Quantificazione della dinamica del citoscheletro mediante microscopia dinamica differenziale

Summary

La microscopia dinamica differenziale (DDM) combina caratteristiche di diffusione dinamica della luce e microscopia. Qui, viene presentato il processo di utilizzo del DDM per caratterizzare le reti citoscheletriche ricostituite quantificando la dinamica subdiffusiva e ingabbiata delle particelle nelle reti di vimentine e il movimento balistico dei compositi actina-microtubulo attivi guidati dalla miosina.

Abstract

Le cellule possono strisciare, auto-guarire e sintonizzare la loro rigidità a causa del loro citoscheletro notevolmente dinamico. Pertanto, la ricostituzione di reti di biopolimeri citoscheletrici può portare a una serie di materiali attivi e adattabili. Tuttavia, l'ingegneria di tali materiali con proprietà sintonizzate con precisione richiede la misurazione di come le dinamiche dipendano dalla composizione della rete e dai metodi di sintesi. La quantificazione di tali dinamiche è messa in discussione dalle variazioni nel tempo, nello spazio e nello spazio di formulazione delle reti composite. Il protocollo qui descrive come la tecnica di analisi di Fourier, la microscopia dinamica differenziale (DDM), possa quantificare la dinamica delle reti di biopolimeri ed è particolarmente adatta per gli studi di reti di citoscheletri. DDM lavora su sequenze temporali di immagini acquisite utilizzando una gamma di modalità di microscopia, tra cui confocale a scansione laser, fluorescenza a campo largo e imaging a campo luminoso. Da tali sequenze di immagini, si possono estrarre tempi di decorrelazione caratteristici delle fluttuazioni di densità attraverso un arco di vettori d'onda. Viene inoltre sviluppato un pacchetto Python open source user-friendly per eseguire analisi DDM. Con questo pacchetto, si può misurare la dinamica dei componenti del citoscheletro etichettati o delle particelle traccianti incorporate, come dimostrato qui con i dati delle reti di filamenti intermedi (vimentina) e delle reti attive di actina-microtubulo. Gli utenti senza precedenti esperienze di programmazione o di elaborazione delle immagini saranno in grado di eseguire DDM utilizzando questo pacchetto software e la documentazione associata.

Introduction

Il citoscheletro è una rete di filamenti proteici che si estende attraverso il citoplasma delle cellule eucariotiche, collegando la superficie cellulare al nucleo. Ha proprietà uniche del materiale, fornendo protezione meccanica contro carichi meccanici grandi e ripetuti, ma anche guidando cambiamenti dinamici della forma della cella¹. Le reti di citoscheletri ricostituite possono dare origine a una serie di interessanti comportamenti dinamici, dall'ingabbiamento di particelle incorporate al movimento balistico guidato da motori molecolari ^{2,3,4,5,6,7,8,9,10,11} . I metodi per analizzare la dinamica di tali reti includono il monitoraggio del movimento delle microsfere traccianti incorporate ^6,7,12,13,14, l'analisi delle immagini per tracciare le dimensioni degli ammassi densi di proteine nel tempo 8, la diffusione dinamica della luce¹⁵, la velocimetria dell'immagine delle particelle 4,16,17,18,19 , calcolando la densità spettrale di potenza delle immagini nel tempo¹⁹ e l'analisi del kymograph²⁰. Man mano che vengono condotti ulteriori studi sulle reti di citoscheletri ricostituiti, sia per comprendere la meccanica cellulare o la materia attiva, sono sempre più necessari metodi robusti, imparziali e riproducibili per caratterizzare la dinamica. La microscopia dinamica differenziale (DDM)^21,22, una tecnica relativamente nuova che è stata utilizzata per studiare la dinamica del citoscheletro, è una di queste tecniche che quantifica in modo efficiente la dinamica con pochi parametri definiti dall'utente. Con il pacchetto software qui descritto, i ricercatori con poca esperienza nella programmazione o nell'analisi delle immagini saranno in grado di sfruttare DDM per il proprio lavoro.

DDM è una tecnica di analisi delle immagini per estrarre la dinamica di un campione. Come il tracciamento delle particelle o la velocimetria delle immagini delle particelle, il DDM richiede una serie temporale di immagini (spesso migliaia di immagini), in genere registrate con un microscopio. A differenza del tracciamento delle particelle, le singole caratteristiche o le perle traccianti non devono essere localizzate (o addirittura localizzabili) nell'immagine. A differenza sia del tracciamento delle particelle che della velocimetria dell'immagine delle particelle, si recupera la dinamica dell'insieme con DDM con relativamente pochi parametri specificati dall'utente. Con DDM, le immagini vengono analizzate nello spazio di Fourier per determinare il tempo di decadimento delle fluttuazioni di densità su un intervallo di numeri d'onda, q, dove q = 2πu e u è la grandezza delle frequenze spaziali, . Si ottengono informazioni simili a scattering ma con immagini nello spazio reale acquisite al microscopio 21,22,23. Pertanto, si possono sfruttare i vari metodi di microscopia che generano contrasto, come la fluorescenza a campo largo^22,24, la fluorescenza confocale²⁵, polarizzata²⁶, il campo oscuro²⁷ o la fluorescenza a foglio di luce²⁸ microscopie. Inoltre, le immagini utilizzate per l'analisi DDM possono essere utilizzate per il tracciamento delle particelle o la velocimetria delle immagini delle particelle per fornire informazioni complementari.

Questa combinazione di caratteristiche della diffusione dinamica della luce e della microscopia ottica rende il DDM una tecnica potente e versatile. Dalla sua prima descrizione da parte di Cerbino e Trappe nel 2008²¹, dove DDM è stato dimostrato per misurare la diffusione di particelle colloidali a 73 nm, DDM è stato utilizzato per misurare colloidi fluenti²⁹, aggregazione colloidale ^30,31, la viscoelasticità dei cristalli liquidi nematici²⁶, la dinamica dei gel colloidali³², schiume grossolane³³, nanoparticelle in ambienti confinati ^34, 35,36,37, motilità batterica 38,39,40,41, diffusione di cluster proteici debolmente scattering⁴², onde capillari a interfacce fluide⁴³ e altri sistemi. Coloro che cercano un elenco più completo delle pubblicazioni che utilizzano DDM possono fare riferimento a documenti di revisione approfonditi sull'argomento ^22,23,44,45.

DDM è stato utilizzato anche per studiare la dinamica delle reti biologiche. Drechsler et al. hanno usato DDM per misurare la dinamica dell'actina negli ovociti viventi di Drosophila ⁴⁶. Burla et al. hanno quantificato la dinamica delle particelle traccianti in reti di compositi ialuronan e ialuronan-collagene⁴⁷. Sono stati documentati anche diversi usi del DDM per studiare la dinamica delle particelle traccianti nelle reti citoscheletriche ricostituite ^9,10, il trasporto di molecole di DNA in tali reti ^48,49 e la dinamica delle reti ricostituite attive 11,50,51. Un vantaggio del DDM nella misurazione della dinamica in tali sistemi è che le singole particelle o molecole non devono essere localizzate e tracciate. Quindi, ad esempio, la dinamica delle molecole di DNA in ambienti affollati può essere misurata con DDM nonostante la difficoltà nel tracciare molecole così piccole e non sferiche. Inoltre, con la microscopia a fluorescenza, è possibile utilizzare l'etichettatura multicolore per misurare selettivamente la dinamica dei singoli costituenti in un composito complesso.

Per eseguire DDM, viene acquisita una sequenza di immagini nel tempo, I(x,y,t). Per un dato tempo di ritardo, Δt, si trovano tutte (o un sottoinsieme di) coppie di immagini separate da quel tempo di ritardo. La trasformata di Fourier al quadrato della differenza di ogni coppia,

è calcolato e mediato insieme. Questa quantità, , è media radialmente, a condizione che le dinamiche siano isotrope. In questo modo viene prodotta la matrice DDM (nota anche come funzione di struttura dell'immagine), . Questo processo è illustrato graficamente nella Figura 1. Per determinare la dinamica del campione da questa matrice DDM, si presume che la matrice DDM assuma la forma

dove A è l'ampiezza, che dipende dai dettagli del microscopio e dalla struttura del campione, B è lo sfondo, che dipende dal rumore nelle immagini, e f (q, Δt) è la funzione di scattering intermedio (ISF), che contiene informazioni sulla^{dinamica 21,22}. In casi semplici,

dove τ è un tempo caratteristico di decadimento o decorrelazione. Tale ISF è stato utilizzato in diversi studi che impiegano DDM su sistemi ergodici come sospensioni colloidali diluite 21,24,27,37,40,52. Tuttavia, altre forme di ISF possono essere utilizzate per modellare vari tipi di dinamiche. Ad esempio, si può utilizzare un'espansione cumulativa per modellare l'ISF per i campioni polidispersi come

dove μ è una misura della polidispersità^42,53; Se le fluttuazioni di densità decadono di due modi separati, si può usare un ISF come

^{26, 54, 55, 56, 57};

altri ISF possono essere utilizzati per il nuoto di microrganismi o altre particelle attive 38,39,40,41,58,59.

Figura 1: Panoramica dell'analisi DDM. Dalla serie temporale di immagini, la trasformata di Fourier delle differenze di immagine viene calcolata per calcolare la matrice DDM. La matrice DDM può essere adattata a un modello per determinare la scala temporale delle fluttuazioni di densità in un intervallo di valori q . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Qui, viene descritto l'uso di un pacchetto software di analisi DDM sviluppato in Python, PyDDM. Questo pacchetto software si basa sul lavoro svolto dai nostri laboratori di ricerca e da altri studi pubblicati negli ultimi anni. I principali motivatori per la creazione di questo pacchetto software includono la necessità di (1) tenere traccia e archiviare i metadati e i parametri utilizzati nell'analisi; (2) documentazione approfondita con esempi dettagliati di analisi dall'inizio alla fine; e (3) un modo semplice per impiegare diversi (o creare nuovi) modelli matematici per adattare i dati (ad esempio, l'aggiunta di modelli ISF, come quelli recentemente sviluppati per i filamenti attivi⁶⁰, sarebbe semplice). Esistono anche altri pacchetti software per l'analisi DDM, anche se non tutti sono ben documentati e scritti in un linguaggio di programmazione open source. Ad esempio, esiste codice C++ con calcolo su GPU (https://github.com/peterlu/ConDDM)²⁵, codice C++ che utilizza le trasformazioni di Fourier nel tempo per accelerare i calcoli (https://github.com/giovanni-cerchiari/diffmicro)⁶¹, matlab e versioni Python (https://github.com/MathieuLeocmach/DDM)⁴⁰, codice MATLAB (https://sites.engineering.ucsb.edu/~helgeson/ddm.html)²⁷ e codice MATLAB con quantificazione dell'incertezza ( https://github.com/UncertaintyQuantification/DDM-UQ)⁶². Poiché questo pacchetto PyDDM è ben documentato e offre molta flessibilità nel modo in cui la matrice DDM viene calcolata e analizzata, si spera che possa essere utile ai ricercatori che desiderano implementare DDM indipendentemente dal loro background nella programmazione o nell'analisi delle immagini.

Il protocollo mostra come questo pacchetto software può essere utilizzato per quantificare la dinamica delle reti di citoscheletri ricostituite in vitro . Questo viene fatto utilizzando due distinti set di dati di imaging: (1) immagini di particelle traccianti submicroniche incorporate in una rete di vimentine prese con microscopia a campo luminoso e (2) immagini di filamenti di actina e microtubuli marcati fluorescentemente in una rete composita entangled con attività guidata dalla miosina presa con microscopia confocale a scansione laser. Le analisi di questi due set di dati evidenziano notevoli punti di forza del DDM, inclusa la sua capacità di analizzare le immagini scattate con una varietà di modalità di imaging (ad esempio, campo luminoso o fluorescenza confocale), di estrarre dinamiche da traccianti incorporati o da filamenti etichettati e di quantificare una varietà di dinamiche (ad esempio, subdiffusive e vincolate o balistiche).

Protocol

NOTA: un file Jupyter Notebook contenente il codice da eseguire con ogni passaggio nel seguente protocollo è disponibile nel seguente repository GitHub, https://github.com/rmcgorty/PyDDM/tree/main/Examples. Un PDF di tale file è incluso nel fascicolo complementare 1. Inoltre, una procedura dettagliata del codice e della documentazione di ogni funzione e classe è disponibile sul sito Web, https://rmcgorty.github.io/PyDDM/.

1. Installazione del software

1. Per seguire insieme ai file di analisi DDM di esempio, installare Jupyter Notebook per l'esecuzione del codice. Installa anche altri pacchetti Python comuni richiesti, inclusi NumPy e Matplotlib. Questi pacchetti vengono tutti forniti in bundle con la distribuzione Anaconda (vedi https://www.anaconda.com/products/individual).
2. Installare il pacchetto Python xarray⁶³. Questo pacchetto è necessario per organizzare e memorizzare metadati e parametri di analisi. Se si utilizza la distribuzione Anaconda, installare xarray (insieme alle dipendenze consigliate) utilizzando il comando:
   conda install -c conda-forge xarray dask netCDF4 collo di bottiglia
3. Installare il pacchetto PyYAML utilizzando il comando:
   conda install -c anaconda yaml
   Questo pacchetto è necessario per la lettura dei metadati relativi alle immagini da analizzare e ai parametri impostati dall'utente per l'analisi e il montaggio.
4. Installa il pacchetto PyDDM, scaricando dal repository GitHub o usando il comando git:
   git clone https://github.com/rmcgorty/PyDDM.git

2. Pianificazione delle sessioni di imaging

1. Scegli la modalità di imaging e le impostazioni ottiche ottimali disponibili. Come accennato, DDM può essere utilizzato con una serie di metodi di microscopia.
2. Per facilitare la pianificazione dell'obiettivo e delle dimensioni dell'immagine appropriate da utilizzare, determinare l'intervallo di numeri d'onda, q, che verrà sondato in base alla dimensione dei pixel e alla dimensione totale dell'immagine. Verificare che la scelta dell'ingrandimento e del campo visivo siano ottimali per l'esperimento, sulla base di questi calcoli. Per le immagini analizzate qui, un obiettivo 60x 1.4 NA e una dimensione dell'immagine di 256 x 256 pixel con una dimensione dei pixel di 0.83 μm sono stati utilizzati per la rete composita actina-microtubulo attivo. Per le immagini di perline incorporate in una rete di vimentine, sono stati utilizzati un obiettivo 100x 1,4 NA e una dimensione dell'immagine di 512 x 512 pixel con una dimensione dei pixel di 0,13 μm.
   NOTA: il q minimo è impostato da 2π/NΔx, dove la dimensione dell'immagine (che si presume sia quadrata) è N × N pixel con una dimensione in pixel di Δx. Il massimo q è il minimo di π/Δx e 2π NA/λ, dove NA è l'apertura numerica dell'obiettivo di imaging e λ è la lunghezza d'onda della luce (per l'imaging a campo luminoso, si può sostituire NA con (_obiettivo NA +_condensatore NA)/2).
3. Successivamente, considera l'intervallo di tempo da indagare. In genere, l'analisi DDM viene eseguita su sequenze di almeno 1000 fotogrammi.
   1. Per determinare la frequenza fotogrammi appropriata, considerare il tempo previsto necessario affinché le feature del campione spostino una distanza nell'ordine della scala di lunghezza minima risolvibile (corrispondente alla q massima).
   2. Nel considerare il limite superiore dell'intervallo di tempo sondato, riconoscere che, in genere, lo spettro di potenza di centinaia di differenze di immagine di un dato tempo di ritardo Δt sono mediati insieme per fornire statistiche sufficienti per ridurre il rumore. Quindi, acquisire sequenze di immagini più lunghe della scala temporale massima sondata.
      NOTA: Se è noto un coefficiente di diffusione atteso, D, o velocità, v, allora si possono stimare i tempi di decadimento caratteristici attesi usando τ = 1/Dq² o τ = 1/vq insieme all'intervallo di q, che è stato determinato in base al campo visivo e alla dimensione dei pixel. L'intervallo di valori τ attesi nell'intervallo q accessibile può aiutare a guidare la scelta del frame rate e del numero di fotogrammi da acquisire.

3. Preparazione del campione e acquisizione delle immagini

NOTA: per i dettagli della preparazione del campione e delle impostazioni di imaging utilizzate per i dati presentati nella sezione dei risultati rappresentativi, vedere le precedenti pubblicazioni degli autori ^11,51,64 e il file supplementare 2.

1. Sulla base della considerazione delle scale di tempo e lunghezza da sondare, acquisire sequenze di immagini di, idealmente, oltre 1000 fotogrammi.
   NOTA: il codice analizzerà le immagini quadrate o le regioni quadrate di interesse all'interno dell'immagine, quindi regola le dimensioni del fotogramma di conseguenza.
2. Salvate le sequenze di immagini come stack TIFF tridimensionale in scala di grigi. In alternativa, il formato utilizzato dai sistemi Nikon Instruments, formato ND2, può essere letto dal pacchetto installato. Se le immagini vengono salvate in un formato diverso, utilizzare ImageJ o un altro programma di elaborazione delle immagini per convertire le immagini in uno stack TIFF.
   Nota : se si utilizzano file ND2, è necessario installare il pacchetto nd2reader da https://github.com/Open-Science-Tools/nd2reader.

4. Impostazione dei parametri

1. Creare una copia del file di parametri example_parameter_file.yml fornito nel repository di codice PyDDM nella cartella degli esempi. Apri questo file YAML con un editor di testo come NotePad ++ o l'editor di testo in JupyterLab. Vedere il file supplementare 2 per un esempio di file di parametri YAML utilizzato nell'analisi dei dati presentati nella sezione dei risultati rappresentativi.
2. Nel file YAML copiato, specificare la directory dei dati e il nome del file corrispondenti alla sequenza di immagini da analizzare. Nella sezione dei metadati, fornisci la dimensione dei pixel e la frequenza dei fotogrammi.
3. Nella sezione Analysis_parameters, fornire dettagli su come calcolare la matrice DDM. Alcuni parametri qui sono facoltativi.
   1. Come minimo, specificare i valori per i parametri number_lag_times e last_lag_time. Questi corrispondono al numero di diversi tempi di ritardo per i quali calcolare la matrice DDM e il tempo di ritardo più lungo (in fotogrammi) da utilizzare, rispettivamente. Per i dati delle perle traccianti nelle reti di vimentine qui utilizzate, i parametri number_lag_times e last_lag_time erano rispettivamente 60 e 1000. Il codice calcolerà la matrice DDM per i tempi di ritardo da 1 fotogramma (o qualche altro tempo di ritardo minimo se viene specificato il parametro opzionale first_lag_time) al last_lag_time con spaziatura logaritmica.
      NOTA: se sono stati acquisiti fotogrammi M, si potrebbe calcolare la matrice DDM per un tempo di ritardo grande quanto M-1. Tuttavia, con statistiche scadenti in un momento di ritardo così ampio, è probabile che i dati siano rumorosi. Il tempo di ritardo più lungo per calcolare la matrice DDM dipenderà dai dettagli dei dati, ma suggeriamo di provare circa un terzo della durata totale della serie di immagini.
4. Fornire dettagli su come la matrice DDM o la funzione di scattering intermedio (ISF) dovrebbero essere adattate nella sezione Fitting_parameters. Specificare il nome del modello sotto il parametro del modello. Fornite l'ipotesi iniziale, il limite inferiore e il limite superiore per ciascuno dei parametri di raccordo nel modello scelto.
   NOTA: per visualizzare un elenco dei possibili modelli di raccordo, eseguite la funzione print_fitting_models. I modelli possono anche essere trovati nella documentazione online sul sito Web PyDDM.

5. Calcolo della matrice DDM

1. Inizializzare un'istanza della classe DDM_Analysis. Per fare ciò, fornire i metadati e i parametri di analisi discussi in precedenza passando il nome del file, con il percorso completo del file incluso, del file YAML a DDM_Analysis. In alternativa, passare i metadati e i parametri come struttura di dati del dizionario Python.
2. Eseguire la funzione calculate_DDM_matrix per calcolare la matrice DDM. Questo calcolo può richiedere alcuni minuti o più a seconda delle dimensioni del fotogramma e del numero di tempi di ritardo. Vedere la Figura 2 per i tempi di esecuzione tipici.
3. Esaminare i dati restituiti, che si troveranno in una struttura di dati dal pacchetto xarray noto come Dataset. Questa struttura di dati viene archiviata nell'attributo ddm_dataset.
   NOTA: in questa struttura di dati verranno memorizzati non solo la matrice DDM, ma anche le variabili e i metadati associati. Verrà inoltre salvato su disco in un formato netCDF (Network Common Data Form).
4. Ispeziona le trame e le figure, che verranno generate e visualizzate. Queste figure vengono anche salvate come file PDF nella directory dei dati.
   1. Guarda che uno dei grafici generati mostra il modulo quadrato mediato dall'insieme delle immagini trasformate di Fourier, in funzione di q. Per impostazione predefinita, il codice lo utilizza per stimare il parametro di sfondo B. Stimare lo sfondo assumendo che, nel limite di q grande, si avvicinerà a B / 2, dove B è lo sfondo.
   2. Se non sta raggiungendo un plateau a grande q, utilizzare un altro metodo per stimare B. A tale scopo, impostare il parametro background_method nel file YAML o come argomento facoltativo della parola chiave alla funzione calculate_DDM_matrix. Maggiori dettagli sui metodi per stimare B sono presentati nella sezione dei risultati rappresentativi.

Figura 2: Tempo di calcolo per il calcolo della matrice DDM. In (A) e (B) viene mostrato il tempo per il calcolo della matrice DDM, , . I dati utilizzati in tutti i casi sono un filmato di 5000 fotogrammi con una dimensione dell'immagine di 512 x 512 pixel. La matrice DDM è stata calcolata per 30 tempi di ritardo, distanziati logaritmicamente tra 1 frame (0,01 s) e 1000 frame (10 s). Il codice è stato eseguito su un computer desktop Intel i7-10700 a 2,90 GHz con 32 GB di RAM. In (A), viene mostrato l'effetto di variare il numero di differenze di immagine utilizzate nel calcolo della matrice DDM per ogni tempo di ritardo. Per questo, le immagini vengono associate per ottenere una dimensione dell'immagine di 256 x 256. Per ogni tempo di ritardo Δt, le immagini separate da quel Δt vengono sottratte e la matrice risultante viene trasformata di Fourier. Per un dato Δt, tutte le coppie di immagini separate da quel Δt possono essere utilizzate (mostrate in blu), possono essere utilizzate solo coppie di immagini non sovrapposte (ad esempio, cornici 1 e 10, 10 e 19, ecc.; mostrate in marrone), oppure 300 coppie di immagini o meno possono essere utilizzate per ogni Δt. In (B), viene mostrato l'effetto della modifica delle dimensioni dell'immagine sul tempo di calcolo. Le immagini sono state associate raggruppando 2 x 2, 4 x 4 o 8 x 8 pixel, con il risultato di dimensioni dell'immagine di 256 x 256, 128 x 128 o 64 x 64, rispettivamente. Per ciascuno, circa 300 coppie di immagini vengono utilizzate nel calcolo della matrice DDM per ogni Δt. (C) Dalla matrice DDM è possibile estrarre la funzione di scattering intermedio (ISF). Questo è mostrato per i tre casi in (A). I punti dati blu (senza offset) corrispondono all'ISF quando viene utilizzato il numero massimo di coppie di immagini per ogni Δt; i punti dati marroni (con un offset di 0,1) corrispondono all'ISF quando per ogni Δt vengono utilizzate coppie di immagini non sovrapposte; e i punti dati rosa (con un offset di 0,2) corrispondono all'ISF quando al massimo vengono utilizzate 300 coppie di immagini per ogni Δt. L'ISF trovato usando coppie di immagini non sovrapposte mostra rumorosità a lungo Δt. In tal caso, vengono utilizzate poche coppie di immagini a Δt lunghi (ad esempio, per Δt di 1000 fotogrammi, vengono utilizzate solo 4 coppie di immagini). (D) Adattando l'ISF ad una funzione esponenziale, viene determinato il tempo di decadimento caratteristico, τ, per ogni numero d'onda, q. In rosa, i risultati vengono mostrati dopo aver associato le immagini originali di 2 x 2, con una dimensione dell'immagine di 256 x 256. In grigio, i risultati vengono visualizzati dopo il binning di 8 x 8, con una dimensione dell'immagine di 64 x 64. Associando i dati, le informazioni sulla dinamica a numeri d'onda più alti vengono perse, ma il calcolo della matrice DDM per le immagini 64 x 64 è circa 16 volte più veloce rispetto alle immagini 256 x 256. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

6. Montaggio della matrice DDM o isF

1. Inizializzare un'istanza della classe DDM_Fit. A tale scopo, passare a DDM_Fit il nome del file YAML contenente i metadati dell'immagine e i parametri per il fitting.
2. Decidere quale modello per la matrice DDM o l'ISF utilizzare per adattare i dati. Elencare i modelli disponibili eseguendo la funzione print_fitting_models. Specificate il modello da utilizzare nel file dei parametri YAML o utilizzando la funzione reload_fit_model_by_name.
3. Impostare le ipotesi e i limiti iniziali per ciascun parametro nel modello scelto nel file di parametri YAML fornito. Per modificare l'ipotesi iniziale per qualsiasi parametro, utilizzare la funzione set_parameter_initial_guess. Impostare i limiti per i parametri con la funzione set_parameter_bounds. Ad esempio, come si vede nel file supplementare 2, per i dati delle perle traccianti nella rete vimentina, l'ipotesi iniziale per il tempo di decadimento era 1 s e i limiti su quel parametro erano 0,01 s e 2000 s.
4. Esegui l'adattamento con la funzione adatta. Assegna una variabile all'output di questa funzione per accedere facilmente ai risultati.
   NOTA: questa funzione può accettare molti argomenti facoltativi. Vedere la documentazione del codice e gli esempi forniti per un elenco di tali argomenti e quando considerare di impostarli su valori non predefiniti.

7. Interpretazione dei risultati di adattamento

1. Genera grafici per ispezionare gli adattamenti e la dipendenza q dei parametri di adattamento con la funzione fit_report.
   NOTA: Questa funzione genererà una serie di grafici, che verranno salvati anche come PDF. Gli argomenti facoltativi di questa funzione possono essere utilizzati per modificare i grafici prodotti.
2. Tra i grafici generati ci sarà una figura con 2 x 2 sottotrame che mostrano la matrice DDM o ISF (a seconda del modello di raccordo scelto) a quattro valori q (specificati come argomento opzionale per fit_report), insieme alla matrice DDM calcolata o ISF utilizzando il modello e i parametri di adattamento migliore. Per tracciare la matrice DDM o ISF insieme alla soluzione migliore in modo interattivo, utilizzare la classe Browse_DDM_Fits come illustrato negli esempi forniti quando viene utilizzato l'ambiente Jupyter Notebook.
3. Dal grafico del tempo di decadimento caratteristico τ rispetto al numero d'onda q, determinare se la dinamica segue movimenti diffusivi, subdiffusivi, balistici o qualche altro tipo di movimento. Questo può essere fatto cercando la relazione della legge di potere tra τ e q.
   NOTA: nel grafico log-log di τ vs. q generato dalla funzione fit_report, verranno visualizzate tre linee, corrispondenti alla legge di potenza che si adatta a un intervallo specificato di valori q . La linea nera continua corrisponde all'adattamento di τ vs. q a una legge di potenza, τ = 1 / Kq^β, dove K e β sono parametri liberi. La linea tratteggiata in arancione corrisponde al raccordo alla diffusione semplice, τ = 1 / Dq², dove D è un coefficiente di diffusione. La linea tratteggiata in blu corrisponde al raccordo a τ = 1 / vq, dove v è una velocità.

8. Salvataggio dei risultati

1. I risultati dell'adattamento verranno salvati in un set di dati xarray. Usa la funzione xarray to_netcdf o il modulo pickle integrato di Python per salvare questa struttura di dati su disco. Utilizzare la funzione xarray open_dataset per caricare questi file netCDF.
2. Utilizzare la funzione save_fit_results_to_excel per salvare i risultati di adattamento, insieme ai dati, in un file di foglio di lavoro.

Results

Qui, mostriamo esempi dell'analisi fatta con PyDDM da due diversi set di esperimenti. In una serie di esperimenti, le perle traccianti sub-micron sono state incorporate in reti costituite dalla vimentina proteica del filamento intermedio e fotografate utilizzando una lente obiettivo 100x in modalità brightfield a 100 fotogrammi / s (Figura 3A). La vimentina è espressa nelle cellule mesenchimali ed è un determinante chiave delle proprietà meccaniche del citoplasma⁶⁵ e della stabilità meccanica del nucleo nelle cellule che eseguono migrazioni confinate ^66,67. Finora, le reti di vimentine ricostituite sono state studiate principalmente dalla reologia macroscopica 64,68,69, mentre le dinamiche hanno ricevuto relativamente poca attenzione 13,70,71. Ulteriori dettagli di questi esperimenti sono disponibili nel file supplementare 2. Nell'altra serie di esperimenti, sono state preparate reti di citoscheletri attivi con actina, microtubuli e miosina. Etichette fluorescenti spettralmente distinte hanno permesso di visualizzare i filamenti di actina e microtubuli con un microscopio confocale a scansione laser a due colori utilizzando una lente obiettivo 60x a 2,78 fotogrammi / s (Figura 3B, C). I filamenti di actina e microtubulo sono entrambi importanti motori dei cambiamenti dinamici della forma cellulare, con le loro azioni coordinate da interazioni meccaniche e biochimiche⁷². Ulteriori dettagli di questi esperimenti possono essere trovati in¹¹. I singoli fotogrammi delle sequenze di immagini prese in questi esperimenti sono mostrati nella Figura 3.

Figura 3: Immagini delle serie temporali analizzate. (A) Immagine Brightfield di perline da 0,6 μm in una rete di vimentine. (B,C) Immagine dei (B) microtubuli e (C) actina in un composito attivo actina-microtubulo prelevata con un obiettivo 60x su un microscopio confocale a scansione laser, utilizzando la luce di eccitazione a 561 nm per l'imaging del microtubulo e la luce di eccitazione a 488 nm per l'imaging dell'actina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per le immagini di perline traccianti in reti vimentine, sono stati registrati filmati di 5000 fotogrammi con una dimensione di 512 x 512 pixel a 100 fotogrammi/s. Da questi, la matrice DDM è stata calcolata a 60 tempi di ritardo logaritmicamente distanziati tra 1 e 1000 fotogrammi, o 0,01 s e 10 s. Per stimare lo sfondo, B, la media delle immagini quadrate trasformate di Fourier, , è stato calcolato e impostato uguale a ^55,73. È stata fatta l'ipotesi che, oltre il 10% più grande dei valori q, questa quantità sia uguale a B/2 e che B sia indipendente da q. Questo è il metodo predefinito del pacchetto per la stima di B, ma altri metodi sono possibili impostando il parametro background_method su un valore diverso.

Con i parametri A(q) e B determinati da , si può estrarre la funzione di scattering intermedio (ISF) dalla matrice DDM. Gli ISF di esempio sono mostrati nella Figura 4. Nella Figura 4A, viene mostrato l'ISF da immagini di perline di diametro 0,6 μm incorporate in una rete con una concentrazione di vimentina di 19 μM. Nella Figura 4B, viene mostrato l'ISF per lo stesso tipo di perline in una rete con una concentrazione di vimentina di 34 μM. È interessante notare che in nessuno dei due casi l'ISF è decaduto a zero. In tempi di ritardo elevati, l'ISF dovrebbe avvicinarsi allo zero per i sistemi ergodici. Cioè, in tali sistemi, le fluttuazioni di densità dovrebbero decorrelarsi completamente su grandi tempi di ritardo. Il fatto che l'ISF qui non sia decaduto a zero potrebbe essere il risultato di stime imprecise di A (q) e B, che sono state utilizzate per trovare l'ISF dalla matrice DDM calcolata. In particolare, il metodo qui utilizzato può sovrastimare B in alcuni scenari⁶². Tuttavia, è più probabile che la dinamica delle perle traccianti sia veramente non ergodica in quanto le perle hanno una dimensione paragonabile alla dimensione della rete e possono, quindi, diventare ingabbiate. Altri dati hanno confermato la scoperta della non ergodicità. Vale a dire, la dimensione del tallone, 0,6 μm, era maggiore del valore medio calcolato per le dimensioni delle maglie di 0,4 μm per la concentrazione di 19 μM e 0,3 μm per la concentrazione di 34 μM. Inoltre, i risultati del tracciamento di singole particelle di queste perle traccianti, che vengono mostrati in seguito, hanno anche mostrato un movimento confinato.

Figura 4: Funzioni di scattering intermedie a diversi numeri d'onda per reti di vimentine. L'ISF è tracciato in funzione del tempo di ritardo per valori q da circa 1 a 9 ^μm-1. (A) L'ISF da immagini di perline da 0,6 μm in una rete di vimentine con concentrazione di vimentina di 19 μM. (B) L'ISF da immagini di perline da 0,6 μm in una rete di vimentine con concentrazione di vimentina di 34 μM. Il lungo plateau temporale dell'ISF ad un valore ben al di sopra dello zero indica la non ergodicità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Dato che le dinamiche sono probabilmente non ergodiche, gli ISF sono adatti alla forma , dove C è il fattore di non ergodicità ³². Questa forma di ISF è stata utilizzata in precedenti studi di dinamica non ergodica, come quella dei gel colloidali^32,74 o delle particelle traccianti nelle reti actina-microtubulo ¹⁰. Le linee nere tratteggiate nella Figura 4 mostrano gli adattamenti insieme ai dati. Da questi adattamenti, si può ora guardare alla q-dipendenza del tempo di decadimento, τ, e del parametro di non ergodicità, C.

Figura 5: Tempo di decadimento rispetto al numero d'onda per le reti di vimentine. Dagli adattamenti all'ISF, il tempo di decadimento τ è determinato per un intervallo di valori q . Per chiarezza, non stiamo mostrando il valore di τ per ogni q, ma solo un insieme spaziato logaritmicamente. In blu (tan) sono i dati delle immagini di perline da 0,6 μm all'interno di reti di vimentine con una concentrazione di vimentina di 19 μM (34 μM). Le barre di errore rappresentano le deviazioni standard in τ su più filmati (quattro filmati per i dati con la rete da 19 μM [blu] e cinque filmati per i dati con la rete da 34 μM [tan]). Le linee tratteggiate dal trattino rosso segnano i limiti stimati per la nostra risoluzione temporale e spaziale, come descritto nei risultati. La linea nera continua mostra il ridimensionamento, che indicherebbe il movimento diffusivo. Nessuno dei due set di dati segue questo ridimensionamento. Piuttosto, le perline nella rete da 19 μM mostrano un movimento subdiffusivo (con β > 2) e le perline nella rete da 34 μM mostrano un movimento confinato o ingabbiato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I tempi di decadimento hanno mostrato una grande quantità di incertezza, sia agli estremi q bassi che q alti, come si vede nella Figura 5. Le barre di errore su questo grafico mostrano la deviazione standard tra quattro video analizzati per il caso di concentrazione di vimentina più bassa o cinque video analizzati per la concentrazione più alta. Per comprendere la fonte della grande incertezza a questi estremi, considera sia la risoluzione temporale che spaziale. I limiti approssimativi della risoluzione sono mostrati con tre linee tratteggiate rosse. Le due linee orizzontali corrispondono ai tempi di ritardo minimo e massimo sondati. Dato il frame rate di 100 fotogrammi/s e il tempo di ritardo massimo corrispondente a 1000 fotogrammi (20% della durata totale del video), la precisione è stata persa quando si misurano dinamiche che si verificano più velocemente di 0,01 s o più lente di 10 s. Ai valori q più bassi, i valori adattati per τ erano superiori a 10 s. Pertanto, ci si dovrebbero aspettare grandi incertezze nei tempi di decadimento che sono maggiori del tempo massimo di ritardo. All'estremità superiore del q-range, il tempo di decadimento si avvicinava al tempo minimo di ritardo di 0,01 s, ma rimaneva al di sopra di esso. Piuttosto che essere limitata dalla risoluzione temporale, a questi valori q più alti, la risoluzione spaziale può essere il fattore limitante. Data la dimensione dei pixel di 0,13 μm, il valore più grande per q era di circa 24 ^μm-1. Tuttavia, la risoluzione limitata alla diffrazione non consente necessariamente misurazioni accurate della dinamica a queste alte frequenze spaziali. Approssimando la risoluzione ottica come si ottiene un limite superiore del numero d'onda di circa 16 ^μm-1, data l'apertura numerica della lente dell'obiettivo, NA, di 1,4 e la lunghezza d'onda della luce, . Questo è contrassegnato dalla linea tratteggiata rossa verticale nella Figura 5. In effetti, i dati erano rumorosi a grandi valori di q. Anche prima di questo limite superiore approssimativo di q, si è visto un aumento dell'incertezza in τ, e questo potrebbe derivare dalla sopravvalutazione di q_max. Una risoluzione ottica più scarsa del previsto può essere dovuta al fatto che una lente ad immersione in olio è stata utilizzata per visualizzare oltre il coverslip in un campione acquoso o perché la lente del condensatore era allineata in modo imperfetto.

Per le perle da 0,6 μm incorporate nella rete meno concentrata (19 μM di vimentina), si può osservare dal grafico log-log del tempo di decadimento rispetto al numero d'onda che il tempo di decadimento è diminuito con il numero d'onda in modo coerente con una legge di potenza (Figura 5). Tuttavia, non sembra seguire ciò che ci si aspetterebbe per il normale movimento diffusivo, dove . Piuttosto, τ diminuì più bruscamente con l'aumento di q. Questo è indicativo del movimento subdiffusivo, che spesso si verifica per le perline in ambienti affollati come questi. L'adattamento di τ(q) nell'intervallo da 1,4 ^μm-1 a 12,3 ^μm-1 a una legge di potenza della forma τ = 1/Kq^β produce i parametri di trasporto K = 0,0953 μm^β / s e β = 2,2. Per coloro che sono più abituati a pensare alla diffusione normale rispetto alla sottodiffusione in termini di spostamento quadrato medio (MSD) delle particelle traccianti in funzione del tempo di ritardo (cioè MSD = K' Δt^α), è utile riconoscere che l'esponente di scala subdiffusivo nell'equazione MSD, α, è equivalente a α = 2 / β. In altre parole, il valore di β = 2,2 è coerente con un esponente di scala subdiffusivo nell'equazione MSD di α = 0,9. Si imposterebbe PyDDM per adattarsi a τ(q) su questo intervallo di valori q specificando gli indici della matrice di q con il parametro Good_q_range nel file YAML o passando l'argomento opzionale forced_qs alla funzione generate_fit_report. L'intervallo di q da 1,4 ^μm-1 a 12,3 ^μm-1 corrisponderebbe, per i dati qui, agli indici della matrice di q da 15 a 130.

Per le perle da 0,6 μm nella rete più concentrata (34 μM), il tempo di decadimento ha mostrato poca dipendenza da q. Ciò è probabilmente dovuto alla non ergodicità delle perline in una rete con una dimensione di maglia più piccola. Per sondare la non-ergodicità in questo sistema, il parametro non ergodicità, C, dovrebbe essere tracciato in funzione di q, come nella Figura 6. Per le perle da 0,6 μm nella rete di vimentine da 19 μM, C ≈ 0,2 con poca dipendenza da q (non mostrato). Tuttavia, per la rete con vimentina da 34 μM e per una rete con una concentrazione ancora più elevata di 49 μM di vimentina, il log di C era proporzionale a q² come mostrato nella Figura 6. Questa relazione tra C e q è prevista per il moto confinato. Per le perline intrappolate all'interno delle tasche della rete, ci si aspetta che l'MSD si stabilizzi a tempi di ritardo abbastanza lunghi (ad esempio, , dove è il MSD e δ² è il MSD massimo). Poiché l'ISF può essere espresso in termini di MSD come , e poiché l'ISF non ergodico va a C a lunghi tempi di ritardo (cioè ), la relazione è ottenuta^32,75. Pertanto, si può usare C(q) per trovare δ², e questo ha prodotto δ² = 0,017 μm² e 0,0032 μm² per le reti di vimentine da 34 e 49 μM, rispettivamente (corrispondenti a δ = 0,13 μm e 0,057 μm).

Figura 6: Parametro di nonergodicità rispetto al numero d'onda per le reti di vimentine. Dagli adattamenti all'ISF, il parametro di non ergodicità C viene determinato per un intervallo di valori q . In tan (rosso) sono i dati provenienti dalle immagini di perline da 0,6 μm all'interno di reti di vimentine con una concentrazione di vimentina di 34 μM (49 μM). Le barre di errore rappresentano le deviazioni standard in τ su più filmati (cinque filmati per i dati con la rete da 34 μM [tan] e quattro filmati per i dati con la rete da 49 μM [rosso]). L'asse y ha una scala logaritmica. Si osserva una q-dipendenza di C che segue , che consente di estrarre lo spostamento quadrato medio massimo, δ². Gli adattamenti a sono mostrati con le linee continue. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Si possono usare altri metodi per estrarre la dimensione del confinamento δ dai dati e l'esponente subdiffusivo trovato dall'esame di τ(q) per le perline all'interno della rete di vimentine da 19 μM. In primo luogo, si può usare il metodo descritto da Bayles et ^al.76 e Edera et ^al.77 per estrarre la MSD dalla matrice DDM. In particolare, questo metodo non richiede alcun adattamento della matrice DDM. Basta calcolare la matrice DDM, D(q, Δt) e (da cui È possibile determinare A(q) e B ). Quindi, per trovare il MSD, si usa la relazione . Si noti che questo metodo per trovare l'MSD presuppone che la distribuzione degli spostamenti delle particelle sia gaussiana, anche se lavori precedenti hanno dimostrato che, in alcuni casi, i DMS derivati da DDM concordano con i DMS dal tracciamento delle particelle, anche quando gli spostamenti non sono gaussiani⁷³. Per questo sistema, come previsto⁷⁸, c'è non-gaussianità nella distribuzione dei grandi spostamenti, come si vede nella Figura S1. Nel pacchetto PyDDM, la funzione extract_MSD deve essere eseguita, che restituisce . In secondo luogo, si può usare il tracciamento di singole particelle per trovare il MSD. Sebbene il DDM possa essere utilizzato per analizzare immagini in cui l'alta densità di particelle o la limitata risoluzione ottica vietano una localizzazione accurata delle particelle, per le immagini di perline da 0,6 μm nelle reti di vimentine, siamo stati in grado di localizzare e tracciare le perline utilizzando il software trackpy (https://github.com/soft-matter/trackpy)⁷⁹. Questo pacchetto software di tracciamento delle particelle utilizza gli algoritmi descritti da Crocker e Grier⁸⁰.

Figura 7: Spostamento medio al quadrato rispetto al tempo di ritardo per le reti di vimentine. Il MSD è stato determinato utilizzando due metodi. Innanzitutto, il MSD è stato calcolato dalla matrice DDM (mostrata con simboli solidi). Successivamente, l'MSD è stato determinato utilizzando il tracciamento a singola particella (SPT) per trovare traiettorie di particelle (simboli aperti). Le barre di errore vengono determinate nello stesso modo descritto nelle due legende di figure precedenti. (A) I DMS per perline da 0,6 μm nella rete di vimentine da 19 μM indicano un moto subdiffusivo, con un buon accordo tra i due metodi di individuazione del MSD. (B) I DMS per perline da 0,6 μm nella rete di vimentine da 49 μM indicano un movimento in gabbia, con un buon accordo tra i due metodi di ricerca del MSD e con il MSD massimo trovato dal parametro non ergodicità. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I DMS rispetto al tempo di ritardo per le perle da 0,6 μm nella rete di vimentine da 19 μM e nella rete di vimentine da 49 μM sono mostrati nella Figura 7. In entrambi i casi, il MSD determinato da DDM concordava bene con il MSD trovato attraverso il single-particle tracking (SPT). Inoltre, per la rete meno concentrata, l'esponente di scala subdiffusivo (α in ) era di circa 0,9. Questo è coerente con il ridimensionamento τ(q) di trovato adattando l'ISF per determinare τ(q) (cioè, 2/2.2 = 0.9). Per la rete più concentrata, l'MSD si stabilizza a tempi di ritardo più lunghi. Il MSD massimo trovato analizzando la q-dipendenza del parametro non ergodicità (mostrato nella Figura 7B con la linea orizzontale a δ² = 0,0032 μm²) era approssimativamente lo stesso valore verso cui i DMS di SPT e DDM sembravano stabilizzarsi. Esiste una discrepanza tra i DMS con il tempo di ritardo più lungo determinato da DDM e SPT nella Figura 7A. Mentre ciò può essere dovuto a un numero limitato di traiettorie di tempo di ritardo lungo, potrebbe anche essere il caso che un'ulteriore ottimizzazione dell'intervallo di valori q per i quali la matrice DDM viene utilizzata per stimare ogni tempo di ritardo (come fatto da Bayles et al.76 e Edera et ^al.77) migliorerebbe i nostri risultati, e tale ottimizzazione sarà al centro del lavoro futuro.

Questi esperimenti in cui sono state registrate sequenze di immagini di perline traccianti incorporate in una rete di filamenti intermedi di vimentina hanno permesso analisi indipendenti: DDM (utilizzando il pacchetto descritto qui) e SPT (utilizzando trackpy). Entrambe le analisi possono rivelare il grado di sottodiffusione e lunghezza di confinamento, consentendo di utilizzare due tecniche di analisi delle immagini indipendenti per fornire metriche complementari. Ci sono quantità aggiuntive che si possono confrontare da SPT e DDM. Ad esempio, l'eterogeneità nella dinamica del campione può rivelarsi come non-gaussianità nella distribuzione degli spostamenti di particelle (cioè la distribuzione di van Hove) determinati da SPT, così come in un ISF determinato da DDM che si adatta a un esponenziale allungato^34,35. La Figura S1 mostra la distribuzione di van Hove per le particelle da 0,6 μm nelle reti di vimentine e discute l'esponente di allungamento trovato dall'adattamento degli ISF, metriche utilizzate in tandem in studi precedenti per dimostrare la dinamica eterogenea delle particelle all'interno di sistemi biomimetici ^9,10,47 o altri ambienti ^{affollati 34} . Come altro esempio, l'ISF può essere calcolato dalle traiettorie delle particelle misurate con SPT e confrontato con gli ISF acquisiti da DDM. Mentre gli spostamenti quadrati medi e le distribuzioni di spostamento sono le metriche più spesso estratte dall'analisi SPT, si può anche calcolare l'ISF dalle traiettorie delle particelle, utilizzando (vedi Figura S2). Questo ISF può essere confrontato con gli ISF generati da DDM e utilizzato per rivelare dinamiche non evidenti nella MSD⁵⁹.

Mentre l'acquisizione di immagini di particelle traccianti all'interno di una rete può consentire di utilizzare i metodi di analisi complementari di SPT e DDM, è importante notare che un vantaggio di DDM rispetto a SPT è che non richiede immagini di perline (o altre caratteristiche) che possono essere facilmente localizzate e tracciate. Per dimostrare questo punto, evidenziamo poi l'analisi delle reti attive di filamenti di actina e microtubuli, dove l'etichettatura fluorescente di actina e tubulina consente l'imaging di entrambi i tipi di filamenti, distinti l'uno dall'altro tramite diversi fluorofori, con un microscopio confocale a scansione laser multicolore.

Le immagini sono state acquisite con un microscopio confocale a scansione laser di reti di actina-microtubuli con attività guidata dalla miosina (miosina del muscolo scheletrico di coniglio II; Citoscheletro #MY02). I dettagli degli esperimenti e dei risultati sono stati precedentemente descritti¹¹, e i risultati rappresentativi mostrati qui provengono dall'analisi di due film forniti nei materiali supplementari (film S1 e S4) per¹¹. Entrambe le sequenze di immagini sono state registrate a 2,78 fotogrammi/s per 1000 fotogrammi.

Per analizzare queste immagini, la matrice DDM è stata calcolata per 50 tempi di ritardo che vanno da 0,4 s a 252 s (da 1 fotogramma a 700 fotogrammi). La matrice DDM è stata quindi adattata al modello , con la funzione di scattering intermedia che è . Esistono, quindi, quattro parametri di adattamento: A, τ, s e B. I risultati di questi adattamenti sono mostrati nella Figura 8. È stato osservato che la matrice DDM per un particolare valore q aveva un plateau a tempi di ritardo bassi, aumentava con il tempo di ritardo e poi si stabilizzava (o mostrava segni di inizio del plateau) in ampi tempi di ritardo. La matrice DDM per i valori più bassi di q non ha raggiunto un plateau a lunghi tempi di ritardo. Ci si dovrebbe quindi aspettare una scarsa precisione nella misurazione del tempo di decadimento per queste dinamiche q basse (grande scala di lunghezza).

I tempi di decadimento caratteristici, τ, dagli adattamenti alla matrice DDM sono mostrati nella Figura 9. I risultati sono presentati per una rete composita actina-microtubuli attiva (simile al film S1¹¹) e per una rete di actina attiva (simile al film S4¹¹). Entrambe le reti sono state preparate con le stesse concentrazioni di actina e miosina, ma la rete di sola actina è stata creata senza tubulina, come descritto in¹¹. Per questi due tipi di reti attive, la relazione osservata con la legge di potere era . Questo ridimensionamento indica il movimento balistico e che la contrazione e il flusso guidati dalla miosina dominano sul movimento termico dei filamenti. Da τ = (vq)^-1, si poteva trovare una velocità caratteristica, v, di circa 10 nm/s per la rete attiva actina-microtubulo e 75 nm/s per la rete attiva di actina. Questi valori sono coerenti con l'analisi velocimetrica dell'immagine delle particelle degli stessi video mostrati in¹¹. Il ridimensionamento non si è mantenuto ai valori q più bassi per la rete composita actina-microtubulo attivo. Ciò è probabilmente dovuto al fatto che i veri tempi di decadimento per questa rete composita actina-microtubulo ai valori q più bassi sono più lunghi del tempo di ritardo massimo della matrice DDM calcolata. Il tempo massimo di ritardo è indicato con la linea rossa orizzontale nella Figura 9 e i tempi di decadimento deviati dal ridimensionamento previsto vicino a questi tempi più lunghi.

Figura 8: Matrice DDM vs. tempo di ritardo per una rete composita actina-microtubulo attiva. La matrice DDM per diversi valori di q viene tracciata in funzione del tempo di ritardo da un film di una rete composita composta da monomeri di actina da 2,9 μM, dimeri di tubulina da 2,9 μM e miosina da 0,24 μM. Questi dati mostrano l'analisi del solo canale dei microtubuli di una serie temporale multicolore di immagini. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 9: Tempo di decadimento rispetto al numero d'onda per le reti attive actina-microtubulo. Dal montaggio della matrice DDM, si trova il tempo di decadimento, τ, in funzione del numero d'onda, q. Plotted è τ vs q per le immagini di una rete attiva di actina-microtubuli (analizzando solo il canale dei microtubuli) in marrone e per le immagini di una rete di actina attiva in verde. Entrambe le reti hanno le stesse concentrazioni di actina e miosina (rispettivamente 2,9 μM e 0,24 μM); il composito actina-microtubulo ha 2,9 μM di dimeri di tubulina. I tempi di decadimento per la rete di actina attiva sono molto più piccoli dei tempi di decadimento per la rete attiva actina-microtubulo, il che indica un movimento più veloce della rete di actina attiva. In entrambi i casi, le dinamiche sono balistiche in quanto i dati seguono una tendenza. Inserto: il grafico degli ISF rispetto al tempo di ritardo scalato dal numero d'onda (Δt × q) mostra un collasso degli ISF su un intervallo di valori q . Questo indica anche un movimento balistico. Gli ISF mostrati in questo inserto provengono dalla rete actina attiva. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per questi dati di reti attive, abbiamo scelto di adattare la matrice DDM, . Ciò contrasta con quanto fatto per i dati delle perline nella rete delle vimentine, dove A (q) e B sono stati stimati senza alcun adattamento per isolare l'ISF, f (q, Δt). In questo caso, per i dati di rete attivi, A e B sono stati lasciati come parametri di adattamento perché i metodi utilizzati per stimare B non hanno portato a buoni adattamenti. Il metodo predefinito per stimare B è calcolare e assumere che, in generale q, questo vada a B/2. Tuttavia, questo metodo ha sovrastimato B per questi dati, il che è stato visto nel fatto che, quando si calcolano gli ISF da B stimati in questo modo (non mostrato), gli ISF erano maggiori di 1 nei primi tempi di ritardo (mentre dovrebbero passare da un massimo di 1 a zero o qualche parametro di non ergodicità con l'aumentare del tempo di ritardo). È possibile selezionare altri metodi per stimare B utilizzando il parametro background_method. Uno di questi altri metodi consiste nel stimare che B sia il minimo della matrice DDM nei primi tempi di ritardo (impostato con background_method = 1). Un metodo simile è stato usato da Bayles et ^al.76, anche se non hanno assunto che B fosse costante con q. Un'altra opzione è quella di stimare B come valore medio su tutti i tempi di ritardo della matrice DDM al massimo q (impostato con background_method = 2). Questi diversi metodi per stimare lo sfondo, così come i risultati per consentire a B di essere un parametro di raccordo libero, sono mostrati nella Figura 10. Da questi grafici, si può vedere che l'ampiezza, A, non ha raggiunto lo zero ai più grandi valori q sondati, poiché non si è stabilizzata a grande q (Figura 10B), e poiché D (q_max, Δt) è passato da un plateau temporale di ritardo inferiore a un plateau temporale di ritardo più alto (cioè, a q_max, c'era un A diverso da zero; Figura 10D). Pertanto, non sarebbe opportuno né stimare B come né come sarebbe appropriato. Si dovrebbe ispezionare vs. q e D(q_max, Δt) vs. Δt prima di decidere come (o se) stimare B.

Figura 10: Background vs. numero d'onda per reti attive di actina-microtubuli. Dal montaggio della matrice DDM, si può trovare lo sfondo, B, in funzione del numero d'onda, q. Mostrato è B vs. q per le immagini di una rete attiva di actina-microtubuli (analizzando solo il canale dei microtubuli) determinato da questi si adatta ai simboli viola. Le tre linee continue in (A) mostrano le stime dello sfondo trovato senza alcun adattamento. La linea più scura in alto in (A) mostra lo sfondo stimato usando , che può essere appropriato se si stabilizza a un valore costante a grande q. Da (B), si noti che deve ancora raggiungere un valore costante al più grande q sondato. Pertanto, l'utilizzo di questo metodo sovrastima lo sfondo. La riga di fondo in (A) mostra lo sfondo stimato utilizzando . Se la matrice DDM mostra un plateau di tempo di ritardo basso come mostrato in (C) con la linea rossa, questo metodo può essere appropriato per stimare lo sfondo. La linea centrale più chiara in (A) mostra lo sfondo stimato da . Questo metodo può essere appropriato se, a q_max, l'ampiezza, A, ha raggiunto lo zero. Da (D), si vede che l'ampiezza è diversa da zero e, quindi, questo metodo sovrastima lo sfondo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura supplementare S1: Distribuzioni di probabilità degli spostamenti delle particelle. Le distribuzioni di probabilità degli spostamenti delle particelle mostrano una non gaussianità per concentrazioni di vimentine di 34 μM e 49 μM. Il tracciamento a singola particella di perline di 0,6 μm di diametro è stato eseguito in reti di vimentine di diverse concentrazioni. Diversi tempi di ritardo sono mostrati nelle distribuzioni di spostamento per le tre condizioni. (A) La distribuzione degli spostamenti di particelle in una rete di vimentine da 19 μM è adatta a una funzione gaussiana. La larghezza del gaussiano aumenta con l'aumentare del tempo di ritardo. (B) La distribuzione degli spostamenti di particelle in una rete di vimentine da 34 μM mostra più non gaussianità, specialmente a grandi spostamenti, rispetto al caso di 19 μM. (C) Anche la distribuzione degli spostamenti delle particelle in una rete di vimentine da 49 μM mostra una non gaussianità. Inoltre, le larghezze delle distribuzioni non aumentano con il tempo di ritardo in modo significativo come nei campioni con concentrazioni di vimentina più basse, indicando un movimento confinato. Le distribuzioni non gaussiane di van Hove (viste per tutti i campioni di vimentine ma più evidenti nelle concentrazioni più elevate) sono associate a dinamiche eterogenee come spesso si vede nel trasporto di particelle in ambienti affollati e confinati. Un altro indicatore di trasporto eterogeneo che viene determinato dall'analisi DDM è l'esponente di allungamento utilizzato per adattarsi alla funzione di scattering intermedia (il parametro s nell'equazione per l'ISF usato qui: + ). Gli esponenti medi di allungamento nell'intervallo q da 0,4 ^μm-1 a 9,4 ^μm-1 sono, dalla più alta concentrazione di vimentina alla più bassa, 0,53 ± 0,07, 0,64 ± 0,02 e 0,86 ± 0,04 (deviazione media ± standard). Fare clic qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S2: Le funzioni di scattering intermedie di DDM e SPT. Vengono mostrate le funzioni di scattering intermedio (ISF) per cinque diversi numeri d'onda. L'ISF rispetto al tempo di ritardo trovato attraverso DDM è tracciato con marcatori circolari e l'ISF calcolato da traiettorie a particella singola con quadrati aperti. Le linee nere tratteggiate mostrano gli adattamenti agli ISF acquisiti da DDM. L'ISF viene calcolato da traiettorie a particella singola, , utilizzando . In (A), l'ISF è mostrato per particelle da 0,6 μm nelle reti di vimentine da 19 μM. In (B), l'ISF è mostrato per particelle da 0,6 μm nelle reti di vimentine da 34 μM. Le discrepanze nelle ISF rilevate da DDM e SPT sono probabilmente dovute a un numero limitato di traiettorie temporali di ritardo lungo. Fare clic qui per scaricare questo file.

File 1 supplementare: Protocollo per l'utilizzo di DDM. Vengono presentati l'input e l'output dei passaggi mostrati nel protocollo. Fare clic qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: Dettagli sulla preparazione del campione e file di parametri di esempio per reti di vimentin. Vengono forniti passaggi dettagliati per la preparazione dei campioni e l'acquisizione di immagini sulle reti di vimentine. Inoltre, viene fornito anche un file di parametri di esempio per l'analisi dei dati presentati nella sezione dei risultati rappresentativi sulle reti di vimentin. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussion

Il pacchetto software qui descritto utilizza DDM per analizzare le fluttuazioni di densità osservate nelle immagini acquisite utilizzando un microscopio ottico. Sono stati mostrati per la prima volta i risultati rappresentativi dei dati delle particelle traccianti incorporate nelle reti di vimentine. L'analisi di tali dati può essere utilizzata per caratterizzare la dimensione e la rigidità delle maglie della rete in modo simile a come il tracciamento delle singole particelle è stato utilizzato in molti studi precedenti sulle reti di citoscheletri ^6,12,13. Un vantaggio dell'utilizzo di DDM rispetto al tracciamento di singole particelle è che DDM non richiede la localizzazione delle particelle. Pertanto, anche nelle immagini in cui la densità delle particelle è troppo alta o le particelle troppo piccole per localizzarsi e tracciare, DDM può ancora determinare la dinamica. Dove il tracciamento di singole particelle sarebbe vantaggioso è quando si ispeziona la variabilità da particella a particella. Con DDM, si trova la dinamica media dell'insieme mentre, con il tracciamento di singole particelle, si può calcolare sia l'MSD di una singola particella che il MSD medio dell'insieme. Tuttavia, DDM può essere utilizzato per studiare dinamiche eterogenee analizzando più regioni di interesse all'interno di un ampio campo visivo.

Successivamente, sono stati mostrati i risultati rappresentativi dei dati dei filamenti marcati fluorescentemente in una rete attiva composta da due tipi di filamenti citoscheletrici marcati in modo diverso¹¹. Con questi dati, il movimento balistico è stato caratterizzato senza bisogno di alcuna caratteristica localizzabile all'interno dell'immagine. Poiché DDM estrae la dinamica media dell'insieme con pochi input dell'utente, rende semplice il confronto di serie di immagini acquisite con condizioni diverse (ad esempio, confrontando campioni con diversi rapporti di actina a microtubuli o campioni con diverse concentrazioni di miosina, come fatto in⁵⁰). Inoltre, utilizzando l'imaging fluorescente, possiamo studiare le dinamiche di diversi componenti di una rete utilizzando l'etichettatura multicolore. Questo è stato fatto in^11,50, dove la dinamica dell'actina e dei microtubuli è stata analizzata separatamente in una rete composita attiva actina-microtubulo utilizzando l'imaging multicolore. Nella sezione dei risultati rappresentativi qui, sono stati mostrati solo i risultati del canale dei microtubuli, ma nel lavoro precedente abbiamo confrontato la dinamica dei filamenti di microtubuli e actina¹¹.

Notiamo che questi risultati rappresentativi mostrano una sottodiffusione passiva o un movimento balistico attivo. È importante sottolineare che DDM può essere utilizzato per analizzare sistemi in cui vi è un crossover nel tipo di dinamica a scale di tempo o lunghezza intermedie. Come esempi, Kurzthaler et al. hanno usato DDM con un sistema di colloidi Janus attivi per esplorare il movimento diretto attivo su scale temporali brevi e la randomizzazione dell'orientamento su scale temporali più lunghe⁵⁹; Giavazzi et al. hanno usato DDM con una schiuma grossolana e hanno trovato un crossover nella dinamica corrispondente alla scala di lunghezza di una bolla³³; e Cho et al. hanno usato DDM con gel colloidali e hanno trovato tre regimi distinguibili a diverse scale di lunghezza che vanno dai cluster frattali all'intera rete³².

I dati inclusi nella sezione dei risultati rappresentativi sono stati acquisiti con microscopia a campo luminoso e microscopia confocale a scansione laser. Tuttavia, come notato in precedenza, DDM può essere utilizzato con molte modalità di imaging. Con qualsiasi modalità di imaging, gli utenti dovrebbero considerare le impostazioni ottiche come il grado di sezionamento ottico o la profondità di campo. Un alto grado di sezionamento ottico può ridurre il segnale da oggetti fuori fuoco, ma non si sarà in grado di misurare con precisione la dinamica su scale temporali superiori alla scala temporale in cui gli oggetti si spostano fuori dalla profondità di campo^25,28. Una discussione più approfondita di come la profondità di campo q-dipendente influisce sull'analisi DDM può essere trovata in²². Per l'imaging a campo luminoso, gli utenti potrebbero anche dover considerare lo spessore del campione. Mentre per i campioni a dispersione debole, i campioni più spessi possono fornire più segnale⁴², i campioni torbidi possono richiedere la modifica dell'analisi per tenere conto dello scattering multiplo⁸¹. Infine, per i metodi di imaging che non sono invarianti dello spazio lineare (cioè, dove l'intensità registrata dalla telecamera di un oggetto dipende da dove si trova quell'oggetto nel piano del campione x-y), potrebbe essere necessario tenere conto della varianza dello spazio lineare, come dimostrato con il campo oscuro DDM²⁷.

Per coloro che iniziano con DDM, desideriamo sottolineare l'importanza di considerare la risoluzione spaziale e temporale. Quando si ispezionano i tempi di decadimento determinati in funzione del numero d'onda, è importante contrassegnare i limiti della propria risoluzione (cioè i tempi di ritardo massimo e minimo e il numero d'onda massimo, come fatto nella Figura 5). Si dovrebbe riflettere attentamente su questi limiti prima di raccogliere dati in modo da poter selezionare l'obiettivo obiettivo ottimale, le dimensioni dell'immagine, la frequenza dei fotogrammi e la durata del filmato. L'altra considerazione importante è come stimare il parametro di sfondo B. In letteratura sono stati utilizzati diversi metodi per stimare il background e gli effetti della sovrastima o della sottostima di B sono stati descritti in precedenti pubblicazioni^62,77. Come mostrato nella Figura 10, PyDDM consente agli utenti di implementare diversi metodi per stimare B e suggeriamo ai nuovi utenti di provare questi metodi e valutare quali sono appropriati da usare.

Un punto di forza di questo pacchetto è la sua documentazione approfondita e le procedure dettagliate con dati di esempio, l'archiviazione e l'organizzazione dei metadati per tenere traccia di come sono state eseguite le analisi e la flessibilità su come analizzare la matrice DDM (vari modelli di raccordo, più metodi per stimare il parametro di sfondo B, la capacità di trovare il MSD). Tuttavia, ci sono diversi aspetti di questo codice che potrebbero essere migliorati. Attualmente, il codice non è stato ottimizzato per una velocità di calcolo elevata. I metodi per accelerare il calcolo sono stati segnalati^61,62 e questi saranno implementati nelle versioni future. Inoltre, abbiamo in programma di implementare metodi recentemente riportati per stimare meglio le incertezze e impiegare simulazioni per guidare gli utenti verso il modello ISF⁶² appropriato. Per altri miglioramenti, speriamo che gli utenti ci contatteranno con suggerimenti.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fotocamera CMOS, Orca-Flash 4.0	Hamatsu
F-127 Pluronic	Sigma Aldrich
Jupyter Notebook
Nanodrop	Thermo Fisher
Nikon Microscopio Ti-Eclipse	Nikon
PLL-PEG-bio	SuSos AG, Dü bendorf, Svizzera
Perline di polistirene	Sigma Aldrich
Minicassetta per dialisi proteica	Thermo Fisher
PyDDM	Università di San Diego	N/A Software	open source disponibile da https://github.com/rmcgorty/PyDDM