Summary
Fibro-adipojenik progenitör hücrelerin (FAP'lar) ve kas kök hücrelerinin (MuSC'ler) kesin olarak tanımlanması, fizyolojik ve patolojik koşullarda biyolojik işlevlerini incelemek için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, FAP'ların ve MuSC'lerin yetişkin fare kaslarından izolasyonu, saflaştırılması ve kültürü için kılavuzlar sağlar.
Abstract
Fibro-adipojenik progenitör hücreler (FAP'ler), fibrojenik, adipojenik, osteojenik veya kondrojenik soy boyunca farklılaşabilen iskelet kası yerleşik mezenkimal stromal hücrelerin (MSC'ler) bir popülasyonudur. Kas kök hücreleri (MuSC'ler) ile birlikte FAP'lar, hücre dışı matrisi (ECM) aktif olarak korurken ve yeniden şekillendirirken, kas homeostazı, onarımı ve yenilenmesinde kritik bir rol oynar. Kronik hasar ve kas distrofileri gibi patolojik durumlarda, FAP'lar anormal aktivasyona uğrar ve kollajen üreten fibroblastlara ve adipositlere farklılaşarak fibroz ve kas içi yağ infiltrasyonuna yol açar. Bu nedenle, FAP'lar kas rejenerasyonunda, MuSC döngüsünü sürdürerek ve doku onarımını teşvik ederek veya iskelet kası dokusunun bütünlüğünü ve işlevini tehlikeye atan fibrotik skar oluşumuna ve ektopik yağ infiltrasyonlarına katkıda bulunarak ikili bir rol oynamaktadır. FAP ve MuSC'lerin uygun şekilde saflaştırılması, bu hücrelerin fizyolojik ve patolojik koşullardaki biyolojik rolünü anlamak için bir ön koşuldur. Burada, floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS) kullanarak FAP'ların ve MuSC'lerin yetişkin farelerin uzuv kaslarından eşzamanlı izolasyonu için standartlaştırılmış bir yöntem açıklanmaktadır. Protokol, mononüklee hücrelerin tüm ekstremite kaslarından ve yaralı tibialis anterior (TA) kaslarından mekanik ve enzimatik ayrışmasını ayrıntılı olarak açıklamaktadır. FAP'lar ve MuSC'ler daha sonra saf hücre popülasyonları elde etmek için yarı otomatik bir hücre sıralayıcısı kullanılarak izole edilir. Ek olarak, sessiz ve aktif FAP'ları ve MuSC'leri tek başına veya kokültür koşullarında kültürlemek için optimize edilmiş bir yöntem açıklıyoruz.
Introduction
İskelet kası, yetişkin insan ağırlığının ~% 40'ını oluşturan vücuttaki en büyük dokudur ve duruşun korunmasından, hareket üretilmesinden, bazal enerji metabolizmasının düzenlenmesinden ve vücut ısısından sorumludur1. İskelet kası oldukça dinamik bir dokudur ve mekanik stres, metabolik değişiklikler ve günlük çevresel faktörler gibi çeşitli uyaranlara uyum sağlama konusunda olağanüstü bir yeteneğe sahiptir. Ek olarak, iskelet kası akut yaralanmaya yanıt olarak yenilenir ve morfolojisinin ve fonksiyonlarının tamamen restorasyonuna yol açar2. İskelet kası plastisitesi, esas olarak, miyofiber plazma zarı ile bazal lamina 2,3 arasında yer alan uydu hücreleri olarak da adlandırılan yerleşik kas kök hücrelerinin (MuSC'ler) popülasyonuna dayanır. Normal koşullar altında, MuSC'ler kas nişinde sessiz bir durumda bulunur, hücresel ciroyu telafi etmek ve kök hücre havuzunu yenilemek için sadece birkaç bölümvardır 4. Yaralanmaya yanıt olarak, MuSC'ler hücre döngüsüne girer, çoğalır ve ya yeni kas liflerinin oluşumuna katkıda bulunur ya da kendini yenileme sürecinde nişe geri döner 2,3. MuSC'lere ek olarak, iskelet kasının homeostatik bakımı ve yenilenmesi, fibro-adipojenik progenitörler (FAP'ler) olarak adlandırılan bir kas yerleşik hücre popülasyonunun desteğine dayanır5,6,7. FAP'lar kas bağ dokusuna gömülü mezenkimal stromal hücrelerdir ve fibrojenik, adipojenik, osteojenik veya kondrojenik soy 5,8,9,10 boyunca farklılaşabilir. FAP'lar, kas kök hücre nişinde hücre dışı matriks proteinlerinin bir kaynağı oldukları için MuSC'ler için yapısal destek sağlar. FAP'lar ayrıca sitokinler ve miyogenez ve kas büyümesi için trofik destek sağlayan büyüme faktörleri salgılayarak iskelet kasının uzun süreli bakımını teşvik eder 6,11. Akut kas hasarı üzerine, FAP'lar yenilenen kasın yapısal bütünlüğünü destekleyen ve MuSC'lerin proliferasyonunu ve farklılaşmasını parakrin bir şekilde sürdürmek için elverişli bir ortam sağlayan geçici bir niş üretmek için hızla çoğalırlar5. Rejenerasyon ilerledikçe, FAP'lar apoptoz ile rejeneratif kastan temizlenir ve sayıları yavaş yavaş bazal seviye12'ye geri döner. Bununla birlikte, kronik kas hasarını destekleyen koşullarda, FAP'lar pro-apoptotik sinyallemeyi geçersiz kılar ve kollajen üreten fibroblastlara ve adipositlere farklılaşarak ektopik yağ infiltrasyonlarına ve fibrotik skar oluşumuna yol açan kas nişinde birikir12,13.
Çok etkili olmaları ve rejeneratif yetenekleri nedeniyle, FAP'lar ve MuSC'ler iskelet kası bozukluklarının tedavisinde rejeneratif tıpta prospektif hedefler olarak tanımlanmıştır. Bu nedenle, fonksiyonlarını ve terapötik potansiyellerini araştırmak için, FAP ve MuSC'lerin izolasyonu ve kültürü için etkili ve tekrarlanabilir protokoller oluşturmak önemlidir.
Floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS), boyut ve granülerlik gibi morfolojik özelliklere dayanarak farklı hücre popülasyonlarını tanımlayabilir ve hücre yüzey belirteçlerine karşı yönlendirilmiş antikorların kullanımına dayalı olarak hücreye özgü izolasyona izin verir. Yetişkin farelerde, MuSC'ler vasküler hücre adezyon molekülü 1'i (VCAM-1, CD106 olarak da bilinir) 14,15 ve α7-Integrin15'i ifade ederken, FAP'lar trombosit kaynaklı büyüme faktörü reseptörü α (PDGFRa) ve kök hücre antijeni 1'i (Sca1 veya Ly6A / E) 5,6,9,12,16,17 olarak ifade eder. . Burada açıklanan protokolde MuSC'ler CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ olarak tanımlanırken, FAP'lar CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin- olarak tanımlanmıştır. Alternatif olarak, PDGFRαEGFP fareleri, FAP'ları CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- olayları18,19 olarak izole etmek için kullanıldı. Ayrıca, PDGFRa-GFP + hücrelerinin floresan sinyali ile yüzey belirteci Sca1 tarafından tanımlanan hücreler arasındaki örtüşmeyi karşılaştırdık. Analizimiz, GFP eksprese eden tüm hücrelerin Sca1 için de pozitif olduğunu gösterdi, bu da her iki yaklaşımın da FAP'ların tanımlanması ve izolasyonu için kullanılabileceğini gösterdi. Son olarak, spesifik belirteç antikorları ile boyama, her hücre popülasyonunun saflığını doğruladı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yapılan tüm hayvan deneyleri, Ulusal Artrit, Kas-İskelet ve Deri Hastalıkları Enstitüsü (NIAMS) Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (ACUC) tarafından onaylanan kurumsal kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu protokolü uygulayan araştırmacılar, yerel hayvan etiği kurallarına uymalıdır.
NOT: Bu protokol, FAP'ların ve MuSC'lerin yetişkin erkek ve dişi farelerin (3-6 ay) arka ekstremite ve yaralı tibialis anterior (TA) kaslarından nasıl izole edileceğini ayrıntılı olarak açıklamakta ve FAP ve MuSC'lerin birlikte kültürlenmesi için kılavuzlar sunmaktadır. Deneysel prosedüre genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmiştir. Bu protokolün tüm adımları, aksi belirtilmedikçe steril koşullarda ve oda sıcaklığında (RT) gerçekleştirilmelidir.
1. Reaktif kurulumu
- Yıkama Ortamı (WM): Ham'ın F-10 Nutrient Mix hücre ortamına% 10 (hacim / hacim) at serumu ve 1x penisilin / streptomisin ekleyerek bu çözeltiyi hazırlayın. WM önceden hazırlanabilir ve 4 °C'de saklanabilir.
- Kas Ayrışma Tamponu (MDB): Kollajenaz II'yi WM'de çözerek bu tamponu hazırlayın. Tüm arka ekstremite kaslarını topluyorsanız, her fare için 1000 U / mL Kollajenaz II'yi 10 mL WM'de çözün (50 mL'lik bir konik tüp içine hazırlanmalıdır). TA kaslarını topluyorsanız, her fare için 7 mL WM'de 800 U / mL Kollajenaz II'yi çözün (15 mL'lik bir konik tüp içine hazırlanmalıdır). TA kasları için bu, hücre peletlerini daha iyi görselleştirmeye ve daha yüksek FAP ve MuSC verimi elde etmeye yardımcı olacaktır. Kasları toplamadan önce MDB'yi taze hazırlayın ve ihtiyaç duyulana kadar buz üzerinde tutun.
- Kollajenaz II çözelti stoğu: Kollajenaz II'yi steril 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde 1000 U/mL'lik son konsantrasyona eriterek bu çözeltiyi hazırlayın. Çözeltiyi 0,45 μm'lik bir şırınga filtresinden ve aliquot'tan 1 mL stoklara süzün. Çözeltiyi -20 °C'de saklayın.
- Dispase çözelti stoğu: Dispase'ı steril 1x PBS'de 11 U/mL'lik son konsantrasyona kadar çözerek bu çözeltiyi hazırlayın. Çözeltiyi 0,45 μm'lik bir şırınga filtresinden ve aliquot'tan 1 mL stoklara süzün. Çözeltiyi -20 °C'de saklayın.
- DMEM'i% 10 (hacim / hacim) fetal sığır serumu, 1x penisilin / streptomisin ve 2.5 ng / mL FGF ile destekleyerek FAP'ın kültür ortamını hazırlayın. Ortamı 4 °C'de saklayın.
- F10'u %10 (hacim/hacim) at serumu, 1x penisilin/streptomisin ve 2.5 ng/mL FGF ile tamamlayan MuSC'nin kültür ortamını hazırlayın. Ortamı 4 °C'de saklayın.
- DMEM'i% 10 (hacim / hacim) fetal sığır serumu,% 10 (hacim / hacim) at serumu, 1x penisilin / streptomisin ve 2.5 ng / mL FGF ile destekleyerek kokültür ortamını hazırlayın. Ortamı 4 °C'de saklayın.
2. Arka bacak kas hasadı
- 6 cm'lik bir kaba (fare başına bir tabak) 2-3 mL WM ekleyin ve buzun üzerine yerleştirin.
- Boğulma yoluyla ötenazi yapın: fareyi bir CO 2 odasına yerleştirin ve% 100 CO2 ekleyin. Ölümü doğrulamak için servikal çıkık kullanın.
- Fare sırtüstü yatağını bir diseksiyon pedine yerleştirin ve kontaminasyonu önlemek için% 70 (hacim / hacim) etanol ile püskürtün.
- Fare göbeği derisinin merkezini sıkıştırmak ve ~ 1 cm'lik bir açıklığı yatay olarak kesmek için forseps kullanın. Yara kenarlarını ve masayı kavrayın, altındaki kasları ortaya çıkarmak için açıklığı zıt yönlere çekerek farenin içinde. O sırada farenin arka bacağındaki bir tarafı ortaya çıkarın.
- Kasları toplamadan önce, hamstringler ile kuadrisepsin proksimal ucu arasındaki kaslar arası yağları çıkarın. Bu, FAP'ların ve MuSC'lerin izolasyonunu artıracaktır.
- Dokuya zarar vermeden, alttaki TA ve ekstansör digitorum longus (EDL) kaslarını açığa çıkarmak için fasyayı kırmak ve soymak için keskin forseps kullanın. Kasları tibiadan ayırmak için forsepslerin keskin ucunu TA / EDL kaslarının altında çalıştırın.
- TA / EDL'yi ayak bileğine bağlayan tendonları kesin ve forseps ile tutarken, TA / EDL'nin uzunlamasına çizgisi boyunca kasları makasla kesin. Tüm TA/EDL kaslarını ayırmak için diz çevresindeki tendonları kesin. Kasları buz üzerinde tutulan 6 cm'lik bir kaba yerleştirin.
- Gastroknemius ve soleus kaslarını ayak bileğindeki tüm tendonları keserek ve kasları tibia ve fibuladan ayırarak izole etmeye devam edin. Diz çevresini kesin ve kasları 6 cm'lik tabağa aktarın.
- Kuadrisepslerin etrafındaki fasyayı soyun ve forsepslerin keskin ucunu kas ve kemik arasında çalıştırarak femurdan ayırın. Diz çevresindeki tendonları kesin ve kuadrisepsleri distal uçta forseps ile tutarken, femur boyunca keserek kasın geri kalanını kesin. Kasları 6 cm'lik tabağa yerleştirin.
- Hamstringleri ve femur etrafındaki kalan kasları ayırın ve bunları 6 cm'lik tabağa aktarın. Arka ekstremite kaslarını buz üzerinde tutulan 6 cm'lik bir tabakta toplayın.
NOT: Mümkün olduğunda, aşağı akış izolasyonuna müdahale edebilecek kan kümelerinin oluşumunu önlemek için kan damarlarına zarar vermekten kaçının. Kanama meydana gelirse, eksize edilen damarı derhal kanı emmek için steril bir gazlı bezle lekeleyin. - Kontralateral ekstremiteden TA, EDL, gastroknemius, soleus, kuadrisep ve hamstring kaslarını toplayın.
NOT: Tüm arka ekstremite kaslarını izole ederken, iki veya daha fazla fareyi bir araya getirmeyin. TA kasları izole edilirse, üç adede kadar TA kası bir araya getirilebilir.
3. Mekanik ve enzimatik kas sindirimi
- WM'yi 6 cm'lik çanaktan aspire edin ve kasları nemli tutmak için 1-2 mL MDB ekleyin.
- İyi kıyılmış dokudan oluşan bir bulamaç macunu elde edene kadar kasları iyice kesin. Bunu yapmak için, bir kas parçasının bir ucunu tutmak için forseps kullanın, ardından kasları daha az sıkı olana kadar yırtmak ve dilimlemek için bir neşter kullanın.
- Makas kullanarak, kası 1-2 dakika boyunca küçük parçalara ayırmaya devam edin. İyi kıyılmış bir kas çamuru elde edene kadar her kas grubu için bu adımı tekrarlayın.
NOT: Bu, FAP'ların ve MuSC'lerin verimini en üst düzeye çıkarmak için çok kritik bir adımdır. Uygun bir kas kıyma sağlamak için bu adımda 8-10 dakika (sadece TA kaslarını izole ediyorsa 4-5 dakika) harcamanız önerilir. - Kıyılmış kasları her fareden MDB içeren konik tüpe aktarın.
- Tüpleri laboratuvar filmi ile kapatın ve 37 ° C'lik bir su banyosunda 1 saat boyunca ajitasyonlu (75 rpm) inkübe edin. Tüpleri sallanma yolu boyunca yatay olarak yerleştirin ve tüpleri suya batırılmış halde tutmak için ağırlıklar kullanın.
- Fare başına 1 mL Kollajenaz II stoğu ve 1 mL dispase stoğu çözün. Kullanmadan önce, dispase stoğu sallanan bir kova rotorunda 10.000 x g'de 4 ° C'de 1 dakika boyunca döndürün. Sadece süpernatant kullanın.
- Tüm arka bacak kasları toplandıysa, aşağıdaki gibi devam edin:
- 1 saat sonra, tüpü çalkalayıcıdan çıkarın ve WM ile 50 mL'ye doldurun.
- Hücreleri, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de sallanan bir kova rotorunda santrifüj edin. 42 mL süpernatantı iki yeni tüpe aktarın (her tüpte ~21 mL) ve orijinal tüpte ~8 mL bırakın.
- 50 mL'ye kadar 21 mL süpernatant içeren yeni tüpleri WM ile doldurun. hücreleri 4 ° C'de 8 dakika boyunca 350 x g'de sallanan bir kova rotorunda tekrar santrifüj edin. Tüm süpernatantları aspire edin ve peletleri buz üzerinde tutun.
- ~8 mL MDB içeren orijinal tüpe 1 mL kollajenaz II stoğu ve 1 mL dispase stoğu ekleyin.
- 5 mL'lik bir serolojik pipet kullanarak, peleti tıkanmadan 10 kez askıya alın. Çözeltiyi tüpün duvarına doğru dışarı çıkarın ve kabarcık oluşumunu önleyin. Yeniden süspansiyon sırasında tıkanma meydana gelirse, kas parçalarını mekanik olarak bozmak için pipetin ucunu tüpün dibine doğru itin. Adım 3.9'a geçin.
- TA kasları toplandıysa, aşağıdaki gibi devam edin:
- 1 saat sonra, tüpü çalkalayıcıdan çıkarın ve WM ile 15 mL'ye doldurun.
- Hücreleri, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de sallanan bir kova rotorunda santrifüj edin. 13 mL süpernatantı yeni bir 15 mL tüpe aktarın ve orijinal tüpte ~ 2 mL bırakın.
- 15 mL'ye kadar süpernatantın 13 mL'sini içeren yeni tüpü WM ile doldurun. hücreleri 4 ° C'de 8 dakika boyunca 350 x g'de sallanan bir kova rotorunda tekrar santrifüj edin. Tüm süpernatantı aspire edin ve peleti buz üzerinde tutun.
- 1000 μL'lik bir pipet ucu kullanarak, peleti orijinal tüpte tıkanmadan yukarı ve aşağı doğru yeniden askıya alın.
- 2 mL MDB içeren orijinal tüpe 1 mL Kollajenaz II stoğu ve 1 mL dispase stoğu ekleyin ve WM ile 10 mL'ye kadar doldurun.
- Tüpleri laboratuvar filmi ile kapatın ve 30 dakika boyunca ajitasyonlu (75 rpm) 37 ° C'lik bir su banyosunda inkübe edin. Tüpleri adım 3.5'teki gibi yerleştirin.
4. Mononüklee hücrelerin üretimi
NOT: 15 mL'lik bir konik tüpte toplanan TA kaslarıyla çalışıyorsanız, adım 4.1'e geçmeden önce süspansiyonu 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
- 30 dakika sonra, tüpü çalkalayıcıdan çıkarın. Kas süspansiyonunu 20 G'lik bir iğne ile 10 mL'lik bir şırıngadan başarıyla 10 kez aspire edin ve çıkarın.
NOT: Kabarcıkları ve köpüklenmeyi önlemek için kas süspansiyonunu tüpün duvarına doğru çıkarın. Küçük sindirilmemiş tendon veya kıkırdak parçaları, aspirasyonun ilk turlarında iğneyi tıkayabilir. Tıkanma meydana gelirse, tıkanıklığı iğnenin ucundan çıkarmak için steril forseps kullanın. - Her tüpü 50 mL'ye kadar WM ile doldurun ve karıştırmayı sağlamak için birkaç kez hafifçe ters çevirin.
- Hücreleri, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de sallanan bir kova rotorunda santrifüj edin. Süpernatantı yeni bir tüpe (~ 42 mL) aktarın ve orijinal tüpte ~ 8 mL bırakın.
- 50 mL'ye kadar 42 mL süpernatant içeren yeni tüpü WM ile doldurun. hücreleri 4 ° C'de 8 dakika boyunca 350 x g'de sallanan bir kova rotorunda tekrar santrifüj edin. Tüm süpernatantı aspire edin ve peleti buz üzerinde tutun.
- 8 mL WM içeren orijinal 50 mL konik tüpe 40 μm naylon hücre süzgeci yerleştirin ve hücre süzgecini 1-2 mL WM ile önceden ıslatın.
- 40 μm naylon hücre süzgecini tutarken, peleti 5-10 kez nazikçe yeniden askıya almak için 10 mL'lik bir pipet kullanın. Hücre kaybını en aza indirmek için peletleri hücre süzgecinden tekrar aynı tüpe filtreleyin.
- Bu adımda, buz üzerinde hücre peletleri olan ek tüpler olduğundan emin olun. Peletleri yeniden askıya almak ve çözeltiyi orijinal tüpte bulunan hücre süzgecine aktarmak için her tüpe 4-5 mL WM ekleyerek bu peletleri orijinal tüpe geri filtreleyin. Yerçekimi ile filtrelemeye izin verin.
- Tüm peletleri orijinal 50 mL konik tüpe topladıktan sonra, hücre süzgecini başka bir 4-5 mL WM ile durulayın. hücre süzgecinin alt tarafındaki tüm sıvıyı toplamak için 1000 μL'lik bir pipet kullanın.
- Her tüpü 50 mL'ye kadar WM ile doldurun ve karıştırmayı sağlamak için birkaç kez hafifçe ters çevirin.
- Hücreleri, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de sallanan bir kova rotorunda santrifüj edin. Santrifüjlemeden sonra peleti rahatsız etmeden tüm süpernatantı derhal aspire edin.
- Peleti 600 μL WM içinde yeniden askıya alın ve 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
5. Akış sitometrisi için antikor boyama
NOT: Her deney için aşağıdaki kontrolleri ayarlayın: i) lekesiz kontrol, ii) canlı hücre popülasyonu için seçilecek canlılık kontrolü, iii) florokrom emisyon yayılımını düzeltmek için tek lekeli kompanzasyon kontrolleri ve iv) floresan eksi bir (FMO) kontrolleri, yayılma yayılımını hesaba katarak geçit sınırlarını belirlemek. Boyama kontrollerinin tam listesi için Tablo 1'e bakın.
- Lekesiz kontrol hazırlamak için, hücre süspansiyonunun 10 μL'sini, 190 μL WM içeren 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. hücre süspansiyonunu yeniden askıya alın ve 35 μm hücre süzgeci kapağına sahip 5 mL'lik bir polistiren yuvarlak tabanlı tüpten süzün. Süspansiyonun yerçekimine göre filtrelenmesine izin verin.
- Hücre süzgecinin alt tarafındaki tüm sıvıyı toplamak için 200 μL'lik bir pipet kullanın. Bir kapakla kapatın ve ışıktan korunan buz üzerinde bırakın.
- Canlılık, FMO ve tek lekeli kontroller hazırlayın: 10 adet 2 mL mikrosantrifüj tüpünü etiketleyin ve her tüpe 190 μL WM ve 10 μL hücre süspansiyonu ekleyin. Denetimlerin tam listesi için Tablo 1'e bakın. Deneysel kontrole bağlı olarak uygun tüpe antikorlar ekleyin. Antikor kombinasyonu ve konsantrasyonu hakkında bilgi için Tablo 1'e bakınız.
- Hücre süspansiyonunun geri kalanını (500 μL) 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne (deneysel tüp) aktarın ve aşağıdaki antikorları ekleyin: CD31-APC, CD45-APC, Sca1-Pasifik Mavisi, VCAM-1-biyotin ve α7-İntegrin-PE. Antikor kombinasyonu ve konsantrasyonu hakkında bilgi için Tablo 1'e bakınız.
- Düzgün dağılım sağlamak için her tüpü yavaşça iyice karıştırın ve hücreleri ışıktan korunan 45 dakika boyunca 4 ° C'de dönen bir çalkalayıcıda inkübe edin.
- 45 dakika sonra, 2 mL'ye kadar tüm mikrosantrifüj tüplerini WM ile doldurun. Tüpleri, 4 °C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de sabit açılı rotorlu soğutulmuş bir santrifüjde santrifüj yapın. Pelet'i rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin.
- Tüm mikrosantrifüj tüplerindeki hücreleri 300 μL WM'de yeniden askıya alın.
- Streptavidin antikorunu uygun tüplere ekleyin. Antikor kombinasyonu ve konsantrasyonu hakkında bilgi için Tablo 1'e bakınız. Düzgün dağılım sağlamak için her tüpü iyice karıştırın ve hücreleri ışıktan korunan 20 dakika boyunca 4 ° C'de dönen bir çalkalayıcıda inkübe edin. Kalan tüpleri ışıktan korunan buz üzerinde bırakın.
- 20 dakika sonra, streptavidin antikoru içeren mikrosantrifüj tüplerini WM ile 2 mL'ye kadar doldurun. Tüpleri, 4 °C'de 5 dakika boyunca 250 x g'de sabit açılı rotorlu soğutulmuş bir santrifüjde santrifüj yapın. Süpernatantı tamamen aspire edin ve 300 μL WM'deki hücreleri yeniden askıya alın.
- 10 adet 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüpün 35 μm hücre süzgeç kapağını 200 μL WM ile önceden ıslatın. Kontrol tüplerinden hücreleri uygun 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüplerden filtreleyin. Hücre süzgecinin alt tarafındaki tüm sıvıyı toplamak için 200 μL'lik bir pipet kullanın. Kapaklarla kapatın, tüpleri buz üzerinde bırakın ve ışıktan koruyun.
- Deney tüpündeki hücreleri, toplam 500 μL WM için ilave 200 μL WM ile yeniden askıya alın. 200 μL WM ile 5 mL'lik bir polistiren yuvarlak tabanlı tüpün bir hücre süzgeci kapağını önceden ıslatın. Hücre süspansiyonunu deney tüpünden 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüpe aktarın ve yerçekimi ile filtrelemesine izin verin.
- Deneysel numune süspansiyonunu içeren 2 mL mikrosantrifüj tüpünü 300 μL WM ile durulayın ve aynı süzgeç kapağından geçirin. Hücre süzgecinin alt tarafındaki tüm sıvıyı toplamak için 200 μL'lik bir pipet kullanın. Bir kapakla kapatın, tüpleri buz üzerinde bırakın ve ışıktan koruyun.
NOT: 35 μm hücre süzgeci kapağının tıkanması meydana gelirse, akışı kolaylaştırmak için tezgahtaki tüpe hafifçe dokunun. - FAP'lar ve MuSC'ler için toplama tüplerini hazırlayın ve etiketleyin. Hücreleri tüm arka ekstremite kaslarından izole ediyorsanız, hücreleri 5 mL'lik polipropilen yuvarlak tabanlı tüplerde, 2x serum ile desteklenmiş 1 mL'ye kadar FAP veya MuSC kültür ortamı ile sıralayın. Hücreleri TA kaslarından izole ediyorsanız, FAP'ları ve MuSC'leri, 2x serum ile desteklenmiş 400 μL'ye kadar kültür ortamı içeren 2 mL mikrosantrifüj tüplerinde sıralayın.
6. Floresan ile aktive edilmiş hücre sıralama (FACS)
NOT: Bu protokol, 100 μm nozul ile donatılmış ve dokuz adede kadar farklı florokromu (ileri ve yan saçılma dahil 11 parametre) analiz etme kapasitesine sahip üç lazerli bir konfigürasyona (488 nm, 640 nm, 405 nm) sahip kompakt bir tezgah üstü araştırma akışı sitometresi kullanır. Bu protokolde kullanılan florokromlar ve bunlara bağlı dedektör bandpass filtreleri aşağıdaki gibidir: PE 586/42; PE-Cy7 783/56; APC 660/10; Pasifik Mavisi 448/45; 7-Aminoaktinomisin D (7-AAD) 700/54, GFP 527/32. Hücreler 4 ° C'de sıralanır ve sıralamayı takiben buz üzerinde kalır. Bu cihazı çalıştırmadan önce, kullanıcının bir teknik uygulama uzmanı tarafından uygun şekilde eğitildiğinden emin olun.
- Kurulum ve performans, hücre sıralayıcıyı üreticinin spesifikasyonlarına göre kontrol edin.
- FAP'ları ve MuSC'leri tanımlamak için hiyerarşik bir geçit stratejisi oluşturun (Şekil 2).
- FAT'leri aşağıdaki şemaya göre izole edin: i) hücreleri enkaz ile ayırmak için ileri hücre saçılma alanı ile yan hücre saçılma alanı (FSC-A'ya karşı SSC-A), ii) yan hücre saçılma yüksekliği ile yan hücre saçılma genişliği (SSC-H'ye karşı SSC-W), SSC aralığındaki çiftlerden teklileri ayırt etmek, iii) ileri hücre saçılma yüksekliği ile ileri hücre saçılma genişliği (FSC-H'ye karşı FSC-W), ve iv) Canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için SSC-A'ya karşı 7-AAD alanı.
- FAP'ları antikor bazlı yöntemle izole ediyorsanız, aşağıdaki şemayı kullanın: v) CD31 + ve CD45 + hücrelerini daha fazla analizden dışlamak için APC-CD45 / CD31 alanı vs Pasifik Mavisi-Ly-6A / E (Sca1) alanı ve vi) PE-Cy7-VCAM-1 alanı vs PE-α7-Integrin alanı CD31-/CD45-/Sca1+ popülasyonundan FAP'ları ayırt etmek için. FAP'lar CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-Integrin- olayları olarak tanımlanır.
- FAT'leri endojen GFP muhabir yöntemiyle izole ediyorsanız, aşağıdaki şemayı kullanın: v) CD31 + ve CD45 + hücrelerini daha fazla analizden dışlamak ve GFP + hücrelerini izole etmek için APC-CD45 / CD31 alanı vs GFP-PDGFRα alanı. FAP'lar CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-Integrin- olayları olarak tanımlanır.
- MuSC'leri aşağıdaki şemaya göre izole edin: i) hücreleri enkaz karşısında ayırmak için ileri hücre saçılma alanı vs yan hücre saçılma alanı (FSC-A vs SSC-A), ii) yan hücre saçılma yüksekliği vs yan hücre saçılma genişliği (SSC-H vs SSC-W) SSC aralığındaki çiftlerden teklileri ayırt etmek, iii) ileri hücre saçılma yüksekliği vs ileri hücre saçılma genişliği (FSC-H vs FSC-W) FSC aralığındaki çiftlerden teklileri ayırt etmek, iv) Canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için 7-AAD alanı vs SSC-A, v) CD31 + ve CD45+ hücrelerini daha ileri analizlerden dışlamak için APC-CD45 / CD31 alanı vs Pasifik Mavisi-Ly-6A / E (Sca1) alanı ve vi) MuSC'leri ayırt etmek için CD31-/CD45-/Sca1- popülasyonundan PE-Cy7-VCAM-1 alanı vs PE-α7-Integrin alanı. MuSC'ler CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ olayları olarak tanımlanır.
- FAT'leri aşağıdaki şemaya göre izole edin: i) hücreleri enkaz ile ayırmak için ileri hücre saçılma alanı ile yan hücre saçılma alanı (FSC-A'ya karşı SSC-A), ii) yan hücre saçılma yüksekliği ile yan hücre saçılma genişliği (SSC-H'ye karşı SSC-W), SSC aralığındaki çiftlerden teklileri ayırt etmek, iii) ileri hücre saçılma yüksekliği ile ileri hücre saçılma genişliği (FSC-H'ye karşı FSC-W), ve iv) Canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için SSC-A'ya karşı 7-AAD alanı.
- Hücre popülasyonunun SSC-A vs FSC-A grafiğinde düzgün bir şekilde konumlandırıldığından emin olmak ve canlı tek hücrelere düzgün bir şekilde geçiş yapmak için lekesiz kontrol ve canlılık kontrolünü çalıştırın.
- Tüm tek lekeli kontrolleri edinin ve yayılma telafisi matrisini oluşturun.
- Tüm FMO kontrollerini çalıştırın ve arka plan floresan yayılımı ile pozitif lekeli popülasyon arasındaki kesme noktasını belirleyin.
- Deneysel numunenin alınmasından yaklaşık 5-10 dakika önce, 7-AAD canlılık boyası ekleyin ve yavaşça karıştırın.
- Tüm kontroller işlendikten sonra, sıralama kapılarını FMO kontrollerine göre ayarlayın; deneysel örnekleri elde etmek ve sıralamak.
- Tüm numuneler işlendikten sonra, sitometreyi üreticinin spesifikasyonuna göre temizleyin. Analiz için tüm .fcs verilerini dışarı aktarın.
7. FAP ve MuSC Kültürü
NOT: Sıralanmış hücreler, sıralamadan hemen sonra, kollajen I kaplı plakalar üzerinde uygun bir ortamda kültürlenmelidir.
- Toplama borularını 250 x g'de sabit açılı bir rotorda 4 °C'de 5 dakika boyunca santrifüj yapın.
- Hücre peletini rahatsız etmeden süpernatantı aspire edin.
- MuSC kültürü için, hücreleri uygun miktarda MuSC kültür ortamında yeniden askıya alın ve standart koşullarda 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- 20.000 hücre/ cm2 yoğunluğunda taze izole edilmiş MuSC'ler ve 15.000 hücre /cm2 yoğunluğunda aktive edilmiş MuSC'ler plaka.
- Kaplamadan sonra, hücreler küçük, küresel ve yarı saydam görünür. 36 saat içinde, MuSC'ler plakanın yüzeyine yapışır ve ilk 48 saat boyunca boyutlarını yavaşça arttırır.
- Ortamı her 2 günde bir değiştirin.
NOT: MuSC'ler hücre yoğunluğuna karşı çok hassastır. MuSC'leri çoğalma durumlarında tutmak için,% 60 -% 70 oranında birleşene kadar onları büyütün. Hücreleri yeni kollajen I kaplı tabaklara veya tabaklara geçirin ve her 2 günde bir yeni taze ortam ekleyin. MuSC'ler aynı tabakta veya tabakta 3-4 günden daha uzun süre tutulursa, uzun bir form kazanırlar ve birbirine kaynaşana kadar komşu hücrelerle hizalanırlar.
- FAP'ın kültürü için, hücreleri uygun miktarda MuSC kültür ortamında yeniden askıya alın ve standart koşullarda 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin.
- 15.000 hücre / cm2 yoğunluğunda bozulmamış kastan izole edilen FAP'lar ve 9.000 hücre /cm2'de yaralı kastan izole edilen FAP'larıplakalayın.
NOT: Kaplamadan sonra, FAP'lar plakanın yüzeyine 48 saat içinde tamamen yapışırken, aktif FAC'lar plakaya birkaç saat içinde yapışır. Bağlandıktan sonra, FAP'lar küçük bir hücre gövdesi ve uzun hücre süreçleri ile karakteristik şekillerini kazanırlar ve hızla çoğalırlar. - Ortamı her 2 günde bir değiştirin.
NOT: FAP'lar hücre yoğunluğuna karşı çok hassastır. Düşük yoğunluklarda FAP'ların tohumlanması, zayıf hücre büyümesine ve hücre ölümüne neden olabilir. Aksine, FAP'ların yüksek tohumlama yoğunluğunda kaplanması, hücre sağkalımını artıracak ve genişlemelerini artıracaktır. Hasarlı kaslardan türeyen FAP'lar, zaten aktive oldukları için genellikle hasarsız kastan daha düşük hücre yoğunluğu gerektirir. FAP kaplama yoğunluğunun, kişinin deneysel koşullarına ve numunelerin kaynağına göre ayarlanması önerilir.
- 15.000 hücre / cm2 yoğunluğunda bozulmamış kastan izole edilen FAP'lar ve 9.000 hücre /cm2'de yaralı kastan izole edilen FAP'larıplakalayın.
- Kokültür için, FAP'ları ve MuSC'leri kokültür ortamında 1: 1 oranında yeniden askıya alın ve standart koşullarda olanları 37 ° C ve% 5 CO2'de inkübe edin. Hücrelerin 48 saat boyunca bağlanmasına izin verin ve ortamı her 2 günde bir değiştirin.
8. Kültürlenmiş FAP'ların ve MuSC'lerin immünofloresan analizi
- Hücre ortamını aspire edin ve 1x PBS ile iki veya üç yıkama yapın.
- RT'de 15 dakika boyunca hücreleri 1x PBS'de% 2 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin.
- % 2 PFA'yı aspire edin ve hücreleri 1x PBS ile iki veya üç kez hızlı bir şekilde yıkayın.
- Hücre geçirgenliği ve blokajı gerçekleştirin:
- Yeni izole edilmiş FAP'ların immün boyaması için, RT'de 30 dakika boyunca 1x PBS +% 0.1 Triton X-100 (PBST) +% 1 sığır serum albümini (BSA) +% 5 Normal Eşek Serumu (NDS) ile hücreleri inkübe ederek hücre geçirgenliği ve blokajı gerçekleştirin.
- Yeni izole edilmiş MuSC'lerin immün boyaması için, RT'de 30 dakika boyunca PBST +% 1 BSA +% 5 Normal Keçi Serumu (NGS) ile hücreleri inkübe ederek hücre geçirgenliği ve blokajı gerçekleştirin.
- Birincil antikorları uygulayın:
- Yeni izole edilmiş FAP'ların immünoboyaması için, 4 ° C'de gece boyunca PBST +% 1 BSA +% 5 NDS ile seyreltilmiş keçi anti PDGFRα primer antikoru (1:300) uygulayın.
- Yeni izole edilmiş MuSC'lerin immünoboyaması için, RT'de 45 dakika boyunca PBST + %1 BSA + %5 NGS ile seyreltilmiş fare anti Pax7 primer antikoru (1:10) uygulayın.
- Birincil antikor çözeltisini çıkarmak için hücreleri 1x PBS ile iki veya üç kez yıkayın.
- İkincil antikorlar uygulayın:
- Yeni izole edilmiş FAP'ların immünoboyaması için, RT'de 1 saat boyunca PBST +% 1 BSA'da seyreltilmiş eşek anti-keçi IgG (H + L) Alexa Fluor 488 sekonder antikoru (1:500) uygulayın.
- Yeni izole edilmiş MuSC'lerin immün boyaması için, RT'de 45 dakika boyunca PBST +% 1 BSA'da seyreltilmiş keçi anti-fare IgG 1 Alexa Fluor 555 sekonder antikoru (1 :500) uygulayın.
- Birincil antikor çözeltisini çıkarmak için hücreleri 1x PBS ile iki veya üç kez yıkayın.
- RT'de 5 dakika boyunca PBST'de (1:1000) DAPI içeren hücreleri inkübe ederek nükleer karşı boyama gerçekleştirin.
- DAPI çözeltisini çıkarmak için hücreleri 1x PBS ile üç kez yıkayın.
DİKKAT: DAPI toksik ve tehlikelidir; Dikkatli bir şekilde kullanın ve tehlikeli atık şişesine atın. - Hücreleri ışıktan korunan 4 °C'de saklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokol, yaklaşık bir milyon FAP'ın ve 350.000'e kadar MuSC'nin vahşi tip yetişkin farelerin (3-6 ay) yaralanmamış arka bacaklarından izole edilmesine izin verir, bu da FAP'lar için% 8'lik bir verime ve toplam olayların MuSC'leri için% 3'lük bir verime karşılık gelir. Yaralanmadan 7 gün sonra hasarlı TA'dan hücreleri ayırırken, sırasıyla% 11 ve% 4'lük bir verime karşılık gelen 300.000 FAP ve 120.000 MuSC'ye kadar elde etmek için iki ila üç TA kası toplanır. Sıralama sonrası saflık değerleri FAP'lar ve MuSC'ler için genellikle% 95'in üzerindedir.
FAP'ları ve MuSC'leri izole etmek için benimsenen geçit stratejisi Şekil 2'de gösterilmiştir. İlk olarak, ilgilenilen hücre popülasyonları, hücre morfolojik özelliklerine dayanan bir dereceye kadar hücresel tanımlamaya izin veren bir ileri saçılma (FSC) ve yan saçılma (SSC) yoğunluk grafiği oluşturularak tanımlanır. Bu geçit stratejisi, genellikle FSC vs SSC grafiğinin sol alt köşesinde bulunan küçük hücresel kalıntıları dışlamak için de kullanılır. FSC ve SSC yükseklik ve genişlik sinyallerine dayanarak çiftleri dışlamak için hücreler daha da kapılanır ve elde edilen singlet hücreleri daha sonra canlılıklarını değerlendirmek için 7-AAD ile boyanır. Canlı hücreler, Lineage pozitif hücrelerini daha ileri analizlerden dışlamak için Sca1 ve CD31 / CD45 ekspresyonu için daha fazla değerlendirilir. Soy negatif Sca1 negatif skalletleri daha sonra FAP'ları ve MuSC'leri ayırt etmek için VCAM-1 ve α7-Integrin için boyanır. FAP'lar CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-İntegrin- hücreleri olarak tanımlanır ve MuSC'ler CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-İntegrin+ hücreleri olarak tanımlanır. Alternatif olarak, canlı hücreler ayrıca FAP'ları ayırt etmek için CD31 / CD45 ve GFP-PDGFRα için kapılıdır. FAP'lar CD31-/CD45-/PDGFRα+/VCAM-1-/α7-İntegrin- hücreleri olarak tanımlanır.
Bu protokol, FAP popülasyonunu izole etmek için iki geçit stratejisi sunar: endojen bir PDGFRa-EGFP raporlayıcısı kullanarak veya bir Sca1 antikoru ile hücre boyama yaparak. PDGFRa-EGFP knock-in muhabir fareleri (B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J)18, endojen PDGFRα lokusundan H2B-eGFP füzyon genini eksprese ederek PDGFRα soyunun verimli ve spesifik bir şekilde etiketlenmesini sağlar (Şekil 3A). Bu fare çizgisi daha önce Pdgfrα + FAP'ları izole etmek için kullanıldı ve GFP muhabiri oldukça görünür ve spesifik bir sinyal19 sağladığı için FAC'lerin izolasyonu için gerçekten çok yararlıdır. Alternatif olarak, bu protokol FAP'ların tanımlanması için Sca1 tabanlı bir yalıtım yöntemini açıklar. Sca1 (Ly-6A / E), kas hazırlığında FAP'ları tanımlamak ve izole etmek için yaygın olarak kullanılır13,16,17. Sca1, Ly-6 ailesi20'nin 18-kDa glikozilfosfatidilinositol (GPI) bağlantılı bir protein üyesidir. Bununla birlikte, mezenkimal progenitör kas hücrelerinin hücre yüzeyinde eksprese edilmesinin yanı sıra, hematopoetik kök hücrelerde (HSC'ler) ve olgun lökositlerde ve T hücrelerinde de Sca1 ekspresyonu gözlenir. Bu protokolde, FACS'a dayalı soy izleme çalışmaları yaparak Sca1'in FAP'ların belirteci olarak uygunluğunu doğruladık. Spesifik olarak, PDGFRa-EGFP fareleri, mononüklee hücrelerin popülasyonları arasında Sca1 + / GFP eksprese eden FAP'ları izole etmek için kullanılmıştır. Tüm GFP eksprese eden hücrelerin de Sca1 için pozitif ve CD31, CD45, VCAM-1 ve α7-Integrin için negatif olduğunu bulduk. Bu analiz, Sca1 antikorunun hem sessiz hem de aktif FAB'lerde FAP'lar için bir belirteç olarak kullanıldığını doğruladı ve FAP'ları izole etmek için her iki stratejinin de belirsiz kullanımı için araçlar sağladı.
Bu protokolde, FAP'lar ve MuSC'ler, yaralanmadan 7 gün sonra, intramüsküler Notexin enjeksiyonları ile yaralanan yetişkin farelerden de izole edildi (Şekil 5). Yaralanmayı takiben, MuSC'ler ve FAP'lar in vivo olarak aktive olur ve çoğalır, 3. ve 4. 2,3. günler arasında proliferasyonun zirvesine ulaşır. Proliferasyondaki bu değişiklikler, Sca1 / PDFGRα ve VCAM-1 / α7-Integrin pozitif hücrelerinin yüzdesindeki bir artışla yansıtılır. Şekil 6, yaralanmamış ve yaralanma sonrası 7 gün TA'larda FAP ve MuSC'lerin miktarını göstermektedir; Proliferasyondaki zirve yaralanmadan sonraki 2. ila 3. günler arasında gözlenmesine rağmen, düşük bir proliferasyon hücresi oranı yaralanmadan 7 gün sonra hala kayda değerdir. MuSC'ler aktive edildikçe, hücresel boyutlarında21,22'de belirgin bir artış vardır. Bu nedenle, bu hücreleri FACS ile izole ederken, FSC-A ve SSC-A parametrelerini ayarlamak ve kapıyı bu hücreleri merkeze dahil edecek şekilde genişletmek kritik öneme sahiptir (Şekil 5A).
İzole hücre popülasyonlarının saflığı, kokültürlenmiş GFP + FAP'ların ve MuSC'lerin Pax7 antikorları ile immünoboyaması ile doğrulandı. Yeni izole edilmiş GFP + FAP'lar ve MuSC'ler 48 saat boyunca 1: 1 oranında kokültüre alındı (Şekil 3B). GFP + FAP'lar Pax7 belirtecini ifade etmezken, MuSC'ler bu antikor ile reaksiyona girdi. Bu nedenle, Lin-/Sca-1+/VCAM-1-/α7-Integrin- ve Lin-/Sca-1-/VCAM-1+/α7-Integrin+ geçit stratejisi, sırasıyla FAP ve MuSC'lerin saf popülasyonlarının izole edilmesinde etkilidir.
Şekil 1: FAP ve MuSC izolasyonuna grafiksel genel bakış. Arka ekstremite kaslarından FAP ve MuSC izolasyonunu gösteren grafiksel genel bakış. Protokol ayrıca TA kaslarından izole edilen hücreler için de geçerlidir. İlk olarak, enzimatik sindirimden geçmeden önce kaslar toplanır ve mekanik olarak kıyılır. Kas karışımı daha sonra 20 G'lik bir iğne ile işlenir ve mononüklee hücrelerin süspansiyonunu elde etmek için filtrelenir. Hücreler daha sonra florofor konjuge antikorların bir kokteyli ile inkübe edilir ve sonuçta saf bir FAP ve MuSC popülasyonunu izole etmek için bir hücre sıralayıcısından geçer. Saf hücre popülasyonları daha sonra aşağı akış uygulaması için işlenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Sessiz FAP'ların ve MuSC'lerin temsili FACS profili. (A-H) FAP'lerin ve MuSC'lerin izolasyonu için geçit stratejisi. (A) İlk olarak, örnekler hücresel kalıntıları dışlamak için kapılıdır ve (B, C) SSC ve FSC özelliklerine göre ikiye katlanır. (D) Elde edilen tek hücreler daha sonra canlılıklarını değerlendirmek için 7-AAD ile boyanır. (E) 7-AAD negatif tek hücreler daha sonra Lineage pozitif hücreleri daha ileri analizlerden dışlamak için APC-CD31 / CD45 ve Pasifik Mavi-Sca1 için değerlendirilir. (F,G) Soy negatif segletler daha sonra PE-Cy7-VCAM-1 ve PE-α7-Integrin için boyanır. (F) FAP'lar CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-İntegrin- hücreleri olarak tanımlanır ve (G) MuSC'ler CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-İntegrin+ hücreleri olarak tanımlanır. (H) Bir GFP muhabiri kullanarak PDGFRa-EGFP farelerinde FAP izolasyonu. (I-M) Floresan Eksi Bir (FMO) kontrolleri için FACS profili, uygun kompanzasyon ve geçişi göstermek için. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: FAP ve MuSC hücre kültürünün doğrulanması. (A) GFP'yi eksprese eden yeni izole edilmiş FAP'lar kaplandı ve bir PDGFRα antikoru ile birlikte boyandı. Çekirdekler DAPI ile boyandı. GFP (yeşil), PDGFRα (kırmızı) ve DAPI (mavi) boyamanın birleştirilmiş görüntüleri görüntülenir. Ölçek çubukları, 25 μm. (B) Yeni izole edilmiş FAP'lar (yeşil) ve MuSC'ler 48 saat boyunca birlikte kültürlendi ve Pax7 (kırmızı) ile boyandı. Çekirdekler DAPI ile boyandı. GFP eksprese eden FAP'lar Pax7'yi ifade etmezken, MuSC'ler sadece Pax7'yi ifade eder ve GFP için olumlu değildir, bu da her iki sıralanmış popülasyonun saflığını doğrular. Ölçek çubukları, 75 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: PDGFRα-EGFP fareleri ve Sca1 ekspresyonu, yetişkin farelerde FAP'ları özel olarak etiketler. FAP'lar GFP+/Sca1+ hücreleri olarak izole edilir. 7-AAD negatif tek hücreler, Lineage pozitif hücreleri dışlamak ve FAP'ları ayırt etmek için APC-CD31 / CD45 ve GFP-PDGFRa için değerlendirilir. Soy negatif/Sca1 pozitif hücreler, MuSC'leri dışlamak için PE-Cy7-VCAM-1 ve PE-α7-Integrin için boyanır. FAP'lar CD31-/CD45-/PDGFRα+/Sca1+/VCAM-1-/α7-İntegrin- hücreleri olarak tanımlanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Aktive edilmiş FAP'ların ve MuSC'lerin temsili FACS profili. (A-H) Aktive edilmiş FAP'ların ve MuSC'lerin izolasyonu için geçit stratejisi. (A) FSC-A vs SSC-A yoğunluk grafiği oluşturularak hücresel kalıntıları dışlamak için numuneler kapılanır. İlgilenilen nüfusu karşılamak için genişletilmiş kapıya dikkat edin. (B,C) SSC ve FSC özelliklerine dayalı çiftleri ortadan kaldırmak için numuneler daha da kapılıdır. (D) Elde edilen tek hücreler daha sonra canlılıklarını değerlendirmek için 7-AAD ile boyanır. (E) 7-AAD negatif tek hücreler daha sonra Lineage pozitif hücreleri daha ileri analizlerden dışlamak için APC-CD31 / CD45 ve Pasifik Mavi-Sca1 için değerlendirilir. (F,G) Soy negatif tekletler daha sonra PE-Cy7-VCAM-1 ve PE-α7-integrin için boyanır. (F) FAP'lar CD31-/CD45-/Sca1+/VCAM-1-/α7-integrin- hücreleri olarak tanımlanır ve (G) MuSC'ler CD31-/CD45-/Sca1-/VCAM-1+/α7-integrin+ hücreleri olarak tanımlanır. (H) Bir GFP muhabiri kullanarak PDGFRa-EGFP farelerinde FAP izolasyonu. (I-M) Floresan Eksi Bir (FMO) kontrolleri için FACS profili, uygun kompanzasyon ve geçişi göstermek için. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Bozulmamış ve yaralı TA'larda FAP ve MuSC'lerin miktarı. FAP ve MuSC'lerin yaralanmamış ve yaralanma sonrası 7 gün TA kaslarında miktarının belirlenmesi. Hücre sayımı, toplanan kas mg'ı başına sıralanan hücre sayısının bölünmesiyle gerçekleştirildi. ** P < 0.01 yaralanmamış ve yaralı arasında. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| 7-AAD (μg/mL) |
CD31/CD45-APC (μg/mL) |
Sca1-Pasifik Mavisi (μg/mL) |
α 7-Integrin-PE (μg/mL) |
VCAM-1-Biotin (μg/mL) |
PE-Cy7 Streptavidin (μg/mL) |
||
| Lekesiz Kontrol | |||||||
| Tek Lekeli Kontroller | |||||||
| 7-AAD (Canlılık Kontrolü) | 1 | ||||||
| CD31/CD45 | 2 | ||||||
| Sca1 | 5 | ||||||
| α7-İntegrin | 0.4 | ||||||
| VCAM-1 | 5 | 2 | |||||
| FMO Kontrolleri | |||||||
| FMO 7 AAD | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO CD31/CD45 | 1 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO Sca1 | 1 | 2 | 0.4 | 5 | 2 | ||
| FMO α7-İntegrin | 1 | 2 | 5 | 5 | 2 | ||
| FMO VCAM-1 | 1 | 2 | 5 | 0.4 | |||
| Deneysel örnek | |||||||
| Tam leke | 1 | 2 | 5 | 0.4 | 5 | 2 | |
Tablo 1: Antikor boyama matrisi. Deney ve kontrol örneklerini boyamak için kullanılan antikor konsantrasyonlarının listesi. FAT'leri GFP ile izole ederse, Sca1 boyama ihmal edilebilir. Bunun yerine, GFP tek lekeli kontrol ve GFP FMO'yu çalıştırın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Saf yetişkin kök hücre popülasyonlarının tanımlanması ve izolasyonu için etkili ve tekrarlanabilir protokollerin oluşturulması, işlevlerini anlamaya yönelik ilk ve en kritik adımdır. İzole FAP'lar ve MuSC'ler, kas hastalıkları için potansiyel bir tedavi olarak transplantasyon deneylerinde multiomik analiz yapmak için kullanılabilir veya kök hücre tedavisinde hastalık modellemesi için genetik olarak değiştirilebilir.
Burada açıklanan protokol, yetişkin farelerin arka bacak kaslarından elde edilen FAP ve MuSC'lerin tanımlanması, izolasyonu ve kültürü için standartlaştırılmış kılavuzlar sağlar. FAP ve MuSC'lerin saf popülasyonları, FACS-tabanlı bir teknik kullanılarak izole edildi ve saflıkları daha sonra spesifik hücre yüzey belirteçleri ve genetik araçlarla immünoboyama hücreleri ile değerlendirildi.
Protokol, FAP'ların ve MuSC'lerin verimini yüksek oranda etkileyen üç ana bölümden oluşur: mekanik ve enzimatik kas sindirimi, 20 G iğne yoluyla mononüklee bir hücre süspansiyonunun oluşturulması ve FACS yoluyla tek hücrelerin son izolasyonu.
Uygun kas kıyma işleminin yapılması, tek hücrelerin serbest bırakılması için kritik öneme sahiptir. Kıyma işleminden sonra kas parçalarının optimal boyutuna ulaşmak, sindirim için kullanılan enzimlerin en iyi şekilde çalışmasına izin verdiği ve adım 4.1'de kullanılan iğnenin tıkanmasını önlediği için bu adıma vurgu yapılmalıdır. Öte yandan, kasın aşırı kıyılması, zayıf hücre verimine ve hücre canlılığının azalmasına neden olabilir, çünkü MuSC'ler ilk sindirim sırasında hızla salınır ve adım 3.7.2 veya 3.8.214'te aspire edilebilir. Ek olarak, kas preparatının sindirimi için kullanılan enzimlerin etkinliği, enzimatik ayrışmanın kalitesini de etkiler, çünkü farklı enzim lotları arasında değişkenlik olabilir veya enzimlerin aktivitesindezaman 23 ile bir azalma olabilir. Bu nedenle, sindirim zamanlamasını ve konsantrasyonunu optimize etmek için her enzim grubunun test edilmesi önerilir. Ayrıca, kasın sindirilmesi için gereken konsantrasyon ve süre, kas sertliğini etkileyen patolojik durumlardan da etkilenebilir. Bu özel koşullar bireysel optimizasyon gerektirecektir.
Son nesil mononüklee hücreler, süspansiyonu 20 G'lik bir iğne ile 10 mL'lik bir şırıngadan geçirerek gerçekleşir. Bu adımı uygularken, patlamaları ek hücre hasarına neden olduğu için oluşan kabarcıkların sayısını en aza indirmek için özel dikkat gösterilmelidir24.
Hücre süspansiyonu daha sonra bir antikor kokteyli ile boyanır ve bir hücre ayıklayıcısı ile elde edilir. Uygun kapıları ayarlamak başka bir kritik adımdır. Bu deneyleri gerçekleştirirken, emisyon yayılımını uygun şekilde telafi etmek ve yayılma nedeniyle arka plan sinyalini hesaba katmak için listelenen tek lekeli kontrollerin ve FMO kontrollerinin çalıştırılması şiddetle tavsiye edilir. Bu özellikle GFP gibi parlak floresan proteinler ve VCAM-1-biotin / Stretpavidin-PE-Cy7 kompleksi gibi dolaylı lekelerle uğraşırken önemlidir.
Ayrıca, bu deneyi ilk kez gerçekleştirmeden önce, ilgilenilen popülasyonları tespit etmek için kullanılan antikorların titrasyonunu gerçekleştirmek iyi bir uygulamadır. Antikorların optimal konsantrasyonunun belirlenmesi, pozitif popülasyonun en parlak sinyalini sağlamak ve arka plan boyamasındaki artışı önlemek için kritik bir adımdır.
Sıralama tamamlandıktan sonra, saflıklarını ve canlılıklarını belirlemek için sıralanmış hücreler üzerinde sıralama sonrası bir analiz yapmak önemlidir. Sıralanmış hücrelerin verimi ve yaşayabilirliği, numuneyi işlemek için gereken süreden oldukça etkilenir ve birden fazla fareyi işlemeyi planlarken dikkate alınmalıdır. Ayrıca, sıralanmış hücreleri buz üzerinde 2x serum zenginleştirici ortamda tutmak, hücre iyileşmesine yardımcı olabilir ve canlılıklarını artırabilir.
Bu protokolde, FAP'lar ve MuSC'ler, yaralanmamış farelerin tibialis anterior kaslarından ve Notexin enjeksiyonundan 7 gün sonra izole edildi. Akut bir yaralanmayı takiben, farklı FAP ve MuSC alt popülasyonlarının rejenere kas dokusunda geçici olarak eksprese edildiği bildirilmiştir. Malecova ve meslektaşları, hasarsız kasta bulunmayan, akut inflamasyonda yaralanma sonrası 2 ila 3. günler arasında zirveye ulaşan ve murin distrofik farelerde devam eden FAP'ları ifade eden bir VCAM-1 alt popülasyonunun varlığını bildirmişlerdir13. Benzer şekilde, Kafadar ve meslektaşları, yaralanmadan 2 gün sonra25 miyojenik progenitörlerin küçük bir alt kümesinde Sca1 ekspresyonunda geçici bir artış olduğunu bildirmişlerdir. Bununla birlikte, Sca1 + miyojenik hücreler, yaralanma25'ten 3 gün sonra büyük ölçüde azalmıştır. Bu alt popülasyonların varlığı, FAP'ları ve MuSC'leri daha erken aşamalarda izole etmek için bu protokolü kullanırken kabul edilmeli ve dikkate alınmalıdır.
Özetle, bu protokol, sağlıklı veya yaralı yetişkin fare kaslarından izole edilmiş saf bir FAP ve MuSC popülasyonunun izolasyonu ve kültürü için bir yöntemi açıklamaktadır. Hücrelerin yüksek saflığı ve yaşayabilirliği, bu protokolü daha sonraki aşağı akış uygulamaları için uygun hale getirir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiç kimse.
Acknowledgments
MuSC izolasyonu konusundaki tavsiyeleri için Tom Cheung'a (Hong Kong Bilim ve Teknoloji Üniversitesi) teşekkür ederiz. Bu çalışma, NIAMS-IRP tarafından NIH hibeleri AR041126 ve AR041164 aracılığıyla finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5 mL Polypropylene Round-Bottom Tube | Falcon | 352063 | |
| 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell-Strainer Cap | Falcon | 352235 | |
| 20 G BD Needle 1 in. single use, sterile | BD Biosciences | 305175 | |
| anti-Alpha 7 Integrin PE (clone:R2F2) (RatIgG2b) | The University of British Columbia | 53-0010-01 | |
| APC anti-mouse CD31 Antibody | BioLegend | 102510 | |
| APC anti-mouse CD45 Antibody | BioLegend | 103112 | |
| BD FACSMelody Cell Sorter | BD Biosciences | ||
| BD Luer-Lok tip control syringe, 10-mL | BD Biosciences | 309604 | |
| Biotin anti-mouse CD106 Antibody | BioLegend | 105703 | |
| C57BL/6J mouse (Female and Male) | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S4-Pdgfratm11(EGFP)Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | 007669 | |
| Corning BioCoat Collagen I 6-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356400 | |
| Corning BioCoat Collagen I 12-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356500 | |
| Corning BioCoat Collagen I 24-well Clear Flat Bottom TC-treated Multiwell Plate | Corning | 356408 | |
| DAPI Solution (1 mg/mL) | ThermoFisher Scientific | 62248 | |
| Disposable Aspirating Pipets, Polystyrene, Sterile | VWR | 414004-265 | |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher Scientific | A-11055 | |
| Falcon 40 µm Cell Strainer, Blue, Sterile | Corning | 352340 | |
| Falcon 60 mm TC-treated Cell Culture Dish, Sterile | Corning | 353002 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 15-mL | VWR | 352196 | |
| Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile, Corning, 50-mL | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polypropylene, Corning | VWR | 60819-728 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes, Polystyrene, with 35um Cell Strainer Cap Corning | VWR | 21008-948 | |
| Fibroblast Growth Factor, Basic, Human, Recombinant (rhFGF, Basic) | Promega | G5071 | |
| FlowJo 10.8.1 | |||
| Gibco Collagenase, Type II, powder | ThermoFisher Scientific | 17101015 | |
| Gibco Dispase, powder | ThermoFisher Scientific | 17105041 | |
| Gibco DMEM, high glucose, HEPES | ThermoFisher Scientific | 12430054 | |
| Gibco Fetal Bovine Serum, certified, United States | ThermoFisher Scientific | 16000044 | |
| Gibco Ham's F-10 Nutrient Mix | ThermoFisher Scientific | 11550043 | |
| Gibco Horse Serum, New Zealand origin | ThermoFisher Scientific | 16050122 | |
| Gibco PBS, pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
| Gibco PBS (10x), pH 7.4 | ThermoFisher Scientific | 70011044 | |
| Gibco Penicillin-Streptomycin-Glutamine (100x) | ThermoFisher Scientific | 10378016 | |
| Goat anti-Mouse IgG1 cross-absorbed secondary antibody, Alexa Fluor 555 | ThermoFisher Scientific | A-21127 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine Science Tools Inc | 14090-09 | |
| Invitrogen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D) | ThermoFisher Scientific | A1310 | |
| Mouse PDGF R alpha Antibody | R&D Systems | AF1062 | |
| Normal Donkey Serum | Fisher Scientific | NC9624464 | |
| Normal Goat Serum | ThermoFisher Scientific | 31872 | |
| Pacific Blue anti-mouse Ly-6A/E (Sca 1) Antibody | BioLegend | 108120 | |
| Paraformaldehyde, 16% | Fisher Scientific | NCC0528893 | |
| Pax7 mono-clonal mouse antibody (IgG1) (supernatant) | Developmental Study Hybridoma Bank | N/A | |
| PE/Cyanine7 Streptavidin | BioLegend | 405206 | |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools Inc | 91500-09 | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools Inc | 91150-20 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 |
References
- Baskin, K. K., Winders, B. R., Olson, E. N. Muscle as a "mediator" of systemic metabolism. Cell Metabolism. 21 (2), 237-248 (2015).
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite cells and skeletal muscle regeneration. Comprehensive Physiology. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Relaix, F., et al. Perspectives on skeletal muscle stem cells. Nature Communications. 12 (1), 692 (2021).
- Pawlikowski, B., Pulliam, C. J., Betta, N. D., Kardon, G., Olwin, B. B. Pervasive satellite cell contribution to uninjured adult muscle fibers. Skeletal Muscle. 5, 42 (2015).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Wosczyna, M. N., et al. Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle. Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).
- Theret, M., Rossi, F. M. V., Contreras, O. Evolving roles of muscle-resident fibro-adipogenic progenitors in health, regeneration, neuromuscular disorders, and aging. Frontiers in Physiology. 12, 673404 (2021).
- Uezumi, A., Fukada, S. I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle. Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).
- Wosczyna, M. N., Biswas, A. A., Cogswell, C. A., Goldhamer, D. J. Multipotent progenitors resident in the skeletal muscle interstitium exhibit robust BMP-dependent osteogenic activity and mediate heterotopic ossification. Journal of Bone and Mineral Research. 27 (5), 1004-1017 (2012).
- Eisner, C., et al. Murine tissue-resident PDGFRα+ fibro-adipogenic progenitors spontaneously acquire osteogenic phenotype in an altered inflammatory environment. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (8), 1525-1534 (2020).
- Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: The social network. Frontiers in Physiology. 10, 1074 (2019).
- Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
- Malecova, B., et al. Dynamics of cellular states of fibro-adipogenic progenitors during myogenesis and muscular dystrophy. Nature Communications. 9, 3670 (2018).
- Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting. Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).
- Maesner, C. C., Almada, A. E., Wagers, A. J. Established cell surface markers efficiently isolate highly overlapping populations of skeletal muscle satellite cells by fluorescence-activated cell sorting. Skeletal Muscle. 8, 6-35 (2016).
- Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Fibro/adipogenic progenitors (FAPs): Isolation by FACS and culture. Methods and Protocols. 1556, 179-189 (2017).
- Judson, R. N., Low, M., Eisner, C., Rossi, F. M. V. Isolation, culture, and differentiation of fibro/adipogenic progenitors (FAPs) from skeletal muscle. Methods in Molecular Biology. 1668, 93-103 (2017).
- Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms. Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).
- Contreras, O., et al. Cross-talk between TGF-β and PDGFRα signaling pathways regulates the fate of stromal fibro-adipogenic progenitors. Journal of Cell Science. 132 (19), (2019).
- Holmes, C., Stanford, W. L. Concise review: Stem cell antigen-1: Expression, function, and enigma. Stem Cells. 25 (6), 1339-1347 (2007).
- Rodgers, J. T., Schroeder, M. D., Chanthia, M., Rando, T. A. HGFA Is an injury-regulated systemic factor that induces the transition of stem cells into GAlert. Cell Reports. 19 (3), 479-486 (2017).
- García-Prat, L., et al. FoxO maintains a genuine muscle stem-cell quiescent state until geriatric age. Nature Cell Biology. 22 (11), 1307-1318 (2020).
- Yamamoto, T., et al. Deterioration and variability of highly purified collagenase blends used in clinical islet isolation. Transplantation. 84 (8), 997-1002 (2007).
- Walls, P. L. L., et al. Quantifying the potential for bursting bubbles to damage suspended cells. Scientific Reports. 7 (1), 1-9 (2017).
- Kafadar, K. A., et al. Sca-1 expression is required for efficient remodeling of the extracellular matrix during skeletal muscle regeneration. Developmental Biology. 326 (1), 47-59 (2009).
