Quantificazione della dinamica del citoscheletro mediante microscopia dinamica differenziale

Il nostro protocollo è in grado di quantificare la dinamica in molti sistemi utilizzando una gamma di tecniche di microscopia ottica. Evidenziamo come questo metodo possa, in particolare, aiutare a caratterizzare la dinamica delle reti di citoscheletri ricostituiti. Il vantaggio principale dell'utilizzo del nostro pacchetto software di microscopia dinamica differenziale è che è ben documentato, ha più file di analisi di esempio e può essere facilmente adattato per studiare diversi tipi di dinamica.

Il nostro pacchetto software può essere utilizzato per quantificare le dinamiche non solo in reti di citoscheletri ricostituite, ma anche in altri materiali morbidi e biologicamente rilevanti. In base alle scale di tempo e lunghezza per sondare acquisire sequenze di immagini di oltre 1.000 fotogrammi utilizzando software di controllo del microscopio, come Micro-Manager. Nella cartella degli esempi fornita nel repository di codice PyDDM, creare una copia del file di parametri denominato example_parameter_file.yml.

Apri questo file EML con un editor di testo come Notepad + o l'editor di testo in JupyterLab. Nel file EML copiato, specificare la directory dei dati e il nome del file corrispondenti alla sequenza di immagini da analizzare. Nella sezione dei metadati, fornisci la dimensione dei pixel e la frequenza dei fotogrammi.

Nella sezione dei parametri di analisi, selezionare i parametri per il calcolo della matrice DDM, ad esempio il numero di diversi tempi di ritardo e il tempo di ritardo più lungo. Fornite dettagli sul raccordo della matrice DDM o sulla funzione di scattering intermedia nella sezione dei parametri di raccordo, ad esempio il nome del modello e il parametro del modello, l'ipotesi iniziale, il limite inferiore e il limite superiore. Inizializzare un'istanza della classe di analisi DDM fornendo i metadati nei parametri di analisi passando il nome file del file EML con il percorso completo del file all'analisi DDM.

In alternativa, passare i metadati e i parametri come struttura di dati del dizionario Python. Eseguire la funzione per calcolare la matrice DDM. Esaminare i dati restituiti con le variabili e i metadati associati, archiviati come dataset nel pacchetto Xarray.

Quindi, ispezionare i grafici e le figure, che vengono salvati come file PDF e la directory dei dati. Uno di questi grafici mostra il metodo predefinito per la stima dello sfondo. Se necessario, modificare il metodo in cui viene stimato lo sfondo utilizzando il metodo di sfondo del parametro nel file EML o come argomento di parola chiave facoltativo per la matrice DDM di calcolo della funzione.

Inizializzare un'istanza della classe DDM fit passando il nome del file EML contenente i metadati dell'immagine e i parametri di raccordo. Elencare i modelli disponibili eseguendo i modelli di raccordo di stampa funzione. Specificate il modello da utilizzare nel file dei parametri EML o utilizzando la funzione reload fit model in base al nome.

Per ogni parametro nel modello scelto, impostare le ipotesi e i limiti iniziali se diversi dai valori specificati nel file EML utilizzando le funzioni imposta l'ipotesi iniziale del parametro e imposta i limiti dei parametri. Esegui l'adattamento con la funzione adatta. Generare grafici per ispezionare gli adattamenti nella dipendenza q dei parametri di adattamento con il report di adattamento della funzione.

Controllare l'output, inclusa la figura con sottotrame due per due, che mostrano la matrice DDM o ISF a quattro valori q insieme all'adattamento. Utilizzare la classe browse DDM fits in the Jupyter Notebook environment per tracciare la matrice DDM o ISF insieme alla soluzione migliore in modo interattivo. Facendo clic su un punto nel tempo di decadimento rispetto al grafico del numero d'onda verranno visualizzati i dati e l'adattamento.

Controllare i risultati dell'adattamento salvato in un set di dati Xarray e utilizzare la funzione due netCDF o il modulo pickle integrato di Python per salvare questa struttura di dati su disco. L'analisi DDM è stata eseguita sulla serie di immagini a campo luminoso di perline da 0,6 micron in una rete di vimentine e immagini al microscopio confocale da una rete composita attiva actina-microtubulo con etichette fluorescenti spettralmente distinte. Le funzioni di scattering intermedie sono state tracciate in funzione del tempo di ritardo a diversi numeri d'onda e di una rete con una concentrazione di vimentina di 19 micromolari e 34 micromolari.

Il lungo plateau temporale di ritardo della funzione a un valore ben superiore a zero indica la non ergodicità. Il tempo di decadimento tau tracciato in funzione di q per due reti con diverse concentrazioni di vimentine mostrano un moto sub-diffusivo o confinato. I parametri di non ergodicità c tracciati in funzione di q al quadrato per la rete con vimentina micromolare 34 e 49 hanno mostrato che il log di c era proporzionale a q al quadrato come previsto per il moto confinato.

I grafici medi di spostamento quadrato rispetto al tempo di ritardo hanno mostrato che i valori determinati da DDM concordavano bene con quelli trovati attraverso il tracciamento di singole particelle. Per la rete più concentrata, il valore si stabilizza a tempi di ritardo più lunghi. La matrice DDM rispetto al tempo di ritardo per una rete composita attiva actina-microtubulo ha mostrato che la matrice DDM per un particolare valore q aveva un plateau a tempi di ritardo bassi, quindi aumentava in ulteriori plateau in tempi di ritardo ampi.

I tempi di decadimento caratteristici tau dagli adattamenti alla matrice DDM mostrano che la relazione tra tau e q indica un movimento balistico. Dopo aver sviluppato questo pacchetto software PyDDM, lo abbiamo usato per studiare le dinamiche anisotropiche e variabili nel tempo delle reti di citoscheletri attivi e di altri sistemi.