同样品的 n = 10 个不同细胞）。数据点表示G ' （y轴）和 G“ （x轴）的平均值，以及它们各自的误差线（平均值的标准误差），这是针对实验中使用的每个角频率获得的。请点击此处查看此图的大图。

图 10：G' （Pa）的曲线拟合与 G“ （Pa）的函数关系。 线性黑线是数据点拟合的曲线。N = 来自三个不同样品的 10 个不同细胞。误差线表示平均值的标准误差。请点击此处查看此图的大图。

图 11：根据结果调整软玻璃流变模型。复剪切模量（G*）与样品中不同红细胞的角频率 ω 的函数关系。图中的绿色圆圈表示 G' 的平均值，而蓝色圆圈表示 G“ 的平均值，并绘制了各自的误差线。连续的绿色和蓝色线条表示软玻璃流变模型的曲线拟合。参数 m1、m 2 和 m3 在图中表示。虽然 m 1 是 G₀，但 m2 和 m3 是指数，α. N = 来自三个不同样本的 10 个不同单元格。误差线表示平均值的标准误差。请点击此处查看此图的大图。

补充文件1： ImageJ插件DivideQ2.class。请点击此处下载此文件。

补充文件2： ImageJ 自定义宏以获取外形规格。请点击此处下载此文件。

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Discussion

在该协议中，提出了一种基于光学镊子和散焦显微镜的集成方法，以定量映射RBC的粘弹性。确定存储和损失剪切模量的结果，以及表征RBC软玻璃流变学的缩放指数。该协议应用于不同的实验条件，例如在生理情况⁸ 或沿着 恶性疟原虫 红细胞内循环⁹ 的每个阶段已经进行。

文献中的参考文献指出了红细胞流变学的差异，部分归因于在测量过程中未正确考虑细胞形态的变化⁶^，⁷。使用动态光散射，报告了RBC存储和损耗模量的值，范围为0.01-1 Pa，频率范围为1-100 Hz⁶。在另一项研究中，使用光学磁扭曲细胞术，确定表观复合弹性模量为⁷，但与动态光散射值不同;因此，为了比较目的，使用了乘法因子84。按照本协议中描述的程序，通过使用无创散焦显微镜¹¹，¹²^，¹³表征RBC形状^{因子来澄清}这些差异8。表征细胞表面的复剪切模量只有在几何形状为¹⁶^，¹⁷ 并且并不总是正确执行时才可以获得。

该协议中提出的集成方法允许对同一单个细胞一个接一个地执行两种方法（OT测量和DM测量）。它还允许对群体中的不同细胞进行OT测量，然后对同一细胞群中的其他细胞进行DM测量。最后一个选项可能会给两个结果带来更多的可变性，但误差可以相应地传播，这样结果会将整体RBC形态与对应于特定实验条件的给定细胞群中的整体RBC粘弹性相关联。

执行该协议的主要限制是执行方法本身的固有困难，因为它是光学镊子和散焦显微镜的集成;因此，是否有仪器来执行所描述的所有步骤可能是一个挑战。但是，如果可以使用OT设施，则最终调整该设施以进行实验更为可行。这就是当前协议的适用之处，不仅详细说明了执行测量和分析的每个步骤，而且还帮助人们识别和采用这些OT系统，而不是从头开始创建设置。

此外，红细胞附着在盖玻片上成为一个限制因素，因为它们是非贴壁细胞，并且这些步骤可能会给测量带来困难，因为一些红细胞可能会分离。因此，选择粘附良好的红细胞非常重要。在准备样品进行测量时，可以检查选择是否成功的一种方法。将OT捕获的RBC球体定位到细胞表面后，稍微移动样品以确保细胞牢固固定并且没有改变OT捕获珠的位置。如果是这样，请在样本中查找另一个单元格。还可以进行未来的改进，例如使用双光束OT同时捕获RBC并同时执行流变测量。

除此之外，提取基于单细胞的红细胞定量粘弹性信息的可能性使刚刚开始探索的各种应用成为可能⁸^，⁹。因此，所提出的方法可以扩展到在其他生理病理条件下（如缺铁性贫血和糖尿病）或遗传性血液疾病（例如镰状细胞病和地中海贫血）中红细胞机械行为的表征。这种集成工具可以为开发新的诊断方法提供基础，这些方法能够将红细胞粘弹性的变化与具有不同病理的个体血流的改变联系起来。

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Disclosures

作者对本手稿中描述的产品没有经济利益，也没有其他信息要披露。

Acknowledgments

作者要感谢CENABIO高级显微镜设施的所有成员提供的所有重要帮助。这项工作得到了巴西国家科学和技术发展委员会（CNPq）、高级财政编码001、里约热内卢国家宪法权利保护令基金会（FAPERJ）和圣保罗国家宪法权利保护基金会（FAPESP）的支持。B.P.得到了FAPERJ的JCNE资助。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35mm culture dishes	Corning	430165
Bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A9418
Coverslips	Knittel Glass	VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01
Glass-bottom dishes	MatTek Life Sciences	P35G-0-10-C
Glucose	Sigma-Aldrich	G7021
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
Immersion oil	Nikon	MXA22165
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE300
KaleidaGraph	Synergy Software	https://www.synergy.com/
KCl	Sigma-Aldrich	P5405
KH₂PO₄	Sigma-Aldrich	P5655
Microscope camera	Hamamatsu	C11440-10C
Na₂HPO₄	Sigma-Aldrich	S5136
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886
Neubauer chamber	Sigma-Aldrich	BR717805-1EA
Objective lens	Nikon	PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2
Optical table	Thorlabs	T1020CK
OT laser	IPG Photonics	YLR-5-1064-LP
Polystyrene microspheres	Polysciences	17134-15
rubber ring	Forever Seals	NBR O-Ring
Silicone grease	Dow Corning	Z273554
Stage positioning	PI	P-545.3R8S
Pipette	Gilson	P1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Biology

使用光学镊子和散焦显微镜定量分析红细胞的粘弹性

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Protocol

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Discussion

Disclosures

Acknowledgments

Materials

References

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