Summary
Den exakta identifieringen av fibro-adipogenic stamceller (FAPs) och muskelstamceller (MuSC) är avgörande för att studera deras biologiska funktion under fysiologiska och patologiska tillstånd. Detta protokoll ger riktlinjer för isolering, rening och odling av FAPs och MuSC från vuxna musmuskler.
Abstract
Fibro-adipogenic stamceller (FAPs) är en population av skelettmuskelboende mesenkymala stromaceller (MSC) som kan differentieras längs fibrogen, adilogen, osteogen eller kondrogen härstamning. Tillsammans med muskelstamceller (MuSC) spelar FAPs en kritisk roll i muskelhomeostas, reparation och regenerering, samtidigt som de aktivt upprätthåller och omformar den extracellulära matrisen (ECM). Vid patologiska tillstånd, såsom kronisk skada och muskeldystrofier, genomgår FAPs avvikande aktivering och differentieras till kollagenproducerande fibroblaster och adipocyter, vilket leder till fibros och intramuskulär fettinfiltration. Således spelar FAPs en dubbel roll i muskelregenerering, antingen genom att upprätthålla MuSC-omsättningen och främja vävnadsreparation eller bidra till fibrotisk ärrbildning och ektopiska fettinfiltrat, vilket äventyrar skelettmuskelvävnadens integritet och funktion. En korrekt rening av FAP och MuSC är en förutsättning för att förstå dessa cellers biologiska roll i fysiologiska såväl som i patologiska tillstånd. Här beskriver vi en standardiserad metod för samtidig isolering av FAPs och MuSC från lemmuskler hos vuxna möss med hjälp av fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Protokollet beskriver i detalj den mekaniska och enzymatiska dissociationen av mononukleerade celler från hela extremitetsmuskler och skadade tibialis främre (TA) muskler. FAPs och MuSC isoleras därefter med hjälp av en halvautomatisk cellsorterare för att erhålla rena cellpopulationer. Vi beskriver dessutom en optimerad metod för odling av vilande och aktiverade FAPs och MuSCs, antingen ensamma eller i samodlingsförhållanden.
Introduction
Skelettmuskeln är den största vävnaden i kroppen, som står för ~ 40% av vuxen mänsklig vikt och ansvarar för att upprätthålla hållning, generera rörelse, reglera basal energimetabolism och kroppstemperatur1. Skelettmuskeln är en mycket dynamisk vävnad och har en anmärkningsvärd förmåga att anpassa sig till en mängd olika stimuli, såsom mekanisk stress, metaboliska förändringar och dagliga miljöfaktorer. Dessutom regenererar skelettmuskeln som svar på akut skada, vilket leder till fullständig återställning av dess morfologi och funktioner2. Skelettmuskelns plasticitet är huvudsakligen beroende av en population av bosatta muskelstamceller (MuSC), även kallade satellitceller, som ligger mellan myofiberplasmamembranet och basal lamina 2,3. Under normala förhållanden bor MuSC i muskelnischen i vilande tillstånd, med bara några få divisioner för att kompensera för cellulär omsättning och för att fylla på stamcellspoolen4. Som svar på skada går MuSC: er in i cellcykeln, sprider sig och bidrar antingen till bildandet av nya muskelfibrer eller återgår till nischen i en självförnyelseprocess 2,3. Förutom MuSC är homeostatiskt underhåll och regenerering av skelettmuskeln beroende av stöd från en population av muskelboende celler som heter fibro-adipogena förfäder (FAPs)5,6,7. FAPs är mesenkymala stromaceller inbäddade i muskelbindvävnaden och kan differentieras längs fibrogen, adipogen, osteogen eller kondrogen härstamning 5,8,9,10. FAPs ger strukturellt stöd för MuSC eftersom de är en källa till extracellulära matrisproteiner i muskelstamcellsnischen. FAPs främjar också långsiktigt underhåll av skelettmuskeln genom att utsöndra cytokiner och tillväxtfaktorer som ger trofiskt stöd för myogenes och muskeltillväxt 6,11. Vid akut muskelskada sprider sig FAPs snabbt för att producera en övergående nisch som stöder den regenererande muskelns strukturella integritet och ger en gynnsam miljö för att upprätthålla MuSCs spridning och differentiering på ett parakrint sätt5. När regenereringen fortskrider rensas FAPs från den regenerativa muskeln genom apoptos, och deras antal återgår gradvis till basalnivå12. Men under förhållanden som gynnar kronisk muskelskada åsidosätter FAPs pro-apoptotisk signalering och ackumuleras i muskelnischen, där de differentieras till kollagenproducerande fibroblaster och adipocyter, vilket leder till ektopiska fettinfiltrat och fibrotisk ärrbildning12,13.
På grund av deras multipotens och deras regenerativa förmågor har FAPs och MuSCs identifierats som potentiella mål inom regenerativ medicin för behandling av skelettmuskelsjukdomar. För att undersöka deras funktion och terapeutiska potential är det därför viktigt att upprätta effektiva och reproducerbara protokoll för isolering och odling av FAPs och MuSC.
Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) kan identifiera olika cellpopulationer baserat på morfologiska egenskaper såsom storlek och granularitet och tillåter cellspecifik isolering baserat på användning av antikroppar riktade mot cellytmarkörer. Hos vuxna möss uttrycker MuSC den vaskulära celladhesionsmolekylen 1 (VCAM-1, även känd som CD106) 14,15 och α7-Integrin 15, medan FAP uttrycker den trombocyt-härledda tillväxtfaktorreceptorn α (PDGFRα) och stamcellsantigenet 1 (Sca1 eller Ly6A / E) 5,6,9,12,16,17 . I protokollet som beskrivs här identifierades MuSC:er som CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+, medan FAPs identifierades som CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-. Alternativt användes PDGFRαEGFP-möss för att isolera FAP som CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- händelser18,19. Vidare jämförde vi överlappningen mellan den fluorescerande signalen från PDGFRα-GFP+-celler med celler som identifierats av ytmarkören Sca1. Vår analys visade att alla GFP-uttryckande celler också var positiva för Sca1, vilket indikerar att båda metoderna kan användas för identifiering och isolering av FAPs. Slutligen bekräftade färgning med specifika markörantikroppar renheten hos varje cellpopulation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som utfördes utfördes i enlighet med institutionella riktlinjer som godkänts av djurvårds- och användningskommittén (ACUC) vid National Institute of Arthritis, Musculoskeletal, and Skin Diseases (NIAMS). Utredare som utför detta protokoll måste följa sina lokala djuretiska riktlinjer.
OBS: Detta protokoll beskriver i detalj hur man isolerar FAPs och MuSC från bakbenet och skadade tibialis främre (TA) muskler hos vuxna manliga och kvinnliga möss (3-6 månader) och ger riktlinjer för coculturing FAPs och MuSCs. En översikt över försöksförfarandet visas i figur 1. Alla steg i detta protokoll bör utföras under sterila förhållanden och vid rumstemperatur (RT) om inte annat anges.
1. Inställning av reagens
- Wash Medium (WM): Förbered denna lösning genom att tillsätta 10% (vol / vol) hästserum och 1x penicillin / streptomycin till Hams F-10 Nutrient Mix cellmedia. WM kan förberedas i förväg och förvaras vid 4 °C.
- Muskeldissociationsbuffert (MDB): Förbered denna buffert genom att lösa upp kollagenas II i WM. Om du samlar hela bakbensmusklerna, lös upp 1000 U / ml Kollagenas II i 10 ml WM för varje mus (bereds i ett 50 ml koniskt rör). Om du samlar TA-muskler, lös upp 800 U / ml Kollagenas II i 7 ml WM för varje mus (bereds i ett 15 ml koniskt rör). För TA-muskler kommer detta att bidra till att bättre visualisera cellpellets och få ett högre utbyte av FAPs och MuSCs. Förbered MDB färskt innan du samlar musklerna och håll det på is tills det behövs.
- Kollagenas II lösningsstam: Bered denna lösning genom att lösa kollagenas II i steril 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till en slutlig koncentration av 1000 U / ml. Filtrera lösningen genom ett 0,45 μm sprutfilter och alikvotera till 1 ml lager. Förvara lösningen vid -20 °C.
- Dispase lösningsstam: Bered denna lösning genom att lösa Dispase i steril 1x PBS till en slutlig koncentration av 11 U/ml. Filtrera lösningen genom ett 0,45 μm sprutfilter och alikvotera till 1 ml lager. Förvara lösningen vid -20 °C.
- Förbered FAP: s odlingsmedium genom att komplettera DMEM med 10% (vol / vol) fetalt bovint serum, 1x penicillin / streptomycin och 2.5 ng / ml FGF. Förvara mediet vid 4 °C.
- Förbered MuSC: s odlingsmedium som kompletterar F10 med 10% (vol / vol) hästserum, 1x penicillin / streptomycin och 2.5 ng / ml FGF. Förvara mediet vid 4 °C.
- Bered coculture medium genom att komplettera DMEM med 10% (vol/vol) fetal bovint serum, 10% (vol/vol) hästserum, 1x penicillin/streptomycin och 2,5 ng/ml FGF. Förvara mediet vid 4 °C.
2. Muskelskörd i bakbenet
- Tillsätt 2-3 ml WM i en 6 cm skål (en maträtt per mus) och lägg den på is.
- Utför eutanasi genom kvävning: placera musen i en CO 2-kammare och introducera 100% CO2. Använd cervikal dislokation för att bekräfta döden.
- Placera musen liggande på en dissektionsdyna och spraya den med 70% (vol / vol) etanol för att undvika kontaminering.
- Använd pincett för att nypa mitten av musmagens hud och skär en ~ 1 cm öppning horisontellt. Ta tag i sårkanterna och skrivbordet i musen genom att dra öppningen i motsatta riktningar för att avslöja musklerna under. Exponera ena sidan av musens bakben vid den tiden.
- Innan du samlar muskler, ta bort intermuskulärt fett mellan hamstringsna och den proximala änden av quadriceps. Detta kommer att förbättra isoleringen av FAPs och MuSCs.
- Utan att skada vävnaden, använd vassa tångar för att bryta och skala av fascian för att exponera musklerna under TA och extensor digitorum longus (EDL). Kör den vassa spetsen på tången under TA / EDL-musklerna för att lossa musklerna från skenbenet.
- Skär av senorna som fäster TA / EDL på fotleden och, medan du håller den med pincett, trimma musklerna med sax längs den längsgående linjen i TA / EDL. Skär senorna runt knäet för att lossa hela TA / EDL-musklerna. Placera musklerna i en 6 cm skål som hålls på is.
- Fortsätt att isolera gastrocnemius- och soleusmusklerna genom att skära alla senor vid fotleden och lossa musklerna från skenbenet och vadbenet. Skär runt knäet och överför musklerna till 6 cm skålen.
- Skala av fascian runt quadriceps och separera den från lårbenet genom att köra den skarpa spetsen av pincetten mellan muskeln och benet. Skär senorna runt knäet och, medan du håller quadriceps med pincett i den distala änden, trimma resten av muskeln genom att skära längs lårbenet. Placera musklerna i 6 cm skålen.
- Lossa hamstrings och kvarvarande muskler runt lårbenet och överför dem till 6 cm skålen. Samla bakbensmusklerna i en 6 cm skål som hålls på is.
OBS: Undvik att skada blodkärlen, när det är möjligt, för att förhindra bildandet av blodklumpar som kan störa nedströmsisoleringen. Om blödning uppstår, torka omedelbart det utskurna kärlet med en steril gasbindning för att absorbera blodet. - Samla TA, EDL, gastrocnemius, soleus, quadricep och hamstring muskler från den kontralaterala lemmen.
OBS: När du isolerar hela bakbensmusklerna, slå inte ihop två eller flera möss. Om du isolerar TA-muskler kan upp till tre TA-muskler poolas.
3. Mekanisk och enzymatisk muskelsmältning
- Aspirera WM från 6 cm skålen och tillsätt 1-2 ml MDB för att hålla musklerna fuktiga.
- Hacka musklerna noggrant tills du får en uppslamningspasta av välmalet vävnad. För att göra det, använd tång för att hålla ena änden av en muskelbit, använd sedan en skalpell för att riva och skära muskeln tills den är mindre tät.
- Använd sax och fortsätt skära muskeln i små bitar i 1-2 minuter. Upprepa detta steg för varje muskelgrupp tills du får ett välfärmat muskelslam.
OBS: Detta är ett mycket kritiskt steg för att maximera utbytet av FAPs och MuSCs. Det rekommenderas att spendera 8-10 min (4-5 min om du bara isolerar TA-muskler) i detta steg för att säkerställa en korrekt muskelbrytning. - Överför de malet musklerna från varje mus till det koniska röret som innehåller MDB.
- Förslut rören med laboratoriefilm och inkubera i ett 37 °C vattenbad med omrörning (75 rpm) i 1 h. Placera rören horisontellt längs skakningsvägen och använd vikter för att hålla rören nedsänkta i vatten.
- Tina 1 ml kollagenas II-lager och 1 ml dispase-lager per mus. Före användning, snurra dispase-stocken i en svängande skoprotor vid 10 000 x g i 1 min vid 4 °C. Använd endast supernatanten.
- Om hela bakbensmusklerna samlades in, fortsätt enligt följande:
- Efter 1 h, ta bort röret från skakaren och fyll det till 50 ml med WM. Vänd försiktigt ett par gånger för att säkerställa blandning.
- Centrifugera cellerna i en svängande skoprotor vid 250 x g i 5 minuter vid 4 °C. Överför 42 ml supernatant till två nya rör (~ 21 ml i varje rör) och lämna ~ 8 ml i originalröret.
- Fyll de nya rören som innehåller 21 ml supernatant upp till 50 ml med WM. Centrifugera cellerna igen i en svängande skoprotor vid 350 x g i 8 minuter vid 4 °C. Aspirera alla supernatanter och håll pelletsen på is.
- Tillsätt 1 ml kollagenas II-stam och 1 ml dispase-buljong i originalröret som innehåller ~ 8 ml MDB.
- Använd en 5 ml serologisk pipett, återsuspendera pelleten 10 gånger utan igensättning. Mata ut lösningen mot rörets vägg och undvik bildandet av bubblor. Om igensättning inträffar under resuspension, tryck pipettens spets mot rörets botten för att mekaniskt störa muskelbitarna. Fortsätt till steg 3.9.
- Om TA-muskler samlades in, fortsätt enligt följande:
- Efter 1 h, ta bort röret från skakaren och fyll dem till 15 ml med WM. Vänd försiktigt ett par gånger för att säkerställa blandning.
- Centrifugera cellerna i en svängande skoprotor vid 250 x g i 5 minuter vid 4 °C. Överför 13 ml supernatant till ett nytt 15 ml rör och lämna ~ 2 ml i originalröret.
- Fyll det nya röret som innehåller 13 ml supernatant upp till 15 ml med WM. Centrifugera cellerna igen i en svängande skoprotor vid 350 x g i 8 minuter vid 4 °C. Aspirera all supernatant och håll pelleten på is.
- Använd en 1000 μL pipettspets och återsuspendera pelleten i originalröret upp och ner utan igensättning.
- Tillsätt 1 ml kollagenas II-stam och 1 ml dispase-lager i originalröret som innehåller 2 ml MDB och fyll upp till 10 ml med WM. Fortsätt till steg 3.9.
- Förslut rören med laboratoriefilm och inkubera i ett 37 °C vattenbad med omrörning (75 rpm) i 30 minuter. Placera rören enligt steg 3.5.
4. Generering av mononukleerade celler
OBS: Om du arbetar med TA-muskler uppsamlade i ett 15 ml koniskt rör, överför suspensionen till ett 50 ml koniskt rör innan du fortsätter med steg 4.1.
- Efter 30 min, ta bort röret från skakaren. Aspirera och mata ut muskelsuspensionen genom en 10 ml spruta med en 20 G nål framgångsrikt 10 gånger.
OBS: Mata ut muskelupphängningen mot rörets vägg för att undvika bubblor och skumning. Små bitar av osmälta senor eller brosk kan täppa till nålen under de första omgångarna av aspiration. Om igensättning inträffar, använd sterila pincett för att ta bort täppan från nålspetsen. - Fyll varje rör upp till 50 ml med WM och vänd försiktigt ett par gånger för att säkerställa blandning.
- Centrifugera cellerna i en svängande skoprotor vid 250 x g i 5 minuter vid 4 °C. Överför supernatant till ett nytt rör (~ 42 ml) och lämna ~ 8 ml i originalröret.
- Fyll det nya röret som innehåller 42 ml supernatant upp till 50 ml med WM. Centrifugera cellerna igen i en svängande skoprotor vid 350 x g i 8 minuter vid 4 °C. Aspirera all supernatant och håll pelleten på is.
- Placera en 40 μm nyloncellsil i det ursprungliga 50 ml koniska röret som innehåller 8 ml WM och förfukta cellsilen med 1-2 ml WM.
- Medan du håller 40 μm nyloncellsilen, använd en 10 ml pipett för att försiktigt återsuspendera pelleten 5-10 gånger. Filtrera pellets genom cellsilen tillbaka till samma rör för att minimera cellförlusten.
- Vid detta steg, se till att det finns ytterligare rör med cellpellets på is. Filtrera tillbaka dessa pellets i det ursprungliga röret genom att tillsätta 4-5 ml WM till varje rör för att återsuspendera pellets och överföra lösningen till cellsilen placerad i det ursprungliga röret. Tillåt filtrering efter tyngdkraft.
- Efter att ha samlat alla pellets i det ursprungliga 50 ml koniska röret, skölj cellsilen med ytterligare 4-5 ml WM. Använd en 1000 μL pipett för att samla all vätska från undersidan av cellsilen.
- Fyll varje rör med WM upp till 50 ml och vänd försiktigt ett par gånger för att säkerställa blandning.
- Centrifugera cellerna i en svängande skoprotor vid 250 x g i 5 minuter vid 4 °C. Aspirera omedelbart all supernatant efter centrifugering utan att störa pelleten.
- Återsuspendera pelleten i 600 μl WM och överför den till ett 2 ml mikrocentrifugrör.
5. Antikroppsfärgning för flödescytometri
OBS: För varje experiment, ställ in följande kontroller: i) ofärgad kontroll, ii) viabilitetskontroll för att välja för levande cellpopulation, iii) enkelfärgade kompensationskontroller för att korrigera för fluorokromutsläppsspillover, och iv) fluorescens minus en (FMO) kontroller för att ställa in grindgränser genom att ta hänsyn till spridningsspridning. Se tabell 1 för en fullständig lista över färgningskontroller.
- För att förbereda ostoppad kontroll, överför 10 μL av cellsuspensionen till ett 2 ml mikrocentrifugrör innehållande 190 μL WM. Återsuspendera cellsuspensionen och filtrera genom ett 5 ml polystyrenrörs med en 35 μm cellsillock. Låt suspensionen filtreras efter tyngdkraften.
- Använd en pipett på 200 μl för att samla upp all vätska från cellsilens undersida. Försegla med ett lock och lämna det på is, skyddat från ljus.
- Förbered viabilitet, FMO och enkelfärgade kontroller: märk 10 2 ml mikrocentrifugrör och tillsätt 190 μL WM i varje rör och 10 μL cellsuspension. Se tabell 1 för en fullständig lista över kontroller. Tillsätt antikroppar till lämpligt rör beroende på experimentell kontroll. Se tabell 1 för information om antikroppskombination och koncentration.
- Överför resten av cellsuspensionen (500 μL) till ett 2 ml mikrocentrifugrör (experimentrör) och tillsätt följande antikroppar: CD31-APC, CD45-APC, Sca1-Pacific Blue, VCAM-1-biotin och α7-Integrin-PE. Se tabell 1 för information om antikroppskombination och koncentration.
- Blanda försiktigt varje rör för att säkerställa jämn fördelning och inkubera cellerna i en roterande skakapparat vid 4 °C i 45 minuter skyddad från ljus.
- Efter 45 min fyller du alla mikrocentrifugrör upp till 2 ml med WM. Vänd försiktigt rören ett par gånger för att säkerställa fullständig blandning. Centrifugera rören i en kyld centrifug med en rotor med fast vinkel på 250 x g i 5 minuter vid 4 °C. Aspirera supernatanten utan att störa pelleten.
- Återsuspendera cellerna i alla mikrocentrifugrör i 300 μL WM.
- Tillsätt streptavidinantikropp i lämpliga rör. Se tabell 1 för information om antikroppskombination och koncentration. Blanda försiktigt varje rör väl för att säkerställa jämn fördelning och inkubera cellerna i en roterande skakapparat vid 4 °C i 20 minuter skyddad från ljus. Lämna de återstående rören på is, skyddade från ljuset.
- Efter 20 min fyller du mikrocentrifugrör som innehåller streptavidinantikropp till 2 ml med WM. Vänd försiktigt rören några gånger för att säkerställa fullständig blandning. Centrifugera rören i en kyld centrifug med en rotor med fast vinkel på 250 x g i 5 minuter vid 4 °C. Aspirera supernatanten helt och återsuspendera cellerna i 300 μL WM.
- Förväta 35 μm cellsillocket på 10 5 ml polystyren rundbottenrör med 200 μl WM. Filtrera celler från kontrollrör genom lämpliga 5 ml polystyren rundbottenrör. Använd en pipett på 200 μl för att samla upp all vätska från cellsilens undersida. Försegla med lock, lämna rören på is och skydda dem från ljus.
- Återsuspendera cellerna i experimentröret med ytterligare 200 μl WM för totalt 500 μl WM. Förväta ett cellsillock på ett 5 ml polystyrenrörsrör med 200 μl WM. Överför cellsuspensionen från experimentröret till 5 ml polystyren rundbottenrör och låt det filtrera efter tyngdkraften.
- Skölj 2 ml mikrocentrifugröret som innehåller experimentprovssuspensionen med 300 μl WM och för det genom samma sillock. Använd en pipett på 200 μl för att samla upp all vätska från cellsilens undersida. Försegla med lock, lämna rör på is och skydda dem från ljus.
OBS: Om igensättning av cellsillocket på 35 μm uppstår, knacka försiktigt på röret på bänken för att underlätta genomströmningen. - Förbered och märk uppsamlingsrören för FAPs och MuSCs. Om du isolerar celler från hela bakbensmusklerna, sortera cellerna i 5 ml polypropen rundbottenrör med upp till 1 ml antingen FAPs eller MuSCs odlingsmedium kompletterat med 2x serum. Om du isolerar celler från TA-muskler, sortera FAPs och MuSCs i 2 ml mikrocentrifugrör som innehåller upp till 400 μL odlingsmedium kompletterat med 2x serum.
6. Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS)
OBS: Detta protokoll använder en kompakt bänkskivans forskningsflödescytometer utrustad med ett 100 μm munstycke och med en trelaserkonfiguration (488 nm, 640 nm, 405 nm) med förmågan att analysera upp till nio olika fluorokromer (11 parametrar inklusive framåt- och sidospridning). De fluorokromer som används i detta protokoll och deras tillhörande detektorbandpassfilter är följande: PE 586/42; PE-CY7 783/56; APC 660/10; Stilla havet Blå 448/45; 7-aminoaktinomycin D (7-AAD) 700/54, GFP 527/32. Cellerna sorteras vid 4 °C och ligger kvar på is efter sorteringen. Innan du använder detta instrument, se till att användaren är ordentligt utbildad av en teknisk applikationsspecialist.
- Ställ in och prestandakontrollera cellsorteraren enligt tillverkarens specifikationer.
- Ställ in en hierarkisk grindstrategi för att identifiera FAPs och MuSCs (Figur 2).
- Isolera FAPs baserat på följande schema: i) framåtcellspridningsområde vs sidocellspridningsområde (FSC-A vs. SSC-A) för att separera celler kontra skräp, ii) sidocellspridningshöjd vs sidocellspridningsbredd (SSC-H vs. SSC-W) för att skilja singlets från dubbletter i SSC-området, iii) framåtspridningshöjd vs framåtcellspridningsbredd (FSC-H vs. FSC-W) för att diskriminera singlets från dubbletter i FSC-intervallet, och iv) 7-AAD-område vs SSC-A för att skilja levande kontra döda celler.
- Om du isolerar FAPs genom den antikroppsbaserade metoden, använd följande schema: v) APC-CD45 / CD31-området vs Pacific Blue-Ly-6A / E (Sca1) -området för att utesluta CD31 + och CD45 + -celler från vidare analys, och vi) PE-Cy7-VCAM-1-området vs PE-α7-Integrin-området från CD31-/CD45-/Sca1+-populationen för att skilja FAPs. FAPs identifieras som CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-händelser.
- Om du isolerar FAPs genom endogen GFP-reportermetod, använd följande schema: v) APC-CD45 / CD31-område vs GFP-PDGFRα-område för att utesluta CD31 + och CD45 + -celler från vidare analys och isolera GFP + -celler. FAPs identifieras som CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-händelser.
- Isolera MuSCs baserat på följande schema: i) framåtcellspridningsområde vs sidocellspridningsområde (FSC-A vs. SSC-A) för att separera celler kontra skräp, ii) sidocellsspridningshöjd vs sidocellspridningsbredd (SSC-H vs. SSC-W) för att skilja singlets från dubbletter i SSC-området, iii) framåtcellspridningshöjd vs framåtcellspridningsbredd (FSC-H vs. FSC-W) för att skilja singlets från dubbletter i FSC-intervallet, iv) 7-AAD-område vs SSC-A för att skilja levande vs döda celler, v) APC-CD45 / CD31-området vs Pacific Blue-Ly-6A / E (Sca1) -området för att utesluta CD31 + och CD45 + -celler från vidare analys, och vi) PE-Cy7-VCAM-1-området vs PE-α7-Integrin-området från CD31-/CD45-/Sca1-populationen för att skilja MuSCs. MuSC:er identifieras som CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+-händelser.
- Isolera FAPs baserat på följande schema: i) framåtcellspridningsområde vs sidocellspridningsområde (FSC-A vs. SSC-A) för att separera celler kontra skräp, ii) sidocellspridningshöjd vs sidocellspridningsbredd (SSC-H vs. SSC-W) för att skilja singlets från dubbletter i SSC-området, iii) framåtspridningshöjd vs framåtcellspridningsbredd (FSC-H vs. FSC-W) för att diskriminera singlets från dubbletter i FSC-intervallet, och iv) 7-AAD-område vs SSC-A för att skilja levande kontra döda celler.
- Kör den ofärgade kontrollen och viabilitetskontrollen för att säkerställa att cellpopulationen är korrekt placerad i SSC-A vs FSC-A-diagrammet och för att korrekt grinda på levande enskilda celler.
- Skaffa alla enstaka färgade kontroller och generera spilloverkompensationsmatrisen.
- Kör alla FMO-kontroller och bestäm brytpunkten mellan bakgrundsfluorescensspridning och den positivt färgade populationen.
- Cirka 5-10 min före förvärv av experimentprovet, tillsätt 7-AAD viabilitetsfärg och blanda försiktigt.
- När alla kontroller har bearbetats ställer du in sorteringsgrindarna i enlighet med FMO-kontrollerna. förvärva och sortera de experimentella proverna.
- När alla prover har bearbetats, rengör cytometern enligt tillverkarens specifikation. Exportera alla .fcs-data för analys.
7. Kultur av FAPs och MuSCs
OBS: Sorterade celler bör odlas omedelbart efter sortering, i ett lämpligt medium på kollagen I-belagda plattor.
- Centrifugera uppsamlingsrören i en rotor med fast vinkel på 250 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Aspirera supernatanten utan att störa cellpelleten.
- För MuSC:s odling, återsuspendera cellerna i en lämplig volym av MuSC-odlingsmediet och inkubera dem under standardförhållanden vid 37 °C och 5 %CO2.
- Platta nyligen isolerade MuSC med en densitet av 20 000 celler / cm 2 och aktiverade MuSC vid en densitet av 15 000 celler / cm2.
- Efter plätering verkar cellerna små, sfäriska och genomskinliga. Inom 36 h fäster MuSC: er på plattans yta och ökar långsamt sin storlek under de första 48 timmarna.
- Byt ut mediet var 2: e dag.
OBS: MuSCs är mycket känsliga för celltäthet. För att hålla MuSCs i sitt prolifererande tillstånd, odla dem tills de är 60% -70% sammanflytande. Passera cellerna i nytt kollagen jag belagda rätter eller tallrikar och tillsätt nytt färskt medium var 2: e dag. Om MuSC hålls i samma skål eller tallrik längre än 3-4 dagar, kommer de att få en långsträckt form och kommer att anpassa sig till angränsande celler tills de smälter samman.
- För FAP:s odling, återsuspendera cellerna i en lämplig volym av MuSC-odlingsmediet och inkubera dem under standardförhållanden vid 37 °C och 5 %CO2.
- Platta FAPs isolerade från ostörd muskel med en densitet av 15 000 celler / cm 2 och FAPs isolerade från skadad muskel vid 9 000 celler / cm2.
OBS: Efter plätering fäster FAPs helt på plattans yta inom 48 timmar, medan aktiverade FAPs fästs på plattan inom några timmar. När de väl är fästa får FAPs sin karakteristiska form, med en liten cellkropp och långsträckta cellprocesser, och de sprider sig snabbt. - Byt ut mediet var 2: e dag.
OBS: FAPs är mycket känsliga för celltäthet. Sådd av FAP vid låga densiteter kan leda till dålig celltillväxt och celldöd. Tvärtom kommer plätering av FAPs med hög sådddensitet att öka cellöverlevnaden och förbättra deras expansion. FAPs som härrör från skadade muskler kräver vanligtvis lägre celltäthet än oskadade muskler, eftersom de redan är aktiverade. Det rekommenderas att justera FAP-pläteringstätheten baserat på ens experimentella förhållanden och på källan till proverna.
- Platta FAPs isolerade från ostörd muskel med en densitet av 15 000 celler / cm 2 och FAPs isolerade från skadad muskel vid 9 000 celler / cm2.
- För samodling, återsuspendera FAP och MuSC i cokulturmediet i förhållandet 1:1 och inkubera dem under standardförhållanden vid 37 °C och 5 %CO2. Låt cellerna fästa i 48 timmar och byt ut mediet var 2: e dag.
8. Immunofluorescensanalys av odlade FAP och MuSC
- Aspirera cellmediet och utför två eller tre tvättar med 1x PBS.
- Fixera cellerna med 2% paraformaldehyd (PFA) i 1x PBS i 15 min vid RT.
- Aspirera 2% PFA och tvätta cellerna snabbt två eller tre gånger med 1x PBS.
- Utför cellpermeabilisering och blockering:
- För immunfärgning av nyisolerade FAPs, utför cellpermeabilisering och blockering genom att inkubera celler med 1x PBS + 0,1% Triton X-100 (PBST) + 1% bovint serumalbumin (BSA) + 5% Normal Donkey Serum (NDS) i 30 min vid RT.
- För immunfärgning av nyisolerade MuSC, utför cellpermeabilisering och blockering genom att inkubera celler med PBST + 1% BSA + 5% Normal Goat Serum (NGS) i 30 min vid RT.
- Applicera primära antikroppar:
- För immunfärgning av nyligen isolerade FAPs, applicera getanti PDGFRα primär antikropp (1:300) utspädd i PBST + 1% BSA + 5% NDS över natten vid 4 °C.
- För immunfärgning av nyligen isolerade MuSC: er, applicera mus anti Pax7 primär antikropp (1:10) utspädd i PBST + 1% BSA + 5% NGS i 45 min vid RT.
- Tvätta cellerna två eller tre gånger med 1x PBS för att ta bort den primära antikroppslösningen.
- Applicera sekundära antikroppar:
- För immunfärgning av nyligen isolerade FAPs, applicera åsna anti-get IgG (H + L) Alexa Fluor 488 sekundär antikropp (1:500) utspädd i PBST + 1% BSA i 1 h vid RT.
- För immunfärgning av nyligen isolerade MuSC, applicera get-anti-mus IgG 1 Alexa Fluor 555 sekundär antikropp (1:500) utspädd i PBST +1 % BSA i 45 min vid RT.
- Tvätta cellerna två eller tre gånger med 1x PBS för att ta bort den primära antikroppslösningen.
- Utför kärnmotfärgning genom att inkubera celler med DAPI i PBST (1:1000) i 5 minuter vid RT.
- Tvätta cellerna tre gånger med 1x PBS för att ta bort DAPI-lösningen.
VARNING: DAPI är giftigt och farligt; Hantera det med försiktighet och släng det i flaskan för farligt avfall. - Förvara cellerna vid 4 °C skyddade från ljuset.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll tillåter isolering av cirka en miljon FAPs och upp till 350 000 MuSC från oskadade bakben hos vuxna möss av vild typ (3-6 månader), vilket motsvarar ett utbyte på 8% för FAPs och 3% för MuSCs av totala händelser. Vid sortering av celler från skadad TA 7 dagar efter skada samlas två till tre TA-muskler för att få upp till 300 000 FAP och 120 000 MuSC, vilket motsvarar ett utbyte på 11% respektive 4%. Renhetsvärden efter sortering är vanligtvis över 95% för FAP och MuSC.
Den grindstrategi som antagits för att isolera FAP och MuSC illustreras i figur 2. Först identifieras cellpopulationer av intresse genom att skapa ett framåtriktat spridningsdiagram (FSC) kontra sidospridningsdiagram (SSC), vilket möjliggör en viss grad av cellulär identifiering baserat på cellmorfologiska egenskaper. Denna grindstrategi används också för att utesluta små cellulära skräp, som vanligtvis ligger längst ner till vänster i FSC vs SSC-tomten. Celler är vidare gated för att utesluta dubbletter baserat på FSC- och SSC-höjd- och breddsignaler, och de resulterande singletcellerna färgas sedan med 7-AAD för att utvärdera deras livskraft. Levande celler utvärderas vidare för Sca1- och CD31/CD45-uttryck för att utesluta härstamningspositiva celler från vidare analys. Härstamningsnegativa Sca1-negativa singlets färgas sedan för VCAM-1 och α7-Integrin för att skilja FAPs och MuSCs. FAPs identifieras som CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-celler och MuSCs identifieras som CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ celler. Alternativt är levande celler också gated för CD31 / CD45 och GFP-PDGFRα för att skilja FAPs. FAPs identifieras som CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin-celler.
Detta protokoll presenterar två gatingstrategier för att isolera FAP-populationen: antingen genom att använda en endogen PDGFRα-EGFP-reporter eller genom att utföra cellfärgning med en Sca1-antikropp. PDGFRα-EGFP knock-in reportermöss (B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J)18 uttrycker H2B-eGFP-fusionsgenen från det endogena PDGFRα-locus, vilket möjliggör effektiv och specifik märkning av PDGFRα-härstamningen (figur 3A). Denna muslinje användes tidigare för att isolera Pdgfrα + FAPs och är verkligen till stor hjälp för isolering av FAPs, eftersom GFP-reportern ger en mycket synlig och specifik signal19. Alternativt beskriver detta protokoll en Sca1-baserad isoleringsmetod för identifiering av FAPs. Sca1 (Ly-6A/E) används ofta för att identifiera och isolera FAP i muskelpreparat13,16,17. Sca1 är en 18-kDa glykosylfosfatidylinositol (GPI)-länkad proteinmedlem i Ly-6-familjen20. Förutom att uttryckas på cellytan hos mesenkymala stammuskelceller observeras emellertid Sca1-uttryck också i hematopoetiska stamceller (HSC) såväl som mogna leukocyter och T-celler. I detta protokoll bekräftade vi lämpligheten av Sca1 som FAPs markör genom att utföra FACS-baserade härstamningsspårningsstudier. Specifikt användes PDGFRα-EGFP-möss för att isolera Sca1+/GFP-uttryckande FAP bland populationer av mononukleerade celler. Vi fann att alla GFP-uttryckande celler också var positiva för Sca1 och negativa för CD31, CD45, VCAM-1 och α7-Integrin (figur 4). Denna analys bekräftade användningen av Sca1-antikroppar som en markör för FAPs i både vilande och aktiverade FAPs och ger möjlighet till otydlig användning av endera strategin för att isolera FAPs.
I detta protokoll isolerades FAP och MuSC också från vuxna möss som skadats med intramuskulära injektioner av Notexin, 7 dagar efter skada (figur 5). Efter skada aktiveras och sprids MuSC och FAPs in vivo och når toppen av spridningen mellan dag 3 och 4 2,3. Dessa förändringar i spridning återspeglas av en ökning av andelen Sca1 / PDFGRα samt VCAM-1 / α7-Integrin-positiva celler. Figur 6 visar kvantifieringen av funktionella luftrumsblock och muSC:er i oskadade och 7 dagar efter skada. Även om toppen i proliferation observeras mellan dag 2 och 3 efter skada, är en låg frekvens av prolifererande celler fortfarande märkbar 7 dagar efter skada. När MuSC aktiveras finns det en markant ökning av deras cellstorlek21,22. Därför, medan du isolerar dessa celler med FACS, är det av avgörande betydelse att justera FSC-A- och SSC-A-parametrar och expandera porten för att inkludera dessa celler i mitten (figur 5A).
Renheten hos de isolerade cellpopulationerna bekräftades genom immunfärgning av cocultured GFP+ FAP och MuSC med Pax7-antikroppar. Nyisolerade GFP+ FAPs och MuSC samodlades i 48 timmar i förhållandet 1:1 (figur 3B). GFP+ FAPs uttryckte inte Pax7-markör, medan MuSCs reagerade med denna antikropp. Således är Lin-/Sca-1+/VCAM-1-/α7-Integrin- och Lin-/Sca-1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ gating-strategin effektiv för att isolera rena populationer av FAP respektive MuSC.
Bild 1: Grafisk översikt över FAP- och MuSC-isolering. Grafisk översikt som visar FAP- och MuSC-isolering från bakbensmusklerna. Protokollet gäller även celler isolerade från TA-muskler. Först samlas musklerna och males mekaniskt innan de genomgår enzymatisk matsmältning. Muskelblandningen bearbetas sedan genom en 20 G nål och filtreras för att erhålla en suspension av mononukleerade celler. Celler inkuberas sedan med en cocktail av fluoroforkonjugerade antikroppar och körs slutligen genom en cellsorterare för att isolera en ren population av FAPs och MuSC. Rena cellpopulationer bearbetas sedan för nedströms applikation. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Representativ FACS-profil för vilande FAPs och MuSCs. (A-H) Gating-strategi för isolering av FAPs och MuSCs. (A) För det första är prover gated för att utesluta cellulärt skräp och (B,C) dubbletter baserat på SSC- och FSC-egenskaper. (D) De resulterande enskilda cellerna färgas sedan med 7-AAD för att utvärdera deras livskraft. (E) 7-AAD negativa enskilda celler bedöms sedan för APC-CD31 / CD45 och Pacific Blue-Sca1 för att utesluta lineage-positiva celler från vidare analys. (F,G) Härstamningsnegativa singlets färgas sedan för PE-Cy7-VCAM-1 och PE-α7-Integrin. (F) FAPs identifieras som CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-celler och (G) MuSCs identifieras som CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+-celler. (H) FAPs-isolering i PDGFRα-EGFP-möss med hjälp av en GFP-reporter. (I-M) FACS-profil för fluorescens minus en (FMO) -kontroller för att visa korrekt kompensation och gating. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Validering av FAP- och MuSC-cellodling. (A) Nyisolerade FAPs som uttrycker GFP pläterades och färgades tillsammans med en PDGFRα-antikropp. Kärnor färgades med DAPI. Sammanslagna bilder av GFP (grön), PDGFRα (röd) och DAPI (blå) färgning visas. Skalstänger, 25 μm. (B) Nyisolerade FAPs (gröna) och MuSCs odlades i 48 timmar och färgades med Pax7 (röd). Kärnor färgades med DAPI. GFP-uttryckande FAPs uttrycker inte Pax7, medan MuSCs uteslutande uttrycker Pax7 och inte är positiva för GFP, vilket bekräftar renheten hos båda sorterade populationerna. Skala staplar, 75 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: PDGFRα-EGFP-möss och Sca1-uttryck märker specifikt FAP hos vuxna möss. FAPs isoleras som GFP+/Sca1+-celler. 7-AAD negativa enskilda celler bedöms för APC-CD31 / CD45 och GFP-PDGFRα för att utesluta härstamningspositiva celler och särskilja FAPs. Härstamningsnegativa / Sca1-positiva celler färgas för PE-Cy7-VCAM-1 och PE-α7-Integrin för att utesluta MuSC. FAPs identifieras som CD31-/CD45-/PDGFRα+/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin-celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Representativ FACS-profil för aktiverade FAPs och MuSCs. (A-H) Gating-strategi för isolering av aktiverade FAPs och MuSCs. (A) Prover är gated för att utesluta cellulärt skräp genom att skapa FSC-A vs SSC-A densitetsdiagram. Notera den förstorade porten för att rymma befolkningen av intresse. (B,C) Prover är vidare gated för att eliminera dubbletter baserat på SSC- och FSC-egenskaper. (D) De resulterande enskilda cellerna färgas sedan med 7-AAD för att utvärdera deras livskraft. (E) 7-AAD negativa enskilda celler bedöms sedan för APC-CD31 / CD45 och Pacific Blue-Sca1 för att utesluta lineage-positiva celler från vidare analys. (F,G) Härstamningsnegativa singlets färgas sedan för PE-Cy7-VCAM-1 och PE-α7-integrin. (F) FAPs identifieras som CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-integrin- celler och (G) MuSCs identifieras som CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-integrin+ celler. (H) FAPs-isolering i PDGFRα-EGFP-möss med hjälp av en GFP-reporter. (I-M) FACS-profil för fluorescens minus en (FMO) -kontroller för att visa korrekt kompensation och gating. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Kvantifiering av FAP och MuSC i ostörda och skadade TAs. Kvantifiering av FAPs och MuSCs i oskadade och 7 dagar efter skada TA-muskler. Cellräkning utfördes genom att dividera antalet celler sorterade per mgs uppsamlad muskel. ** P < 0,01 mellan oskadade och skadade. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| 7-AAD (μg/ml) |
CD31/CD45-APC (μg/ml) |
Sca1-Pacific Blå (μg/ml) |
α 7-Integrin-PE (μg/ml) |
VCAM-1-Biotin (μg/ml) |
PE-Cy7 Streptavidin (μg/ml) |
||
| Ofärgad kontroll | |||||||
| Enstaka färgade kontroller | |||||||
| 7-AAD (livskraftskontroll) | 1 | ||||||
| CD31/CD45 | 2 | ||||||
| Sca1 | 5 | ||||||
| α7-Integrin | 0.4 | ||||||
| VCAM-1 | 5 | 2 | |||||
| FMO-kontroller | |||||||
| FMO 7 AAD | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO CD31/CD45 | 1 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO Sca1 | 1 | 2 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO α7-Integrin | 1 | 2 | 5 | 5 | 2 | ||
| FMO VCAM-1 | 1 | 2 | 5 | 0.4 | |||
| Experimentellt prov | |||||||
| Full fläck | 1 | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | |
Tabell 1: Antikroppsfärgningsmatris. Förteckning över antikroppskoncentrationer som används för färgning av experiment- och kontrollproverna. Om man isolerar FAPs med GFP kan Sca1-färgning utelämnas. Kör istället GFP single stained control och GFP FMO.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Att upprätta effektiva och reproducerbara protokoll för identifiering och isolering av rena vuxna stamcellspopulationer är det första och mest kritiska steget mot att förstå deras funktion. Isolerade FAP och MuSC kan användas för att genomföra multiomikanalys i transplantationsexperiment som en potentiell behandling för muskelsjukdomar eller kan modifieras genetiskt för sjukdomsmodellering i stamcellsterapi.
Protokollet som beskrivs här ger standardiserade riktlinjer för identifiering, isolering och odling av FAPs och MuSC erhållna från bakbensmuskler hos vuxna möss. Rena populationer av FAP och MuSC isolerades med hjälp av en FACS-baserad teknik, och deras renhet bedömdes därefter av immunfärgningsceller med specifika cellytmarkörer och genetiska medel.
Protokollet består av tre huvudavsnitt som i hög grad påverkar utbytet av FAPs och MuSCs: den mekaniska och enzymatiska muskelsmältningen, genereringen av en mononukleerad cellsuspension genom 20 G-nålen och den slutliga isoleringen av enskilda celler genom FACS.
Att utföra korrekt muskelbrytning är av avgörande betydelse för att frigöra enstaka celler. Tonvikten bör läggas på detta steg, eftersom att nå den optimala storleken på muskelbitarna efter malning gör att enzymerna som används för matsmältningen kan fungera bäst och förhindrar igensättning av nålen som används i steg 4.1. Å andra sidan kan övermincing av muskeln resultera i dåligt cellutbyte och minskad cellviabilitet, eftersom MuSC snabbt frigörs under den första matsmältningen och kan aspireras i steg 3.7.2 eller 3.8.214. Dessutom påverkar effektiviteten hos enzymerna som används för matsmältningen av muskelpreparatet också kvaliteten på den enzymatiska dissociationen, eftersom det kan finnas variationer mellan olika enzympartier eller en minskning av enzymernas aktivitet med tiden23. Därför rekommenderas det att testa varje sats enzymer för att optimera matsmältningstidpunkten och koncentrationen. Dessutom kan koncentrationen och mängden tid som krävs för att smälta muskeln också påverkas av patologiska tillstånd som påverkar muskelstelhet. Dessa speciella förhållanden kräver individuell optimering.
Den slutliga generationen av mononukleerade celler sker genom att köra suspensionen genom en 10 ml spruta med en 20 G nål. Särskild försiktighet bör iakttas vid utförandet av detta steg för att minimera antalet bubblor som bildas eftersom deras sprängning orsakar ytterligare cellskador24.
Cellsuspensionen färgas sedan med en antikroppscocktail och förvärvas med en cellsorterare. Att ställa in rätt grindar är ett annat kritiskt steg. När du utför dessa experiment rekommenderas det starkt att köra de listade enkelfärgade kontrollerna och FMO-kontrollerna för att korrekt kompensera för utsläppsspillover och ta hänsyn till bakgrundssignalen på grund av spridningsspridning. Detta är särskilt viktigt när man hanterar ljusa fluorescerande proteiner som GFP och indirekta fläckar som VCAM-1-biotin / Stretpavidin-PE-Cy7-komplexet.
Innan detta experiment utförs för första gången är det dessutom god praxis att utföra en titrering av antikropparna som används för att upptäcka populationer av intresse. Att bestämma den optimala koncentrationen av antikropparna är ett kritiskt steg för att säkerställa den ljusaste signalen från den positiva befolkningen och undvika ökningen av bakgrundsfärgning.
När sorteringen är klar är det viktigt att utföra en eftersorteringsanalys på de sorterade cellerna för att bestämma deras renhet och livskraft. Utbytet och viabiliteten hos de sorterade cellerna påverkas starkt av den tid som krävs för att bearbeta provet och bör beaktas vid planering för att bearbeta flera mus. Dessutom kan förvaring av de sorterade cellerna på is i 2x serumberikande media hjälpa cellåtervinning och förbättra deras livskraft.
I detta protokoll isolerades FAPs och MuSCs från tibialis främre muskler hos oskadade möss samt 7 dagar efter Notexin-injektion. Efter en akut skada har olika FAP- och MuSC-subpopulationer rapporterats vara övergående uttryckta i den regenererande muskelvävnaden. Malecova och kollegor har rapporterat närvaron av en delpopulation av VCAM-1 som uttrycker FAP som saknas i oskadade muskler, toppade mellan dag 2 och 3 efter skada vid akut inflammation och kvarstod hos murina dystrofa möss13. På samma sätt har Kafadar och kollegor rapporterat en övergående ökning av uttrycket av Sca1 på en liten delmängd av myogena stamfäder 2 dagar efter skada25. Sca1+ myogena celler minskade dock kraftigt 3 dagar efter skada25. Förekomsten av dessa delpopulationer bör erkännas och beaktas när detta protokoll används för att isolera FAP och MuSC i tidigare skeden.
Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll en metod för isolering och odling av en ren population av FAPs och MuSC isolerade från antingen friska eller skadade vuxna musmuskler. Cellernas höga renhet och viabilitet gör detta protokoll lämpligt för ytterligare nedströmsapplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen.
Acknowledgments
Vi vill tacka Tom Cheung (Hong Kong University of Science & Technology) för råd om MuSC-isolering. Detta arbete finansierades av NIAMS-IRP genom NIH-bidrag AR041126 och AR041164.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
- Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
- Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
- Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
- Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
- Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
- Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
- Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
- Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
- García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
