Visualizzazione a raggi X del trattamento ablativo intraduttale a base di etanolo per la prevenzione del cancro al seno in modelli di ratto

Il cancro al seno è una malattia prevalente e mortale con strategie di prevenzione limitate che comportano gravi effetti collaterali negativi. Per fornire un metodo con effetti collaterali ridotti, abbiamo sviluppato una tecnica per l'iniezione intraduttale di una soluzione ablativa a base di etanolo all'albero duttale mammario del ratto che consente l'imaging simultaneo in vivo e la prevenzione del cancro al seno. Ciò si basa su precedenti lavori nei topi in cui l'iniezione direttamente nell'apertura del capezzolo consente di colpire le cellule epiteliali mammarie con un danno tissutale collaterale minimo.

Sia i topi che i ratti hanno ghiandole mammarie contenenti un singolo albero duttale originato dall'apertura del capezzolo. I ratti sono più grandi dei topi e consentono l'iniezione di un volume maggiore di etanolo per lo studio del successo dell'ablazione per dimostrare la scalabilità del modello. Un altro perfezionamento di questo metodo è l'aggiunta di etilcellulosa alla soluzione ablativa.

L'etilcellulosa è stata utilizzata in precedenza in altri approcci clinici per ridurre la diffusione di etanolo lontano dall'area presa di mira. Ciò si ottiene attraverso la natura del composto, che lo induce a gelificare quando entra in contatto con il fluido nel tessuto. Ci sono cinque passaggi chiave coinvolti in questo metodo di prevenzione del cancro al seno verificato dall'immagine.

Dobbiamo prima iniziare a dosare gli animali con carprofen per via orale utilizzando coppette di gel di sucralosio preparate in laboratorio. Questo trattamento antinfiammatorio prolungato viene mantenuto pre e post proceduralmente. Successivamente, rimuoviamo la pelliccia dall'area circostante i capezzoli da iniettare con crema depilatoria per preparare l'animale alle iniezioni.

Le iniezioni intraduttali vengono quindi eseguite con uno stereoscopio che aiuta la visualizzazione dell'apertura del capezzolo per l'inserimento dell'ago. Gli animali vengono sottoposti a scansione o valutazione mediante microTC o fluoroscopia dopo l'iniezione per determinare il successo delle iniezioni. Le scansioni microCT possono quindi essere elaborate per creare ricostruzioni 3D dell'albero duttale mammario iniettato per ulteriori analisi del riempimento riuscito.

Il carprofene viene prima diluito in PVS alla concentrazione richiesta. Il colorante alimentare sterile può essere aggiunto alla miscela per confermare meglio la piena miscelazione del farmaco nel sucralosio della tazza. Le tazze vengono quindi riscaldate a bagnomaria a 60 gradi Celsius per 15 minuti.

L'asciugatura delle tazze dopo la rimozione e la pulizia del coperchio della tazza con etanolo al 70% riduce il rischio di contaminazione. La soluzione di carprofen può essere iniettata direttamente nella tazza utilizzando una siringa per perforare il coperchio. In questo caso, dobbiamo iniettare 500 microlitri per il risultato desiderato.

Sigillare il foro con un adesivo prima di scuotere la tazza per 15 secondi e poi vorticare per altri 15 secondi. La miscelazione omogenea può essere valutata cercando ciuffi di blu scuro. Le tazze possono quindi essere refrigerate fino al momento del bisogno.

Gli animali devono essere preparati due o tre giorni prima che si verifichino le iniezioni. Anestetizzare l'animale usando isoflurano inalante. Trasferire ratto anestetizzato a un cono nasale su un pad riscaldante.

Applicare lubrificante per gli occhi al ratto mentre si trova sul cono del naso e quindi posizionare l'animale sulla schiena. La crema depilatoria può essere applicata sull'area dei capezzoli che si prevede di iniettare con un applicatore con punta di cotone. Un allentamento più rapido della pelliccia può essere ottenuto strofinando l'applicatore su e giù sulla pelle dell'animale nell'area desiderata.

È importante lasciare la crema sul ratto per il minor tempo possibile per evitare di bruciare la pelle. I ratti sono ancora più sensibili dei topi a questa procedura. Dopo 10-30 secondi di applicazione, utilizzare acqua tiepida su una garza per rimuovere completamente la crema.

Utilizzare da tre a quattro risciacqui per garantire la rimozione completa prima di asciugare la pelle con una garza pulita. Confermare una buona visibilità e accesso ai capezzoli nelle aree di rimozione della pelliccia. Ripetere la procedura depilatoria se necessario.

Metti il ratto in una gabbia di recupero pulita su una piastra riscaldante per riprendersi dall'anestesia. Dare una tazza di carprofen ai ratti preparati nella loro gabbia di casa dopo il recupero. Inizierai anestetizzando l'animale usando l'anestesia isoflurana inalante e sposterai il ratto in un cono nasale una volta che è stato completamente indotto.

Il lubrificante per gli occhi deve essere applicato prima di posizionare l'animale sulla schiena per le iniezioni. Può essere utile fissare le gambe vicino ai capezzoli che verranno iniettati, ma non è necessario. Una volta preparata la siringa con il volume desiderato di soluzione iniettabile, preparare il capezzolo rimuovendo la pelle morta visibile con una pinza a punta fine, se possibile.

L'area di preoccupazione più comune è l'apertura del capezzolo stesso. I ratti hanno spesso una spina che sporge dall'apertura. La rimozione di questo tappo può aiutare a migliorare l'incannulamento.

Con la smussatura dell'ago visibile, inserire l'ago nella punta del capezzolo con l'aiuto di una pinza a punta fine. Fare attenzione a seguire il percorso dell'apertura del capezzolo. I capezzoli di ratto tendono ad avere più grasso che circonda l'apertura, rendendo più facile perforare questo grasso e credere erroneamente di aver raggiunto l'incannulamento a causa dell'avanzamento dell'ago.

Una volta che la smussatura dell'ago è completamente circondata dal capezzolo, iniziare lentamente a iniettare la soluzione. La velocità desiderata è di circa 100 microlitri al minuto nei ratti. Evitare di iniettare più rapidamente di questo per prevenire possibili danni all'albero duttale.

Dopo l'iniezione completa, attendere 30 secondi prima di rimuovere l'ago dal capezzolo con l'assistenza della pinza. Ciò ridurrà la probabilità di perdite dal capezzolo. Se si verifica una perdita, utilizzare una garza inumidita o una salvietta di etanolo per pulire la soluzione.

Il contrasto e la soluzione versata possono distorcere le immagini acquisite. Qui vediamo un video ingrandito della sequenza di iniezione che è stata appena visualizzata. Si noti che la respirazione dell'animale rende difficile mantenere il capezzolo in un unico piano focale.

Ciò può rendere l'iniezione più difficile in quanto il capezzolo non rimane in una posizione costante. Questo problema è esacerbato dalla vicinanza alla gabbia toracica e alle prime tre coppie di ghiandole. Il tappo nell'apertura del capezzolo è stato ora rimosso per una migliore incannulazione.

L'ago può ora essere orientato smussato verso l'alto per essere avanzato nel capezzolo con l'assistenza della pinza. Una volta che la smussatura è completamente inserita, l'iniezione può iniziare. Se guarda attentamente sul lato sinistro del capezzolo potrebbe notare un aumento della tinta blu in cui la soluzione iniettabile è leggermente visibile diffondendosi attraverso l'albero duttale.

Questo è molto meno visibile nel ratto a causa della pelle più spessa. Qui possiamo vedere la rimozione dell'ago 30 secondi dopo che l'iniezione è stata completata e la soluzione risultante fuoriesce dal capezzolo. La soluzione extra viene ripulita, consentendo la valutazione dell'area in cui non vediamo traumi al capezzolo o cupola dell'area, il che indicherebbe un'iniezione di cuscinetto di grasso.

Se si inietta una soluzione contenente etanolo, è necessario prestare attenzione per evitare l'intossicazione da alcol. Ciò richiede di sapere quanto etanolo può essere iniettato in una sessione e somministrare la soluzione contenente saccarosio IP durante la procedura per contrastare gli effetti. Dopo l'iniezione, gli animali possono essere recuperati in una gabbia pulita su una piastra riscaldante o spostati alla microCT per l'imaging del successo dell'iniezione.

Dopo aver spostato l'animale iniettato nello strumento microCT, continuare a somministrare isoflurano per mantenere l'anestesia durante l'imaging. L'aumento delle dimensioni del ratto richiede un'ulteriore manipolazione della posizione per ottenere una buona immagine. Il raddrizzamento della colonna vertebrale prima di fissare le gambe vicino al sito da fotografare è utile per generare immagini coerenti.

Toccare le gambe in una posizione estesa può impedire alle ossa di diventare il punto focale dell'immagine. Abbiamo anche scoperto che il taping attraverso l'addome del ratto può aiutare a ridurre l'artefatto respiratorio per le ghiandole inferiori. Diversi parametri di scansione sono accettabili per la visualizzazione del trattamento duttale.

Tuttavia, la dose di radiazioni deve sempre essere considerata quando si selezionano i parametri. La dose di radiazioni risultante da queste scansioni non deve superare i limiti di radiazione per un dato ceppo di ratti. L'analisi fluoroscopica, piuttosto che l'acquisizione di immagini, può ridurre notevolmente il carico complessivo di radiazioni.

Una volta effettuate tutte le scansioni o le valutazioni, l'animale può essere riportato in una gabbia di recupero pulita su una piattaforma riscaldante. L'animale deve essere monitorato fino a quando non si è completamente ripreso e restituito alla gabbia di casa. Le coppette di carprofen devono essere fornite fino ad almeno sette giorni dopo l'iniezione.

Il software sullo strumento microCT che utilizziamo consente la creazione di rendering rapidi per valutare il successo dell'iniezione senza analisi formale. Questa funzione ha un semplice cursore di contrasto che consente una ragionevole riduzione del segnale al rumore. Il difetto principale di queste rappresentazioni è che l'intera immagine deve essere sospesa contemporaneamente.

Ciò consente ai segnali luminosi che chiaramente non fanno parte dell'albero duttale, come il ferro nella dieta, di rimanere nell'immagine. In alcuni casi, il vero segnale visto qui è debole come lo sfondo e può essere facilmente escluso dall'immagine. Rese formali migliori possono essere effettuate utilizzando software di analisi più sofisticati che consentono la segmentazione dell'area di interesse.

È meglio segmentare il cuscinetto di grasso mammario per un'ulteriore elaborazione delle immagini al fine di ottenere la migliore resa dell'albero duttale iniettato. Il bordo scuro del cuscinetto di grasso mammario può essere tracciato su tutto lo spessore dell'animale per ottenere questa segmentazione. Tracciare ogni terza fetta e propagare l'oggetto è sufficiente per catturare l'intero condotto nella nostra esperienza.

A questo punto, è possibile sospendere la resa utilizzando una data rabbia per visualizzare solo il contrasto contenuto all'interno del cuscinetto di grasso mammario. Ciò dovrebbe includere la soluzione all'interno dell'albero duttale e qualsiasi perdita nelle immediate vicinanze. Le soluzioni di ossido di tantalio sono generalmente ben visualizzate in un intervallo da 300 a 3000 HU. Ulteriori analisi possono essere formate una volta creata una ricostruzione dell'albero duttale.

Se non si desidera l'imaging longitudinale, è possibile acquisire immagini a risoluzione più elevata che catturino meglio la complessa architettura dell'albero duttale. Le differenze tra gli animali possono rendere l'iniezione più o meno difficile. Non possiamo parlare di variabilità da ceppo a ceppo poiché attualmente lavoriamo esclusivamente con ratti Sprague Dawley.

Alcuni animali avranno capezzoli con profili bassi, come quello qui raffigurato, rendendo difficile manipolare e ottenere un incannulamento di successo. Altri avranno capezzoli con un profilo più alto, come quello mostrato qui, che sarà più suscettibile all'incannulamento. Qui è raffigurato un capezzolo incannulato con successo.

La difficoltà di incannulamento può causare traumi al capezzolo, come mostrato qui. L'acquisizione di immagini microCT immediatamente dopo l'iniezione può informare meglio i ricercatori del successo di un'iniezione e aiutare a identificare le proprietà di riempimento di determinate soluzioni. Qui vediamo diversi aspetti delle ghiandole addominali dello stesso ratto iniettati con lo stesso volume di una soluzione ablativa contenente etanolo al 70% con contrasto fornito da ossido di tantalio 100 millimolare.

La soluzione utilizzata nella ghiandola superiore mostrata conteneva anche l'1% di etilcellulosa. Vediamo strutture simili a pareti alle estremità dei rami duttali. Queste sono gemme terminali piene della soluzione e non si rovesciano.

Nella riga inferiore, vediamo estremità duttali meno definite che indicano la fuga della soluzione dall'albero duttale. Questo, insieme a danni collaterali più limitati nell'esame istologico. sembra indicare una migliore ritenzione delle soluzioni contenenti etilcellulosa nell'albero duttale.

Questo metodo fornisce un passo verso la scalabilità di un metodo meno invasivo di prevenzione del cancro al seno per offrire un'alternativa alla mastectomia profilattica. L'ablazione epiteliale di successo in un modello di roditore più grande è stata dimostrata con effetti collaterali minimi per l'animale. L'aggiunta di etilcellulosa alla soluzione ablativa consente una migliore ritenzione della soluzione nell'area di iniezione, che si traduce in una riduzione dei danni collaterali.

L'uso innovativo di soluzioni clinicamente testate e la maggiore capacità di visualizzare il successo della consegna con modalità di imaging comuni consente una pronta traduzione in clinica.