Summary
秀丽隐杆线虫感染秀丽隐杆线虫感染使蠕虫能够产生对相同病原体具有高度抗性的后代。这是遗传免疫的一个例子，遗传免疫是一种鲜为人知的表观遗传现象。本方案描述了在遗传可处理的蠕虫模型中遗传免疫的研究。
Abstract
遗传免疫力描述了一些动物如何将先前感染的“记忆”传递给它们的后代。这可以提高其后代的病原体耐药性并促进生存。虽然许多无脊椎动物中已经报道了遗传免疫，但这种表观遗传现象背后的机制在很大程度上是未知的。天然微孢子病原体线虫皮病菌感染秀丽隐杆线虫感染，导致蠕虫产生的后代对微孢子虫具有很强的抵抗力。本方案描述了在简单且遗传可处理的巴黎猪笼草-秀丽隐杆线虫感染模型中的代际免疫研究。当前的文章描述了感染秀丽隐杆线虫和产生免疫启动后代的方法。还给出了通过微孢子虫染色和显微镜观察感染来测定对微孢子虫感染的抗性的方法。特别是，遗传免疫可防止宿主细胞被微孢子虫侵袭，荧光原位杂交（FISH）可用于量化侵袭事件。免疫引物后代中产生的微孢子孢子的相对量可以通过用甲壳素结合染料染色孢子来量化。迄今为止，这些方法已经阐明了遗传免疫的动力学和病原体特异性，以及其背后的分子机制。这些技术，加上可用于秀丽隐杆线虫研究的广泛工具，将使遗传免疫领域的重要发现成为可能。
Introduction
遗传免疫是一种表观遗传现象，父母暴露于病原体可以产生抗感染的后代。这种类型的免疫记忆已经在许多缺乏适应性免疫系统的无脊椎动物中得到证明，并且可以预防病毒，细菌和真菌疾病1。虽然遗传免疫对理解健康和进化具有重要意义，但这种保护背后的分子机制在很大程度上是未知的。这部分是因为许多描述遗传免疫力的动物不是用于研究的模型生物。相比之下，透明线虫 秀丽隐杆线虫 的研究受益于广泛的遗传和生化工具包2，3，高度注释的基因组4，5和短的生成时间。事实上， 对秀丽隐杆线虫 的研究已经在表观遗传学和先天免疫6，7领域取得了根本性的进步，现在它是研究免疫记忆的既定模型8，9。
微孢子虫是真菌病原体，可感染几乎所有动物，并在免疫功能低下的人中引起致命感染10。当微孢子孢子使用称为极性管的结构将其细胞内容物（孢子质）注入或“发射”到宿主细胞中时，感染就开始了。寄生虫的细胞内复制导致梅龙的形成，其最终分化成可以离开细胞的成熟孢子11，12。虽然这些寄生虫对人类健康和粮食安全都有害，但关于它们的感染生物学还有很多需要了解的地方12。线虫是一种天然的微孢子虫寄生虫，仅在蠕虫的肠细胞中复制，导致繁殖力降低，最终导致死亡。秀丽隐杆线虫感染模型已被用于显示：（1）自噬在病原体清除中的作用13，（2）微孢子虫如何非溶解地离开感染细胞14，（3）病原体如何通过形成合胞体15从细胞传播到细胞，（4）巴黎猪笼草用于与其宿主16接口的蛋白质，以及（5）转录细胞内病原体反应（IPR）的调节17，18.
秀丽隐杆线虫感染的方案在当前的工作中进行了描述，可用于揭示独特的微孢子虫生物学并剖析宿主对感染的反应。用甲壳素结合染料Direct Yellow 96（DY96）染色的固定蠕虫的显微镜检查显示含甲壳素的微孢子孢子在整个肠道中的感染扩散。DY96染色还可以可视化含甲壳素的蠕虫胚胎，以便同时评估蠕虫的重力（产生胚胎的能力），作为宿主适应性的读数。
最近的研究表明，感染了巴黎猪笼草的秀丽隐杆线虫产生的后代对相同的感染具有很强的抵抗力19。这种遗传性免疫持续一代并且是剂量依赖性的，因为来自感染更重的父母的后代对微孢子虫的抵抗力更强。有趣的是，巴黎猪笼草的后代对细菌性肠道病原体铜绿假单胞菌也更具抗性，尽管它们没有受到天然病原体奥赛病毒19的保护。本研究还表明，免疫引物的后代限制了微孢子虫对宿主细胞的侵袭。该方法还描述了免疫引物后代的收集以及如何使用FISH来检测肠细胞中的N. parisii RNA以测定宿主细胞入侵和孢子放电20。
总之，这些方案为研究 秀丽隐杆线虫的微孢子虫和遗传免疫提供了坚实的基础。希望该模型系统的未来工作能够在遗传免疫的新兴领域取得重要发现。这些技术也可能是研究微孢子虫诱导的其他宿主生物体遗传免疫的起点。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
本研究使用野生型 秀丽隐杆线虫 布里斯托尔菌株N2在21°C下生长。
1. 培养基的制备
- 准备M9介质，如上一份报告21，22。
- 根据先前的报告21，22准备线虫生长培养基（NGM）。每6厘米板倒入12毫升NGM或每10厘米板30毫升。
- 根据以前的报告23准备大肠杆菌菌株OP50-1。
- 按照以下步骤制备OP50-1种子NGM板。
- 通过涡旋重悬10倍浓缩的OP50-1。
- 使用中继器移液器在中心为板授种。对于6cm和10cm板，分别具有200μL或500μL体积的种子。
- 对于10厘米的板，使用玻璃铺展器铺展OP50-1并形成细菌草坪。不要将细菌传播到板的边缘。
注意：乙醇每五个板浸渍并点燃吊具，以确保无菌。让撒布机冷却几秒钟，然后再撒布，以防止杀死细菌。 - 将板在室温下放置2天干燥，以确保细菌草坪的生长。
注意：种子板可以在室温下储存2-3周或在4°C下储存长达1个月。
2. 秀丽隐杆线虫的维持
- 将蠕虫保持在OP50-1种子NGM平板上的恒定细菌食物源上。
注意：饥饿可能导致代际表型，这可能会影响结果。10 cm OP50-1种子板支持2，500 L1s（ 秀丽隐杆线虫最早的幼虫阶段）长达72小时。 - 如果蠕虫挨饿，在使用蠕虫进行实验之前，在OP50-1上生长三代。
3. 使用次氯酸钠同步秀丽隐杆线虫 种群（漂白）
注意：此步骤对时间非常敏感，因此在开始之前请确保离心机可用。文献中提供了替代的、速度较慢的漂白方案，如果愿意，可以使用。为了防止6%次氯酸钠随着时间的推移而失去活性，请将试剂在4°C的黑暗中储存，并保持长达1年。
- 通过混合400μL1M NaOH，250μL6%次氯酸钠（参见 材料表）和1350μL蒸馏水，为每个样品制备2mL漂白剂溶液。
- 使用1mL M9培养基将成虫（孵化后约72小时）从板上洗涤到微量离心管中。
注意：如果板上残留许多蠕虫，则在室温下以1，400× g 离心30秒，使用1 mL移液器吸头除去上清液，并进行额外的板洗。 - 在室温下以1，400× g 离心30秒以沉淀蠕虫，然后用1mL M9培养基洗涤2x以除去细菌。
- 除去上清液，加入1mL制备的漂白剂溶液（步骤3.1.），并设置定时器1分钟。将管子倒置3-4倍。
注意：在光学显微镜下，可以看到蠕虫停止撞击。 - 1分钟后，在室温下以3，000× g 离心30秒以沉淀蠕虫，然后除去上清液并加入1mL新鲜漂白剂溶液。
- 在光学显微镜下密切监测试管，以观察蠕虫胴体分裂并释放胚胎。当~50%-80%的胴体裂开并且许多胚胎已经释放时，立即进入下一步。
注意：根据动物的数量和蠕虫菌株，此步骤可能需要15秒至4分钟。由于未知原因，受 帕氏猪笼草感染的蠕虫通常比未感染的动物需要更长的时间来漂白。 - 在室温下以3，000× g 离心30秒以沉淀胚胎，然后在1mL M9培养基中洗涤3x。
注意：洗涤稀释了管中残留的次氯酸盐溶液，必须快速进行，以确保漂白剂溶液不会损坏胚胎。 - 将1 mL M9培养基加入最终沉淀中，并转移到含有4 mL M9培养基的15 mL锥形管中。将胚胎悬浮在5mL的最终体积中。
- 在21°C的机械转子上旋转管子（参见 材料表）18-24小时，以将胚胎孵化成L1s。
注意：由于 帕里西猪 笼草感染蠕虫肠道并且不会侵入种系，因此受感染的父母不会通过垂直传播将感染传染给其后代19。受感染的成虫的漂白使F1动物同步并破坏 巴黎猪笼草 孢子，确保F1后代不会被父母携带的孢子感染。 - 在室温下以1，800 ×g 离心管1分钟以沉淀L1s，并丢弃除1mL外的所有上清液。
- 将1-5μL L1混合物移液到未播种的NGM板上，并通过在光学显微镜下观察立即计数液滴中的L1s数量。重复3x并平均计数以确定L1的浓度和总数。
注意：大多数胚胎应该孵化，L1应该在液滴中快速移动。如果大部分未孵化的胚胎和昏昏欲睡（缓慢移动）的L1仍然存在，则表明漂白时间过长。
4. 巴黎猪笼草 孢子的制备
- 准备 巴黎猪笼草 孢子遵循先前发表的参考文献19，24。
5. 秀丽隐杆线虫感染秀丽隐杆线虫以产生免疫启动的后代
- 在计划感染前一天，将所需数量的10厘米非种子NGM板从4°C移至室温。
- 在感染前，在微量离心管中以1，400× g 在室温下离心约2，500个同步的L1蠕虫30秒以沉淀蠕虫。用移液器吸头除去上清液，将蠕虫留在~50μL M9培养基中。
- 向L1s和 巴黎猪笼草 孢子中加入1 mL的10x OP50-1至所需浓度（通常为约250万个孢子）。作为未感染的对照，制备L1s和OP50-1的等效管，其M9培养基的体积相当于所使用的孢子制备体积。
注意：为了获得免疫启动的后代，请使用足够高的孢子剂量，以便>90%的动物在72小时内被感染（通过DY96染色测量，步骤7），但足够低，以便>80%的动物仍然被怀孕。这确保了大多数后代来自受感染的父母，并且父母的漂白会产生足够的胚胎进行F1测试。尽管孢子制剂的浓度和感染性各不相同，但合适的亲本剂量通常为每10厘米板5-15μL孢子制剂（约250万孢子）。 - 短暂涡旋，将上述1 mL蠕虫混合并接种到10cm非种子NGM板上。旋转以确保液体扩散到整个板上。
- 在干净的柜中干燥板，关闭盖子10-20分钟或直到完全干燥，然后在21°C下孵育72小时。
- 在感染后72小时（hpi），使用1mL M9培养基将板上的蠕虫洗入微量离心管中。如果许多蠕虫残留在板上，则通过以1，400× g 离心30秒来沉淀蠕虫，除去上清液，并进行额外的板洗。
- 在室温下以1，400× g 离心30秒以沉淀蠕虫，用1mL M9培养基洗涤2倍或直到上清液澄清。重悬于最终体积的 1 mL M9 培养基中。
- 上下移液以混合，然后将100μL悬浮蠕虫转移到新管中。
注意：这个约250个成年人的样本可以在以后进行固定和染色，以确定父母蠕虫的适应性和感染状态，如步骤7和步骤3的开头所述。 - 为了打破成虫并释放F1胚胎进行测试，漂白剩余的900μL悬浮蠕虫，如步骤3中所述。
注意：此步骤还会在随后的感染测定之前破坏任何 巴黎 猪笼草孢子。
6. 检测秀丽隐杆线虫对巴黎猪笼草的遗传免疫力
- 按照步骤 5.1.-5.6.中所述执行感染，并进行如下所述的修改。
注意：F1上的感染测定可以缩小，并使用约1，000 L1蠕虫和400μL的10x OP50-1在6 cm NGM板上进行。还必须使用“高”剂量的孢子，使得约100%的幼稚F1（即来自未感染父母的蠕虫）被感染，并且只有约10%的幼稚F1被怀孕。虽然孢子制剂的浓度和感染性各不相同，但合适的剂量通常在每6cm平板5-15μL（约250万孢子）之间。 - 在 72 hpi 下，进行固定和染色以确定蠕虫的适应性和感染状态，如步骤 7 中所述。
7. DY96秀丽隐杆线虫 染色，以可视化胚胎和微孢子
注意：DY96是一种绿色荧光甲壳素结合染料，可染色蠕虫胚胎和微孢子壁19，15，25。这允许同时监测蠕虫的适应性和感染状态。
- 使用1 mL含有0.1%吐温-20的M9培养基将板上的蠕虫洗涤到微量离心管中。如果许多蠕虫残留在板上，则在室温下以1，400× g 离心30秒，用移液器吸头除去上清液，并进行额外的板洗。
- 在室温下以1，400× g 离心30秒以沉淀蠕虫，并用1mL含有0.1%吐温-20的M9培养基洗涤2倍或直到上清液澄清。
- 除去上清液，加入700μL丙酮，让蠕虫在室温下固定10分钟。
注意：此时，如果需要，蠕虫可以储存在-20°C下，以便在几个月后进行处理。 - 在室温下以10，000× g 离心30秒以沉淀固定蠕虫，并用1mL含有0.1%吐温-20（PBST）的PBS洗涤2x。
- 制备50毫升DY96工作溶液：PBST，0.1%（v / v）十二烷基硫酸钠（SDS）和20μg/ mL DY96（来自蒸馏水中的5mg / mL储备溶液）（参见 材料表）。将管子包裹在铝箔中，并将其存放在抽屉中，以防止暴露在光线下。
注意：DY96库存和工作溶液如果保存在黑暗中，可以在室温下储存>1年。 - 在室温下以10，000× g 离心30秒，以沉淀蠕虫并除去上清液。向沉淀中加入500μLDY96工作溶液，并在室温下旋转30分钟。
- 在室温下以10，000× g 离心30秒以沉淀蠕虫。除去上清液并加入15μL具有/不带DAPI的安装介质（参见 材料表）。
- 将含有染色蠕虫的溶液移液10μL到显微镜载玻片上，并将盖玻片放在顶部。
注意：载玻片和其他样品可以在4°C的黑暗中储存，以便长期储存。
8. DY96染色蠕虫的成像和分析，以评估蠕虫的适应性和感染状态
- 为了分析DY96染色的蠕虫（安装在载玻片上，如步骤7.8所示），使用荧光显微镜的GFP通道进行成像。
- 要确定蠕虫种群的适应性，请使用5x或10x物镜来测定每种条件下>100只蠕虫的重力。
注意：携带≥1胚胎的蠕虫被认为是怀孕的。机械电池计数器有助于最大限度地减少计数时的人为错误。蠕虫胚胎的染色（荧光较少）比微孢子孢子少19。胚胎是卵形的，〜50μm x 〜30μm，并且发现于健康的 秀丽隐杆线虫 成年人的中体。健康，未感染的成年人携带10-20个胚胎，沿着他们的体长排列26。 - 为了揭示更健康的更细微的差异，进行胚胎计数。为此，手动计算每种条件下20-30个个体蠕虫中的胚胎数量。
- 要确定蠕虫种群的感染程度，请使用 5x-40x 物镜来评估每种病症> 100 种蠕虫的感染状态。包含任意数量的细胞内肠道孢子的蠕虫被认为是感染的。
注意：微孢子比蠕虫胚胎更亮。 N. parisii 的豆形孢子约为2.2μm x 〜0.8μm，在蠕虫的肠细胞中从〜48 hpi15产生。孢子仅在肠腔内而不是沿着肠壁可见的蠕虫不被认为是感染的19。这是因为这些孢子可能代表新摄入的孢子，这些孢子不是由个体感染引起的。 - 使用图像分析软件（参见 材料表），按照以下步骤量化寄生虫负担和蠕虫大小。
- 图像20-30蠕虫安装在显微镜载玻片上，使用荧光立式立体镜对每个样品。在 Brightfield、DAPI 和 GFP 通道中捕获图像。在GFP通道中选择适当的曝光，以便感染最多的样品中的荧光不饱和。
注意：感染程度最低的样本中仍然可以观察到感染。通常使用5倍物镜拍摄图像。 - 在斐济/图像J中打开文件。根据文件类型，可能需要生物格式导入器插件才能在ImageJ中打开图像。
- 使用明场或 DAPI 图像以及工具栏中的 多边形选择 工具，在图像中概述 20-30 个单独的蠕虫。使用 “分析>工具”>下拉菜单中的“感兴趣区域 （ROI） 管理器 ”保存每个大纲，方法是单击 “添加 [t]”。勾勒出在框架中完全可见的动物的轮廓。
注意：以后可以通过将带有轮廓的文件另存为 Tiff 来重新访问蠕虫轮廓。 - 单击ROI管理器中的取消选择以从图像中删除所有轮廓，然后单击下拉菜单中的图像>复制。在“通道”框中键入与感兴趣通道对应的数字，以复制GFP通道以产生寄生虫负担（例如，2）。
- 使用 图像>将此通道阈值调整>阈值 到捕获明亮寄生虫负担但来自蠕虫胚胎的变暗荧光不捕获的水平，然后单击“ 应用”。记下应用的阈值，并一致地将它们用于同一实验的所有图像。
注意：在分析所有图像之前，请检查阈值是否为感染最少和最多感染样本的适当值。 - 选择 分析>设置测量值 ，然后选中面积 分数框。从 ROI 管理器中依次选择单个蠕虫轮廓，然后单击“ 分析>测量” 功能。 结果 窗口将提供面积百分比（即寄生虫负担百分比）的测量值。
注意：如果胚胎的荧光非常亮，超过阈值，则可以使用工具栏中的黑色 画笔工具 在测量%Area之前手动擦除这些区域。 - 要确定蠕虫大小作为适合性的读数，请按照步骤 8.3 中所述概述蠕虫。选择 分析>设置测量值 ，然后选中“ 面积”框。从 ROI 管理器 中依次选择单个蠕虫轮廓，然后单击“ 分析>测量” 功能。 “结果 ”窗口将提供 %面积的测量值。
- 图像20-30蠕虫安装在显微镜载玻片上，使用荧光立式立体镜对每个样品。在 Brightfield、DAPI 和 GFP 通道中捕获图像。在GFP通道中选择适当的曝光，以便感染最多的样品中的荧光不饱和。
9. FISH测定，以评估微孢子虫和孢子放电对秀丽隐杆线虫 的入侵
注意：MicroB FISH探针识别微孢子虫18s rRNA的保守区域，可用于标记细胞内孢子质（即入侵的宿主细胞）和孢子内的遗传物质。
- 在由 M9 培养基组成的 400 μL 的最终体积中，将 6，000 个漂白同步 L1 蠕虫与 400 μL 的 Parisii 孢子和 10 μL 的 10x OP50-1 感染。
- 将混合物放在6厘米非种子NGM板上，在干净的柜中干燥10-20分钟，并在21°C下放置。
- 30分钟后，用1mL含有0.1%吐温-20的M9培养基洗涤动物。
- 通过在室温下以1，400× g 离心1分钟来沉淀蠕虫。
- 使用移液器吸头除去上清液，加入700μL丙酮，并使其在室温下静置10分钟。
注意：此时，蠕虫可以储存在-20°C，以便以后处理。 - 使用MicroB探针进行过夜FISH测定，遵循先前发表的报告27，19。
注意：为了评估孢子燃烧，将最终的500μL洗涤缓冲液与20μg/ mL DY96添加到样品中，并在21°C下旋转30分钟，然后像往常一样继续使用方案。 - 将载玻片储存在4°C的载玻片盒中。 对于长期储存（即几个月），在黑暗中以4°C的微量离心管中储存额外的样品。
- 为了评估FISH染色蠕虫的入侵，使用荧光显微镜的红色通道观察蠕虫。在高倍率（63x 物镜）下可视化感染事件，因为 L1 动物较小，孢子质将处于复制的早期阶段。要评估孢子放电，请使用63倍物镜以及红色和绿色荧光通道。
注意：GFP和mCherry信号共定位的孢子被认为是未发射的;空的GFP孢子病例被认为是烧制的。 - 为了测定侵袭或孢子放电，手动计算孢子质（肠细胞中的mCherry病灶）的数量或每种条件下20-30个蠕虫中发射的孢子的百分比。调整 z 平面中的焦点以捕获所有感染事件和孢子，这些事件和孢子通常在不同的平面中发现。
注意：孢子质仅存在于肠细胞内。最高浓度的孢子质通常在咽部之后立即发现。如果样品也用DY96染色，寻找不与孢子共定位的孢子质的存在。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
在本研究中， 秀丽隐杆线虫 （P0）的亲本种群在L1阶段感染了低剂量的 巴黎猪笼草 孢子。这些感染条件通常用于通过漂白亲本获得大量微孢子虫耐药F1后代。将受感染的父母群体和未感染的对照组固定在72 hpi并用DY96染色以可视化蠕虫胚胎和微孢子（图1A）。受感染的动物很小，含有许多微孢子，并且比健康未感染的对照组产生更少的胚胎。对蠕虫引力的评估显示，约95%的未感染动物产生后代，而感染动物的这一比例不到80%（图1B）。量化显示，约90%的微孢子虫处理群体被感染，这取决于含有DY96染色孢子的蠕虫数量（图1C）。为了获得免疫预处理的F1后代，重要的是使用足够高的微孢子虫剂量以确保大多数父母被感染，但足够低以确保种群仍然可以产生后代。提供了用于获取本研究中数据的微孢子虫剂量表（表1）。
未感染和受感染的亲本群体（图1）用72 hpi的次氯酸钠处理，以获得幼稚和免疫引发的F1后代。F1动物在L1阶段暴露于高剂量的 巴黎猪笼草 孢子，以测试对微孢子虫的遗传免疫力。在72 hpi下，固定F1动物并用DY96染色以评估微孢子虫耐药性（图2A）。对这些固定动物的量化表明，引物蠕虫比幼稚的蠕虫含有更多的胚胎，这表明在面对感染时适应性更强（图2B）。FIJI/ImageJ用于确定个体幼稚和免疫引发的蠕虫的寄生虫负担（即体内充满荧光 猪 笼草孢子的百分比）（图2C）。量化显示，来自受感染父母的蠕虫寄生虫负担显着降低（图2D）。此外，对单个蠕虫大小的计算显示，在面对 巴黎猪 笼草感染时，预浸蠕虫比幼稚动物具有显着的生长优势（图2E）。这些数据表明，受 帕氏猪笼草感染的亲本产生的后代具有高水平的微孢子虫抗性。
先前的研究表明，对微孢子虫的遗传免疫减少了猪笼草19对肠细胞的侵袭。为了可视化宿主细胞侵袭的差异，幼稚和免疫启动的动物（从未感染或受感染的父母那里获得，如上所述）在L1阶段暴露于最大剂量的巴黎猪笼草。在30 dpi下，使用FISH探针检测巴黎猪笼草RNA和DY96检测巴黎猪笼草孢壁，固定并共染色蠕虫。成像显示，虽然幼稚动物通常含有多个孢子和几个受感染的细胞（孢子质），但引物动物的孢子要少得多（或没有），并且通常没有孢子质（图3）。
图 1：未感染和巴黎猪笼草感染的秀丽隐杆线虫的直接黄 96 （DY96） 染色揭示了蠕虫的繁殖力和感染状态。 （A-C）N2秀丽隐杆线虫在L1阶段未感染或感染低剂量的巴黎猪笼草。在72 hpi时，将蠕虫固定，用DY96染色，并成像以评估蠕虫的繁殖力和感染状态。（A）显示代表性图像。DY96能够可视化蠕虫胚胎和微孢子孢子（甲壳素）。受感染蠕虫的插图显示在右侧。胚胎被标记为“E”;肠内猪笼草感染被标记为“Np”。左右图像的比例尺 = 500 μm。（B）携带一个或多个胚胎的蠕虫被评分为怀孕并绘制图形。（C）在肠细胞中携带任意数量的巴黎猪笼草孢子的蠕虫被评分为感染并绘制图表。（B-C）从 5 个独立实验中汇总的数据，每个实验的每个条件使用 n = 100 个蠕虫。显示 SEM ±平均值。p 值由未成对的双尾学生 t 检验确定。显著性定义为：*p < 0.05;p < 0.001。请点击此处查看此图的大图。
图 2：直接对幼稚和免疫引发的秀丽隐杆线虫进行黄 96 （DY96） 染色，以确定每个蠕虫的胚胎、微孢子虫负担和蠕虫大小。 （A）N2秀丽隐杆线虫在L1阶段感染或未感染低剂量的巴黎猪笼草。在72 hpi时，蠕虫用次氯酸钠处理以释放胚胎。由此产生的幼稚和免疫启动的后代在L1阶段感染了高剂量的巴黎猪笼草。在72 hpi时，蠕虫被固定，用DY96染色，并成像以可视化蠕虫胚胎和寄生虫负担。显示代表性图像。比例尺 = 200 μm.（B） 从（A）计算每个蠕虫的胚胎数量并绘制图表。（C） 来自 FIJI/ImageJ 的屏幕截图显示了来自面板 A 的幼稚蠕虫，这些蠕虫已使用右下角的阈值窗口对寄生虫负担进行阈值以可视化寄生虫负担（以白色显示）。在这里，使用“多边形选择”工具概述了单个蠕虫，该工具以红色突出显示，并使用右上角的ROI窗口定义为“感兴趣区域”（ROI）。使用分析>测量>面积函数来量化两个示例蠕虫的寄生虫负担，分别为25.02%和13.49%。（D）确定每条蠕虫的寄生虫负荷，并从（A）中绘制图表。（E）从上图中，使用分析>测量>面积功能从图C中概述的动物中计算出单个蠕虫的大小。（B、D 和 E）显示 SEM ±平均值。p 值由未成对的双尾学生 t 检验确定。显著性定义为：*p < 0.05。**p < 0.01， ***p < 0.001。请点击此处查看此图的大图。
图3：针对巴黎猪笼草18S rRNA的荧光原位杂交（FISH）揭示了幼稚但未启动的动物中秀丽隐杆线虫肠道细胞的寄生虫入侵。 N2秀丽隐杆线虫在L1阶段感染或未感染低剂量的巴黎猪笼草。在72 hpi时，蠕虫用次氯酸钠处理以释放胚胎。由此产生的幼稚和免疫启动的后代在L1阶段感染了最大剂量的巴黎猪笼草。在30 mpi下，固定蠕虫，进行FISH检测孢子质，用DY96染色以检测微孢子壁，并进行成像。显示代表性图像。幼稚蠕虫的插图显示孢子质（红色，星号），发射的孢子（绿色，箭头）和未发射的孢子（黄色，箭头）。图中幼稚感染的蠕虫显示 4 个孢子质。比例尺 = 20μm。请点击此处查看此图的大图。
| 帕里西猪笼草 剂量 | 板浓度（孢子/厘米2） | 每6厘米板数百万个孢子 | 每10厘米板数百万孢子 |
| 低 | 35,400 | - | 2.7 |
| 高 | 88,400 | 2.5 | - |
| 最大 | 2,12,000 | 6 | - |
表1：研究中采用的巴黎猪笼草剂量。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
本方案描述了在简单 且遗传可 处理的秀丽隐杆线虫-秀丽隐杆线虫 感染模型中研究微孢子虫和遗传免疫。
孢子制备是一种密集的方案，通常产生足够的孢子进行6个月的实验，具体取决于生产率24。重要的是，在将其用于实验之前，必须确定每个新孢子“批次”的传染性。由于孢子制剂之间的传染性各不相同，因此必须一致地使用单个批次进行实验的所有重复。单个等分试样不应解冻并重新冷冻，因为解冻可能导致孢子着火并降低传染性。因此，孢子只能在感染前立即从-80°C冰箱中取出，并在工作台上保持在冰上。
在步骤5-6中，概述了感染测定。在感染测定期间，避免动物的污染或饥饿非常重要，因为这可能导致额外的代际效应，从而混淆F1s的免疫力。遗传免疫测定的一个重要局限性是，更多受感染的父母产生较少的F1后代。因此，重要的是要在父母一代被充分感染以传递免疫力与足够健康以产生后代进行测试之间取得谨慎的平衡。虽然目前的方案描述了L1动物的感染测定，但可以修改该方案以测试微孢子虫感染对不同阶段的父母的影响以及老年后代免疫力的持续性。还可以修改这些方法以测试多种或不同应力（例如，渗透应激，重金属应激，与另一种病原体的合并感染）对遗传免疫的影响。虽然秀丽隐杆线虫对巴黎猪笼草的遗传免疫是代际的（即持续一代）19，但该方案可以适应研究进一步的世代以测试跨代效应。虽然所提供的方案是针对帕里西奈瑟菌感染的，但存在许多其他线虫感染的微孢子虫物种28种。这些方案可适用于研究对其他肠道感染（例如，奥苏贝利线虫）和表皮和肌肉感染（例如，线虫）微孢子虫的遗传免疫力29，30。秀丽隐杆线虫还被许多其他自然和人类病原体（细菌，真菌和病毒）感染。这里描述的方法可用于测试秀丽隐杆线虫对其他病原体的遗传免疫力以及对巴黎猪笼草的遗传免疫反应的病原体特异性。秀丽隐杆线虫是一种成熟的模式生物。然而，Caenorhabditis属的其他成员，包括雌雄同体物种C. tropicalis和C. briggsae以及雄雌性物种C. kamaaina也不同程度地感染了N. parisii31。通过对提供的协议进行小的修改，遗传免疫也可以在这些动物中进行测试。
在步骤8中，给出了快速简单的方法来确定DY96染色蠕虫（即，感染的动物百分比，怀孕的动物百分比）中微孢子虫易感性的差异。然而，有时这些方法不够敏感，无法检测免疫力和适应性的微小变化。这是因为具有一个胚胎和许多受感染细胞的蠕虫将被视为具有10个胚胎和一个受感染细胞的蠕虫。因此，还提供了具有更精细分辨率的方法来确定这些动物的感染结果（即寄生虫负担百分比，胚胎数量，蠕虫大小）。虽然这两种方法都可以使用，但后者通常更明显，因此更容易检测到显着差异。未来对这种方法的适应可能包括使用机器学习来自动分析。
在步骤9中，提供了使用FISH测定微孢子侵袭和孢子放电的宿主细胞的技术。虽然DY96标记具有强烈荧光绿色信号的微孢子虫，但其他染料，包括亲脂性染料尼罗河红和几丁质结合的钙荧光白，也可用于染色 巴黎猪笼草30，32，33。本方案描述了使用丙酮固定，并且对于使用DY96和FISH染色检测微孢子虫效果很好。然而，在某些成像方案中，用4%多聚甲醛固定可以帮助保持组织形态并改善信号。
微孢子虫是一种研究不足的病原体，感染的大部分细胞生物学仍然未知。 秀丽隐杆线虫 是一种简单的模式生物，这些协议可以作为一个平台，了解感染和宿主防御这种寄生虫的关键过程。遗传免疫是一个新兴领域，许多问题仍然悬而未决1.受感染的父母如何将免疫力传递给后代（母体供应或后代转录调节改变）？什么介导后代的免疫力（抗菌肽或其他免疫蛋白）？遗传性免疫反应的病原体特异性如何，物种之间的遗传免疫力如何保守？鉴于 秀丽隐杆线虫可用的广泛工具，基于此处描述的方案的研究已准备好回答遗传免疫的这些基本问题。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢Winnie Zhao和Yin Chen Wan对稿件提供有益的评论。这项工作得到了加拿大自然科学和工程研究委员会（Grant #522691522691）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2.0 mm zirconia beads | Biospec Products Inc. | 11079124ZX | |
| 10 mL syringe | Fisher Scientific | 1482613 | |
| 5 μm filter | Millipore Sigma | SLSV025LS | |
| Axio Imager 2 | Zeiss | - | Fluorescent microscope for imaging of DY96- and FISH- stained worms on microscope slides |
| Axio Zoom V.16 Fluorescence Stereo Zoom Microscope | Zeiss | - | For live imaging of fluorescent transgenic animals to visualize the IPR |
| Baked EdgeGARD Horizontal Flow Clean Bench | Baker | - | |
| Bead disruptor, Genie SI-D238 Analog Disruptor Genie Cell Disruptor, 120 V | Global Industrial | T9FB893150 | |
| Cell-VU slide, Millennium Sciences Disposable Sperm Count Cytometers | Fisher Scientific | DRM600 | |
| Direct Yellow 96 | Sigma-Aldrich | S472409-1G | |
| EverBrite Mounting Medium with DAPI | Biotium | 23001 | |
| EverBrite Mounting Medium without DAPI | Biotium | 23002 | |
| Fiji/ImageJ software | ImageJ | https://imagej.net/software/fiji/downloads | |
| Mechanical rotor | Thermo Sceintific | 415110 / 1834090806873 | Used to spin tubes of bleached embryos for overnight hatching |
| MicroB FISH probe | Biosearch Technologies Inc. | - | Synthesized with a Quasar 570 (Cy3) 5' modification and HPLC purified, CTCTCGGCACTCCTTCCTG |
| N2 | Wild-type, Bristol strain | Default strain | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | L3771-100G | |
| Sodium hydroxide solution (5 N) | Fisher Chemical | FLSS256500 | |
| Sodium hypochlorite solution (6%) | Fisher Chemical | SS290-1 | |
| Stemi 508 Stereo Microscope | Zeiss | - | For daily maintenance of worms and counting of L1 worms for assay set ups |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P1379-100ML | |
| Vectashield + A16 | Biolynx | VECTH1500 |
References
- Tetreau, G., Dhinaut, J., Gourbal, B., Moret, Y. Trans-generational immune priming in invertebrates: current knowledge and future prospects. Frontiers in Immunology. 10, 1938 (2019).
- Au, V., et al. CRISPR/Cas9 methodology for the generation of knockout deletions in Caenorhabditis elegans. G3 Genes|Genomes|Genetics. 9 (1), 135-144 (2019).
- Kamath, R. Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans. Methods. 30 (4), 313-321 (2003).
- The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282 (5396), 2012-2018 (1998).
- Yoshimura, J., et al.
- Weinhouse, C., Truong, L., Meyer, J. N., Allard, P. Caenorhabditis elegans as an emerging model system in environmental epigenetics: C. elegans as an environmental epigenetics model. Environmental and Molecular Mutagenesis. 59 (7), 560-575 (2018).
- Ermolaeva, M. A., Schumacher, B. Insights from the worm: the C. elegans model for innate immunity. Seminars in Immunology. 26 (4), 303-309 (2014).
- Willis, A. R., Sukhdeo, R., Reinke, A. W. Remembering your enemies: mechanisms of within-generation and multigenerational immune priming in Caenorhabditis elegans. TheFEBS Journal. 288 (6), 1759-1770 (2020).
- Burton, N. O., et al. Cysteine synthases CYSL-1 and CYSL-2 mediate C. elegans heritable adaptation to P. vranovensis infection. Nature Communications. 11, 1741 (2020).
- Wadi, L., Reinke, A. W. Evolution of microsporidia: an extremely successful group of eukaryotic intracellular parasites. PLoS Pathogens. 16, 1008276 (2020).
- Han, B., Takvorian, P. M., Weiss, L. M. Invasion of host cells by microsporidia. Frontiers in Microbiology. 11, 172 (2020).
- Tamim El Jarkass, H., Reinke, A. W. The ins and outs of host-microsporidia interactions during invasion, proliferation and exit. Cellular Microbiology. 22 (11), 13247 (2020).
- Balla, K. M., Lažetić, V., Troemel, E. R. Natural variation in the roles of C. elegans autophagy components during microsporidia infection. PLoS ONE. 14, 0216011 (2019).
- Szumowski, S. C., Estes, K. A., Troemel, E. R. Preparing a discreet escape: Microsporidia reorganize host cytoskeleton prior to non-lytic exit from C. elegans intestinal cells. Worm. 1 (4), 207-211 (2012).
- Balla, K. M., Luallen, R. J., Bakowski, M. A., Troemel, E. R. Cell-to-cell spread of microsporidia causes Caenorhabditis elegans organs to form syncytia. Nature Microbiology. 1 (11), 1-6 (2016).
- Reinke, A. W., Balla, K. M., Bennett, E. J., Troemel, E. R. Identification of microsporidia host-exposed proteins reveals a repertoire of rapidly evolving proteins. Nature Communications. 8, 14023 (2017).
- Bakowski, M. A., et al. Ubiquitin-mediated response to microsporidia and virus infection in C. elegans. PLoS Pathogen. 10, 1004200 (2014).
- Reddy, K. C., et al. An intracellular pathogen response pathway promotes proteostasis in C. elegans. Current Biology. 27 (22), 3544-3553 (2017).
- Willis, A. R., et al. A parental transcriptional response to microsporidia infection induces inherited immunity in offspring. Science Advances. 7 (19), (2021).
- Tamim El Jarkass, H., et al. An intestinally secreted host factor promotes microsporidia invasion of C. elegans. eLife. 11, 72458 (2022).
- Solis, G. M., Petrascheck, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span in 96 well microtiter plates. Journal of Visualized Experiments. 49, 2496 (2011).
- Stiernagle, T.
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. Journal of Visualized Experiments. (27), e1152 (2009).
- Estes, K. A., Szumowski, S. C., Troemel, E. R. Non-lytic, actin-based exit of intracellular parasites from C. elegans intestinal cells. PLOS Pathogens. 7, 1002227 (2011).
- Botts, M. R., Cohen, L. B., Probert, C. S., Wu, F., Troemel, E. R. Microsporidia intracellular development relies on myc interaction network transcription factors in the host. G3 Genes|Genomes|Genetics. 6 (9), 2707-2716 (2016).
- Corsi, A. K. A Transparent window into biology: A primer on Caenorhabditis elegans. WormBook. , 1-31 (2015).
- Rivera, D. E., Lažetić, V., Troemel, E. R., Luallen, R. J. RNA fluorescence in situ hybridization (FISH) to visualize microbial colonization and infection in the Caenorhabditis elegans intestines. bioRxiv. , (2022).
- Zhang, G., et al. A large collection of novel nematode-infecting microsporidia and their diverse interactions with Caenorhabditis elegans and other related nematodes. PLoS Pathogens. 12, 1006093 (2016).
- Luallen, R. J., et al. Discovery of a natural microsporidian pathogen with a broad tissue tropism in Caenorhabditis elegans. PLoS Pathogens. 12, 1005724 (2016).
- Troemel, E. R., Félix, M. -A., Whiteman, N. K., Barrière, A., Ausubel, F. M. Microsporidia are natural intracellular parasites of the nematode Caenorhabditis elegans. PLoS Biology. 6, 309 (2008).
- Burton, N. O., et al. Intergenerational adaptations to stress are evolutionarily conserved, stress-specific, and have deleterious trade-offs. eLife. 10, 73425 (2021).
- Jaroenlak, P., et al. 3-Dimensional organization and dynamics of the microsporidian polar tube invasion machinery. PLoS Pathogens. 16, 1008738 (2020).
- Weidner, E., Manale, S. B., Halonen, S. K., Lynn, J. W. Protein-membrane interaction is essential to normal assembly of the microsporidian spore invasion tube. The Biological Bulletin. 188 (2), 128-135 (1995).
