Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

direkte måling av krefter i rekonstituerte aktive mikrotubulibunter

Published: May 10, 2022 doi: 10.3791/63819
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Biological Sciences and Center for Biotechnology and Interdisciplinary Studies, Rensselaer Polytechnic Institute
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en protokoll for rekonstituering av mikrotubulibunter in vitro og direkte kvantifisering av kreftene som utøves i dem ved hjelp av samtidig optisk fangst og total intern refleksjonsfluorescensmikroskopi. Denne analysen tillater nanoskalanivåmåling av kreftene og forskyvningene som genereres av proteinensembler i aktive mikrotubulinettverk.

Abstract

Mikrotubulinettverk er ansatt i celler for å utføre et bredt spekter av oppgaver, alt fra å fungere som spor for vesikkeltransport til å fungere som spesialiserte arrays under mitose for å regulere kromosomsegregering. Proteiner som interagerer med mikrotubuli inkluderer motorer som kinesiner og dynein, som kan generere aktive krefter og retningsbestemt bevegelse, samt ikke-motoriske proteiner som kryssbinder filamenter i høyere ordens nettverk eller regulerer filamentdynamikk. Til dags dato har biofysiske studier av mikrotubuli-assosierte proteiner overveldende fokusert på rollen som enkeltmotorproteiner som trengs for vesikkeltransport, og det er gjort betydelige fremskritt i å belyse de kraftgenererende egenskapene og mekanokjemisk regulering av kinesiner og dyneiner. For prosesser der mikrotubuli fungerer både som last og spor, for eksempel under filamentglidning i den mitotiske spindelen, forstås imidlertid mye mindre om den biofysiske reguleringen av ensembler av de tverrbindende proteinene som er involvert. Her beskriver vi vår metodikk for direkte sondering av kraftgenerering og respons innen tverrbundne mikrotubuliminimale nettverk rekonstituert fra rensede mikrotubuli og mitotiske proteiner. Mikrotubulipar er tverrbundet av proteiner av interesse, en mikrotubuli er immobilisert til et mikroskopdeksel, og den andre mikrotubulien manipuleres av en optisk felle. Samtidig total intern refleksjonsfluorescensmikroskopi muliggjør flerkanals visualisering av alle komponentene i dette mikrotubulinettverket når filamentene glir fra hverandre for å generere kraft. Vi demonstrerer også hvordan disse teknikkene kan brukes til å sondere skyvekrefter som utøves av kinesin-5-ensembler og hvordan viskøse bremsekrefter oppstår mellom glidende mikrotubulipar tverrbundet av det mitotiske MAP PRC1. Disse analysene gir innsikt i mekanismene for spindelmontering og funksjon og kan tilpasses bredere for å studere tett mikrotubulinettverksmekanikk i ulike sammenhenger, for eksempel akson og dendritter av nevroner og polare epitelceller.

Introduction

Celler benytter mikrotubulinettverk for å utføre et bredt spekter av mekaniske oppgaver, alt fra vesikkeltransport 1,2,3 til kromosomsegregering under mitose 4,5,6. Mange av proteinene som interagerer med mikrotubuli, som de molekylære motorproteinene kinesin og dynein, genererer krefter og reguleres av mekaniske belastninger. For bedre å forstå hvordan disse kritiske molekylene fungerer, har forskere brukt biofysiske metoder med ett molekyl, for eksempel optisk fangst og TIRF-mikroskopi, for direkte å overvåke kritiske parametere som lossede trinnhastigheter, prosessivitet og krafthastighetsforhold for individuelle proteiner. Den mest brukte eksperimentelle geometrien har vært å feste motorproteiner direkte til fangstperler hvis sfæriske geometri og størrelse etterligner vesikler som gjennomgår motordrevet transport. Tallrike kinesiner, inkludert kinesin-1 7,8,9, kinesin-2 10,11,12, kinesin-313,14,15,16 kinesin-517,18, kinesin-8 19,20, samt dynein og dynein komplekser21,22, 23,24,25, har blitt studert med disse metodene.

I mange cellulære prosesser bruker imidlertid motoriske og ikke-motoriske proteiner mikrotubuli både som spor og last26,27. Videre, i disse scenariene hvor mikrotubulifilamenter er tverrbundet til høyere ordens bunter, fungerer disse proteinene som ensembler i stedet for enkeltenheter. For eksempel, innenfor deling av somatiske celler, organiserer tette filamentnettverk seg selv for å bygge det mitotiske spindelapparatet28,29,30. Det interpolare spindelmikrotubulinettverket er svært dynamisk og er i stor grad ordnet med minus-ender som peker mot spindelpolene og plussendene overlappende nær spindelekvator. Filamenter i spindelen er tverrbundet av motoriske proteiner som kinesin-5 31,32,33, kinesin-12 34,35,36 og kinesin-1437,38,39, eller av ikke-motoriske proteiner som PRC1 40,41,42,43 eller NuMA 44,45, 46. De beveger seg ofte eller opplever mekanisk stress under prosesser som poleward flux eller mens de koordinerer kromosomsentrering under metafase eller kromosomsegregering under anafase 47,48,49,50,51,52. Integriteten til mikronskala spindelapparatet gjennom mitose er derfor avhengig av en nøye regulert balanse mellom skyve- og trekkkrefter generert og opprettholdt av dette nettverket av samvirkende filamenter. Imidlertid har verktøyene som trengs for å undersøke denne mekaniske reguleringen og forklare hvordan proteinensembler jobber sammen for å koordinere mikrotubulibevegelser og produsere kreftene som trengs for å montere spindelen riktig, bare nylig blitt utviklet, og vi begynner bare å forstå de biofysiske reglene som definerer dynamiske mikrotubulinettverk.

Målet med dette manuskriptet er å demonstrere trinnene som kreves for å rekonstituere tverrbundne mikrotubulipar in vitro, immobilisere disse buntene i et mikroskopikammer som muliggjør samtidig fluorescensvisualisering av både mikrotubuli og tverrbindingsproteiner og nanoskala kraftmåling, og behandle disse dataene robust. Vi beskriver trinnene som trengs for å stabilt polymerisere fluorescensmerkede mikrotubuli, forberede mikroskopdeksler for vedlegg, forberede polystyrenperler for optiske fangsteksperimenter og montere tverrbundne filamentnettverk som bevarer deres in vivo-funksjonalitet samtidig som de tillater direkte biofysisk manipulasjon.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fremstilling av mikrotubuli

MERK: Ved bruk av GFP-merkede tverrbindingsproteiner, rød (f.eks. Rhodamin) og langt rød (f.eks. Biotinylert HiLyte647, referert til som biotinylert langt rød i resten av teksten), fungerer organisk fluoroformerking av mikrotubuli bra. Minimal krysstale mellom alle tre kanalene kan oppnås under avbildning ved å bruke et høykvalitets firebånds TIRF-filter (Total Internal Reflection Fluorescence).

  1. Forbered GMPCPP mikrotubulifrølagre
    1. Suspender 1 mg umerket lyofilisert tubulin i 84 μL iskald 1x BRB80 (80 mM PIPES, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA; pH 6,8), med DTT tilsatt til en endelig konsentrasjon på 1 mM like før bruk. Suspender 60 μg fluoroformerket lyofilisert tubulin i 6 μL kald 1x BRB80 med 1 mM DTT. Suspender 60 μg biotinmerket lyofilisert tubulin i 6 μL kald 1x BRB80 med 1 mM DTT.
    2. For å fremstille ikke-biotinylert rhodaminmerket tubulinfrøbestand med et merkeforhold på 1:10, tilsett 84 μL umerket tubulin, 6 μL fluoroformerket tubulin og 10 μL 10 mM GMPCPP-stamløsning til et 0,5 ml rør. Bland godt ved forsiktig pipettering og hold på is.
      MERK: GMPCPP-polymerisasjon foretrekkes for disse analysene, da mikrotubuli er mer stabile og mottagelige for direkte manipulering med den optiske fellen enn hvis polymerisert med GTP eller hvis taxol utelates.
    3. For å forberede biotinylert langt rødmerket tubulinfrøbestand med et fluorescerende merkingsforhold på 1:10, tilsett 80 μL umerket tubulin, 6 μL fluoroformerket tubulin, 4 μL biotinmerket tubulin og 10 μL 10 mM GMPCPP-lagerløsning i et 0,5 ml rør. Bland godt ved forsiktig pipettering og hold på is. Inkuber frøbestanden på is i 5 min.
    4. Overfør tubulinoppløsningen til et polykarbonatrør som er egnet for høyhastighets sentrifugering. Sentrifuge frøstammen ved ~ 350 000 x g i 5 minutter ved 2 ° C for å forhindre mikrotubulipolymerisering og gjenvinne supernatanten for aliquoting. Den endelige estimerte konsentrasjonen av tubulin på dette stadiet er ~ 50 μM.
    5. Bruk 0,2 ml PCR-rør, lag 2 μL aliquots av frømassen og flash frys med flytende nitrogen. Aliquots kan oppbevares ved -80 °C i inntil 6 måneder.
  2. Polymerisering av mikrotubuli
    1. Forbered 500 μL 1x BRB80 og legg på is. Plasser en hver av de biotinylerte langt røde og ikke-biotinylerte rhodaminfrølagrene på is for å tine.
    2. Inkuber frøbestandene på is i 5 min. På slutten av inkubasjonsperioden tilsettes umiddelbart 26 μL 1x BRB80 til hvert rør. Hvis lengre mikrotubuli er ønsket, øk volumet av BRB80 med 5-10 μL, mens for kortere mikrotubuli reduserer volumet for polymerisering med 5 μL.
    3. Inkuber mikrotubulifrølagrene i 1 time ved 37 ° C i et vannbad. Kombiner 298,5 μL romtemperatur 1x BRB80 og 1,5 μL 4 mM taxol stamløsning for å produsere en 20 μM taxolløsning. Forbered 300 μL 1x BRB80 og hold begge rørene ved romtemperatur.
    4. Varm en passende høyhastighetsrotor til 30 °C. Dette kan gjøres i en bordplate ultracentrifuge satt til 30 °C. Fjern mikrotubuli fra vannbadet og hold ved romtemperatur på en benk i 10-15 min.
  3. Avklaring av mikrotubuli
    1. Tilsett 100 μL romtemperatur 1x BRB80 til mikrotubulivekstløsningen og bland ved å flikke på røret ~10 ganger eller forsiktig pipettere. Overfør mikrotubulivekstløsningen til et polykarbonatsentrifugerør.
    2. Merk den ene siden av polykarbonatrøret, som vender utover i forhold til sentrifugens rotasjon. Dette vil hjelpe til med å finne mikrotubulipelleten, som knapt vil være synlig på grunn av det lille volumet av materiale.
    3. Sentrifuge mikrotubulioppløsningen ved ~350 000 x g i 10 minutter ved 30 °C. Etter sentrifugering, inspiser røret som inneholder mikrotubuli for en pellet hvis mulig. Fjern alle unntatt de siste mikroliterne væske forsiktig, uten å forstyrre pelleten. Hvis pelleten ikke er godt synlig, bruk merkingen som er laget som en veiledning for å unngå å forstyrre området der pelleten ligger.
    4. Tilsett umiddelbart 100 μL 1x BRB80 + 20 μM taxol til mikrotubulirøret. Dette kan legges direkte på pelleten; Forstyrrelse av pelleten på dette stadiet påvirker ikke avklaringsprosessen betydelig.
    5. Sentrifuge mikrotubuli igjen ved ~ 350 000 x g i 10 minutter, og vær forsiktig med å sikre at den markerte delen av røret igjen er orientert utover i forhold til sentrifugens rotasjon.
    6. Fjern alle unntatt noen få mikroliter løsning som før, igjen for å unngå å forstyrre mikrotubulipelleten. Gjenta trinn 1.3.4.-1.3.5. og deretter resuspendere mikrotubulipelleten i 20-50 μL på 1x BRB80 + 20 μM taxol.
    7. Resuspenderes ved å pipettere det meste av resuspenderingsvolumet og forsiktig kaste det direkte ut på pelleten, gjenta 20-30x eller til pelleten er helt resuspendert. Dette bør gjøres med forsiktighet for ikke å skjære mikrotubuli ved altfor kraftig pipettering. Kutting av pipettespissen for å øke størrelsen på åpningen kan også være nyttig for å redusere klipping av mikrotubuli.
    8. Oppbevar mikrotubuli ved romtemperatur ved å pakke røret i folie for å beskytte fluoroforene mot lys og holde på benken. Mikrotubuli er vanligvis brukbare i 2-3 dager etter avklaring.
  4. Vurdering av mikrotubuli gjennom mikroskopi
    1. Forbered en 1:10 fortynning av den klargjorte mikrotubulioppløsningen ved å blande 1 μL mikrotubuli og 9 μL romtemperatur 1x BRB80. Avbild umiddelbart denne løsningen ved å pipettere 10 μL på et mikroskopglass og deretter plassere et deksel over dråpen for å danne en squash.
    2. Sørg for at mikrotubuli som varierer i lengder fra 8-25 μm ved høy tetthet (flere hundre per fullt synsfelt lagdelt i et tett nett) er synlige når de visualiseres ved hjelp av fluorescensmikroskopi og et 100x mål fokusert på dekseloverflaten i kontakt med fortynningen av mikrotubuli.

2. Utarbeidelse av passiverte deksler

  1. Vask coverslips
    1. Plasser 18 mm x 18 mm deksler i ikke-reaktive plaststativer, og legg deretter hvert stativ i et 100 ml beger. Plasser en dekselslipp per spor i stativene, da rengjøring av begge sider av dekslene er nødvendig.
    2. Sonicat ved bruk av en badsonikator i 5 minutter, ved bruk av 50 ml av følgende løsninger i den rekkefølgen som er gitt for hver sonikeringssyklus: (1) avionisert vann (med 18,3 MΩ cm resistivitet), (2) 2% Micro-90-løsning, (3) avionisert vann, (4) nytilberedt 0,1 M KOH, (5) avionisert vann (figur 1A). Forsikre deg om at dekslene er helt dekket av væske. Mellom sonikeringssykluser, skyll hvert stativ med deksler i avionisert vann ved å bruke pinsett til å dyppe stativet opp og ned 10-20x i avionisert vann, erstatte vannet og gjenta skylleprosessen 2x.
    3. Skyll dekslene 3x i vann, fyll deretter begeret med 100% etanol og sett stativene tilbake til begeret. Flytt begerglassene inn i en avtrekkshette og legg ut nok vevservietter til å gi plass til alle dekselene. Fjern deretter stativene med pinsett og legg på vevsserviettene.
    4. Bruk en tørr nitrogengassstrøm, blås etanolen fra dekslene og stativene til de er tørre. Kast den gjenværende etanolen fra begerglassene og tørk dem på samme måte ved hjelp av den tørre nitrogengasstrømmen (figur 1A).
  2. Aminosilane overflatefunksjonalisering på coverslips
    1. Forbered (3-Aminopropyl) tiethoxysilan (APTES) reagensoppløsning ved å tilsette 40 ml aceton og 400 μL APTES-reagens til et 50 ml konisk rør, kappe tett og blande ved å invertere 10x.
    2. Flytt ett stativ med deksler inn i det tilsvarende tørre begeret, og senk deretter helt ned i APTES-løsningen. Inkuber i 5 minutter (figur 1A). Flytt det APTES-behandlede stativet til et nytt tørt beger, og flytt et nytt stativ inn i APTES for å ruge i 5 m.
    3. Skyll det behandlede stativet med avionisert vann ved å dyppe stativet 10-20x som beskrevet i trinn 2.1.2., og erstatt vannet 5x. Gjenta til alle dekslene er behandlet og vasket.
  3. PEGylering av aminosilane overflate
    1. Forbered to PEG-løsninger, en på ~ 100 μL med 25% w / v PEG og en annen på ~ 10 μL med 10% w / v biotin-PEG, begge suspendert i nytilberedte 0,1 M NaHCO3, tilstrekkelig til å belegge 24 coverslips. Sentrifuge 25% PEG-løsningen ved 3000 x g i 20 s når 0,1 M NaHCO3 er tilsatt for å oppløse PEG-pinnen helt; Oppløsningen kan forbli uklar. Bland biotin-PEG ved skånsom pipettering (figur 1B).
    2. Forbered en blanding av PEG- og biotin-PEG-løsningene, med 33,3 ganger volum PEG til 1 volum biotin-PEG (f.eks. 100 μL PEG-løsning og 3 μL biotin-PEG-løsning).
    3. Legg ut flere sterile og lofrie våtservietter i en avtrekkshette. Flytt dekselstativene på våtserviettene og tørk med en tørr nitrogengasstrøm som før. På flere nye og tørre våtservietter legger du ut de nå helt tørkede dekslene arrangert parvis og merker hver nederst til høyre med et asymmetrisk symbol som "b". Denne merkingen vil være motsatt prøveflaten på dekselet og vil ikke forstyrre eksperimentet (figur 1B).
    4. Vend en coverslip i hvert par med pinsett. På hver vendt deksel, plasser 6 μL PEG / biotin-PEG-blanding og legg den andre dekselet på toppen slik at begge "b" -etikettene vender utover.
    5. Juster dekselkantene, og plasser det i et fuktet og lufttett kammer for å forhindre tørking. Inkuber dekslene i fuktighetskammeret ved romtemperatur i 3 timer.
    6. Etter inkubasjon, fjern dekslene fra fuktighetskammeret, skill forsiktig dekselet, og legg dem tilbake i stativene. Vask hvert stativ i avionisert vann som før, dypp stativene med pinsett 10-20x og bytt ut vannet totalt 5x.
    7. Plasser alle PEGylated sider av coverslips vendt i samme retning, slik at ingen to PEGylated coverslip overflater vender mot hverandre. Den PEGylerte overflaten vil være veldig klebrig til den tørker helt, så vær ekstra forsiktig for å forhindre at dekslene berører hverandre. Tørk hvert stativ og deksel som før med en tørr nitrogengasstrøm (figur 1B).
    8. Når dekslene og stativene er tørket helt, oppbevares de i en vakuumtørker for å forhindre nedbrytning av overflatebelegget. Riktig lagret under vakuum og med tørkemiddel for å forhindre fuktighet i å forstyrre PEG-belegget; Coverslips kan brukes i ca 1 uke.

3. Tilberedning av kinesinbelagte perler

  1. Valg og forberedelse av rigor kinesin konstruksjon
    1. Uttrykke og rense rigor kinesin konstruerer i henhold til publiserte protokoller53,54. Flash fryse 5 μL aliquots av 0,02 mg / ml kinesin løsninger og lagre ved -80 ° C i opptil 1 år.
      MERK: Rigor kinesinproteiner har en G234A-punktmutasjon som forhindrer ATP-hydrolyse. Når de konjugeres til mikroperler, tillater interaksjoner med høy affinitet med mikrotubuli perler å opprettholde belastninger på 10-20 pN i flere minutter. Rigor muterte versjoner av både den vanlige kinesin-1 homodimer K56053 og en ytterligere optimalisert K439 konstruksjon 55 har også blitt brukt med suksess i disse analysene54. Denne forbedrede K439-konstruksjonen inneholder et EB1-dimeriseringsdomene for å forbedre stabiliteten og en C-terminal 6-He-tag for spesifikk binding til et 6-He-antistoff, som beskrevet nedenfor.
  2. Binding 6-Hans antistoff mot streptavidin-belagte perler
    1. Tilsett 50 μL 1 μm diameter streptavidinbelagte polystyrenperler i et 0,5 ml sentrifugerør. Sonicate for 30 s.
    2. Tilsett 10 μL 200 mM DTT til 790 μL 1x BRB80. Tilsett 10 μL sonikerte perler til 40 μL av denne 1x BRB80 + 2,5 mM DTT-bufferen.
    3. Kombiner 1 μL biotinylert 6-His antistoff og 49 μL 1x BRB80 + 2,5 mM DTT; vortex kort å blande.
    4. Kombiner 50 μL fortynnet perleblanding og 50 μL antistofffortynning i et nytt rør. Plasser røret i en rørrotator ved 4 °C og roter i 1 time. Spinn ned perleblandingen i 10 minutter ved 3000 x g ved 4 °C.
    5. Pipetter av supernatanten og resuspender pelleten i 100 μL 2 mg/ml kaseinoppløsning i 1x BRB80. Gjenta denne sentrifugeringen og resuspendering 2x.
  3. Tilsetning av rigor kinesin
    1. Bland den endelige pelleten i 100 μL 2 mg/ml kaseinoppløsning. I et 0,5 ml sentrifugerør kombinerer du 5 μL 0,02 mg / ml rigorkinesin og 5 μL perler, blander forsiktig ved å slå lett på røret ~ 10x.
    2. Hold både K439 G234A perlesuspensjon og de resterende 6-His perlene på rotoren ved 4 ° C når den ikke er i bruk. Perler må tilberedes ferske og brukes samme dag til forsøkene, da de har en tendens til å klumpe seg og miste aktivitet utover denne tiden.

4. Montering av mikroskopikammeret

  1. Forberedelse av glassglass og kammerkonstruksjon
    1. Skyll 75 mm x 25 mm mikroskopglass lysbilder først med ultrarent vann, etterfulgt av ikke-strek ammoniakk-d glassrenser, og deretter igjen med ultrarent vann. Rist for å fjerne overflødige vanndråper. Tørk lysbildene med en nitrogenstrøm slik at det ikke er noen striper igjen, og legg lysbildene ned på et papirhåndkle (figur 2A).
    2. Med saks, kutt dobbeltsidig tape i strimler på ~ 2-3 mm x 2,5 cm (2 strimler per enkeltkammer og 3 per dobbeltkammer).
    3. Bruk tang til å legge to båndstrimler på ett glassglass slik at det er ~ 0,5 cm mellomrom mellom dem for å konstruere et enkelt kammer. For doble kamre, bruk samme avstand, men med tre båndstrimler (figur 2B). Volumet av prøvekanalen ved bruk av denne metoden er ca. 10 μL.
      MERK: Jo bredere kammeret (e), desto mer sannsynlig er det at bobler dannes når løsninger strømmes inn; Kamre som er mindre enn 0,5 cm brede kan imidlertid være utfordrende å bruke på grunn av det reduserte området for avbildning.
    4. Skrap over lengden på hver stripe tape ved hjelp av tang slik at båndet er godt festet til glassglasset.
    5. Slipp trykket fra tørkemidlet og bruk tang for å fjerne en biotinylert deksel fra et lagringsstativ. Plasser en biotinylert deksel på toppen av glassglasset ved hjelp av tang. Forsikre deg om at den biotinylerte siden vender innover, mot glassglasset.
    6. Bruk den flate bakenden av tangenden, og trykk forsiktig på glasset der dekselet berører båndet for å forsegle kamrene sikkert. Det må brukes lett trykk for å sikre at dekselet ikke sprekker (figur 2C).
    7. Oppbevar de ferdige mikroskopikamrene i en lufttett beholder, vekk fra direkte lys, til bruk (figur 2D).
      MERK: Det anbefales å bruke kamre samme dag som de er laget, da de biotinylerte dekslene nedbrytes når de utsettes for luft.
  2. Innstrømning av mikroskopireagenser
    1. Konstruer et fuktighetskammer ved å plassere et sammenbrettet lofritt vev fuktet med ultrarent vann i bunnen av en tom pipettespissboks. Prøvekamrene skal oppbevares i denne boksen mellom innstrømningstrinn for å redusere fordampning av løsninger fra kanalen.
    2. Introduser alle reagensene ved å pipettere væsken i den ene enden av kanalen og transportere væske ut i motsatt ende. For å veke, vri den ene enden av vevet og legg det forsiktig på utgangssiden av kammeret, slik at kapillærvirkningen kan fordele reagenset homogent (figur 3A). Bring alle reagenser til romtemperatur like før de strømmer inn for å forhindre depolymerisering av mikrotubuli.
    3. Bruk en 20 μL vinklet pipettespiss slik at den berører inngangssiden av ett kammer, flyt sakte i 10 μL på 0,5 mg / ml streptavidin eller Neutravidin. Bruk mindre pipettespisser og en langsom, konstant innstrømning av reagenser for å redusere sannsynligheten for å få bobler i kammeret (figur 3B).
    4. Inkuber lysbildet i fuktighetskammeret i 4 minutter med dekselsiden av kammeret vendt ned. Denne orienteringen vil tillate større gjenstander, for eksempel mikrotubuli eller perler, å synke nær PEGylated overflaten.
    5. Skyll ut kammeret med 20 μL 1x BRB80, ved hjelp av et lofritt vev for å trekke ut væsker. Hvis det er en lekkasje tilstede i kammeret, kast lysbildet og start med en annen; Små bobler som oppstår i kammeret vil ikke påvirke bildebehandlingen skadelig.
    6. Gjenta innstrømnings-, inkubasjons- og spyletrinnene med 10 μL 0,5 mg/ml kaseinblokkerende oppløsning (figur 3C). Fortynn biotinylerte langt røde mikrotubuli ~ 1:20 og flyt 10 μL inn i kammeret. Inkuber i 5 minutter og skyll kammeret med 20 μL 1x BRB80 (figur 3D). Den optimale tettheten av disse mikrotubuli innenfor et 100 μm x 100 μm bildefelt bør være 10-20; og fortynningen på dette stadiet bør justeres for å oppnå dette overflatebindende forholdet.
    7. Gjenta innstrømnings-, inkubasjons- og spyletrinnene med 10 μL av en passende konsentrasjon (typisk 1-10 nM) tverrbindingsmotor eller ikke-motorisk protein som skal studeres (figur 3E).
    8. Flyt i 10 μL rhodaminmikrotubuli fortynnet til en lignende konsentrasjon som de tidligere biotinylerte langt røde mikrotubuli. Gjenta inkubasjons- og spyletrinnene (figur 3F).
    9. Kombiner 1 μL rigor kinesinbelagte perler og 19 μL reaksjonsbuffer optimalisert for tverrbindingsproteinaktivitet. For eksempel, for analyse av kinesin-5-aktivitet, bruk reaksjonsbuffer med 1 mM TCEP-bindingsbryter, 0,2 mg / ml alfa-kasein, 70 mM KCl, oksygenscavenging-system (4,5 mg / ml glukose, 350 enheter / ml glukoseoksidase, 34 enheter / ml katalase), 1 mM DTT og ATP ved ønsket konsentrasjon (f.eks. 1 mM for maksimale kinesinhastighetsforhold) i 1x BRB80 (figur 3G ). For analyse av ikke-motoriske proteiner, utelat ATP og varier konsentrasjonen av KCl for å modulere protein-mikrotubuli-interaksjonsstyrken i disse analysene.
    10. Forsegl begge kantene av kammeret med klar neglelakk og vent til neglelakken tørker før avbildning (figur 3H). Et vellykket konstruert kammer vil ikke ha noen lekkasje tilstede og minimale bobler.

5. Imaging mikrotubulibunter med 3-fargers TIRF

  1. Bruk et omvendt mikroskopinstrument som har TIRF-bildeegenskaper, og som en optisk felle med én stråle er konstruert i (figur 4).
    MERK: For studiene beskrevet her, ble et omvendt mikroskop brukt med en 100x / NA1.49 oljeobjektivlinse, TIRF-modul og tre lasere ved henholdsvis 488 nm, 561 nm og 640 nm for GFP-merket protein, rhodaminmerkede mikrotubuli og biotinylerte langt rødmerkede mikrotubuli.
    1. Tilsett en dråpe nedsenkningsolje på dekselet til prøvekammeret. Overdreven olje kan skade mikroskopmålet. Med dekselsiden av prøvekammeret vendt nedover, plasser prøven som skal avbildes på mikroskopplattformen.
    2. Ta sakte målet opp slik at det er kontakt mellom både dekselet og målet gjennom oljen. Juster målhøyden slik at dekkflaten på prøvekammeret er i fokus.
    3. Ta enkeltbilder av eksemplet i alle tre kanalene. For eksperimentene her, bruk 100-200 ms eksponering som en optimal bildevarighet på tvers av alle tre kanalene; Lengre eksponeringstider kan føre til økt fotobleking.
    4. Juster lasereffekten for å oppnå et godt signal-til-støy-forhold fra prøvene, samtidig som du minimerer fotobleking over 2-5 minutter når den enkelte bunten analyseres. For laseren som brukes her (figur 4 og figur 5), bruk en lasereffekt på 5 mW for GFP-kanalen og 3 mW for begge mikrotubulikanalene som optimal.
      MERK: Vellykkede sammensatte bunter skal bestå av en overflateimmobilisert mikrotubuli i den langt røde kanalen, en coextensive region av flere mikron med signifikant GFP-proteinsignal, og en rhodaminmikrotubuli som overlapper disse regionene og deretter strekker seg flere mikron bort fra bunten (figur 5B, C og figur 6 ). Levende avbildning av rhodaminmikrotubuli bør avsløre subtile svingninger ved den ikke-tverrbundne mikrotubulienden, noe som indikerer at dette filamentet ikke er festet til overflaten eller andre proteiner i kammeret.
    5. Vær oppmerksom på hyppigheten av mikrotubulibunter per synsfelt. For en vellykket forberedt prøve bør det være omtrent 3-4 mikrotubulibunter tilstede per 100 μL x 100 μL synsfelt per kammer.

6. Utføre optiske felleeksperimenter på mikrotubulibunter

  1. Preeksperimentell kalibrering av forhold
    1. For å utføre disse eksperimentene, bruk en enkeltstråle optisk felle med en stivhet på 0,05-0,1 pN / nm. Inkorporer fangstoptikken og den posisjonsfølsomme fotodetektoren i et TIRF-kompatibelt invertert mikroskop ved å introdusere henholdsvis kortpassfiltre rett under målet og over kondensatoren (figur 4).
    2. I tillegg legger du til et nanopositioning-stadium som prøven sitter på, slik at brukeren kan flytte mikrotubuli med nanometerskala presisjon på en kontrollert måte under disse analysene. Systemet som brukes her for å skaffe representative data er beskrevet i publisert arbeid 27,53,54,56,57.
      MERK: Selv om det er utenfor omfanget av denne protokollen, er flere ressurser tilgjengelige som beskriver konstruksjonen og kalibreringen av en enkeltstråle optisk felle58,59,60.
    3. Vær oppmerksom på tettheten av perler i prøven ved hjelp av en brightfield- eller DIC-kanal og 100x-målet på mikroskopet. Bruk bare brightfield-mikroskopi til å identifisere og manipulere perler og ikke samtidig ta opp med fluorescensbildeopptak. Plasser perlene til å være minst 10 μm fra hverandre i gjennomsnitt, og sørg for at de er fri for noen form for overflatebegrensning eller vedlegg og ikke er festet til hverandre eller på annen måte klynger.
    4. Forsikre deg om at de biotinylerte, langt røde mikrotubuli er godt festet til overflaten av dekselet, uten synlig brownsk bevegelse, for eksempel bevegelser langs mikrotubuliaksen eller frie ender av mikrotubuli som svinger i oppløsning.
    5. Sørg for at rhodaminmikrotubuli er festet til biotinylerte mikrotubuli via tverrbindingskartet og er synlig svingende i de frie endene. Overflatefesting av ikke-biotinylerte mikrotubuli indikerer ofte at PEGylering kan ha vært mislykket eller at PEG-belegget har forringet.
  2. Glidende målinger av motordrevet mikrotubuli
    1. Uttrykk og rens motorproteinet av interesse etter publiserte protokoller. For eksempel har full lengde GFP-merkede kinesin-5-proteiner blitt vellykket renset og anvendt i disse analysene 53,61, samt umerket kinesin-1262 og kinesin-1463. Sett sammen og visualiser tverrbundne motorproteinbunter som beskrevet ovenfor i trinn 4 og 5.
    2. Ta opp med den optiske fellen en gratis enkeltperle i løsning som viser brownsk bevegelse. Juster overlappingsoptikken etter behov for å flytte perlen til midten av synsfeltet. Forsikre deg om at det reflekterte interferensmønsteret fra fellestrålen er symmetrisk, og juster trapoptikken for å løse eventuelle asymmetrier i strålen.
    3. Flytt prøvetrinnet slik at den frie enden av en rhodaminmikrotubuli i et bunt er rett under perlen, og perlen er flere mikron vekk fra overlappingsområdet som inneholder tverrbindingsproteiner for å minimere fellestråleindusert fotobleking. Senk perlen i Z-aksen til den kolliderer med mikrotubuli. Pass på å senke perlen forsiktig, og ikke skyv perlen mot dekseloverflaten, da dette kan føre til at den fester seg til dekseloverflaten.
    4. Slå kort av fellen for å observere med brightfield-kanalen motiliteten til perlen festet til glidemikrotubuli. Når du utfører motorproteinanalyser, vil den vedlagte perlen bevege seg retningsbestemt når mikrotubuli glir fra hverandre. Aktiver fellen på nytt og fang opp perlen igjen.
    5. Begynn å registrere fluorescensdata i de tre (488 nm, 561 nm, 640 nm) kanalene med en hastighet på 1-2 bilder per s ved hjelp av lasereffekten og eksponeringstidene som ble optimalisert i trinn 5 ovenfor.
    6. Ved hjelp av programvaren for overlapping kan du registrere spenningsdata fra den posisjonsfølsomme fotodetektoren (X-, Y- og SUM-intensitetssignaler), nanoposisjoneringstrinnet (X-, Y- og Z-koordinatene) og TIRF-kameraets lukkertilstand. Begynn å digitalisere disse fellespenningsverdiene ved hjelp av et dedikert datainnsamlingskort for spenningsinngang kontrollert av passende programvare (for eksempel spesialskrevet LabView-kode) med en hastighet på 1-10 kHz, avhengig av eksperimentelle krav.
    7. Overvåk kraftsignalet etter hvert som data samles inn, og vær nøye med eventuelle uregelmessigheter som kan forstyrre vellykket datainnsamling.
      MERK: Anomaliene inkluderer, men er ikke begrenset til, (1) andre perler som beveger seg inn i fellen, (2) perlen som unnslipper fellen for tidlig, og (3) plutselige kraftfall og påfølgende manglende evne til å gjenopprette kraft mot fellen, noe som indikerer problemer med rigor-kinesinmolekylene på overflaten av perlen.
    8. Etter måling, deaktiver fellen for å frigjøre perlen og gjenta med en ny perle og ny mikrotubuli til det nødvendige antall eksperimentelle repetisjoner oppnås.
  3. Passive tverrbindingsmotstandsmålinger
    1. Uttrykk og rens de ikke-motoriske tverrbindingsproteinene av interesse etter publiserte protokoller. For eksempel har full lengde GFP-merket PRC1 43,54,57 og en dimerisk NuMA avkortet konstruksjon 56 blitt brukt med suksess i disse analysene. Sett sammen og visualiser de tverrbundne buntene som beskrevet ovenfor i trinn 4 og 5.
    2. Identifiser en egnet mikrotubulibunt som bare inneholder to mikrotubuli, en biotinylert med full overflatefeste og en ikke-biotinylert mikrotubuli som er delvis fri i oppløsning; dette gir en fri ende for å feste en perle og garanterer at perlen ikke er festet til den overflatebundne mikrotubuli og er justert på enten X- eller Y-aksen, slik at scenebevegelsen bare vil være langs en akse.
    3. Bruk den optiske fellen til å fange en fri perle som gjennomgår brownsk bevegelse. Når perlen er fanget, flytter du forsiktig perlen over til den valgte mikrotubulibunten, slik at ingen andre perler trekkes inn i fellen i prosessen. Sørg for at perlen er flere mikron unna overlappingsområdet som inneholder tverrbindende proteiner for å minimere fotobleking av GFP-taggen.
    4. Senk forsiktig perlen i Z-aksen til den kommer i kontakt med kanten av det frie segmentet av rhodaminmikrotubuli. Trekk forsiktig opp og flytt vinkelrett på mikrotubuliaksen for å se etter vedlegg ved å observere rhodaminmikrotubuli som bøyer seg og følger perleposisjonen. Hvis den ikke er festet, gjenta den forsiktige støtingen av perlen på mikrotubuli til den er festet.
    5. Juster forsiktig rhodaminmikrotubuli langs mikrotubuliaksen til den overflatefestede mikrotubuli ved å flytte nanoposisjoneringstrinnet og sett opp parametrene for automatisert trekking av mikrotubulibunten. Still inn retningen langs mikrotubuliens parallelle akse, still inn ønsket trekkhastighet (25-200 nm/s er et nyttig hastighetsområde), og ønsket trekktid (ca. 30 s til 2 min) avhengig av overlappingslengde.
    6. Begynn å registrere fluorescensdata i de tre (488 nm, 561 nm, 640 nm) kanalene med en hastighet på 1-2 bilder per sekund. Bruk laserkrefter og eksponeringstider optimalisert i trinn 5 ovenfor.
    7. Start automatisert scenebevegelse og ta opp fangstdata fra den posisjonsfølsomme detektoren, scenen og TIRF-kameratilstanden. Overvåk for eventuelle faktorer som kan forstyrre datainnsamlingen, som inkluderer, men er ikke begrenset til (1) en annen perle som kommer inn i fellen, (2) for tidlig tap av kryssbinding av mikrotubuli eller (3) perleløsrivelse fra rhodaminmikrotubuli.
    8. Deaktiver fellen for å frigjøre perlen og gjenta eksperimentet etter ønske. Et typisk prøvekammer kan brukes i ca. 30 minutter før nedbrytning av buntene og tap av proteinaktivitet oppstår.
      MERK: Nedbrytningseffekter vil variere etter tverrbinding som brukes, men kan manifestere seg som dannelse av statisk puncta på enten mikrotubuli eller overflate, tap av mikrotubulifluktuasjoner som indikerer ikke-spesifikk binding, eller manglende evne til stabilt å feste perler til mikrotubuli.

7. Analyse av data og korrelasjon av fluorescensbilder med optiske felleposter

MERK: For å optimalisere datainnsamlingen er det fordelaktig å bruke to separate datastyringssystemer: en for den optiske fangstprogramvaren og en annen for fluorescensbilder. Dette oppsettet muliggjør høyhastighets datainnsamling i både eksperimentelle modaliteter og eliminerer nano- og mikrosekundforsinkelser i driftsutførelsen som blir introdusert til dataene, noe som kan oppstå når du bruker en enkelt CPU.

  1. Digitaliser de optiske fangstdataene med en hastighet som er optimalisert for de brukte motoriske eller ikke-motoriske tverrbindingsproteinene og deres forventede tråkkhastigheter (f.eks. vanligvis mellom 1-10 kHz).
  2. Ta opp X-, Y- og SUM-spenningssignaler fra den posisjonsfølsomme fotodetektoren, samt X-, Y- og Z-posisjonsdataene til nanoposisjoneringstrinnet ved hjelp av dedikert programvare for å kontrollere den optiske fellen og ta prøver av de digitale spenningssignalene fra disse komponentene.
  3. Ta opp det digitale signalet fra lukkeren fra kameraet med en ekstra spenningsinngangskanal på det optiske fangstdatainnsamlingskortet. Dette muliggjør korrelasjon av fluorescensbildedataene med de optiske fangsttidssporene. Begynn datainnsamlingen med den optiske fellen før bildestart slik at kamerasignalet fra det første bildet blir riktig registrert.
  4. Gjennomsnittlig råtidsseriedataene som samles inn ved høye samplingsfrekvenser ved hjelp av en passende filtreringsmetode, for eksempel skyvevindu, medianfilter eller Gauss-filter, avhengig av behov.
  5. Kvantifiser tidsseriedataene for fluorescensbilder ved hjelp av metoder som linescan-analyse, der pikselintensitetsverdien langs lengden på mikrotubuliområdet beregnes. Fra disse linjenekan baner, identifiser mikrotubulikantene, og derfor overlappingsområdene. I tillegg bruker du fluorescensintensiteten fra tverrbindingsproteinkanalen for å beregne proteinlokalisering, konsentrasjon og tetthet.
  6. Korrelasjon av kraft- og bildedata er en viktig utgang av dette eksperimentelle systemet. Du kan for eksempel velge og beregne gjennomsnittet av alle kraftdatapunkter innenfor et gitt kameraeksponeringsområde (angitt med den tilsvarende digitale signaltoppen i kamerakanalen) for å sammenligne direkte med den tilsvarende fluorescensbilderammen. Deretter trekker du ut forholdet mellom kraftstørrelse og antall tverrbindingsproteiner, overlappingslengde eller tverrbindingsfordeling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fremstilling av mikrotubulibunter egnet for biofysisk analyse anses som vellykket dersom flere av de viktigste kriteriene er oppfylt. For det første bør avbildning i tre farger avsløre to justerte mikrotubuli med en konsentrasjon av tverrbindingsprotein som fortrinnsvis dekorerer overlappingsområdet (figur 5B, C og figur 6B). Ideelt sett bør avstanden mellom overlappingskanten og den frie enden av rhodaminmikrotubuli være minst 5 μm for å gi tilstrekkelig fysisk plass mellom fangststrålen og de fluorescensmerkede proteinene. For det andre bør det være minimalt bakgrunnsfluorescenssignal i regioner som mangler biotinylerte langt røde mikrotubuli, spesielt fra samme kanal som tverrbindingsproteinet er merket med. Høy bakgrunnsfluorescens indikerer dårlig coverslip passivering og en høy konsentrasjon av glassbundne proteiner, som sannsynligvis vil interagere ikke-spesifikt med mikrotubuli eller fangstperle. I tillegg antyder tilstedeværelsen av små runde puncta eller korte fragmenter sett i en av mikrotubuli-avbildningskanalene at mikrotubulipolymerisasjon og avklaring mislyktes eller at mikrotubuli var eldre eller skadet.

For det tredje bør perlene som brukes til fangst, vises som enkeltperler og ikke i klumper som inneholder mange perler. Det er sannsynlig at en liten brøkdel av perlene irreversibelt vil feste seg til overflaten, men en betydelig brøkdel bør observeres som individuelle partikler diffusert i prøvekammeret. Overdreven klumping kan ofte lindres ved å sonikere perlene i minst 10 minutter før de strømmer inn i kammeret. For det fjerde bør det å feste en perle til en mikrotubuli resultere i godt feste, med perlen igjen bundet når fangstlaserlyset er stengt. Perlene skal ikke feste seg ikke-spesifikt når de kommer i kontakt med overflaten, og når en perle er festet til mikrotubuli, bør det være mulig å manipulere lett (f.eks. bøye eller bøye) filamentet før måling. Til slutt bør det være mulig å observere endringer i overlappingslengden når kraft påføres, eller motoraktivitet får fortsette. For eksempel, hvis man observerer motorproteindrevet glidning, bør overlappingslengden reduseres med en hastighet som er i samsvar med hastigheten på motorproteintrapping. Hvis man undersøker passive tverrbindinger, bør bruk av kraft resultere i en endring i overlappingslengden. Disse utgangene indikerer at rhodaminmikrotubuli bare er festet til den overflatebundne mikrotubuli via tverrbindingsproteiner, i stedet for ikke-spesifikt å feste seg til dekseloverflaten.

Når disse kriteriene er oppfylt, er det mulig å utføre et bredt spekter av eksperimenter for å trekke ut de essensielle biofysiske parametrene som definerer ensemblemekanikk. Denne analysen eller lignende analyser har blitt brukt mye for å undersøke mitotiske tverrbindingsproteiner i tidligere studier. For eksempel har vi vist at ensembler av det essensielle mitotiske motorproteinet kinesin-5 kan regulere glidning av mikrotubuli ved å generere både skyve- og bremsekrefter som skaleres lineært med overlappingslengde64 (figur 5). Mikrotubuli i enten en antiparallel eller parallell geometri ble tverrbundet av et lite ensemble av kinesin-5 molekyler. Da disse motoriske proteinene gikk mot mikrotubuli pluss-endene, ble filamentene enten skjøvet fra hverandre (antiparallel) eller raskt svingt frem og tilbake (parallelt). Ved å overvåke mekanikken i denne minispindelgeometrien fant vi størrelsen på kraften skalert både med lengden på filamentoverlapping, samt antall tverrbindingsmotorproteiner. Når mikrotubuli ble flyttet med en hastighet raskere enn kinesin-5s lossede trinnhastighet, ga motorproteinene en resistiv bremsekraft. Det ble også funnet at C-terminalhaledomenet er nødvendig for effektiv tverrbinding og kraftgenerering61 (figur 5B, C). Proteinet i full lengde er i stand til å generere vedvarende krefter som platå når alle motorproteiner når sin individuelle stallkraft (figur 5D). Imidlertid genererer kinesin-5-motoren som mangler sin C-terminalhale maksimale krefter som er nesten fem ganger mindre i størrelse (figur 5E, F). Sammen avslører disse resultatene hvordan kinesin-5-proteiner fungerer i ensembler for å presse mikrotubuli poleward under spindelmontering og belyse den biofysiske funksjonen til essensielle regulatoriske proteindomener i molekylet.

Vi har også vist at ensembler av det ikke-motoriske mitotiske proteinet PRC1 fungerer som en mekanisk dashpot for å motstå mikrotubuliglidning i anafasespindel midtsoner54 (figur 6A-C). PRC1 genererer friksjonsmotstand som skalerer lineært med trekkhastighet, akkurat som en mekanisk dashpot produserer hastighetsavhengige resistive krefter. Disse resistive kreftene avhenger ikke av lengden på overlappingsregioner mellom mikrotubulipar eller den lokale tverrbindingstettheten, men de er sterkt avhengige av den totale konsentrasjonen av engasjerte PRC1-molekyler (figur 6D, E). Fra disse resultatene foreslås det at PRC1-ensembler fungerer som et lekkende stempel, hvor kompresjon av diffusive tverrbindinger gir en hastighetsavhengig motstand, men tapet av tverrbindinger ved mikrotubuli plus-ender lindrer store trykkkrefter.

Lignende analysegeometrier ble også brukt til å undersøke det mitotiske kinesin-12-proteinet Kif1562. Ved å måle kraften som ble produsert da mikrotubuli ble skjøvet fra hverandre, fant Reinemann et al.62 at Kif15-ensembler kan skyve fra hverandre filamenter opp til en kritisk platåkraft og kreve den C-terminale haletetherregionen av proteinet for effektivt å tverrknytte mikrotubuli og bygge vedvarende belastninger. Reinemann og medarbeidere viste også elegant at kinesin-14 HSET, et minus-end rettet kinesin, på samme måte kan gli fra hverandre antiparallelle mikrotubuli63. Når det blandes med like mengder av pluss-end-rettet kinesin-5 Eg5-protein, tjener HSET til å hemme Eg5-glideaktivitet, og engasjerer seg i en dragkamp for mikrotubuli-glidebevegelse innenfor overlappingsområdet. Sammen demonstrerer disse resultatene kraften i direkte kraftmåling på tvers av aktive mikrotubulibunter og tydeliggjør behovet for å karakterisere proteinfunksjon i den biologisk korrekte nettverksgeometrien.

Figure 1
Figur 1: Passivering av glassdeksler. (A) Skjematisk skildring av sekvensielle vasketrinn, tørking og konjugering av nr. 1.5 glassdeksler for aminosilankonjugering. (B) Skjematisk som viser protokollen for kovalent kobling av PEG- og biotin-PEG-grupper til glassdekselet, vask og tørking, og tetting av dekslene under vakuum for kortvarig lagring. Noen deler av skjemaet er modifiserte bilder fra 65. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Montering av et prøvekammer . (A) Skjematisk som viser montering av et prøvestrømningskammer ved bruk av passiverte deksler og en standard 3 i mikroskopsklie. (B) Montering og typiske dimensjoner av enkelt- og tokanals strømningskamre som er optimalisert for optisk overlapping og fluorescensavbildning av mikrotubulibunter. Noen deler av skjemaet er modifiserte bilder fra 65. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Generering av overflateimmobiliserte mikrotubulibunter for optisk overlapping og TIRF-basert avbildning. Skjemaer som viser trinnvis montering av optisk fangbare mikrotubulibunter. (A) Reagenser strømmes inn fra inngangsporten til kammeret og væske er ugudelig ut fra utgangskanalen. (B) Streptavidin (blå) binder seg først til biotin-PEG-stedene på dekselet, og (C) kasein (rød) innføres som et ekstra blokkeringsmiddel. (D) Biotinylerte langt rødmerkede mikrotubuli (magenta) blir introdusert og tillatt å inkubere i ~ 5 minutter, etterfulgt av tilsetning av (E) tverrbindingsprotein (grønt), (F) ikke-biotinylert rhodaminmerket mikrotubuli (rød), og til slutt (G) rigor kinesinbelagte mikrosfærer suspendert i riktig reaksjonsbuffer for vedlegg til bunten og optisk fellebasert manipulasjon. (H) Kammeret er forseglet med klar neglelakk for å forhindre fordampning av prøvebufferen under eksperimenter. Noen deler av skjemaet er modifiserte bilder fra 65. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Skjematisk av den optiske pinsetten/TIRF-mikroskopsystemet. En enkeltstråle optisk felle blir introdusert i den optiske banen til et målbasert TIRF-bildesystem i et omvendt mikroskop. Et kort passfilter satt inn like under målet gjør at fellestrålen kan rettes inn i den bakre blenderåpningen på målet, hvor den vil bli fokusert like over overflaten av prøvedekselet, og danner en optisk felle. En posisjonsfølsom fotodetektor vil samle det overførte lyset, noe som muliggjør posisjons- og kraftdeteksjon av perlen. Flere kanaler med fluorescensdata kan anskaffes via TIRF-avbildning og registreres på et høysensitivt EMCCD- eller sCMOS-kamera. En bredspektret lyskilde brukes til å avbilde fangstperler under oppsettet av forsøkene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Representativt eksempel på måling av kraftproduksjon ved kinesin-5. (A) Skjematisk avbildning av eksperimentell geometri, som viser mikrotubuli tverrbundet av kinesin-5 motorproteiner som genererer kraft når de skyver filamentene fra hverandre, som måles med en optisk felle. Representative fluorescensbilder av bunter sammensatt av overflateimmobiliserte mikrotubuli, GFP-kinesin-5 og rhodaminmerkede transportmikrotubuli. (B) Full lengde og (C) C-terminal hale avkortet kinesin-5 konstruksjoner ble benyttet. Skala barer = 5 μm. Prøveregistreringer av kraftproduksjon for (D) full lengde og (E) haleløs vises, med gjennomsnittlig kraft plottet som en funksjon av tid. (F) Plott av maksimal platåkraft og tilsvarende overlappingslengde for begge konstruksjonene vises, noe som avslører at kinesinkonstruksjonen i full lengde genererer overlappingslengdeavhengige krefter som er vesentlig større i størrelse enn den haleløse kinesinkonstruksjonen. Dette tallet er endret fra61. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Representativt eksempel på måling av friksjonskrefter ved PRC1. (A) Skjematisk som viser eksperimentell geometri, som viser mikrotubuli tverrbundet av GFP-PRC1 (proteinregulator av cytokinese) tverrbindingsproteiner som genererer motstand når filamentene skyves fra hverandre ved å bevege dekselet med konstant hastighet. (B) Representative tidsseriefluorescensbilder som viser den bevegelige overflate-immobiliserte langt røde mikrotubuli, GFP-PRC1-molekyler som kondenserer innenfor den krympende overlappingen, og den frie rhodaminmikrotubulien som holdes med perlen. Tidsintervall mellom rammer = 6 s; Skala bar = 5 μm. (C) Eksempel på kraftspor som viser friksjonskraft under glidehendelsen, med forstyrrelseshendelse og kraftfall til null (~ 55 sek) når overlappingen nådde 0 μm. (D) Korrelasjon av gjennomsnittlig kraft og integrert GFP-intensitet innenfor overlappingen ved fire forskjellige glidehastigheter. (E) Gjennomsnittlige skråninger og beregnede tilpasningsfeil av spor i (D) avslører at kraften per PRC1-molekyl øker lineært som en funksjon av glidehastighet. Dette tallet er endret fra66. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Mikrotubuli-nettverk brukes av utallige celletyper for å utføre et bredt spekter av oppgaver som er fundamentalt mekaniske. For å beskrive hvordan celler fungerer i både friske og sykdomstilstander, er det avgjørende å forstå hvordan disse mikron-skala nettverkene er organisert og regulert av nanometer-størrelse proteiner som kollektivt bygger dem. Biofysiske verktøy som optisk pinsett er godt egnet til å undersøke mekanokjemien til nøkkelproteiner i denne skalaen. Komplekse eksperimentelle geometrier som bruker optisk pinsett har blitt utforsket, inkludert kraftavhengige analyser av mikrotubulispissdynamikk67,68, generering av krefter av kinetochore-komponenter69,70,71, og tostråle manualfellegeometrier for å undersøke mikrotubulifilamentmekanikk72,73 . I denne protokollen har vi beskrevet nye metoder for rekonstituering av grunnleggende mikrotubulinettverksmotiver som bunter og bruk av biofysiske verktøy for enkeltmolekylfluorescensmikroskopi og optisk fangst for å vurdere kritisk informasjon om cellulær funksjon.

Selv om de fleste individuelle trinn i denne protokollen er teknisk enkle, er det til sammen mange potensielle feilpunkter som kan oppstå, og det må utvises betydelig forsiktighet på hvert punkt for å sikre vellykkede målinger. For det første, som med mange mikroskopbaserte eksperimentelle analyser av enkeltmolekyler, er riktig overflatepassivering nøkkelen, da ikke-spesifikk binding av proteiner eller perler til dekseloverflaten nesten alltid forhindrer vellykket gjennomføring av disse eksperimentene. For det andre må uttrykket og rensingen av de tverrbindende proteinene av interesse optimaliseres for å sikre produkter av høy kvalitet, ettersom forurensninger kan forstyrre analysen på mange måter, for eksempel å indusere overflødig bunting av filamenter eller forstyrre perle- og mikrotubulivedlegg, for ikke å nevne å introdusere kompleksiteter i tolkningen av kraftdata. For det tredje krever opprettholdelse av robust perle-mikrotubuli-feste høykvalitets rigor-kinesinmotorer bundet med høy tetthet til fangstperlen, slik at flere kinesin-filamentfestepunkter kan gjøres. Disse bindingene tåler 10 s pN kraft i flere minutter, noe som passer for et bredt spekter av potensielle studiesystemer som bruker denne teknikken.

Vi bemerker også at det er mange måter denne protokollen kan endres på for å passe best til sluttbrukerens instrumenterings- eller biologiske systembehov. Mens vi har beskrevet eksperimenter som bruker GFP-merkede tverrbindingsproteiner og røde / langt rødmerkede mikrotubuli, er det også mulig å bytte fluorescerende merking etter behov. For eksempel, hvis brukeren ikke har nok laserlinjer til å utføre trefarget TIRF-mikroskopi, er det mulig å få data av høy kvalitet ved differensielt å merke mikrotubuli med samme fluorofor, men bruke forskjellige konsentrasjoner (f.eks. Svak vs. lys) for hver art av mikrotubuli. På samme måte kan det ikke alltid være mulig eller fordelaktig å legge til en fluorescerende etikett til tverrbindingsproteinet. I denne situasjonen vil visse eksperimentelle opplysninger som tverrbindingskonsentrasjon eller lokalisering ikke være tilgjengelige, men bestemmelsen av parametere som mikrotubulioverlappingslengde kan fortsatt gjøres. Vi forventer at denne protokollen er svært tilpasningsdyktig for mange forskjellige typer og kombinasjoner av mikrotubuli-tverrbindingsproteiner. Innføringen av flere tverrbindingsproteiner vil sannsynligvis nødvendiggjøre enten fjerning av fluorescenskoder fra et av proteinene eller utelukkelse av fluorescerende etiketter fra en av de to mikrotubulitypene for å frigjøre bildebehandlingsmuligheter i en passende båndbredde (f.eks. Ved å bruke en rød eller langt rød proteinkodet etikett for tverrbindingsproteinet). Det er usannsynlig at mer enn tre fluorescerende kanaler kan brukes med denne TIRF-baserte analysen, selv om det absolutt er fleksibilitet i hvordan de distribueres, noe som bør vurderes nøye når du planlegger et eksperiment. Endelig er det sannsynlig at denne analysen kan modifiseres for å studere forskjellige nettverksgeometrier og typer cytoskjelettfilament. Analysen av mekanikken til mikrotubuliforgrening, mediert av augmin og gamma-tubulinringkomplekset, kunne lett undersøkes og avbildes. I tillegg vil andre tverrbundne cytoskeletale nettverk, som de som involverer aktin, septiner eller mellomliggende filamenter, være ganske mottagelige for å studere med disse verktøyene, forutsatt at riktige modifikasjoner og ortogonale vedleggsstrategier til dekselet og fangstperlen er laget.

Avslutningsvis har vi beskrevet en protokoll for rekonstituering av aktive kraftgenererende mikrotubulinettverk, som kan avbildes ved hjelp av enkeltmolekylfluorescensmikroskopiverktøy og manipuleres via en enkeltstråle optisk felle. Vi har demonstrert nytten av denne metoden med datasett som avslører ensemblemekanikken til både et mitotisk motorisk og ikke-motorisk protein. Vi forventer at mange typer høyt organiserte mikrotubulinettverk, som de som finnes i nevroner, epitelvev eller kardiomyocytter, kan analyseres med disse verktøyene, og avslører nye prinsipper for biofysisk funksjon for det dynamiske cytoskelettet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å anerkjenne støtte fra R21 AG067436 (til JP og SF), T32 AG057464 (til ET) og Rensselaer Polytechnic Institute School of Science Startup Funds (til SF).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10W Ytterbium Fiber Laser, 1064nm IPG Photonics YLR-10-1064-LP
405/488/561/640nm Laser Quad Band Set for TIRF applications Chroma TRF89901v2
6x His Tag Antibody, Biotin Conjugate Invitrogen #MA1-21315-BTIN
Acetone, HPLC grade Fisher Scientific 18-608-395
Alpha casein from bovine milk Sigma 1002484390
ATP Fisher Scientific BP413-25
Benzonase Novagen 70746-3
Biotin-PEG-SVA-5000 Laysan Bio, Inc. NC0479433
BL21 (DE3) Rosetta Cells Millipore Sigma 71-400-3
Catalase MP Biomedicals LLC 190311
CFI Apo 100X/1.49NA oil immersion TIRF objective Nikon N/A
Chloramphenicol ACROS Organics 227920250
Coverslip Mini-Rack, for 8 coverslips Fisher Scientific C14784
Delicate Task Wipers Kimberly-Clark 34120
Dextrose Anhydrous Fisher Scientific BP3501
D-Sucrose Fisher Scientific BP220-1
DTT Fisher Scientific BP172-25
Ecoline Immersion Thermostat E100 with 003 Bath LAUDA-Brinkmann 27709
EDTA Fisher Scientific BP118-500
EGTA Millipore Corporation 32462-25GM
FIJI / Image J https://fiji.sc/ N/A
Frosted Microscope Slides Corning 12-553-10 75mmx25mm, with thickness of 0.9-1.1mm
Glucose Oxidase MP Biomedicals LLC 195196 Type VII, without added oxygen
GMPCPP Jena Biosciences JBS-NU-405S Can be stored for several months at -20 °C and up to a year at -80 °C
Gold Seal-Cover Glass Thermo Scientific 3405
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Imidazole Fisher Scientific 03196-500
IPTG Fisher Scientific BP1755-10
Laboratory dessicator Bel-Art 999320237 190mm plate size
Kanamycin Sulfate Fischer Scientific BP906-5
KIF5A K439 (aa:1-439)-6His Gilbert Lab, RPI N/A doi.org/10.1074/jbc.RA118.002182
Kimwipe Kimberley Clark Z188956 lint-free tissue
Immersion Oil, Type B Cargille 16484
Lens Tissue ThorLabs MC-5
LuNA Laser launch (4 channel: 405, 488, 561, 640nm) Nikon N/A
Lysozyme MP Biomedicals LLC 100834
Magnesium Acetate Tetrahydrate Fisher Scientific BP215-500
Microfuge 18 Beckman Coulter 367160
MPEG-SVA MW-5000 Laysan Bio, Inc. NC0107576
Neutravadin Invitrogen PI31000
Nikon Ti-E inverted microscope Nikon N/A Nikon LuN4 Laser
Ni-NTA Resin Thermo Scientific 88221
Oligonucleotide - CACCTATTCTGAGTTTGCGCGA
GAACTTTCAAAGGC		 IDT N/A
Oligonucleotide - GCCTTTGAAAGTTCTCGCGCAA
ACTCAGAATAGGTG		 IDT N/A
Open-top thickwall polycarbonate tube, 0.2 mL, 7 mm x 22 mm Beckman Coulter 343755
Optima-TLX Ultracentrifuge Beckman Coulter 361544
Paclitaxel (Taxol equivalent) Thermo Fisher Scientific P3456
PIPES ACROS Organics 172615000
PMSF Millipore 7110-5GM
Porcine Tubulin, biotin label Cytoskeleton, Inc. T333P
Porcine Tubulin, HiLyte 647 Fluor Cytoskeleton, Inc. TL670M far red labelled
Porcine Tubulin, Rhodamine Cytoskeleton, Inc. TL590M
Porcine Tubulin, Tubulin Protein Cytoskeleton, Inc. T240
Potassium Acetate Fisher Scientific BP364-500
Prime 95B sCMOS camera Photometric N/A
Quadrant Detector Sensor Head ThorLabs PDQ80A
Quikchange Lightning Kit Agilent Technologies 210518
Sodium Bicarbonate Fisher Scientific S233-500
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous Fisher Scientific BP332-500
Square Cover Glasses Corning 12-553-450 18 mm x 18 mm, with thickness of 0.13-0.17 mm
Streptavidin Microspheres Polysciences Inc. 24162-1
Superose-6 Column GE Healthcare 29-0915--96
TCEP Thermo Scientific 77720
TLA-100 Fixed-Angle Rotor Beckman Coulter 343840
Ultrasonic Cleaner (Sonicator) Vevor JPS-08A(DD) 304 stainless steel, 40 kHz frequency, 60 W power
Vectabond APTES solution Vector Laboratories SP-1800-7
Windex Powerized Glass Cleaner with Ammonia-D S.C. Johnson SJN695237

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bentley, M., Banker, G. The cellular mechanisms that maintain neuronal polarity. Nature Reviews Neuroscience. 17 (10), 611-622 (2016).
  2. Yang, R., et al. A novel strategy to visualize vesicle-bound kinesins reveals the diversity of kinesin-mediated transport. Traffic. 20 (11), 851-866 (2019).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: Transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Helmke, K. J., Heald, R., Wilbur, J. D. Interplay between spindle architecture and function. International Review of Cell and Molecular Biology. 306, (2013).
  5. Elting, M. W., Suresh, P., Dumont, S. The spindle: integrating architecture and mechanics across scales. Trends in Cell Biology. 28 (11), 896-910 (2018).
  6. Kapoor, T. Metaphase spindle assembly. Biology. 6 (1), 8 (2017).
  7. Svoboda, K., Block, S. M. Force and velocity measured for single kinesin molecules. Cell. 77 (5), 773-784 (1994).
  8. Svoboda, K., Schmidt, C. F., Schnapp, B. J., Block, S. M. Direct observation of kinesin stepping by optical trapping interferometry. Nature. 365 (6448), 721-727 (1993).
  9. Schnitzer, M. J., Visscher, K., Block, S. M. Force production by single kinesin motors. Nature Cell Biology. 2 (10), 718-723 (2000).
  10. Andreasson, J. O. L., Shastry, S., Hancock, W. O., Block, S. M. The mechanochemical cycle of mammalian kinesin-2 KIF3A/B under load. Current Biology. 25 (9), 1166-1175 (2015).
  11. Bensel, B. M. The mechanochemistry of the kinesin-2 kif3ac heterodimer is related to strain-dependent kinetic properties of kif3a and kif3c. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (27), 15632-15641 (2020).
  12. Gilbert, S. P., Guzik-Lendrun, S., Rayment, I. Kinesin-2 motors: kinetics and biophysics. Journal of Biological Chemistry. 293 (12), 4510-4518 (2018).
  13. Okada, Y., Higuchi, H., Hirokawa, N. Processivity of the single-headed kinesin KIF1A through binding to tubulin. Nature. 424 (6948), 574-577 (2003).
  14. Budaitis, B. G., et al. Pathogenic mutations in the kinesin-3 motor KIF1A diminish force generation and movement through allosteric mechanisms. Journal of Cell Biology. 220 (4), 202004227 (2021).
  15. Tomishige, M., Klopfenstein, D. R., Vale, R. D. Conversion of Unc104/KIF1A kinesin into a processive motor after dimerization. Science. 297 (5590), 2263-2267 (2002).
  16. Siddiqui, N., et al. Force generation of KIF1C is impaired by pathogenic mutations. bioRxiv. , (2021).
  17. Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro. Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).
  18. Valentine, M. T., Gilbert, S. P. To step or not to step? How biochemistry and mechanics influence processivity in Kinesin and Eg5. Current Opinion in Cell Biology. 19 (1), 75-81 (2007).
  19. Jannasch, A., Bormuth, V., Storch, M., Howard, J., Schäffer, E. Kinesin-8 is a low-force motor protein with a weakly bound slip state. Biophysical Journal. 104 (11), 2456-2464 (2013).
  20. Bormuth, V., Varga, V., Howard, J., Schäffer, E. Protein friction limits diffusive and directed movements of kinesin motors on microtubules. Science. 325 (5942), 870-873 (2009).
  21. Gennerich, A., Carter, A. P., Reck-Peterson, S. L., Vale, R. D. Force-induced bidirectional stepping of cytoplasmic dynein. Cell. 131 (5), 952-965 (2007).
  22. Mallik, R., Carter, B. C., Lex, S. A., King, S. J., Gross, S. P. Cytoplasmic dynein functions as a gear in response to load. Nature. 427 (6975), 649-652 (2004).
  23. Redwine, W. B., et al. The human cytoplasmic dynein interactome reveals novel activators of motility. eLife. 6, 28257 (2017).
  24. Belyy, V., Hendel, N. L., Chien, A., Yildiz, A. Cytoplasmic dynein transports cargos via load-sharing between the heads. Nature Communications. 5 (1), 5544 (2014).
  25. Belyy, V., et al. The mammalian dynein-dynactin complex is a strong opponent to kinesin in a tug-of-war competition. Nature Cell Biology. 18 (9), 1018-1024 (2016).
  26. Subramanian, R., Kapoor, T. M. Building complexity: insights into self-organized assembly of microtubule-based architectures. Developmental Cell. 23 (5), 874-885 (2012).
  27. Forth, S., Kapoor, T. M. The mechanics of microtubule networks in cell division. Journal of Cell Biology. 216 (6), 1525-1531 (2017).
  28. Dumont, S., Mitchison, T. J. Force and length in the mitotic spindle. Current Biology. 19 (17), 749-761 (2009).
  29. McIntosh, J. R., Molodtsov, M. I., Ataullakhanov, F. I. Biophysics of mitosis. Quarterly Reviews of Biophysics. 45 (2), 147-207 (2012).
  30. McIntosh, J., Hays, T. A brief history of research on mitotic mechanisms. Biology. 5 (4), 55 (2016).
  31. Ferenz, N. P., Gable, A., Wadsworth, P. Mitotic functions of kinesin-5. Seminars in Cell and Developmental Biology. 21 (3), 255-259 (2010).
  32. Kapitein, L. C., et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks. Nature. 435 (7038), 114-118 (2005).
  33. Vukušić, K., Ponjavić, I., Buđa, R., Risteski, P., Tolić, I. M. Microtubule-sliding modules based on kinesins EG5 and PRC1-dependent KIF4A drive human spindle elongation. Developmental Cell. 56 (9), 1253-1267 (2021).
  34. Sturgill, E. G., Ohi, R. Kinesin-12 differentially affects spindle assembly depending on its microtubule substrate. Current Biology. 23 (14), 1280-1290 (2013).
  35. Drechsler, H., McHugh, T., Singleton, M. R., Carter, N. J., McAinsh, A. D. The Kinesin-12 Kif15 is a processive track-switching tetramer. eLife. 3, 01724 (2014).
  36. Tanenbaum, M. E., et al. Kif15 Cooperates with Eg5 to promote bipolar spindle assembly. Current Biology. 19 (20), 1703-1711 (2009).
  37. Mountain, V., et al. Cross-links microtubules in the mammalian mitotic spindle. Journal of Cell Biology. 147 (2), 351-365 (1999).
  38. Norris, S. R., et al. Microtubule minus-end aster organization is driven by processive HSET-tubulin clusters. Nature Communications. 9 (1), 2659 (2018).
  39. Cai, S., Weaver, L. N., Ems-McClung, S. C., Walczak, C. E. Proper organization of microtubule minus ends is needed for midzone stability and cytokinesis. Current Biology. 20 (9), 880-885 (2010).
  40. Pamula, M. C., et al. High-resolution imaging reveals how the spindle midzone impacts chromosome movement. Journal of Cell Biology. 218 (8), 2529-2544 (2019).
  41. Bieling, P., Telley, I. A., Surrey, T. A minimal midzone protein module controls formation and length of antiparallel microtubule overlaps. Cell. 142 (3), 420-432 (2010).
  42. Zhu, C., Lau, E., Schwarzenbacher, R., Bossy-Wetzel, E., Jiang, W. Spatiotemporal control of spindle midzone formation by PRC1 in human cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (16), 6196-6201 (2006).
  43. Subramanian, R., et al. Insights into antiparallel microtubule crosslinking by PRC1, a conserved nonmotor microtubule binding protein. Cell. 142 (3), 433-443 (2010).
  44. Elting, M. W., Prakash, M., Udy, D. B., Dumont, S. Mapping load-bearing in the mammalian spindle reveals local kinetochore fiber anchorage that provides mechanical isolation and redundancy. Current Biology. 27 (14), 2112-2122 (2017).
  45. Fant, X., Merdes, A., Haren, L. Cell and molecular biology of spindle poles and NuMA. International Review of Cytology. 238, 1-57 (2004).
  46. Merdes, A., Heald, R., Samejima, K., Earnshaw, W. C., Cleveland, D. W. Formation of spindle poles by dynein/dynactin-dependent transport of NuMA). Journal of Cell Biology. 149 (4), 851-861 (2000).
  47. Maddox, P., Straight, A., Coughlin, P., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Direct observation of microtubule dynamics at kinetochores in Xenopus extract spindles: Implications for spindle mechanics. Journal of Cell Biology. 162 (3), 377-382 (2003).
  48. Maddox, P., Desai, A., Oegema, K., Mitchison, T. J., Salmon, E. D. Poleward microtubule flux is a major component of spindle dynamics and anaphase A in mitotic Drosophila embryos. Current Biology. 12 (19), 1670-1674 (2002).
  49. LaFountain, J. R., Cohan, C. S., Siegel, A. J., LaFountain, D. J. Direct visualization of microtubule flux during metaphase and anaphase in crane-fly spermatocytes. Molecular Biology of the Cell. 15 (12), 5724-5732 (2004).
  50. Pavin, N., Tolić, I. M. Mechanobiology of the mitotic spindle. Developmental Cell. 56 (2), 192-201 (2021).
  51. Vukušić, K., Tolić, I. M. Anaphase B: Long-standing models meet new concepts. Seminars in Cell and Developmental Biology. 117, 127-139 (2021).
  52. Vukušić, K., et al. Microtubule sliding within the bridging fiber pushes kinetochore fibers apart to segregate chromosomes. Developmental Cell. 43 (1), 11-23 (2017).
  53. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  54. Gaska, I., Armstrong, M. E., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts like a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 367-378 (2020).
  55. Woll, K. A., et al. An allosteric propofol-binding site in kinesin disrupts kinesin-mediated processive movement on microtubules. Journal of Biological Chemistry. 293 (29), 11283-11295 (2018).
  56. Forth, S., Hsia, K. C., Shimamoto, Y., Kapoor, T. M. Asymmetric friction of nonmotor MAPs can lead to their directional motion in active microtubule networks. Cell. 157 (2), 420-432 (2014).
  57. Alfieri, A., Gaska, I., Forth, S. Two modes of PRC1-mediated mechanical resistance to kinesin-driven microtubule network disruption. Current Biology. 31 (12), 2495-2506 (2021).
  58. Koch, M. D., Shaevitz, J. W. Introduction to optical tweezers. Methods in Molecular Biology. 1486, 3-24 (2017).
  59. Sarshar, M., Wong, W. T., Anvari, B. Comparative study of methods to calibrate the stiffness of a single-beam gradient-force optical tweezers over various laser trapping powers. Journal of Biomedical Optics. 19 (11), 115001 (2014).
  60. Van Mameren, J., Wuite, G. J. L., Heller, I. Introduction to optical tweezers: Background, system designs, and commercial solutions. Methods in Molecular Biology. 783, 1-20 (2011).
  61. Bodrug, T., et al. The kinesin-5 tail domain directly modulates the mechanochemical cycle of the motor domain for anti-parallel microtubule sliding. eLife. 9, 51131 (2020).
  62. Reinemann, D. N., et al. Collective force regulation in anti-parallel microtubule gliding by dimeric Kif15 kinesin motors. Current Biology. 27 (18), 2810-2820 (2017).
  63. Reinemann, D. N., Norris, S. R., Ohi, R., Lang, M. J. Processive kinesin-14 HSET exhibits directional flexibility depending on motor traffic. Current Biology:CB. 28 (14), 2356-2362 (2018).
  64. Shimamoto, Y., Forth, S., Kapoor, T. M. Measuring pushing and braking forces generated by ensembles of kinesin-5 crosslinking two microtubules. Developmental Cell. 34 (6), 669-681 (2015).
  65. SMART - Servier Medical ART. , Available from: https://smart.servier.com/ (2022).
  66. Gaska, I., Armstrong, M., Alfieri, A., Forth, S. The mitotic crosslinking protein PRC1 acts as a mechanical dashpot to resist microtubule sliding. Developmental Cell. 54 (3), 1-14 (2020).
  67. Janson, M. E., De Dood, M. E., Dogterom, M. Dynamic instability of microtubules is regulated by force. Journal of Cell Biology. 161 (6), 1029-1034 (2003).
  68. Kerssemakers, J. W. J., et al. Assembly dynamics of microtubules at molecular resolution. Nature. 442 (7103), 709-712 (2006).
  69. Powers, A. F., et al. The Ndc80 kinetochore complex forms load-bearing attachments to dynamic microtubule tips via biased diffusion. Cell. 136 (5), 865-875 (2009).
  70. Akiyoshi, B., et al. Tension directly stabilizes reconstituted kinetochore-microtubule attachments. Nature. 468 (7323), 576-579 (2010).
  71. Fong, K. K., et al. Direct measurement of the strength of microtubule attachment to yeast centrosomes. Molecular Biology of the Cell. 28 (14), 1853-1861 (2017).
  72. Kikumoto, M., Kurachi, M., Tosa, V., Tashiro, H. Flexural rigidity of individual microtubules measured by a buckling force with optical traps. Biophysical Journal. 90 (5), 1687-1696 (2006).
  73. Memet, E., et al. Microtubules soften due to cross-sectional flattening. eLife. 7, 34695 (2018).

Tags

Biologi utgave 183 mikrotubuli optisk fangst mitose enkeltmolekyl spindel mekanikk kinesin mikrotubuli-assosierte proteiner fluorescensmikrosopi
direkte måling av krefter i rekonstituerte aktive mikrotubulibunter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Palumbo, J., Tai, E., Forth, S.… More

Palumbo, J., Tai, E., Forth, S. Directly Measuring Forces Within Reconstituted Active Microtubule Bundles. J. Vis. Exp. (183), e63819, doi:10.3791/63819 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter