Summary
Um procedimento para a entrega de uma solução química ablativa à árvore ductal mamária de ratos para tratamento preventivo guiado por imagem do câncer de mama é descrito. As células epiteliais mamárias podem ser alvo de dano tecidual colateral mínimo por meio de canulação diretamente na abertura do mamilo e infusão intraductal de uma solução ablativa à base de etanol a 70%.
Abstract
Ainda há um número limitado de intervenções primárias para a prevenção do câncer de mama. Para as mulheres com alto risco de desenvolver câncer de mama, a intervenção mais eficaz é a mastectomia profilática. Este é um procedimento cirúrgico drástico em que as células epiteliais mamárias que podem dar origem ao câncer de mama são completamente removidas junto com o tecido circundante. O objetivo deste protocolo é demonstrar a viabilidade de um procedimento intraductal minimamente invasivo que possa se tornar uma nova intervenção primária para a prevenção do câncer de mama. Este procedimento local ablaria preferencialmente as células epiteliais mamárias antes que elas pudessem se tornar malignas. Métodos intraductais para fornecer soluções diretamente a essas células epiteliais em modelos de roedores de câncer de mama foram desenvolvidos na Michigan State University e em outros lugares. A glândula mamária de rato consiste em uma única árvore ductal que tem uma arquitetura mais simples e linear em comparação com a mama humana. No entanto, modelos de câncer de mama induzidos quimicamente em ratos oferecem ferramentas valiosas para estudos de prova de conceito de novas intervenções preventivas e escalabilidade de modelos de camundongos para humanos. Aqui, um procedimento para a entrega intraductal de uma solução ablativa à base de etanol contendo nanopartículas de óxido de tântalo como agente de contraste de raios-X e etila celulose como agente gelificante na árvore ductal mamária de ratos é descrito. A administração de reagentes aquosos (por exemplo, compostos citotóxicos, siRNAs, AdCre) por injeção intraductal foi descrita anteriormente em modelos de camundongos e ratos. Esta descrição do protocolo enfatiza mudanças metodológicas e etapas que dizem respeito exclusivamente ao fornecimento de uma solução ablativa, consideração da formulação para minimizar os efeitos colaterais locais e sistêmicos da solução ablativa e imagens de raios-X para avaliação in vivo do enchimento ductal de árvores. As técnicas de fluoroscopia e micro-TC permitem determinar o sucesso da entrega da solução ablativa e a extensão do enchimento ductal da árvore graças à compatibilidade com o agente de contraste contendo tântalo.
Introduction
Para as mulheres nos EUA1, o câncer de mama (BC) continua a ser o tipo de câncer mais diagnosticado e causa mais mortes do que qualquer outro tipo de câncer, exceto o câncer de pulmão. As projeções para 2022 estimam que 51.400 mulheres serão diagnosticadas com carcinoma in situ e 287.850 mulheres serão diagnosticadas com carcinoma invasivo, e que 43.600 mulheres morrerão de BC1. Apesar da prevalência e mortalidade associadas à CB, existem poucas opções disponíveis para a prevenção primária e a pesquisa translacional sobre novas intervenções, uma vez que a prevenção primária não é priorizada pelos órgãos federais2. A mastectomia profilática é a intervenção mais eficaz para a prevenção primária. No entanto, esse procedimento só é recomendado para indivíduos de alto risco, pois é uma cirurgia de grande porte com consequências que mudam a vida3. Esta cirurgia envolve a remoção completa das células epiteliais mamárias a partir das quais a carcinogênese se desenvolve, bem como o tecido circundante normal. Os indivíduos são muitas vezes dissuadidos de usar este procedimento como sua primeira opção de intervenção primária devido ao impacto negativo do estresse físico, psicológico e social. Por esses motivos, mesmo alguns indivíduos de alto risco optam por não se submeter a esse procedimento e optam por uma espera vigilante ou estratégias de vigilância semelhantes3. Em publicação anterior, a entrega de etanol a 70% (EtOH) diretamente na árvore ductal de modelos de camundongos foi eficaz na ablação química de células epiteliais mamárias com danos limitados ao tecido normal adjacente e na prevenção da formação de tumor de mama4. A ETOH é utilizada em múltiplas aplicações clínicas como agente ablativo para o tratamento local de alguns tipos de câncer ou agente esclerosante para o tratamento local do inchaço e malformações arteriovenosas 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14 . A baixa toxicidade e o perfil de segurança da EtOH estão bem estabelecidos, pois em alguns procedimentos até 50 mL de EtOH a 95% podem ser administrados por sessão 5,10.
A remoção completa das células epiteliais mamárias a partir das quais a CB se desenvolve é o componente mais crucial da mastectomia profilática e da entrega local de uma solução ablativa. Portanto, a confirmação do enchimento ductal completo da árvore é necessária para garantir que a solução ablativa tenha entrado em contato direto com todas as células epiteliais mamárias. A entrega de uma solução dentro da(s) árvore(s) ductal e sua visualização por fluoroscopia guiada por imagem ou ductografia são possíveis por meio de procedimentos clínicos já existentes15,16,17. Assim, será viável implementar e avaliar prontamente esse procedimento em ensaios clínicos. Um passo fundamental para estabelecer a eficácia e a viabilidade translacional da ablação intraductal (ID) como uma nova intervenção para a prevenção primária será demonstrar a viabilidade dessa abordagem de visualização de raios-X em modelos animais de tamanho e complexidade crescentes de sua arquitetura de árvore ductal 4,18,19. Um protocolo que amplia esse procedimento ablativo de modelos de camundongo20 para rato é descrito aqui. Enquanto as árvores ductais de camundongos e ratos têm uma estrutura linear semelhante e um padrão de ramificação, a árvore ductal de rato é proporcionalmente maior e é cercada por um estroma muito mais denso. Implementamos um método em laboratório para injetar com sucesso cada glândula mamária em um rato durante uma série de sessões semanais com uma solução ablativa contendo um agente de contraste. O espaçamento entre sessões é necessário para garantir que os animais tenham efeitos colaterais mínimos de EtOH (Figura 1 e Figura 2). O procedimento envolve a injeção da solução ablativa diretamente na abertura do mamilo de um rato anestesiado com isoflurano com uma agulha 33 G. Algumas das principais melhorias do procedimento incluem o uso de tratamento anti-inflamatório prolongado, injeção de volumes mais altos por árvore ductal do que o sugerido21 e seringas à prova de gás para líquidos e gases. A duração do tratamento com 5 mg/kg de carprofeno (um AINE) de 48 h antes a 1 semana após as injeções de ID é comparável ao protocolo anti-inflamatório utilizado para a terapia esclerosante da malformação venosa na clínica. O tratamento é realizado em pacientes sob anestesia sistêmica seguida de 2 dias de medicamentos anti-inflamatórios, como AINEs. O tratamento anti-inflamatório pode ser estendido por mais alguns dias para reduzir a inflamação local e qualquer dor potencial13. Tal como nos ratinhos20, a injeção intraperitoneal de uma solução de sacarose a 5% atenua o efeito a curto prazo da intoxicação alcoólica em ratos. Os ratos podem ser injetados com até 1 mL de EtOH a 70% (até 4 ductos; 0,2 g/dL de conteúdo de EtOH no sangue) em uma única sessão quando administrados com esta solução de sacarose; os animais recuperam totalmente no prazo de 4 h após as injeções de identificação. Realizamos sessões sequenciais para permitir tempo de recuperação suficiente ao injetar mais de 4 glândulas e/ou concentrações mais altas de EtOH. A intoxicação alcoólica em mulheres será muito menos provável, pois a injeção de ID de todas as árvores ductais em ambas as mamas, assumindo 16 ductos principais16,17 e 2 mL por ducto 22,23, com 70% de EtOH, resultaria em menos de 0,1 g / dL de conteúdo de EtOH no sangue e pode causar comprometimento leve.
A radiografia permite determinar o sucesso do parto intraductal em cada glândula individual e se toda a árvore ductal está preenchida (Figura 1, Figura 2, Figura 3). Imagens de fluoroscopia em tempo real em preparação para microtomografia computadorizada e/ou reconstrução 3D de dados de arquivos DICOM podem ser usadas para avaliar a extensão da entrega da solução na árvore ductal e qualquer vazamento no estroma. O uso de fluoroscopia pode ajudar a limitar a dose total de radiação imposta ao animal. A técnica de fluoroscopia aproxima-se mais da aplicação clínica pretendida para orientação por imagem deste tratamento ablativo. A comparação de isovue contendo iodo aprovado pela FDA com nanopartículas de óxido de tântalo (TaOx) foi realizada a fim de refinar ainda mais a utilidade da solução ablativa 4,19. Verificou-se que o TaOx é um agente de contraste micro-TC superior ao Isovue para visualização do enchimento inicial da árvore ductal em camundongos 4,19. Aqui, demonstramos que o TaOx é um meio de contraste adequado para visualizar o enchimento inicial da árvore ductal do rato (Figura 2 e Figura 3). Tanto na pesquisa translacional quanto em aplicações de prática clínica, o agente gelificante etil celulose (CE) foi adicionado à solução de EtOH para minimizar a difusão das regiões-alvo pretendidas 13,14,24,25,26,27,28,29. Estudos têm demonstrado que a adição de até 1,5% de EC a soluções ablativas contendo EtOH é compatível com imagens baseadas em TaOx (Figura 3). Estes, bem como outros refinamentos para a solução ablativa podem ajudar na tradução pronta deste procedimento guiado por imagem para a clínica.
Protocol
Todos os experimentos descritos foram conduzidos sob protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Michigan State University.
1. Tratamento anti-inflamatório prolongado
- Prepare copos de gel de sucralose como dosagem oral de carprofeno. Fornecer aos ratos este tratamento anti-inflamatório a partir de 2 dias antes de receber a injeção de ID de 70% de EtOH a 7 dias após o procedimento.
- Diluir uma solução de trabalho de carprofeno em PBS estéril para injeção no copo. A partir de 50 mg/ml de solução-mãe, preparar uma solução diluída de 2 mg/ml colorida com corante alimentar azul estéril a 1% v/v e injectar 500 μL em cada chávena. A adição do corante auxilia na visualização da mistura completa da droga dentro da sucralose do copo.
- Siga a recomendação do fabricante para preparar o copo para a adição de carprofeno. Salvo indicação em contrário do vendedor, aqueça o copo em banho-maria a 60 °C durante 15 minutos e seque após a remoção para reduzir o risco de contaminação.
- Limpe a tampa do copo de sucralose com 70% de EtOH na área e introduza a agulha da seringa que contém a solução de trabalho de carprofeno. Dispensar o volume adequado (500 μL).
- Cubra a punção com um adesivo. Agite o copo energeticamente por 15 s e, em seguida, coloque esse copo em um vórtice por mais 15 s. Avalie visualmente a mistura homogênea e completa antes de armazenar para uso posterior. Procure a presença de uma cor azul escura.
NOTA: Permita que os copos cheguem à temperatura ambiente. Armazene os copos à temperatura ambiente, se desejado, mas preste atenção às orientações de eficácia do medicamento do fabricante. Alternativamente, armazene os copos a 4 °C e use dentro de um mês. Datar o adesivo é uma boa prática para acompanhar a data de injeção sem o risco de uma caneta ou marcador afiado perfurar a tampa.
- Pouco antes de usar, limpe o exterior do copo com 70% de EtOH. Retire a tampa antes de colocar o copo na gaiola do animal. Substitua os copos a cada dois dias ou quando vazios. Verifique o nível de gel diariamente para garantir uma dosagem adequada. Um copo pode fornecer carprofeno por até dois ratos por até 2 dias; no entanto, os ratos podem consumir copo inteiro mais cedo.
2. Preparação pré-operatória
NOTA: Certifique-se de que a etapa de preparação do animal precede o procedimento de injeção de ID por 2-3 dias.
- Ligue o vaporizador de isoflurano (2%-3% de isoflurano, 1,5 L/min de oxigênio) para anestesiar o rato. Mova o animal para um cone de nariz em uma almofada de aquecimento. Aplique lubrificante ocular no rato e, em seguida, posicione o animal nas costas. Monitore cuidadosamente a respiração do animal para garantir que o plano anestésico seja mantido a 1%-3% de isoflurano.
NOTA: Uma navalha elétrica pode ser usada para remover o excesso de pelo antes da depilação. Extremo cuidado deve ser tomado para não danificar nenhum mamilo com a navalha. Por esse motivo, esta etapa pode ser ignorada. Os ratos são mais sensíveis ao creme depilatório do que os ratos, por isso a remoção do excesso de creme é muito importante. Evite injetar uma solução contendo etanol em uma área que já tenha uma abrasão presente na depilação. Alguns cremes adicionaram compostos como aloe e lanolina que podem ajudar a minimizar a probabilidade de abrasões. - Use um aplicador de ponta de algodão para espalhar o creme depilatório sem receita médica na área do mamilo. Use o aplicador para esfregar o creme na área por 10-30 s. Verifique se a pele se soltou rapidamente.
- Deixe o creme no rato pelo menor intervalo possível e remova completamente para evitar a queimação da pele. Os ratos são ainda mais sensíveis a este procedimento do que os ratos.
- Após 10-30 s de aplicação, molhar gaze com água morna e usá-lo para enxaguar o creme e a pele solta do animal. Realize pelo menos três enxaguamentos da área com gaze fresca umedecida e seque com gaze seca após o enxágue final. Confirme a boa visibilidade e acesso à área do mamilo de onde a pele é removida. Repita o procedimento depilatório, se necessário.
- Coloque o rato em uma gaiola limpa em uma almofada de aquecimento e deixe-o se recuperar. Verifique o rato para se certificar de que ele está totalmente recuperado da anestesia antes de trazê-lo de volta à sua gaiola permanente.
- Coloque um copo de gel de sucralose dosado com carprofeno (1 mg / xícara) na gaiola para tratamento anti-inflamatório. Verifique o consumo de gel diariamente e substitua por um copo fresco, conforme apropriado. Não deixe o copo por mais de 2 dias. Normalmente, os copos precisarão ser substituídos após 1 dia.
3. Injeção intraductal
- Preparar a solução-mãe TaOx a 333,3 mM, conforme descrito19 , utilizando solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Aqueça a solução se o pó não se dissolver completamente. Mexa suavemente. Não faça vórtice ou agite vigorosamente para evitar a formação de bolhas.
- Misture três partes de 333,3 mM TaO x com sete partes de 100% EtOH para uma solução final de 70% EtOH 100 mM/TaOx. Opcionalmente, adicione uma quantidade apropriada de 0,5%-1,5% de etilcelulose (CE) como um agente gelificante para maximizar a retenção local da solução ablativa. Adicionar corante alimentar azul a 1% v/v à solução ablativa para exame visual da entrega na árvore ductal durante a perfusão.
- Preparar um volume apropriado para as necessidades experimentais. Os pares de glândulas 1 (cervical) e 6 (inguinal) podem ser preenchidos com até 100 μL da solução, enquanto todos os outros pares podem ser preenchidos com até 300 μL.
- Anestesiar o rato como no passo 2.1 e movê-lo para o cone do nariz uma vez totalmente anestesiado. Aplique lubrificante ocular em ambos os olhos e, em seguida, coloque o animal de costas. Prenda o rato sob o estereoscópio usando fita adesiva perto dos mamilos que serão injetados, se desejado. O peso do rato é geralmente suficiente para impedi-lo de se mover substancialmente sem gravar.
- Para preparar os mamilos para a injeção, remova qualquer pele morta que cubra a abertura do mamilo com pinça fina e pontiaguda, se possível. Os ratos geralmente têm um plugue saliente da abertura do mamilo que pode impedir a canulação bem-sucedida do mamilo se não for removido.
NOTA: É importante notar que maiores volumes de injeção de soluções ablativas que estão sendo usadas em ratos podem ser mais propensos a resultar em feridas cutâneas superficiais perto do(s) local(is) de injeção. Por esta razão, injetar todos os outros mamilos em uma única sessão é menos prejudicial e irritante para o animal do que injetar mamilos adjacentes. Monitorar os ratos para quaisquer abrasões por 7 dias após a injeção ajuda a garantir que não haja efeitos graves para a saúde do animal arranhando e introduzindo a possibilidade de infecção por contaminação com detritos do chão da gaiola. Pomada antibiótica tripla ou lavagens com solução de clorexidina podem ser usadas para tratar quaisquer sinais de infecção por lesão que possam ocorrer (Tabela 1). - Use uma seringa de 500 μL com uma agulha de 33 G para aspirar 101-301 μL de solução ablativa. Aspirar um extra de 1 μL da solução para uma possível pequena fuga ao remover a agulha canulada.
NOTA: Estas são recomendações para volumes destinados a preencher completamente a(s) árvore(s) ductal(is): até 100 μL nas glândulas cervicais e inguinais, e até 300 μL nas outras glândulas. Para outras aplicações, pode ser apropriado usar volumes menores ou maiores. - Use uma pinça para segurar suavemente o mamilo e canular a agulha na abertura do mamilo. Continue suavemente inserindo a agulha até que o bisel esteja totalmente dentro do mamilo. Para acomodar a agulha no mamilo, traga o mamilo em direção à agulha em vez de empurrar a agulha para baixo no mamilo. (Tabela 1). Tome cuidado para seguir o caminho da abertura do mamilo.
NOTA: Mamilos de ratos são geralmente muito mais fáceis de manipular e canular com sucesso do que aqueles em ratos devido ao tamanho maior. No entanto, o aumento da quantidade de gordura ao redor da abertura do mamilo também torna mais provável injetar erroneamente a almofada de gordura se a agulha se desviar do ducto principal. - Uma vez que o bisel da agulha esteja completamente inserido, infundir lentamente a solução a uma taxa constante de aproximadamente 100 μL/min em ratos. Mudanças abruptas na taxa de infusão podem estourar ou danificar a árvore ductal. Aguarde 30 s após o término da infusão antes de retirar a agulha da árvore canulada com auxílio no uso de fórceps; isso garante que o volume injetado permaneça dentro da árvore ductal (Figura 2) e reduz a probabilidade de vazamento.
- Limpe qualquer solução derramada com gaze umedecida ou um toalhete de EtOH para evitar uma solução de contraste estranha nas imagens.
- Injete PBS contendo 5% de sacarose (10 mL/kg) por via intraperitoneal para mitigar os efeitos da intoxicação alcoólica se o etanol estiver contido nas soluções de injeção ID. Esta dose pode ser administrada no início e no final do procedimento.
4. Micro-TC
- Depois de todas as glândulas desejadas terem sido injetadas, mova o animal rapidamente para o sistema de micro-TC e continue mantendo a anestesia usando o vaporizador de isoflurano incorporado.
- Endireitar a coluna vertebral do animal e colar cada pata traseira em uma posição estendida, de modo que os ossos da perna do animal fiquem mais afastados das glândulas inferiores de interesse e não se sobreponham à região de interesse na imagem digitalizada.
- Fita adesiva através do abdômen para minimizar os artefatos respiratórios se digitalizar as glândulas inferiores.
NOTA: Os animais podem ser fotografados com diferentes parâmetros de varredura (por exemplo, alta resolução, varreduras longitudinais) se for tomado o cuidado de determinar uma dose aceitável apropriada de radiação ao longo da vida para ratos e garantir que a dose cumulativa não exceda esse nível. A exposição à radiação pode ser ainda mais reduzida com a aquisição de fotos e vídeos de fluoroscopia sem a realização de exames (Figura 2). - Realizar imagens TaOx da árvore ductal de ratos com boa resolução e oportunidade para repetidos exames de aquisição padrão (2 min) utilizando os seguintes parâmetros de varredura: 90 kVp/88 μA; campo de visão (FOV), 72 mm; número de fatias, 512; espessura do corte, 72 μm; resolução de voxel, 72 μm3. Varreduras de alta resolução por períodos de tempo mais longos (4-14 min) também podem ser adquiridas em animais que não serão escaneados longitudinalmente usando os mesmos parâmetros.
- Após a aquisição dos dados, retire cuidadosamente o rato do cone de anestesia e coloque em uma nova gaiola limpa em uma almofada de aquecimento. Verifique o rato para se certificar de que ele se recuperou totalmente da anestesia antes de trazê-lo de volta à sua gaiola permanente. Colocar o copo de sucralose contendo carprofeno e substituir adequadamente, conforme descrito no passo 2.5, para garantir que os animais continuam a receber tratamento anti-inflamatório durante os próximos 7 dias.
- Processe as imagens digitalizadas em representações rápidas dentro do software de micro-TC para apreciar melhor quaisquer vazamentos de contraste, enchimento apenas parcial ou superenchimento (Figura 2).
- Prossiga para a próxima seção para executar o processamento formal de imagens para publicação ou análise detalhada das digitalizações, se desejado (Figura 3).
5. Análise de imagem
- Use pacotes de software especializados para produzir renderizações da árvore ductal preenchida.
NOTA: É melhor segmentar a almofada de gordura mamária para obter a melhor interpretação da árvore ductal injetada. Spline traçar os limites escuros da almofada de gordura em toda a espessura do animal, a fim de alcançar esta segmentação. - Para segmentar a almofada de gordura (ao contrário dos ratos, os limites deste compartimento não são tão facilmente distinguíveis da cavidade peritoneal, músculos femorais e pele devido a unidades Hounsfield semelhantes) dentro da qual a árvore ductal de interesse está contida, selecionar a opção "traço spline" no menu manual é o primeiro passo na criação de uma renderização.
- Spline traçar o contorno da almofada de gordura em cada terceira fatia. Clique na opção Propagar objetos no menu semiautomático. Isso propagará e conectará todas as fatias em um único objeto segmentado de interesse.
NOTA: Alterar o limiar dentro da região segmentada permite a visualização do sinal apenas dentro de uma determinada faixa de unidades Hounsfield (HU); para outros agentes de contraste ou parâmetros de imagem, essa faixa pode precisar ser ajustada. Um pacote de software ou análise de Inteligência Artificial pode ser usado para fazer outras medições e imagens para mostrar o quanto a árvore ductal foi preenchida. - Defina os valores de HU para um ponto baixo de 300 e um ponto alto de 3.000 no menu semiautomático na guia de volume limite. Isso permite a criação de uma representação exibindo apenas o contraste (TaOx) dentro da árvore ductal.
- Defina a representação como primária usando o botão "exibir". Isso alterará a exibição para mostrar apenas a representação 3D da árvore ductal.
NOTA: Realizar a reconstrução da árvore ductal para posterior análise.
Representative Results
Cada uma das 12 glândulas mamárias de uma rata contém uma única árvore ductal que se abre no orifício do mamilo. Apesar das diferenças de tamanho entre o camundongo e o rato, o momento de desenvolvimento das glândulas mamárias e o tempo em que esses animais atingem a idade adulta é muito semelhante30,31. Uma breve descrição dos principais estágios do desenvolvimento da glândula mamária em ratos como representativos de ambas as espécies de roedores é fornecida. Os brotos terminais (TEBs) são as estruturas altamente proliferativas nas pontas da árvore ductal alongadora que direcionam a ramificação ductal30,31. O pico de proliferação e densidade dos TEBs ocorre às 3-4 semanas de idade durante a fase de alongamento da árvore ductal no desenvolvimento puberal30. Por 9-10 semanas de idade, há poucos TEBs restantes, pois a árvore ductal cresceu para ocupar todo o comprimento da almofada de gordura30. Depois disso, o crescimento e a expansão da árvore ductal são proporcionais aos da almofada de gordura e do animal32. As unidades lobulares ductais terminais (TDLUs) na mama humana desempenham um papel semelhante aos TEBs em roedores. Os TDLUs são a principal fonte de início da carcinogênese e progressão para BC33,34. Podemos injetar até 300 μL de solução de EtOH a 70% para preencher toda a árvore ductal das glândulas mamárias torácicas e abdominais do rato Sprague-Dawley de 9 semanas de idade (Figura 1, Figura 2, Figura 3). Ao contrário dos camundongos 20, os mamilos das glândulas cervical e inguinal dos ratos Sprague-Dawley são tipicamente adequados para injeção em mais de 80% dos animais, e até 100 μL de solução de EtOH a70% são necessários para preencher toda a árvore ductal (Figura 2). Injetamos rotineiramente até 10 glândulas mamárias com a solução ablativa em estudo. Um delineamento experimental típico consiste em duas sessões semanais independentes de injeção de DI, nas quais cinco glândulas alternadas são infundidas com a solução ablativa contendo contraste de raios-X e/ou EC como agente gelificante (Figura 2). Para a solução ablativa contendo TaOx (50-200 mM), a fluoroscopia e/ou a microtomografia computadorizada são realizadas após o término de cada sessão para determinar e registrar o sucesso individual de infundir cada árvore ductal com quantidade parcial ou total de solução infundida (Figura 2). A imagem imediata e longitudinal após a injeção permite avaliar como as alterações na formulação, especialmente a concentração do agente gelificante CE, afetam e limitam a difusão externa da solução ablativa em função do volume injetado (Figura 3). Esta análise de imagem fornece informações para entender os parâmetros ideais para alcançar a ablação máxima com dano tecidual colateral mínimo.
Figura 1: Esquemas do procedimento para injeção intraductal e análise de imagens em ratos. Destaca-se o procedimento passo-a-passo para injeção intraductal e análise de imagens. Por favor, veja o vídeo para mais detalhes. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Exemplos de canulação mamilar e resultado da entrega da solução ablativa em múltiplas glândulas mamárias . (A) Apresentação típica das formas dos mamilos na linhagem de ratos Sprague-Dawley. O comprimento do mamilo correlaciona-se com a probabilidade de canulação bem-sucedida. Mamilos mais longos são mais fáceis de canular do que mamilos curtos, enquanto mamilos excessivamente curtos ou vestigiais não podem ser canulados. Uma vez canulados, os mamilos longos e curtos podem ser infundidos com a solução e alcançar taxas de sucesso semelhantes de entrega. O corante alimentar azul na solução injetada pode ser usado como evidência in vivo de enchimento ductal de árvores e sucesso de entrega (mais aparente, formação de cúpula, para uma injeção de almofada de gordura malsucedida). As representações de fluoroscopia em tempo real (B) e micro-TC 3D geradas após a aquisição da imagem (C) fornecem evidências in vivo do sucesso da entrega e de uma avaliação mais quantitativa da solução que chega aos TEBs. (B) Cada glândula mamária abdominal do primeiro par (#4, #10) recebeu solução ablativa com CE a 1% (contorno laranja) ou sem ela (contorno verde) (C) Entrega bem-sucedida (contorno azul) da solução ablativa no colo cervical direito (, segundo par de glândulas mamárias torácicas (#3, #9) e primeiro par de glândulas mamárias abdominais (#4, #10) e injeção malsucedida (contorno branco tracejado) na glândula torácica esquerda (1). As barras de escala correspondem a 1 mm nas imagens com diferentes ampliações. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Reconstrução 3D e avaliação do enchimento e difusão da solução ablativa . EtOH/100 mM TaOx nanopartículas a 70% com 1% de CE (superior) ou sem CE (inferior) foram injetadas por via intraductal no segundo par de glândulas mamárias abdominais (#4 e #10) e imediatamente fotografadas por micro-TC. Cada rato Sprague-Dawley recebeu um volume crescente de qualquer uma das soluções. Árvores ductais individuais foram reconstruídas usando um pacote de software de análise de imagem (spline trace + propagate object + threshold rendition). Com 1% EC, a solução pode ser vista chegando às extremidades do terminal. À medida que o volume entregue é aumentado, o número de TEBs preenchidos é mais aparente. A barra de escala corresponde a 10 mm em todas as representações. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Questão | Aparência | Solução | |||
| Mamilo curto (Fig. 2) | Mamilo tem perfil baixo – difícil de agarrar | Às vezes é mais fácil segurar a pele perto do mamilo e atingir o centro do mamilo com a agulha. A agulha provavelmente mergulhará sob a pele. Puxar para cima lentamente pode revelar que o mamilo está ligeiramente sobre a ponta da agulha e dar espaço para agarrá-lo e puxá-lo o resto do caminho para a agulha. Tenha muito cuidado ao mergulhar abaixo da pele sobre o ângulo da agulha. É fácil inadvertidamente obter uma injeção de almofada de gordura esfaqueando no ângulo errado. | |||
| Injeção de almofada de gordura (Fig. 2) | Inchado ao redor do mamilo e, possivelmente, no próprio mamilo – mais fácil de ver se a cor é adicionada à solução injetável | Se o mamilo estiver inchando com os primeiros ul injetados, remova a agulha e tente inserir novamente com mais cuidado com o ângulo. Comece a injeção novamente e observe se há mais inchaço. Se o inchaço continuar, abandone a tentativa. É muito raro injetar com sucesso um mamilo que começou como uma injeção de almofada de gordura. | |||
| Feridas/crostas | Ferida aberta ou crosta perto do local de injeção da solução de EtOH | Os ratos são mais propensos do que os ratos a desenvolver feridas ou crostas perto da área de injeção. Se forem encontradas feridas, aplique pomada antibiótica tripla em feridas abertas, mas deixe as feridas crostas sozinhas. A aplicação de pomada em crostas pode aumentar a probabilidade de o animal incomodar a crosta e removê-la. Verifique a cada 1-2 dias até cicatrizar, dependendo da gravidade da ferida. O carprofeno deve ser administrado até que esteja curado, mesmo que além da janela normal. | |||
| Injetar glândulas alternadas | N/A | Maiores volumes de injeção em ratos tornam mais provável causar abrasões na pele se injetar glândulas consecutivas. Para a menor probabilidade de trauma na área de injeção, glândulas alternativas injetadas dentro de uma única sessão (ou seja, injetar # 1, 3, 4 e 6 em vez de # 1-4). O espaçamento entre o terceiro (#3 e #9) e quarto (#4 e #10) pares de glândulas permite a injeção de ambas as glândulas em uma sessão. | |||
Tabela 1: Dicas úteis e solução de problemas
Discussion
Como mostrado aqui, a entrega de ID de EtOH a 70% ablate preferencialmente as células epiteliais mamárias com danos colaterais limitados ao estroma e vasculatura circundantes em camundongos4. A ablação local da árvore ductal é eficaz na prevenção da formação de tumores em modelos de camundongos4. Aqui, demonstramos que este procedimento ablativo pode ser ampliado para ratos.
Este é o próximo passo no caminho para a tradução deste procedimento ablativo como uma intervenção alternativa à mastectomia profilática para a prevenção primária do câncer de mama em indivíduos de alto risco. A adição de nanopartículas de TaOx como um agente de contraste de raios-X à solução ablativa permite avaliar a eficácia da solução na prevenção da formação de tumores, pois pode ser determinado se o procedimento foi bem-sucedido ou não no preenchimento completo da árvore ductal. O uso da fluoroscopia para visualizar a glândula mamária injetada espelha o que provavelmente será feito na clínica para orientar esse procedimento de identificação. A orientação por imagem de quanto a solução encheu a árvore ductal e quando interromper a infusão será um aspecto fundamental da implementação clínica para garantir o preenchimento máximo de cada árvore ductal. As soluções de problemas e as dicas úteis estão listadas na Tabela 1. A eficácia deste procedimento ablativo requer que a solução infundida faça contato direto com todas as células epiteliais para maximizar a taxa de morte celular. Células epiteliais sobressalentes dentro de uma ou mais árvores poderiam eventualmente servir como uma fonte para o desenvolvimento de BC. Os outros grupos relataram entrega de ID de partículas virais (por exemplo, componentes dos sistemas Cre/LoxP e/ou Cas9/CRISPR), hormônios e antagonistas hormonais (por exemplo, prolactina fulvestrant), agentes quimioterápicos (por exemplo, cisplatina), siRNAs e/ou anticorpos ou outros agentes direcionados em camundongos 4,19,21,35,36,37,38,39,40, 41,42,43,44,45, ratos 21,33,46,47,48 e/ou coelhos 18,49,50,51,52,53 . A canulação bem-sucedida de até oito árvores ductais por mama humana para o parto local de quimioterapia tem sido relatada em estudos clínicos independentes 47,54,55. A orientação por imagem para infusão dessas outras soluções voltadas para a prevenção de tumores ou voltadas para o tratamento local também maximizaria sua eficácia.
A escalabilidade e o refinamento deste procedimento de árvore ductal de rato para rato são demonstrados aqui. A nanopartícula TaOx na árvore ductal murina 4,19 e de rato (dados não publicados) fornece imagens de alta resolução que superam os agentes de contraste de raios-X contendo iodo aprovados pela FDA. Da mesma forma, desconhecemos outras abordagens de imagem de árvores ductais em camundongos40,41 ou outros modelos animais18 que possam fornecer resolução comparável ao TaOx. Relevante para a tradução clínica é o fato de que o efeito gelificante da CE neste modelo de rato de tamanho intermediário é um refinamento de formulação que permite minimizar o dano tecidual colateral. À medida que continuamos a avaliar este procedimento de identificação ablativa quanto à sua capacidade de prevenir a CB, seremos capazes de determinar, mais precisamente, a partir de quais glândulas a CB se desenvolve através das informações adicionais fornecidas por imagem após a entrega da DI em modelos quimicamente induzidos e outros modelos de BC em ratos. Esses dados determinarão a segurança desse procedimento e identificarão quaisquer preocupações ou deficiências sobre se as árvores ductais tratadas parciais ou malsucedidas podem ser mais propensas a desenvolver CB em uma mulher de alto risco.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado, em parte, pelas subvenções do Instituto Nacional do Cancro R21 CA226579 e R01 CA258314 ao LFS e pela subvenção do Instituto Nacional de Imagem Biomédica e Bioengenharia R01 EB029418 à EMS. Somos gratos ao MSU Institute for Quantitative (IQ) Health Science and Engineering Imaging Core pela utilização dos seus sistemas de imagiologia e conhecimentos técnicos. Agradecemos à Dra. Danielle Ferguson por revisar o conteúdo do vídeo e os números para a adesão às diretrizes de bem-estar animal.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AnalyzeDirect v12.0 | Caliper | n/a | For micro-CT image processing |
| Carprieve, Carprofen 50 mg/mL | Allivet | 50647 | For anti-inflammatory treatment |
| Ethyl cellulose | Acros Organics | 9004-57-3 | For intraductal injection |
| Evans blue | Sigma | E2129-50G | For injection visualization |
| Hot water bath | Toolots | Yidu_HH-S2 | For preparing carprofen cups |
| MediGel Sucralose Cups | ClearH2O | 74-02-5022 | For delivery of carprofen |
| Model 1750 TTL, PTFE Luer Lock Syringe, 500μL | Hamilton | 81220 | For intraductal injection |
| Photoshop 2021 | Adobe | n/a | For image processing |
| Quantum GX2 microCT Imaging System | Perkin Elmer | CLS149276 | For micro-CT image acquisition |
| Metal Hub Needle, 33 gauge, custom (30° bevel angle, 0.4 in, point style 4) | Hamilton | 7747-01 | For intraductal injection |
| Stereo Microscope SZM Series | AmScope | SM-4TPZ-144 | For intraductal injection |
| Sterile blue food dye | McCormick | 930641 | For injection visualization |
| Sterile phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 14190250 | For solution preparation |
| Stickers | DOT Scientific | DOTSCI-C50 | For preparing carprofen cups |
| Sucrose | Calbiochem | 8550-5KG | For intraductal injection |
| Syringes | Fisher | 14-826-79 | For preparing carprofen cups |
| Vortex | VWR | 10153-834 | For preparing carprofen cups |
| Warming pump/pad(s) | Braintree Scientific | HTP-1500 120V; AP-R 26E | For intraductal injection/preoperative preparation |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A.
- Wild, C. P. The global cancer burden: necessity is the mother of prevention. Nature Reviews. Cancer. 19 (3), 123-124 (2019).
- Padamsee, T. J., Wills, C. E., Yee, L. D., Paskett, E. D. Decision making for breast cancer prevention among women at elevated risk. Breast Cancer Research. 19 (1), 34 (2017).
- Kenyon, E., et al. Ductal tree ablation by local delivery of ethanol prevents tumor formation in an aggressive mouse model of breast cancer. Breast Cancer Research. 21 (1), 129 (2019).
- Kuang, M., et al. Ethanol ablation of hepatocellular carcinoma Up to 5.0 cm by using a multipronged injection needle with high-dose strategy. Radiology. 253 (2), 552-561 (2009).
- Ansari, D., Andersson, R. Radiofrequency ablation or percutaneous ethanol injection for the treatment of liver tumors. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1003-1008 (2012).
- Zhang, W. Y., Li, Z. S., Jin, Z. D. Endoscopic ultrasound-guided ethanol ablation therapy for tumors. World Journal of Gastroenterology. 19 (22), 3397-3403 (2013).
- Chin, M., Chen, C. L., Chang, K., Lee, J., Samarasena, J. Ethanol ablation of a peripheral nerve sheath tumor presenting as a small bowel obstruction. ACG Case Reports Journal. 3 (1), 31-32 (2015).
- Gueng, M. -K., Chou, Y. -H., Tiu, C. -M., Chiou, S. -Y., Cheng, Y. -F. Pseudoaneurysm of the breast treated with percutaneous ethanol injection. Journal of Medical Ultrasound. 22 (2), 114-116 (2014).
- Zhang, J., et al. Comparison between absolute ethanol and bleomycin for the treatment of venous malformation in children. Experimental and Therapeutic Medicine. 6 (2), 305-309 (2013).
- Wohlgemuth, W. A., et al. Ethanolgel sclerotherapy of venous malformations improves health-related quality-of-life in adults and children - results of a prospective study. European Radiology. 27 (6), 2482-2488 (2017).
- Steiner, F., FitzJohn, T., Tan, S. T. Ethanol sclerotherapy for venous malformation. ANZ Journal of Surgery. 86 (10), 790-795 (2016).
- Sannier, K., et al. A new sclerosing agent in the treatment of venous malformations. Study on 23 cases. Interventional Neuroradiology. 10 (2), 113-127 (2004).
- Dompmartin, A., et al. Radio-opaque ethylcellulose-ethanol is a safe and efficient sclerosing agent for venous malformations. European Radiology. 21 (12), 2647-2656 (2011).
- Faguy, K. Ductography: When, how, and why. Radiologic Technology. 92 (5), 487-503 (2021).
- Slawson, S. H., Johnson, B. A. Ductography: how to and what if. Radiographics. 21 (1), 133-150 (2001).
- Sheiman, L. S., Levesque, P. H. The in's and out's of ductography: A comprehensive review. Current Problems in Diagnostic Radiology. 45 (1), 61-70 (2016).
- Clark, A., Bird, N. K., Brock, A. Intraductal delivery to the rabbit mammary gland. Journal of Visualized Experiments. (121), e55209 (2017).
- Chakravarty, S., et al. Tantalum oxide nanoparticles as versatile contrast agents for X-ray computed tomography. Nanoscale. 12 (14), 7720-7734 (2020).
- Kenyon, E., et al. Intraductal delivery and x-ray visualization of ethanol-based ablative solution for prevention and local treatment of breast cancer in mouse models. Journal of Visualized Experiments. (182), e63457 (2022).
- Murata, S., et al. Ductal access for prevention and therapy of mammary tumors. Cancer Research. 66 (2), 638-645 (2006).
- King, B. L., Love, S. M. The intraductal approach to the breast: raison d'etre. Breast Cancer Research. 8 (2), 206 (2006).
- Love, S. M., Barsky, S. H. Anatomy of the nipple and breast ducts revisited. Cancer. 101 (9), 1947-1957 (2004).
- Lai, Y. E., Morhard, R., Ramanujam, N., Nolan, M. W. Minimally invasive ethyl cellulose ethanol ablation in domesticated cats with naturally occurring head and neck cancers: Six cats. Veterinary and Comparative Oncology. 19 (3), 492-500 (2021).
- Mueller, J. L., et al. Optimizing ethyl cellulose-ethanol delivery towards enabling ablation of cervical dysplasia. Scientific Reports. 11 (1), 16869 (2021).
- Nief, C., et al. Polymer-assisted intratumoral delivery of ethanol: Preclinical investigation of safety and efficacy in a murine breast cancer model. PLoS One. 16 (1), 0234535 (2021).
- Chelales, E., et al. Radiologic-pathologic analysis of increased ethanol localization and ablative extent achieved by ethyl cellulose. Scientific Reports. 11 (1), 20700 (2021).
- Morhard, R., et al. Understanding factors governing distribution volume of ethyl cellulose-ethanol to optimize ablative therapy in the liver. IEEE Trans Biomedical Engineering. 67 (8), 2337-2348 (2020).
- Morhard, R., et al. Development of enhanced ethanol ablation as an alternative to surgery in treatment of superficial solid tumors. Scientific Reports. 7 (1), 8750 (2017).
- Russo, I. H., Russo, J. Developmental stage of the rat mammary gland as determinant of its susceptibility to 7,12-dimethylbenz[a]anthracene. Journal of the National Cancer Institute. 61 (6), 1439-1449 (1978).
- Paine, I. S., Lewis, M. T. The terminal end bud: The little engine that could. Journal of Mammary Gland Biology Neoplasia. 22 (2), 93-108 (2017).
- Hinck, L., Silberstein, G. B. Key stages in mammary gland development: the mammary end bud as a motile organ. Breast Cancer Research. 7 (6), 245-251 (2005).
- Sivaraman, L., et al. Effect of selective ablation of proliferating mammary epithelial cells on MNU induced rat mammary tumorigenesis. Breast Cancer Research Treatment. 73 (1), 75-83 (2002).
- Cardiff, R. D., Wellings, S. R. The comparative pathology of human and mouse mammary glands. Journal of Mammary Gland Biology Neoplasia. 4 (1), 105-122 (1999).
- Brock, A., et al. Silencing HoxA1 by intraductal injection of siRNA lipidoid nanoparticles prevents mammary tumor progression in mice. Scientific Translational Medicine. 6 (217), (2014).
- de Groot, J. S., et al. Intraductal cisplatin treatment in a BRCA-associated breast cancer mouse model attenuates tumor development but leads to systemic tumors in aged female mice. Oncotarget. 8 (37), 60750-60763 (2017).
- Wang, G., et al. Intraductal fulvestrant for therapy of ERalpha-positive Ductal Carcinoma in Situ (DCIS) of the breast - A preclinical study. Carcinogenesis. 40 (7), 907-913 (2019).
- Yoshida, T., et al. Effective treatment of ductal carcinoma in situ with a HER-2- targeted alpha-particle emitting radionuclide in a preclinical model of human breast cancer. Oncotarget. 7 (22), 33306-33315 (2016).
- Chun, Y. S., et al. Intraductally administered pegylated liposomal doxorubicin reduces mammary stem cell function in the mammary gland but in the long term, induces malignant tumors. Breast Cancer Research Treatment. 135 (1), 201-208 (2012).
- Markiewicz, E., et al. High resolution 3D MRI of mouse mammary glands with intra-ductal injection of contrast media. Magnetic Resonance Imaging. 33 (1), 161-165 (2015).
- Markiewicz, E., et al. MRI ductography of contrast agent distribution and leakage in normal mouse mammary ducts and ducts with in situ cancer. Magnetic Resonance Imaging. 40, 48-52 (2017).
- Annunziato, S., et al. Comparative oncogenomics identifies combinations of driver genes and drug targets in BRCA1-mutated breast cancer. Nature Communications. 10 (1), 397 (2019).
- Rutkowski, M. R., et al. Initiation of metastatic breast carcinoma by targeting of the ductal epithelium with adenovirus-cre: a novel transgenic mouse model of breast cancer. Journal of Visualized Experiments. (85), e51171 (2014).
- Xiang, D., Tao, L., Li, Z. Modeling breast cancer via an intraductal injection of cre-expressing adenovirus into the mouse mammary gland. Journal of Visualized Experiments. (148), e59502 (2019).
- Barham, W., Sherrill, T., Connelly, L., Blackwell, T. S., Yull, F. E. Intraductal injection of LPS as a mouse model of mastitis: signaling visualized via an NF-kappaB reporter transgenic. Journal of Visualized Experiments. (67), e4030 (2012).
- Chun, Y. S., et al. Intraductal administration of a polymeric nanoparticle formulation of curcumin (NanoCurc) significantly attenuates incidence of mammary tumors in a rodent chemical carcinogenesis model: Implications for breast cancer chemoprevention in at-risk populations. Carcinogenesis. 33 (11), 2242-2249 (2012).
- Stearns, V., et al. Preclinical and clinical evaluation of intraductally administered agents in early breast cancer. Science Translational Medicine. 3 (106), (2011).
- Okugawa, H., et al. Effect of perductal paclitaxel exposure on the development of MNU-induced mammary carcinoma in female S-D rats. Breast Cancer Research Treatment. 91 (1), 29-34 (2005).
- Falconer, I. R. The distribution of 131 I- or 125 I-labelled prolactin in rabbit mammary tissue after intravenous or intraductal injection. Journal of Endocrinology. 53 (3), 58-59 (1972).
- Fiddler, T. J., Birkinshaw, M., Falconer, I. R. Effects of intraductal prolactin on some aspects of the ultrastructure and biochemistry of mammary tissue in the pseudopregnant rabbit. Journal of Endocrinology. 49 (3), 459-469 (1971).
- Fiddler, T. J., Falconer, I. R. The effect of intraductal prolactin on protein and nucleic acid biosynthesis in the rabbit mammary gland. The Biochemical Journal. 115 (5), 58 (1969).
- Bourne, R. A., Bryant, J. A., Falconer, I. R. Stimulation of DNA synthesis by prolactin in rabbit mammary tissue. Journal of Cell Science. 14 (1), 105-111 (1974).
- Chadwick, A. Detection and assay of prolactin by the local lactogenic response in the rabbit. The Journal of Endocrinology. 27, 253-263 (1963).
- Mahoney, M. E., et al. Intraductal therapy of ductal carcinoma in situ: a presurgery study. Clinical Breast Cancer. 13 (4), 280-286 (2013).
- Love, S. M., et al. A feasibility study of the intraductal administration of chemotherapy. Cancer Preview Research (Phila). 6 (1), 51-58 (2013).
