Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

הקמת קסנוגרפטים מסרטן הלבלב שמקורם בדגי זברה לבדיקת רגישות לכימותרפיה

Published: May 12, 2023 doi: 10.3791/63744
Automatic Translation
1, 2, 1, 2, 1
1Department of Biology, University of Pisa, 2General Surgery Unit, Department of Translational Research and New Technologies in Medicine and Surgery, University of Pisa

Summary

מודלים פרה-קליניים נועדו לקדם את הידע בביולוגיה של סרטן ולחזות את יעילות הטיפול. מאמר זה מתאר את הדור של xenografts מבוססי דגי זברה שמקורם בחולה (zPDXs) עם שברי רקמת גידול. zPDXs טופלו בכימותרפיה, שהשפעתה הטיפולית הוערכה במונחים של אפופטוזיס תאי של הרקמה המושתלת.

Abstract

סרטן הוא אחד הגורמים העיקריים למוות ברחבי העולם, והשכיחות של סוגים רבים של סרטן ממשיכה לעלות. התקדמות רבה הושגה במונחים של סינון, מניעה וטיפול; עם זאת, מודלים פרה-קליניים המנבאים את פרופיל הרגישות הכימותרפית של חולי סרטן עדיין חסרים. כדי למלא את הפער הזה, פותח ואומת מודל קסנוגרפט שמקורו במטופל in vivo . המודל התבסס על עוברים של דגי זברה (Danio rerio) יומיים לאחר ההפריה, אשר שימשו כמושתלים של שברי קסנוגרפט של רקמת גידול שנלקחו מדגימה כירורגית של מטופל.

ראוי גם לציין כי דגימות ביופטיות לא עוכלו או התפרקו, על מנת לשמור על המיקרו-סביבה של הגידול, שהיא קריטית מבחינת ניתוח התנהגות הגידול והתגובה לטיפול. הפרוטוקול מפרט שיטה לביסוס xenografts מבוססי דגי זברה שמקורם במטופל (zPDXs) מכריתה כירורגית ראשונית של גידול מוצק. לאחר הקרנה על ידי אנטומופתולוג, הדגימה מנותחת באמצעות להב אזמל. רקמת נמק, כלי דם או רקמת שומן מוסרים ולאחר מכן קצוצים לחתיכות 0.3 מ"מ x 0.3 מ"מ x 0.3 מ"מ.

לאחר מכן החלקים מסומנים באופן פלואורסצנטי ומושתלים בחלל הפריביטלין של עוברי דגי זברה. ניתן לעבד מספר רב של עוברים בעלות נמוכה, מה שמאפשר ניתוח in vivo בתפוקה גבוהה של הרגישות הכימותרפית של zPDXs למספר תרופות אנטי-סרטניות. תמונות קונפוקליות נרכשות באופן שגרתי כדי לזהות ולכמת את רמות אפופטוטיקה המושרות על ידי טיפול כימותרפי בהשוואה לקבוצת הביקורת. הליך xenograft יש יתרון זמן משמעותי, שכן ניתן להשלים אותו ביום אחד, מתן חלון זמן סביר לבצע סינון טיפולי עבור ניסויים קליניים משותפים.

Introduction

אחת הבעיות של חקר הסרטן הקליני היא שסרטן אינו מחלה אחת, אלא מגוון מחלות שונות שיכולות להתפתח עם הזמן, ודורשות טיפולים ספציפיים בהתאם למאפייני הגידול עצמו והחולה1. כתוצאה מכך, האתגר הוא לנוע לעבר מחקר סרטן מוכוון מטופל, על מנת לזהות אסטרטגיות מותאמות אישית חדשות לחיזוי מוקדם של תוצאות הטיפול בסרטן2. זה רלוונטי במיוחד עבור אדנוקרצינומה של צינור הלבלב (PDAC), שכן הוא נחשב לסרטן קשה לטיפול, עם שיעור הישרדות של 5 שנים של 11%3.

האבחנה המאוחרת, ההתקדמות המהירה והיעדר טיפולים יעילים נותרו הבעיות הקליניות הדחופות ביותר של PDAC. האתגר העיקרי הוא, אם כן, למדל את המטופל ולזהות סמנים ביולוגיים שניתן ליישם במרפאה כדי לבחור את הטיפול היעיל ביותר בקנה אחד עם רפואה מותאמת אישית 4,5,6. עם הזמן, גישות חדשות הוצעו למדל מחלות סרטן: אורגנואידים שמקורם בחולה (PDOs) וקסנוגרפטים שמקורם בעכבר (mPDXs) שמקורם ברקמת גידול אנושית. הם שימשו כדי לשחזר את המחלה כדי לחקור את התגובה ואת ההתנגדות לטיפול, כמו גם הישנות המחלה 7,8,9.

באופן דומה, העניין במודלים מבוססי דגי זברה שמקורם בחולה xenograft (zPDX) גדל, הודות למאפיינים הייחודיים והמבטיחים שלהם10, המייצגים כלי מהיר וזול לחקר הסרטן11,12. מודלים של zPDX דורשים רק דגימת גידול קטנה, מה שהופך את ההקרנה בתפוקה גבוהה של כימותרפיה לאפשרית13. הטכניקה הנפוצה ביותר המשמשת למודלים של zPDX מבוססת על עיכול דגימה מלא והשתלה של אוכלוסיות התאים הראשוניות, אשר משחזרת חלקית את הגידול, אך יש לה את החסרונות של היעדר מיקרו-סביבה של הגידול ותקשורת צולבת בין תאים ממאירים ובריאים14.

עבודה זו מראה כיצד zPDX יכול לשמש כמודל פרה-קליני לזיהוי פרופיל הרגישות הכימותרפית של חולי סרטן הלבלב. האסטרטגיה רבת הערך מקלה על תהליך הקסנוגרפט, שכן אין צורך בהרחבת תאים, מה שמאפשר את האצת ההקרנה הכימותרפית. כוחו של המודל הוא שכל מרכיבי המיקרו-סביבה נשמרים כפי שהם ברקמת הסרטן החולה, כי, כידוע, התנהגות הגידול תלויה ביחסי הגומלין ביניהם15,16. זה עדיף מאוד על פני שיטות חלופיות בספרות, שכן ניתן לשמר את ההטרוגניות של הגידול ולתרום לשיפור יכולת החיזוי של תוצאת הטיפול והישנות באופן ספציפי למטופל, ובכך לאפשר שימוש במודל zPDX בניסויים קליניים משותפים. כתב יד זה מתאר את השלבים הכרוכים ביצירת מודל zPDX, החל מכריתה של גידול בחולה וטיפול בו כדי לנתח את התגובה לכימותרפיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

משרד בריאות הציבור האיטלקי אישר את כל הניסויים בבעלי חיים המתוארים, בהתאם לדירקטיבה 2010/63/EU בנושא שימוש וטיפול בבעלי חיים. ועדת האתיקה המקומית אישרה את המחקר, תחת מספר רישום 70213. הסכמה מדעת התקבלה מכל הנבדקים המעורבים. לפני שמתחילים, יש להכין את כל הפתרונות והציוד (סעיף 1) ולחצות את הדגים (סעיף 2).

1. הכנת פתרונות וציוד

הערה: ראה טבלה 1 לקבלת הפתרונות והמדיה שיש להכין.

  1. התמיכה של Agarose gel
    1. שקלו את אבקת האגרוז בבקבוק הניתן למיקרו והמיסו אותה בנפח נתון של מדיום דג זברה E3 ליצירת ג'ל 1%. מחממים במיקרוגל עד שהאגרוז מתמוסס לחלוטין.
      הערה: אין להרתיח יתר על המידה את התמיסה.
    2. יוצקים את האגרוז המומס לצלחת פטרי ומחכים עד שהג'ל יתמצק לחלוטין.
    3. הכינו גלילי אגרוז קטנים (~ 5 מ"מ גובה) באמצעות פיפטת פסטר פלסטיק עם קצה חתוך. לאחר ההכנה, יש לאחסן בצלחת פטרי בטמפרטורה של 4°C עטופה ברדיד אלומיניום.
  2. מיקרו-מחטים מזכוכית
    1. משוך את נימי זכוכית בורוסיליקט עם מושך כדי להשיג מחטים עדינות (הגדרות: חום 990, PULL 550).
      הערה: מנימים אחד, ניתן להשיג שתי מחטים עדינות בקוטר קצה של 10 מיקרומטר.

2. מעבר דגים ואיסוף ביצים

  1. העברת דגים בוגרים למכלי רבייה 3 ימים לפני השתלת הרקמות, כמתואר על ידי אבדש ואחרים.17.
  2. הערה: מומלץ יחס של 1:1 או 2:3 זכרים לנקבות. צפיפות הדגים צריכה להיות מקסימום חמישה דגים לליטר מים. יש להפריד בין זכרים לנקבות באמצעות מחסום למשך הלילה.
  3. למחרת, הסירו את המחסום ואפשרו לדגים להזדווג.
  4. הוציאו את הדגים ממכלי הרבייה והחזירו אותם למכלי הדיור שלהם.
  5. יוצקים את המים ממיכל הרבייה דרך רשת דקה. מעבירים את הביצים המופרות לצלחת פטרי עם מדיום דג זברה E3.
  6. בדקו את צלחת הפטרי עם סטריאומיקרוסקופ והשליכו את הביצים העכורות. שמור את הביצים מופרות בתווך E3 זברה טרי ב 28 ° C.

3. אוסף דגימות

הערה: מלקחיים Autoclave וידית אזמל.

  1. עיבוד מיידי
    1. לאסוף את הדגימה הכירורגית של הגידול ב 10 מ"ל של תווך הגידול ב 4 ° C (דגימת הגידול נע בין 5 מ"מ ל 10 מ"מ קוטר). העבר את הדגימה ב 4 ° C מהמיקום הרצוי לעיבוד מיידי.
  2. אחסון למשך הלילה (אופציונלי)
    1. לאסוף את דגימת הגידול הכירורגי ב 10 מ"ל של מדיום הגידול ולאחסן את הדגימה לילה ב 4 ° C.
  3. אחסון בטמפרטורה של -80°C (אופציונלי, הכי פחות מומלץ)
    1. אחסנו את הדגימה בטמפרטורה של -80°C בבקבוקון קריוגני עם מדיום גידולי בתוספת 5% דימתיל סולפוקסיד (DMSO).

4. עיבוד דגימה

הערה: בצע את השלבים מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית של תרבית רקמה סטרילית.

  1. לשטוף את כל רקמת הגידול עם 5 מ"ל של מדיום הגידול הטרי, pipeting למעלה ולמטה 10x באמצעות פיפטה פסטר פלסטיק. שאפו והשליכו את אמצעי הכביסה. חזור על שלב זה 3x.
    הערה: הימנע שאיפה של רקמת הגידול כפי שהוא יכול להישאר מחובר פיפטה פסטר פלסטיק.
  2. מעבירים את הדגימה בצלחת פטרי וממזגים אותה ב 1-2 מ"ל של מדיום גידול טרי. חותכים את דגימת הגידול לחתיכות קטנות (1-2 מ"מ3) באמצעות להב אזמל ומניחים אותם בצינור פלסטיק סטרילי 5 מ"ל עם תווך גידול.
  3. הגדר את מסוק הרקמה McIlwain לעובי 100 מיקרומטר. מניחים את שברי הדגימה על שולחן הפלסטיק העגול של המסוק וקוצצים אותם. סובבו את השולחן ב-90° וחזרו על החיתוך.
  4. צנטריפוגה את השברים ב 300 × גרם במשך 3 דקות. לאחר מכן, שאפו בזהירות את הסופרנאטנט והשליכו אותו.
  5. לדגור על השברים עם גשש תאים פלואורסצנטי, CM-DiI (ריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל במי מלח חוצצים פוספט של דולבקו [DPBS]), אדום עמוק (ריכוז סופי של 1 μL / מ"ל ב- DPBS), או CellTrace (ריכוז סופי של 5 מיקרומטר ב- DPBS) למשך 30 דקות, ומניחים את הצינור באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.
  6. השהה מחדש את השברים על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה כל 10 דקות.
    הערה: במקרה של CellTrace, יש להוסיף מדיום המכיל לפחות 1% חלבון בסוף הדגירה, בהתאם להוראות היצרן.
  7. צנטריפוגה ב 300 x גרם במשך 3 דקות ולהשליך את supernatant. חזור על שלב זה 3x עם 1 מ"ל של DPBS כדי להסיר צבע לא משולב.
  8. להשעות את השברים ב 5 מ"ל של DPBS בצלחת פטרי 60 מ"מ.
    הערה: ודא שהרקמה אינה מתייבשת.

5. הקמת zPDX

הערה: בצע את השלבים מתחת למכסה מנוע זרימה למינרית של תרבית רקמה סטרילית.

  1. מרדימים את העוברים יומיים לאחר ההפריה (dpf) עם 0.16 מ"ג/מ"ל טריקאין בתווך דג זברה E3.
  2. הכניסו שלושה גלילי אגרוז (שלב 1.1.3) לצלוחית פטרי והניחו עובר של דג זברה על גליל, תוך חשיפת צד אחד. הסר את התמיסה העודפת כדי לשמור על העובר בסרט דק בלבד.
  3. מעבירים את פיסת הרקמה המוכתמת במלקחיים סטריליים מצלחת הפטרי לתמיכה של 1% אגרוז שבה העובר שוכב. הרימו את הרקמה, הניחו אותה על גבי חלמון העובר, ואז דחפו אותה לחלל הפריביטלין באמצעות מיקרו-מחט זכוכית המושכת בחום (שלב 1.2.1).
  4. הוסיפו בעדינות כמה טיפות של E3 1% פניצילין-סטרפטומיצין (Pen-Strep) לעובר כדי להחזיר אותו לנוזל.
  5. חזור על שלבים 5.2-5.4 עבור כל העוברים, ולבסוף, להסיר את תמיכות האגרוז מצלחת פטרי ולדגור על העוברים ב 35 מעלות צלזיוס.
  6. בדוק את העוברים עבור xenografts הנכון (צביעה חיובית) 2 שעות לאחר ההשתלה באמצעות סטריאומיקרוסקופ פלואורסצנטי. להשליך את העוברים עם שברי הגידול שאינם לגמרי בתוך החלל perivitelline, כמו גם את העוברים המתים. חלקו את העוברים באופן אקראי בשש פלטות מרובות בארות (מקסימום n = 20 עוברים/באר), בחלוקה שווה לקבוצות בהתאם לתוכנית הניסוי (למשל, ביקורת ו-FOLFOXIRI).

6. טיפול

  1. לדלל את התרופה (למשל, 5-fluorouracil, oxaliplatin, irinotecan) לתוך E3 1% Pen-Strep, ערבוב יסודי על ידי pipeting למעלה ולמטה מספר פעמים. כפי שהוצע על ידי Usai et al.12, השתמש דילול פי חמישה של התרופה במי הדגים, ביחס לריכוז פלזמה שווה ערך (EPC).
  2. מערבבים את התרופות להכנת הקוקטייל (למשל, FOLFOXIRI).
  3. הסר את המדיה מכל באר והוסף את קוקטייל התרופה 2 שעות לאחר ההשתלה.
  4. לטפל בעוברים במשך 3 ימים. לחדש את קוקטייל התרופות כל יום.

7. צביעה אימונופלואורסצנטית בהר שלם

הערה: לפני שמתחילים, מניחים אצטון בטמפרטורה של -20°C ומכינים את התמיסות המפורטות בטבלה 1.

  1. יום 1:
    1. תקן את הזחלים עם 1 מ"ל של 4% paraformaldehyde בבקבוקוני זכוכית ב 4 ° C במשך הלילה.
  2. יום 2:
    1. לשטוף את הזחלים 3 x 5 דקות עם 1 מ"ל של PBS, בעדינות מתסיס על נדנדה פלטפורמת מעבדה (400 סל"ד).
    2. יש לאחסן ב-1 מ"ל של 100% מתנול בטמפרטורה של -20°C למשך הלילה (או לאחסון לטווח ארוך).
    3. התייבשו 3 x 10 דקות עם 1 מ"ל של PTw (0.1% tween ב-PBS), והתסיסו בעדינות על נדנדה של פלטפורמת מעבדה (400 סל"ד).
    4. חדיר עם 1 מ"ל של 150 mM Tris-HCl ב- pH 8.8 למשך 5 דקות ב- RT, ולאחר מכן חימום למשך 15 דקות ב- 70 ° C.
    5. שטף 2 x 10 דקות עם 1 מ"ל של PTw, בעדינות מתסיס על נדנדה פלטפורמת מעבדה (400 סל"ד).
    6. יש לשטוף 2 x 5 דקות עם 1 מ"ל של dH2O, בעדינות על נדנדה פלטפורמת מעבדה (400 סל"ד).
    7. חדיר עם 1 מ"ל של אצטון קר כקרח במשך 20 דקות ב -20 ° C.
    8. יש לשטוף 2 x 5 דקות עם 1 מ"ל של dH2O, בעדינות על נדנדה פלטפורמת מעבדה (400 סל"ד).
    9. שטף 2 x 5 דקות עם 1 מ"ל של PTw, בעדינות על נדנדה פלטפורמת מעבדה (400 סל"ד).
    10. לדגור את הזחלים ב 1 מ"ל של חיץ חוסם במשך 3 שעות ב 4 ° C, בעדינות תוסס על נדנדה פלטפורמת מעבדה (400 סל"ד).
    11. הניחו את הזחלים בצלחות באר מחולקות לקבוצה באופן הבא: 10 זחלים בנפח 50 מיקרוליטר/באר בצלחת בת 96 בארות או 20 זחלים בנפח של 100 מיקרוליטר/באר בצלחת בת 48 בארות.
    12. יש להשליך את החיץ החוסם, לדגור על הזחלים בתמיסת נוגדנים ראשונית (למשל, קספאז-3 אנטי-אנושי נגד בני אדם, 1:250) מדולל במאגר הדגירה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס בחושך, ולנענע בעדינות על צלחת שייקר (400 סל"ד). ראה שלב 7.2.11 לקבלת אמצעי אחסון מומלצים.
  3. יום 3:
    1. שטפו את הזחלים ברצף 3 x 1 שעות עם 1 מ"ל של PBS-TS (10% סרום עיזים, 1% Triton X-100 ב-PBS) ולאחר מכן, עם 2 x 10 דקות עם 1 מ"ל של PBS-T (1% Triton X-100 ב-PBS) ו-2 x 1 שעות עם 1 מ"ל של PBS-TS. בכל שטיפה, להסעיר בעדינות את הצלחות המכילות את הזחלים על צלחת שייקר (400 סל"ד).
    2. לדגור על הזחלים עם נוגדנים משניים מצומדים בצבע פלואורסצנטי (למשל, נוגדן משני צולב נגד ארנב IgG [H+L], Alexa Fluor 647, 1:500) ו-100 מיקרוגרם/מ"ל Hoechst 33258 מדולל במאגר הדגירה בחושך למשך הלילה ב-4°C, עם תסיסה עדינה על צלחת שייקר (400 סל"ד). ראה שלב 7.2.11 לקבלת נפחים מומלצים של תמיסת נוגדנים משנית.
  4. יום 4:
    1. שטף 3 x 1 שעות עם 1 מ"ל של PBS-TS ו 2 x 1 שעות עם 1 מ"ל של PTw, עם תסיסה עדינה על צלחת שייקר (400 סל"ד).
    2. צור שכבה עגולה עם האמייל (עובי של ~ 0.5-1 מ"מ) על שקופיות מיקרוסקופ. תנו לאמייל להתייבש והניחו את הזחלים במרכז השכבה העגולה, תוך חשיפת הצד של הקסנוגרפט.
    3. יבשו את התמיסה העודפת והרכיבו את מכסה הזכוכית באמצעי הרכבה מסיס במים שאינו פלואורסצנטי.

8. הדמיה

  1. צלם תמונות תחת מיקרוסקופ קונפוקלי עם מטרה של 40x. השתמש בפרמטרי הרכישה הבאים: רזולוציה של 1024 x 512 פיקסלים עם מרווח Z של 5 מיקרומטר.

9. ניתוח אפופטוזיס על ידי ImageJ

  1. טען (פיג'י זה רק) תוכנת ImageJ (https://imagej.net/Fiji/Downloads) ופתח את תמונת הקובץ Z-stack (לחץ על קובץ | פתוח). בחלון הקופץ, בחר Stack viewing/Hyperstack ולחץ על OK.
  2. שכבת-על של הערוצים השונים על-ידי בחירה באפשרות תמונה | צבע | הכינו קומפוזיט.
  3. גררו את סרגל Z בתחתית התמונה כדי לדפדף בתמונת מחסנית Z ולזהות את אזור xenograft (תאים חיוביים למעקב אחר תאים פלואורסצנטיים. ראה שלב 4.5) במרחב perivitelline של דג הזברה.
  4. בחר כלי נקודה וספור את מספר התאים האנושיים אפופטוטיים (חיובי למעקב אחר תאים פלואורסצנטיים וקספאז-3 שסוע), כפי שמוצג בסרטון המשלים S1.
  5. לחץ פעמיים על סמל כלי הצבעה , שנה את המונה וספור את המספר הכולל של גרעיני תאים אנושיים (גרעיני תאים חיוביים CM-DiI).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר את הגישה הניסיונית ליצירת zPDXs מאדנוקרצינומה ראשונית של הלבלב האנושי. דגימת גידול נאספת, טחונה ומוכתמת באמצעות צבע פלואורסצנטי, כמתואר בפרוטוקול סעיף 4. לאחר מכן zPDXs הוקמו בהצלחה על ידי השתלת פיסת גידול בחלל הפריביטלין של 2 עוברי דגי זברה dpf, כמתואר בסעיף 5 של הפרוטוקול. כפי שמתואר בסעיף 6 של הפרוטוקול, ה-zPDXs נבדקו עוד יותר כדי לזהות את פרופילי הרגישות לכימותרפיה של תאים סרטניים שמקורם בחולה. לדוגמה, השילוב הכימותרפי FOLFOXIRI (5-fluorouracil, חומצה פולינית, oxaliplatin, ואירינוטקן) נבדק, שכן הוא משמש כימותרפיה קו ראשון עבור אדנוקרצינומה מתקדמת של צינור הלבלב ובסרטן מעי גס גרורתי. תמונות שלמות של zPDXs נרכשו כערימות Z במיקרוסקופ הקונפוקלי, והשראת האפופטוזיס נותחה כמתואר בפרוטוקולים סעיפים 8 ו-9. כפי שניתן לראות באיור 1A,B, הטיפול המשולב הוביל לעלייה באפופטוזיס של תאים בהשוואה לקבוצת הביקורת. במחקר המקרה שדווח כאן, זוהתה עלייה מובהקת סטטיסטית בחלק התאים האפופטוטיים בקסנוגרפטים מושתלים בקבוצה שטופלה ב-FOLFOXIRI בהשוואה לקבוצת הביקורת (איור 1C).

Figure 1

איור 1: zPDXs מאדנוקרצינומה של צינור הלבלב האנושי 3 ימים לאחר טיפול FOLFOXIRI. קרומי התאים הוכתמו ב-CM-DiI (אדום) והרקמה הושתלה לתוך החלל הפריביטלי של 2 דגי זברה מסוג בר dpf AB. הזחלים נחשפו לשילוב FOLFOXIRI (0.216 מ"ג/מ"ל 5-פלואורואורציל, 0.013 מ"ג/מ"ל חומצה פולינית, 0.006 מ"ג/מ"ל אוקסליפלטין, 0.011 מ"ג/מ"ל אירינוטקן) או לא נחשפו (CTRL) במשך 3 ימים, תוקנו והוכתמו חיסון בנוגדן קספאז-3 שסוע (ציאן) ומוכתמים על ידי Hoechst (גרעינים כחולים). הזחלים הותקנו עם אקווה פולי-הר בשקופיות מיקרוסקופ זכוכית. (א1-3) דוגמה מייצגת לזחל ביקורת (לא נחשף לכימותרפיה). לא נצפו תאים חיוביים לקספאז-3. (ב1-3) דוגמה מייצגת של זחל xenografed 3 ימים לאחר טיפול FOLFOXIRI, מראה הפעלה עקבית של קספאז-3 שסוע. תמונות שלמות צולמו במיקרוסקופ קונפוקלי Nikon A1 עם מצלמה דיגיטלית. הקווים המקווקווים מראים את אזורי הקסנוגרפט. (C) כימות של תאים חיוביים כפולים של קספאז-3 ו-CM-DiI שסועים בזחלים שטופלו ב-FOLFOXIRI בהשוואה ל-CTRL, המסומנים כממוצע ± SEM (n ≥ 12); p < 0.001, מבחן Mann-Whitney U. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: zPDX = xenograft שמקורו בחולה זברה; DPF = ימים לאחר ההפריה; FOLFOXIRI = 5-fluorouracil, חומצה פולינית, oxaliplatin, ו irinotecan; CTRL = שליטה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
פתרון/בינוני קומפוזיציה, הערות תכלית
גידול בינוני (1x) לבינוני RPMI-1640 יש להוסיף פניצילין-סטרפטומיצין (ריכוז סופי 100 U/mL) ואמפוטריצין (ריכוז סופי 2.50 מיקרוגרם/מ"ל).
E3 דג זברה בינוני (1x) יש לדלל את מדיום העובר E3 60x (NaCl 3 M, KCl 0.1 M, CaCl 2 0.2 M, MgSO4 0.2 M) במים נטולי יונים, עד לריכוז עבודה סופי של 1x.
E3 1% Pen-Strep הוסף 1 מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין ל 99 מ"ל של מדיום דג זברה E3. מערבבים בהיפוך. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4°C
PTw 0.1% טווין ב-PBS Whole-mount immunostaining
מאגר חוסם 10% סרום עיזים, 1% DMSO, 1% BSA, 0.8% Triton X-100 ב-PTw Whole-mount immunostaining
מאגר הדגירה 1% סרום עיזים, 1% DMSO, 1% BSA, 0.8% Triton X-100 ב-PTw Whole-mount immunostaining
PBS-TS 10% סרום עיזים, 1% טריטון X-100 ב-PBS Whole-mount immunostaining
PBS-T 1% Triton X-100 ב-PBS Whole-mount immunostaining

טבלה 1: פתרונות ומדיה המשמשים בפרוטוקול.

איור משלים S1: דגימת גידול PDAC הוכתמה DiO (ירוק) והושתלה בחלל הפריביטלין של 2 עוברי דגי זברה dpf.לאחר זמן דגירה של 3 ימים, הוזרקו ל-zPDXs 2 מיקרוגרם/מ"ל פרופידיום יודיד (PI; אדום) ולאחר מכן עברו הדמיה קונפוקלית תלת-ממדית. כדאיות התא נבדקה על ידי מדידת תאים חיוביים PI מתוך המספר הכולל של תאים אנושיים (DiO חיובי). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: PDAC = אדנוקרצינומה של צינור הלבלב; DPF = ימים לאחר ההפריה; zPDX = xenograft שמקורו בדגי זברה. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

וידאו משלים S1: דוגמה לספירת תאים אנושיים אפופטוטיים, באמצעות הכלי הרב-נקודתי של ImageJ. הסרטון הוא ערימת Z של zPDX 3 ימים לאחר ההשתלה, שנרכשה לאחר קספאז-3 שסע ו-Hoechst 33258 immunostaining. קיצורים: zPDX = xenograft שמקורו בחולה זברה. אנא לחץ כאן כדי להוריד סרטון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מודלים In vivo בחקר הסרטן מספקים כלים שלא יסולא בפז להבנת הביולוגיה של הסרטן ולחיזוי התגובה לטיפול בסרטן. כיום, מודלים שונים in vivo זמינים, למשל, בעלי חיים מהונדסים גנטית (עכברים מהונדסים ונוקאאוט) או xenografts שמקורם בחולה מתאים ראשוניים אנושיים. למרות תכונות אופטימליות רבות, לכל אחד מהם יש מגבלות שונות. בפרט, המודלים הנ"ל חסרים דרך אמינה לחקות את המיקרו-סביבה של רקמת הגידול של המטופל.

הוצע כי מיקרו-סביבה של הגידול עשויה למלא תפקידים חשובים רבים בתגובה לתרופות18. לכן, כדי למצוא מודל מתאים של בעלי חיים השומר על המיקרו-סביבה של רקמת הגידול, פותח מודל PDX חלופי, תוך שימוש בחתיכות של רקמת גידול שהושתלו ב-2 עוברי דגי זברה dpf. הפרוטוקול מתאר כיצד לבצע xenografts במספר רב של עוברים, המאפשר סינון תפוקה גבוהה של תרופות, הן כסוכנים בודדים והן בשילובים.

נקודת המפתח של גישה חדשנית זו היא שהיא משמרת הן אינטראקציות תא-תא והן את המיקרו-סביבה של הגידול, בהשוואה ל-zPDX המבוצעים בדרך כלל עם תרחיפים חד-תאיים. ה- PDAC מדגימה כירורגית מוכנס מיד למדיה גידולית טרייה וקרה, והגידול קצוץ לרסיסים קטנים. ההליך הכולל המשמש ליצירת מודל zPDX מבוסס על השתלה ישירה של מקטע מהגידול של המטופל לתוך החלל perivitelline של עובר 2 dpf דג זברה.

המודל המוצע יכול לשמש חלופה למודל PDX המבוסס על עיכול דגימת רקמת הגידול שמקורה בחולה, ולאחר מכן הזרקה ישירה לשק החלמון או בחלל הפריביטלין. כפי שמעידים עבודתם של פיור ואחרים, ניתן להקים מודל zAvatar מהדיסקציה האנזימטית של סרטן הלבלב שנכרת בניתוח. שיעור ההשתלה נע בין 44% ל -64%, בשל התאיות הנמוכה האופיינית של דגימת הלבלב הגידול והסטרומה הדסמופלסטית הצפופה19 השלילית.

עם זאת, תרחיף התא שיחזר רק באופן חלקי את הגידול המקורי14. לעומת זאת, mPDX, שנבנה על ידי השתלה ישירה של רקמת הגידול בעכברים מדוכאי חיסון, דומה ביותר לגידול המקורי, מה שיכול לעזור טוב יותר לרופאים להבין את התנהגות הגידול ולהעריך תגובות אינדיבידואליות לפני הטיפול20. למעשה, המקטע הקטן והמושתל שומר על המיקרו-סביבה של הגידול ומשמר את ההצלבה בין תאים ממאירים ובריאים, בדומה לגידול המקורי21. לפיכך, הרגישות לכימותרפיה או העמידות לכימותרפיה משוחזרת טוב יותר, עם השפעה ישירה של טכנולוגיית zPDX בתחום האונקולוגיה התרגומית14. גישת zPDX מאפשרת לכל מטופל לפתח גידול משלו במערכת חיה. לכן, זה מייצג חלופה טובה לשימוש mPDX, שבו רקמת הגידול הוא orthografted שלם או disaggregated בתאים, אשר לאחר מכן xenografed לתוך מודלים מושתל עכבר13.

פרוטוקול זה פותח בשיתוף פעולה עם פתולוגים האחראים לבחירת חלקי הגידול המתאימים ביותר להשתלה. דגימות רקמה ביולוגית נלקחו תמיד מהדגימה הכירורגית ולעולם לא מביופסיה, שכן האחרונה מאופיינת בדרך כלל במחסור ברקמה ולכן מיועדת למטרות אבחון בלבד. הקריטריון לדגימת רקמות הוא בדרך כלל לא שולי לעומת ליבה, אלא אזור גידול נטול דימום ונמק. מסיבה זו, קטע היסטולוגי קריוסטט בוצע תמיד על מחצית הדגימה לבקרת איכות מיידית של החומר. המחקר הנוכחי עשוי להיות מוגבל על ידי היכולת של תאי הגידול הראשוניים להשתיל לתוך החלל perivitelline של עוברים דגי זברה. עם זאת, שיעור קליטה של 80% של רקמה בת קיימא נצפה 3 ימים לאחר ההשתלה, הן לאחר אחסון ב -4 ° C (12/15 מקרים) והפשיר מ -80 ° C (10/12 מקרים), דבר המצביע על כך שניתן לשמר את הגידול ביעילות בהקפאה, עם כדאיות תאים של 74% ± 2% (איור משלים S1). למרות זאת, שיעור ההצלחה של השתלת רקמות משתנה בין גידולים שונים של חולי PDAC; כתוצאה מכך, עיבוד מהיר של הרקמה מיד לאחר כריתה כירורגית, כמו גם מניעת הקפאה, יכול לשפר את היעילות.

כמה תועלת טכנית מוצעים גם בפרוטוקול עבור xenografts מוצלח. לדוגמה, השימוש במסוק תיקן את המידות של חתיכות xenografted. כדי לבדוק שחלקי רקמות הגידול שוות בממדיהן לאחר החיתוך, פתרון אפשרי הוא להשתמש בזכוכית כיול כדי למדוד את קוטר השברים לפני ההשתלה.

השימוש בתמיכת גליל אגרוז 1% חיוני הן להנחת העוברים בצד אחד ופשוט להשתלת חתיכת גידול, כמו גם למניעת שבירת המחט. מכיוון שגידולים מפגינים שונות גבוהה, מגבלה נוספת של השיטה היא שההטרוגניות התוך-גידולית מיוצגת פחות במקטע בהשוואה לתרחיף תאי. למעשה, חתיכות רקמה קטנות יכולות להתפצל במונחים של אוכלוסיות תאים שפירות ותת-שיבוטים של גידולים. כדי להתגבר על ביקורת זו, יש להשתמש במספר גבוה של עוברים מוזרקים כדי לשחזר את ההטרוגניות של הגידול ולהפחית את השונות בניתוח. על פי הניתוח הסטטיסטי, כל קבוצה דורשת מדגם גדול מ-15, בהתחשב בגודל אפקט של d = 2, ובחזקה של 80% ו-95% מובהקות סטטיסטית. מספר זה סביר, שכן מפעיל מומחה יכול לעבד כ -40 עוברים בשעה.

בנוסף למתודולוגיה המשמשת ליצירת מודל zPDX, הוכח גם כאן כי שילוב FOLFOXIRI גורם לאפופטוזיס של תאים שמקורם בחולה במודל zPDX. כמו עם FOLFOXIRI, ניתן לבדוק את הרגישות הכימותרפית של zPDX לתוכניות כימותרפיות אחרות, כגון אלה שנבדקו בהצלחה על ידי Usai et al.11.

בנוסף, הטכניקה של immunostaining הר שלם הדמיה מוצג כדי לספק את הכימות של התכונה של עניין. כדי להתגבר על כמה בעיות ולהוביל מוצלח immunostaining שלם, פתרון DMSO 5% מומלץ לחדור את הרקמות. לגבי הדמיה קונפוקלית, מגבלות הרזולוציה של המיקרוסקופ הקונפוקלי עלולות לפגוע ברכישת הערימות העמוקות יותר של הזחלים הקסנו-מושתלים. עם זאת, במחקר, התאים אפופטוטיים נספרים מתוך המספר הכולל של תאי החולה. שחזור תלת ממדי מהבסיס ועד לראש מסת הגידול המושתל, בגודל צעד של 5 מיקרומטר, מאפשר לזהות את כל גרעיני האדם, בהתחשב בהסתברות שאותו גרעין עשוי להתפשט במישור Z הקודם או הבא. כתוצאה מכך, ניתן להשתמש במונה הכלים הרב-נקודתיים של ImageJ כדי לשלוט ולמנוע ספירה של אותו תא פעמיים וכדי להריץ ספירה כפולה באותן ערימות Z (אפופטוטיות מתוך כלל התאים האנושיים) ויכול לעקוב בקלות אחר אפופטוזיס ברמת התא היחיד.

למרות מגבלותיו, למודל zPDX יש מספר יתרונות בהשוואה למודלים in vivo : מחזור החיים המהיר ביותר של דגי זברה, היכולת להשיג מספר רב של בעלי חיים בזמן קצר; הבהירות האופטית בשלבי הפיתוח; ומעל לכל, ההשפעה האתית הנמוכה ביותר בחלון הזמן של 0-120 שעות לאחר ההפריה22. כיום, ניסוי קליני משותף באמצעות zPDXs זול יותר מזה שנערך עם PDX מבוסס עכברים, שכן זנים מארחים מדוכאי חיסון דורשים עלות תחזוקה גבוהה, כמו גם שיטות הדמיה מורכבות לניטור צמיחת הגידול23. לסיכום, כל הגורמים הללו מדגישים את הפוטנציאל של מודל zPDX לשימוש בניסויים קליניים משותפים לחיזוי פרופילי רגישות לכימותרפיה של חולי סרטן ולשימוש על ידי חוקרים המעוניינים במודלים חדשניים לבדיקת תרופות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

Acknowledgments

עבודה זו מומנה על ידי Fondazione Pisa (פרויקט 114/16). המחברים רוצים להודות לרפלה גאטה מהיחידה להיסטופתולוגיה של Azienda Ospedaliera Pisana על בחירת דגימת המטופל והתמיכה הפתולוגית. אנו מודים גם לאלסיה גלנטה על התמיכה הטכנית בניסויים. מאמר זה מבוסס על עבודה של COST Action TRANSPAN, CA21116, הנתמכת על ידי COST (שיתוף פעולה אירופי במדע וטכנולוגיה).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-fluorouracil Teva Pharma AG SMP 1532755
48 multiwell plate Sarstedt 83 3923
96 multiwell plate Sarstedt 82.1581.001
Acetone Merck 179124
Agarose powder  Merck A9539
Amphotericin Thermo Fisher Scientific 15290018
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 Merck MAB1281  1:200 dilution
Aquarium net QN6 Penn-plax 0-30172-23006-6
BSA Merck A9418
CellTrace Thermo Fisher Scientific C34567
CellTracker CM-DiI  Thermo Fisher Scientific C7001
CellTracker Deep Red  Thermo Fisher Scientific C34565
Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb Cell Signaling Technology 9661S 1:250 dilution
Dimethyl sulfoxide (DMSO)  PanReac AppliChem ITW Reagents A3672,0250
Dumont #5 forceps World Precision Instruments 501985
Folinic acid -  Lederfolin Pfizer
Glass capillaries, 3.5" Drummond Scientific Company 3-000-203-G/X Outer diameter = 1.14 mm. Inner diameter = 0.53 mm. 
Glass vials  VWR International WHEAW224581
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific A-21244   1:500 dilution
Goat serum Thermo Fisher Scientific 31872
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570
Irinotecan Hospira
Low Temperature Freezer Vials VWR International 479-1220
McIlwain Tissue Chopper World Precision Instruments
Microplate Mixer SCILOGEX 822000049999
Oxaliplatin Teva
Paraformaldehyde Merck P6148-500G
PBS Thermo Fisher Scientific 14190094
Penicillin-streptomycin  Thermo Fisher Scientific 15140122
Petri dish 100 mm Sarstedt 83 3902500
Petri dish 60 mm Sarstedt 83 3901
Plastic Pasteur pipette Sarstedt 86.1171.010
Poly-Mount Tebu-bio 18606-5
Propidium iodide Merck P4170
RPMI-1640 medium Thermo Fisher Scientific 11875093
Scalpel blade No 10 Sterile Stainless Steel VWR International SWAN3001
Scalpel handle #3 World Precision Instruments 500236
Tricaine Merck E10521
Triton X-100  Merck T8787
Tween 20 Merck P9416
Vertical Micropipette Puller Shutter instrument P-30 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rubin, H. Understanding cancer. Science. 219 (4589), 1170-1172 (1983).
  2. Krzyszczyk, P., et al. The growing role of precision and personalized medicine for cancer treatment. Technology. 6 (3-4), 79-100 (2018).
  3. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics, 2022. CA Cancer Journal for Clinicians. 72 (1), 7-33 (2022).
  4. Trunk, A., et al. Emerging treatment strategies in pancreatic cancer. Pancreas. 50 (6), 773-787 (2021).
  5. Moffat, G. T., Epstein, A. S., O'Reilly, E. M. Pancreatic cancer-A disease in need: Optimizing and integrating supportive care. Cancer. 125 (22), 3927-3935 (2019).
  6. Sarantis, P., Koustas, E., Papadimitropoulou, A., Papavassiliou, A. G., Karamouzis, M. V. Pancreatic ductal adenocarcinoma: Treatment hurdles, tumor microenvironment and immunotherapy. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 12 (2), 173-181 (2020).
  7. Marshall, L. J., Triunfol, M., Seidle, T. Patient-derived xenograft vs. organoids: a preliminary analysis of cancer research output, funding and human health impact in 2014-2019. Animals. 10 (10), 1923 (2020).
  8. Li, Y., Tang, P., Cai, S., Peng, J., Hua, G. Organoid based personalized medicine: from bench to bedside. Cell Regeneration. 9 (1), 21 (2020).
  9. Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
  10. Rizzo, G., Bertotti, A., Leto, S. M., Vetrano, S. Patient-derived tumor models: a more suitable tool for pre-clinical studies in colorectal cancer. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research. 40 (1), 178 (2021).
  11. Usai, A., et al. Zebrafish patient-derived xenografts identify chemo-response in pancreatic ductal adenocarcinoma patients. Cancers. 13 (16), 4131 (2021).
  12. Usai, A., et al. A model of a zebrafish avatar for co-clinical trials. Cancers. 12 (3), 677 (2020).
  13. Chen, X., Li, Y., Yao, T., Jia, R. Benefits of zebrafish xenograft models in cancer research. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 616551 (2021).
  14. Miserocchi, G., et al. Management and potentialities of primary cancer cultures in preclinical and translational studies. Journal of Translational Medicine. 15 (1), 229 (2017).
  15. Baghban, R., et al. Tumor microenvironment complexity and therapeutic implications at a glance. Cell Communication and Signaling. 18 (1), 59 (2020).
  16. Albini, A., et al. Cancer stem cells and the tumor microenvironment: interplay in tumor heterogeneity. Connective Tissue Research. 56 (5), 414-425 (2015).
  17. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196 (2012).
  18. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nature Medicine. 19 (11), 1423-1437 (2013).
  19. Tavares Barroso, M., et al. Establishment of pancreatobiliary cancer zebrafish avatars for chemotherapy screening. Cells. 10 (8), 2077 (2021).
  20. Kopetz, S., Lemos, R., Powis, G. The promise of patient-derived xenografts: the best laid plans of mice and men. Clinical Cancer Research. 18 (19), 5160-5162 (2012).
  21. Xing, F., Saidou, J., Watabe, K. Cancer associated fibroblasts (CAFs) in tumor microenvironment. Frontiers in Bioscience. 15 (1), 166-179 (2010).
  22. Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments-a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
  23. Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4 (9), 998-1013 (2014).

Tags

חקר הסרטן גיליון 195 אווטאר דג זברה מודל פרה-קליני ניסוי קו-קליני השתלת גידולים רגישות לכימותרפיה אימונופלואורסנציה בהר שלם
הקמת קסנוגרפטים מסרטן הלבלב שמקורם בדגי זברה לבדיקת רגישות לכימותרפיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Usai, A., Di Franco, G., Gabellini,… More

Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. Establishment of Zebrafish Patient-Derived Xenografts from Pancreatic Cancer for Chemosensitivity Testing. J. Vis. Exp. (195), e63744, doi:10.3791/63744 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter