Summary
En neuronal lysosom nærhetsmerking proteomikkprotokoll er beskrevet her for å karakterisere det dynamiske lysosomale mikromiljøet i humaninduserte pluripotente stamcelleavledede nevroner. Lysosomale membranproteiner og proteiner som interagerer med lysosomer (stabilt eller forbigående) kan kvantifiseres nøyaktig i denne metoden med utmerket intracellulær romlig oppløsning i levende humane nevroner.
Abstract
Lysosomer kommuniserer ofte med en rekke biomolekyler for å oppnå nedbrytning og andre forskjellige cellulære funksjoner. Lysosomer er kritiske for menneskelig hjernefunksjon, da nevroner er postmitotiske og stole sterkt på autofagi-lysosomveien for å opprettholde cellulær homeostase. Til tross for fremskritt i forståelsen av ulike lysosomale funksjoner, er det teknisk utfordrende å fange den svært dynamiske kommunikasjonen mellom lysosomer og andre cellulære komponenter, spesielt på en høy gjennomstrømningsmåte. Her er en detaljert protokoll gitt for den nylig publiserte endogene (knock-in) lysosom-nærhetsmerkingsproteomiske metoden i humaninduserte pluripotente stamceller (hiPSC) -avledede nevroner.
Både lysosomale membranproteiner og proteiner som omgir lysosomer innenfor en radius på 10-20 nm, kan trygt identifiseres og kvantifiseres nøyaktig i levende humane nevroner. Hvert trinn i protokollen er beskrevet i detalj, dvs. hiPSC-nevronkultur, nærhetsmerking, nevronhøsting, fluorescensmikroskopi, biotinylert proteinberikelse, proteinfordøyelse, LC-MS-analyse og dataanalyse. Oppsummert gir denne unike endogene lysosomale nærhetsmerkingsproteomikkmetoden et høyt gjennomstrømnings- og robust analytisk verktøy for å studere de svært dynamiske lysosomale aktivitetene i levende menneskelige nevroner.
Introduction
Lysosomer er katabolske organeller som nedbryter makromolekyler via lysosomal-autofagi-banen1. Foruten nedbrytning er lysosomer involvert i ulike cellulære funksjoner som signaltransduksjon, næringsmåling og sekresjon 2,3,4. Forstyrrelser i lysosomal funksjon har vært involvert i lysosomale lagringsforstyrrelser, kreft, aldring og nevrodegenerasjon 3,5,6,7. For postmitotiske og svært polariserte nevroner spiller lysosomer kritiske roller i nevronal cellulær homeostase, nevrotransmitterfrigivelse og langdistansetransport langs axonene 8,9,10,11. Imidlertid har det vært en utfordrende oppgave å undersøke lysosomer i humane nevroner. Nylige fremskritt i indusert pluripotent stamcelle (iPSC) -avledet nevronteknologi har muliggjort kulturen av levende menneskelige nevroner som tidligere var utilgjengelige, og bygger bro over gapet mellom dyremodeller og menneskelige pasienter for å studere den menneskelige hjerne12,13. Spesielt integrerer den avanserte i3Neuron-teknologien stabilt neurogenin-2-transkripsjonsfaktoren i iPSC-genomet under en doxycyklinin-induserbar promotor, og driver iPSC-er til å differensiere til rene kortikale nevroner i 2 uker14,15.
På grunn av den svært dynamiske lysosomale aktiviteten er det teknisk utfordrende å fange lysosomale interaksjoner med andre cellulære komponenter, spesielt på en høy gjennomstrømningsmåte. Nærhetsmerkingsteknologi er godt egnet til å studere disse dynamiske interaksjonene på grunn av sin evne til å fange både stabile og forbigående / svake proteininteraksjoner med eksepsjonell romlig spesifisitet16,17. Konstruert peroksidase eller biotin ligase kan genetisk smeltes til agnproteinet. Ved aktivering produseres svært reaktive biotinradikaler for å kovalent merke naboproteiner, som deretter kan berikes av streptavidinbelagte perler for nedstrøms bottom-up proteomikk via flytende kromatografi-massespektrometri (LC-MS) plattformer 17,18,19,20,21.
En endogen lysosomal nærhetsmerkingsproteomikkmetode ble nylig utviklet for å fange det dynamiske lysosomale mikromiljøet i i3Neurons22. Konstruert askorbatperoksidase (APEX2) ble slått inn på C-enden av det lysosomale assosierte membranproteinet 1 (LAMP1) i iPSC, som deretter kan differensieres til kortikale nevroner. LAMP1 er et rikelig lysosomalt membranprotein og en klassisk lysosomal markør23. LAMP1 uttrykkes også i sene endosomer, som modnes til lysosomer; Disse sene endosom-lysosomene og ikke-nedbrytende lysosomene er alle referert til som lysosomer i denne protokollen. Denne endogene LAMP1-APEX-sonden, uttrykt på fysiologisk nivå, kan redusere LAMP1-feillokaliserings- og overuttrykksartefakter. Hundrevis av lysosomale membranproteiner og lysosomale interaktorer kan identifiseres og kvantifiseres med utmerket romlig oppløsning i levende menneskelige nevroner.
Her beskrives en detaljert protokoll for lysosom-nærhetsmerking av proteomikk i humane iPSC-avledede nevroner med ytterligere forbedringer fra den nylig publiserte metoden22. Den generelle arbeidsflyten er illustrert i figur 1. Protokollen inkluderer hiPSC-avledet nevronkultur, nærhetsmerkingsaktivering i nevroner, validering av APEX-aktivitet ved fluorescensmikroskopi, bestemmelse av et optimalt streptavidinperler-til-inngang-proteinforhold, anrikning av biotinylerte proteiner, on-beads proteinfordøyelse, peptidavsalting og kvantifisering, LC-MS-analyse og proteomikkdataanalyse. Feilsøkingsretningslinjer og eksperimentelle optimaliseringer diskuteres også for å forbedre nærhetsmerking kvalitetskontroll og ytelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer ble godkjent av George Washington University biosikkerhets- og etikkkomité. Sammensetningene av medier og buffere som brukes i denne protokollen er gitt i tabell 1. Den kommersielle produktinformasjonen som brukes her, er gitt i materialtabellen.
1. Human iPSC-avledet nevronkultur
- Integrering av iPSC-kultur og LAMP1-APEX-sonde (7 dager)
- Tine Matrigel lagerløsning i en isbøtte ved 4 °C over natten, aliquot 500 μL av oppløsningen i kalde sterile rør, og lagre aliquots ved -80 ° C. Forbered 50 ml beleggløsning ved å tilsette 500 μL av Matrigel-stammen i 49,5 ml kald DMEM/F12 medium.
MERK: Hold Matrigel kald og bruk forkjølte koniske rør og pipettespisser for å forhindre polymerisering. Belegningsoppløsningen kan oppbevares ved 4 °C i 2 uker. - Belagt en 10 cm cellekulturskål med 4 ml beleggløsning i 1 time i en inkubator på 37 °C.
MERK: Vitronektin kan være en alternativ beleggløsning ved 5 μg / ml konsentrasjon og 2 timers belegg for iPSC-kultur. Vitronektin (enkeltproteinkomponent) er dyrere enn Matrigel, men har mindre batchvariasjoner og renere bakgrunnssignaler enn Matrigel, som ekstraheres fra musetumor med mange ekstracellulære matriksproteiner. Ikke-behandlet vevskulturplate er nødvendig for vitronektinbelegg. Matrigel belegg fungerer for både behandlede og ikke-behandlede vevskulturplater. - Tine og plate 1-3 millioner hiPSC på hver belagt 10 cm tallerken forhåndslastet med 8 ml Essential E8 komplett medium supplert med ROCK-hemmer (endelig konsentrasjon 10 μM Y-27632 eller 50 nM Chroman1).
MERK: Tilsetning av ROCK-hemmer (Y-27632 eller Chroman1) til stamcellekulturmediet minimerer dissosiasjonsindusert apoptose etter splitting og kryogen bevaring. Chroman1 har nylig vist seg å være sterkere enn Y-27632 ved å hemme både ROCK1 og ROCK224. - Bytt til 10 ml E8 komplett medium uten ROCK-hemmer etter at iPSCs danner kolonier, vanligvis etter 1-2 dager. Oppretthold iPSC-kulturen i E8 komplett medium og erstatt supernatanten med ferskt medium annenhver dag.
- Integrer nærhetsmerkingsenzymet, konstruert askorbatperoksidase (APEX2), i C-enden av endogent LAMP1-gen ved CRISPR-genomteknikk . For detaljerte trinn for å generere en konstruert stabil cellelinje, se den tidligere publiserte metoden (Frankenfield et al). 22.
- Tine Matrigel lagerløsning i en isbøtte ved 4 °C over natten, aliquot 500 μL av oppløsningen i kalde sterile rør, og lagre aliquots ved -80 ° C. Forbered 50 ml beleggløsning ved å tilsette 500 μL av Matrigel-stammen i 49,5 ml kald DMEM/F12 medium.
- Human iPSC-neuron differensiering (3 dager)
- Belegg en 10 cm cellekulturskål over natten med 4 ml Matrigel beleggløsning i en 37 °C inkubator før differensiering.
- Opprettholde hiPSCs til ~ 70% samløp. Vask hiPSC-ene forsiktig med fosfatbufret saltvann (PBS) 2x for å fjerne døde celler. Aspirer PBS og tilsett3 ml Accutase til 10 cm parabolen av celler. Rist tallerkenen for jevn fordeling og inkuber i 8 minutter i en inkubator på 37 °C.
- Tilsett 2 ml PBS for å vaske og løfte cellene fra platen og samle all celleoppløsning i et 15 ml konisk rør. Pellet cellene ved sentrifugering ved 300 × g i 5 minutter. Plate 2-4 × 106 hiPSC på en Matrigel-belagt plate forhåndslastet med 8 ml varmt nevroninduksjonsmedium (tabell 1). Fordel cellene jevnt og plasser i en 37 ° C inkubator.
MERK: Nevrondifferensiering drives av en doksycyklinininduserbar transkripsjonsfaktor, neurogenin-2 (NGN2), som ble overuttrykt i denne stabile hiPSC-cellelinjen15. - Vask hiPSCs forsiktig med PBS på dag 1 av differensiering for å fjerne døde celleavfall. Bytt ut med 10 ml varmt induksjonsmedium uten ROCK-hemmer.
- Bytt med varmt induksjonsmedium uten ROCK-hemmer hver dag frem til dag 3 av differensiering.
MERK: Nevroner er klare til å bli replisert til nevronmedium.
- Plating nevroner og opprettholde nevronkultur (10 dager)
- Forbered 0,1 mg/ml poly-L-ornitin (PLO) beleggløsning i boratbuffer (tabell 1).
- Belegge en cellekulturskål med PLO-beleggløsningen i en 37 °C inkubator i minst 1 time eller over natten før pletteringsdag 3-nevroner. Vask oppvasken med 4 ml sterilt vann tre ganger og la det lufttørke helt inne i biosikkerhetsskapet.
- Dissocier dag 3-nevroner fra hver 10 cm tallerken med 3 ml Accutase og tallerken 8-10 millioner celler på hver 10 cm PLO-belagt tallerken forhåndslastet med varmt kortikalt nevronmedium (tabell 1).
- Utfør en halv-medium forandring hver 2-3 dag med varmt nevronmedium til i3Neurons når modning i 2 uker etter differensiering.
2. In situ nærhetsmerking og nevronlyse (2 timer)
- Forbered 500 mM biotin-fenol (BP) stamløsning i dimetylsulfoksid (DMSO) og oppbevar ved -20 °C. På dagen for nærhetsmerking, fortynn BP-lagerløsningen med varmt nevronmedium og behandle nevronene ved en endelig konsentrasjon på 500 μM i 30 minutter i en 37 ° C inkubator.
MERK: Doxycyklin tilsettes i nevronmediet, som vil aktivere APEX-enzymuttrykk. Doxcyklin må tilsettes minst 24 timer før nærhetsmerkingseksperimentet. - Start merkereaksjonen ved å tilsetteH2O2ved en endelig konsentrasjon på 1 mM i nevronkulturen og ruge i nøyaktig 1 minutt. Aspirer mediet umiddelbart og skyll 3 ganger med slukkebuffer (tabell 1).
MERK: H2O2-oppløsningen skal lages fersk før merkereaksjonen. H2O2-aktiveringen må være nøyaktig 1 min for å redusere eksperimentell variasjon og minimere oksidativt stress forårsaket av langvarigH2O2-behandling. - Vipp platen for å aspirere all gjenværende buffer. Tilsett iskald cellelysebuffer (tabell 1) direkte på nevronplaten. Bruk 100 μL cellelysebuffer per 1 million nevroner. Virvle platen for tilstrekkelig cellelyse og legg på is.
- Skrap cellelysatene i kalde 1,5 ml rør. Sonicate i et iskaldt vannbad ved hjelp av en badsonikator (>100 W) i 15 minutter med vekslende 40 s på, 20 s av sykluser.
MERK: Tilstrekkelig lysnet proteinoppløsning skal være klar uten pellets eller overdreven bobler. Tilstrekkelig sonikering av cellelysat er avgjørende for å skjære nukleinsyrer og redusere klebrigheten til cellelysatet for å redusere ikke-spesifikk binding i nedstrømsprosedyrer. En sonde sonicator kan også brukes til å gi sterkere og raskere cellelyse, men å vaske sonden mellom prøvene er nødvendig for å minimere krysskontaminering og prøvetap. - Tilsett kald aceton (−20 °C) i prøven ved et 4 ganger volum lysisbuffer. Vortex kort og inkuberer ved -20 °C i 3 timer.
- Sentrifuge ved 16 500 × g i 10 minutter ved 2 °C. Fjern supernatanten uten å forstyrre proteinpelleten. Vask pelleten med 1 ml -20 °C aceton 2x og fjern supernatanten etter sentrifugering.
- Tørk proteinpelleten med en vakuumkonsentrator i 1 min. Legg til cellelysebuffer for å oppløse pelleten helt. Sonicate kort om nødvendig. Oppbevar prøvene ved −80 °C.
MERK: Acetonutfelling kan fjerne rester av biotin-fenol i prøven, noe som kan forstyrre nedstrøms anrikning av biotinylerte proteiner.
3. Fluorescensmikroskopi for å validere APEX-lokalisering og aktivitet (1,5 dager)
- Inkuber i3-nevronenesom uttrykker endogen LAMP1-APEX med 500 μM BP i 30 minutter ved 37 °C. Aktiver merkingen med 1 mM H2O2-behandling i bare 1 s for å begrense diffusjonen av biotinsky.
- Fest cellene umiddelbart med 4% paraformaldehyd i slukkebufferen og vask forsiktig 3x med PBS.
MERK: For en 10 cm tallerken er 4-6 ml nødvendig for tilstrekkelig vask. - Blokker og permeabiliser cellene ved hjelp av 3% eselserum og 0,1% saponin i PBS i 30 minutter ved romtemperatur (RT).
- Inkuber cellene med primært anti-LAMP1 antistoff (mus monoklonal H3A4, 1:1,000) over natten ved 4 °C.
- Vask nevronene 3 x forsiktig med PBS. Inkuber nevronene med anti-mus AF561 sekundært antistoff (1:1,000) og Streptavidin-680 (1:1,000) i 1 time ved RT.
- Vask 2x med PBS og inkuber med Hoechst eller 4',4-diamidino-2-fenylindol (DAPI) nukleær markør i 10 minutter ved RT. Skyll cellene 2x med PBS.
- Visualiser de faste nevronene under et fluorescensmikroskop. Observer biotinylerte proteiner farget med streptavidin og kolokalisert med LAMP1-farging utenfor kjernen for å validere riktig plassering av APEX-aktivitet.
4. Bestemme streptavidinperler-til-inngangsproteinforholdet (1,5 dager)
- Utfør vaskemiddelkompatibel proteinanalyse (DCA) for å bestemme totale proteinkonsentrasjoner i cellelysater
- Oppløs bovint serumalbumin (BSA) proteinstandard i cellelysebufferen ved en konsentrasjon på 4 mg / ml. Forbered en serie BSA-proteinstandardløsninger (0,2-2 mg / ml, 5 fortynninger) ved bruk av cellelysebufferen.
- Overfør 5 μL fra hver proteinprøve, BSA-proteinstandardløsning og blank cellelysebuffer i tre ganger inn i hver brønn i en 96-brønnplate.
- Tilsett 2 μL reagens S per 1 ml reagens A for å få reagens A'. Tilsett 25 μL reagens A' til hver brønn. Tilsett 200 μL reagens B til hver brønn. Bland og pop bobler hvis de er til stede.
- Inkuber den 96-brønnsplaten ved RT i 15 minutter, les absorbansen ved 750 nm i en mikroplateleser, og kvantifiser konsentrasjonene av proteinprøver basert på BSA-standardkurven.
- Perler titrering dot blot analyse (1,5 dager)
- Overfør en serie streptavidin magnetiske perler slurry (20 μL, 15 μL, 12 μL, 10 μL, 8 μL, 4 μL, 1 μL, 0 μL) til PCR stripe rør. Sett PCR-striperørene på et magnetisk stativ, vask perlene 3x med 100 μL 2% SDS-buffer, og fjern vaskebufferen helt mens du er på magnetstativet.
- Tilsett 50 μg proteinprøve til hvert rør. Legg til mer lysisbuffer til et totalt volum på 80 μL. Lukk hvert rør tett og roter ved 4 °C over natten.
- Sentrifuge PCR-striperørene kort på en stasjonær mikrosentrifuge. Plasser PCR-striperørene på et magnetisk stativ i 1 min. Spot 2 μL supernatant fra hvert rør på en tørr nitrocellulosemembran og la membranen tørke helt.
MERK: Hvis signalintensiteten er lav, kan mer enn 2 μL sees på membranen. Volumet kan økes ved å spotte flere ganger på samme sted etter at membranen er lufttørket mellom hver gang. Et Bio-Dot-apparat kan også brukes. - Inkuber membranen i blokkeringsbuffer (TBS) i 1 time. Inkuber membranen i Streptavidin Alexa Fluor 680 konjugat (1: 1,000 i blokkeringsbuffer) i 1 time. Vask deretter membranen med TBS-T (tabell 1) 5x.
MERK: Et alternativ til dot blot-analysen er western blotting ved hjelp av et streptavidinantistoff. - Mål fluorescerende signal for hver prikk på membranen under 680 nm bølgelengde, og generer et spredningsplott med fluorescerende signal over volumet av perler. Velg det optimale volumet av perler som trengs for 50 μg inngangsproteinprøve basert på hvor eksponentielt forfall av kurven slutter .
MERK: Fluorescensintensitet representerer overflod av biotinylerte proteiner i supernatanten, som bør reduseres med økende mengder perler.
5. Berikende biotinylerte proteiner og fordøyelse på perler (3 dager)
- Overfør proteinlysatprøver fra -80 ° C og sonikerer prøvene i 1,5 ml rør i 30 s i en badesonikator for raskt å tine løsningene. Vortex og legg prøverørene på is.
- Overfør 250 μL streptavidin (SA) magnetiske perler slurry til hvert 1,5 ml rør. Sett rørene på et magnetisk stativ, vask perlene 3x med 1 ml vaskebuffer A (2% SDS), og fjern restbufferen.
- Basert på resultatene av dot blot-analysen og DC-proteinanalysen, beregne mengden proteinprøve (μg) som trengs for 250 μL av streptavidin magnetiske perler slurry.
MERK: I denne endogent uttrykte LAMP1-APEX-sonden er det nødvendig med 5 μL perler for 50 μg inngangsprotein. Derfor tilsettes 2,5 mg totalt protein til 250 μL perler. Mindre enn 250 μL SA-perler kan brukes til begrenset inngangsprøvemateriale. - Tilsett cellelysebuffer til røret som inneholder den magnetiske perlelysatblandingen til et totalt volum på 1 ml og roter ved 4 ° C over natten.
MERK: Prøver fra forskjellige grupper eller replikasjoner bør normaliseres til samme proteinkonsentrasjon, volum og mengde perler for å redusere eksperimentelle variasjoner. - Spinn ned alle rørene kort på en stasjonær mikrosentrifuge og legg rørene på et magnetisk stativ i 1 min. Fjern supernatanten mens du er på magnetstativet.
MERK: Det er viktig å vente i 1 minutt etter at prøverørene er plassert på magnetstativet hver gang. Dette kan minimere perletap på grunn av den usynlige lille mengden perler som fortsatt beveger seg mot magneten i løsningen. - Vask perlene 2x med 1 ml vaskebuffer A ved RT (5 min rotasjon hver gang). Gjenta prosessen med hver vaskebuffer 2x sekvensielt ved 4 °C. (Buffer B, Buffer C og Buffer D; Tabell 1).
MERK: En høy konsentrasjon av SDS-løsning kan utfelle ved kalde temperaturer. Den første vasken må utføres på RT. - Sett rørene på magnetstativet. Vask perlene 2x med buffer D for å fjerne restvaskemiddel helt. Resuspender perlene i 100 μL med 50 mM Tris buffer og tilsett 5 mM TCEP (endelig konsentrasjon) for å inkubere i 30 minutter ved 37 °C i en temperaturkontrollert mikser, risting ved 1,200 o / min.
- Tilsett 15 mM iodoacetamid (IAA, endelig konsentrasjon) til hvert rør og rug i 30 minutter ved 37 °C i en temperaturkontrollert mikser, rist ved 1 200 o/min i mørket (blandebatteri på).
MERK: IAA er lysfølsom og bør gjøres frisk 5 min før dette trinnet. - Tilsett 5 mM TCEP (sluttkonsentrasjon) for å slukke overflødig IAA. Inkuber i 10 minutter ved 37 °C i en temperaturkontrollert mikser med risting ved 1 200 o / min (mikserhette av).
- Sentrifuge prøverørene kort og legg på et magnetisk stativ i 1 minutt for å fjerne supernatanten. Tilsett 200 μL 5 mM TCEP i 50 mM Tris buffer for å resuspendere perlene. Tilsett 1 μg Trypsin/Lys-C-blanding i prøven, og inkuber i 14 timer ved 37 °C i en temperaturkontrollert mikser, rist ved 1 200 o/min.
- Tilsett ytterligere 0,2 μg trypsin/lys-C blanding og fordøye i 3 timer.
- Spinn ned prøverørene kort og legg rørene på et magnetisk stativ i 1 min. Overfør peptidsupernatanten for å rengjøre rørene mens du er på et magnetisk stativ. Vask perlene med 50 μL 50 mM Tris buffer (risting i 5 min) og kombiner peptidsupernatantene.
- Tilsett 30 μL 10% trifluoreddiksyre (TFA) til røret som inneholder peptidsupernatant for å få pH <3.
6. Peptid avsalting og fraksjonering (2 timer)
- Fukt den omvendte fase fastfaseekstraksjonsplaten (bare brønnene for bruk) med 200 μL HPLC-klasse metanol (MeOH) 3x på vakuummanifolden. Tilsett 200 μL 1% TFA i HPLC-klasse vann 3x for å balansere platen.
- Legg peptidprøvene inn i platen, og slå sakte på vakuumet for en strømningshastighet lavere enn 3 dråper / s for å minimere prøvetap.
- Vask ekstraksjonsplaten 3x med 200 μL 1% TFA. Vask ekstraksjonsplaten igjen med 200 μL 1% TFA inneholdende 2% MeOH (v / v). Hold strømningshastigheten lavere enn 3 dråper/s.
- Bytt ut oppsamlingsplaten med en 96-brønns oppsamlingsplate. Hvis det ikke er behov for fraksjonering, eluer peptidprøvene 3x med 100 μL 1% TFA inneholdende 80% MeOH og kombineres i et nytt prøverør. Tørk peptidprøvene i en vakuumkonsentrator uten varme.
MERK: Hvis fraksjonering er ønskelig, kan peptidprøver elueres i 4 fraksjoner deretter ved bruk av 200 μL 1% TFA som inneholder henholdsvis 15%, 35%, 50% og 90% MeOH i en annen oppsamlingsplate.
7. Kolorimetrisk peptidkvantifiseringsanalyse (valgfritt) (1 time)
- Resuspender peptidprøver i 50 μL LC-MS-klasse vann og ta 20 μL aliquots for å utføre peptidanalysen.
MERK: Dette trinnet bruker en stor mengde peptidprøve, men kan gi en nøyaktig kvantifisering av peptidkonsentrasjon før LC-MS-analyse. Dette utføres vanligvis bare en gang per prøvetype for testing før storskala prøvepreparering. - Klargjør serielle fortynninger av peptidstandardløsningene (leveres i kolorimetrisk analysesett) i LC-MS-klasse vann. Forbered arbeidsreagenset ved å blande 50 % reagens A, 48 % reagens B og 2 % reagens C.
- Overfør 20 μL av hver peptidstandardløsning (tre replikasjoner) og den ukjente peptidprøven til en 96-brønns mikroplate. Tilsett 180 μL av arbeidsreagenset til hver brønn, bland godt og inkuber platen i 30 minutter ved RT.
- Les av absorbansen ved 480 nm i en mikroplateleser og kvantifiser konsentrasjonene av peptidprøver basert på peptidstandardkurven.
8. LC-MS analyse
- Resuspender peptidprøvene i LC Buffer A (2 % acetonitril og 0,1 % maursyre, LC-MS grad). Sentrifuge ved 16 500 × g i 10 minutter ved 4 °C for å kvitte seg med eventuelle partikler.
- Overfør supernatanten til LC-MS hetteglass. Analyser prøvene ved hjelp av et nanoLC-MS-instrument.
MERK: Detaljerte LC-MS/MS-parametere er instrumentavhengige og er beskrevet tidligere22,25,26. - Generer en tilpasset LC-MS-eksklusjonsliste med en rekke retensjonstider for svært rikelig forurensningspeptidtopper som streptavidin og trypsin med 5 ppm massenøyaktighet 22 (f.eks. vanlige streptavidinpeptidtopper er m / z 402.5435 [ladning 3], m / z 603.3117 [ladning 2], m / z 654.9733 [ladning 3], m / z 678.6812 [kostnad 3], m / z 1017.5182 [ladning 2], etc.; Vanlige trypsinpeptidtopper er M/Z 421,7584 [ladning 2], M/Z 523,2855 [ladning 2] og M/Z 737,7062 [ladning 3]).
9. Proteomikk dataanalyse
- Analyser LC-MS-rådata med programvare for dataanalyse av proteomikk, for eksempel Proteome Discoverer, MaxQuant27 eller MS-Fragger28. Inkluder to ASTINA-biblioteker for dataanalyse: 1) en Swissprot Homo Sapiens referansedatabase; 2) et nylig generert universelt forurensnings-ASA-bibliotek (https://github.com/HaoGroup-ProtContLib), som ble bevist å forbedre proteomikkidentifikasjon og redusere falske funn29.
- Sett opp proteomikkdataanalyseparametrene med en 1% falsk oppdagelsesrate (FDR) cutoff for protein- og peptidspektralmatching (PSM) identifikasjoner. Velg trypsinfordøyelse med maksimalt tre tapte spaltninger, en fast modifikasjon av cysteinkarbamidometylering og en variabel modifikasjon av metioninoksidasjon og protein N-terminal acetylering. Bruk peptid MS1 toppintensiteter for etikettfri kvantifisering. Normaliser peptidintensitetene til den endogent biotinylerte karboksylasen, propionyl-CoA-karboksylase (PCCA), for å redusere variasjoner i nærhetsmerking, som beskrevet tidligere22.
MERK: PCCA normalisering kan velges i Proteome Discoverer programvare ved å inkludere en PCCA protein sekvens FASTA fil. Alternativt kan PCCA-normalisering utføres i nedstrøms dataanalyse. - Eksporter resultater på proteinnivå fra proteomikkprogramvaren. Fjern forurensende proteiner før statistisk analyse29. Fjern proteiner med bare 1 PSM eller ingen kvantifiseringsresultat. Gjennomføre proteingenontologi (GO)-termanalyse med Enrichr30 og proteinnettverksanalyse med STRING31.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne lysosom-nærhetsmerkingsproteomikkstudien ble utført i humane iPSC-avledede nevroner for å fange det dynamiske lysosomale mikromiljøet in situ i levende nevroner. Cellemorfologier av hiPSC og hiPSC-avledede nevroner på forskjellige tidspunkter er illustrert i figur 2A. Humane iPSC-er vokser i kolonier i E8-medium. Differensiering initieres ved plating av iPSCs i doxycyklinholdig nevroninduksjonsmedium. Neurittforlengelser blir mer synlige hver dag i løpet av 3 dagers differensiering. Etter å ha byttet til PLO-belagte plater i nevronmedium, danner nevrittene et nettverk mellom nevroner, og aksonale utvidelser blir mer synlige når nevronene når modning om 2 uker. Ii 3Neurons valideres lokaliseringen av APEX-sonden ved fluorescensmikroskopi etter rask APEX-aktivering. Biotinylerte proteiner er farget ved hjelp av streptavidin (SA) antistoff, og lysosomer er farget ved hjelp av anti-LAMP1 antistoff. Det sammenslåtte bildet validerer riktig lokalisering av LAMP1-APEX til agnproteinet (figur 2B).
Perletitreringsanalysen er avgjørende for å bestemme det optimale forholdet mellom perler og protein, slik at mengden streptavidinperler er nok til å berike alle biotinylerte proteiner, men ikke så overdreven for å forårsake alvorlig streptavidinforurensning i LC-MS. Det optimale volumet av perler som trengs for 50 μg inngangsproteinprøve, velges på grunnlag av hvor eksponentiell forfall av kurven slutter (figur 3A) Som vist i figur 3A, ble prikkblotsignaler fra perleproteininkubasjonssupernatanten redusert etter hvert som flere biotinylerte proteiner ble fanget med økte mengder streptavidinperler. For endogene LAMP1-APEX-prøver var 5 μL streptavidinperler optimale for 50 μg inngangsprotein (uthevet i figur 3A). Etter anrikning er mengden protein fanget av streptavidinperlene ukjent. Overflødig proteolytisk enzym (trypsin) kan øke enzym autodigestion, med rikelig trypsin peptid topper i LC-MS. Overdreven trypsin kan også fordøye flere streptavidinpeptider i prøvene. Derfor bør mengden protease som trengs for fordøyelsen av perler optimaliseres. Sammenlignet med trypsin alene, resulterte fordøyelsen på perler med Trypsin / Lys-C-blanding i identifisering av flere proteiner og peptider og færre ubesvarte spaltninger (figur 3B). I tillegg var 1-1,5 μg protease per 250 μL streptavidin magnetiske perler optimale for å oppnå det høyeste antallet identifiserte proteiner og den laveste prosentandelen av ubesvarte spaltninger (figur 3C). Med et optimalt forhold mellom perler og protein, bør samme mengde perler fange samme mengde biotinylerte proteiner. Derfor kan denne optimaliserte proteasemengden brukes til alle eksperimenter som beriker biotinylerte proteiner ved bruk av samme streptavidin magnetiske perler.
Peroksidasebaserte nærhetsmerkingsenzymer aktiveres ved biotin-fenolinkubasjon og kortH2O2-behandling(1 min). Dette trinnet er en viktig kilde til variasjon i nærhetsmerking proteomikk. Vi har tidligere funnet at normalisering til den mest tallrike, endogent biotinylerte karboksylase, PCCA, kan redusere eksperimentelle variasjoner betydelig, noe som gjør det mulig å sammenligne nærhetsmerkingsproteomikkdata på tvers av forskjellige eksperimentelle partier (figur 4) 22. For endogene LAMP1-APEX-nevroner ble foreldrelinjen uten LAMP1-APEX-sondeuttrykk brukt som kontrollgruppe. Kontrollnevroner ble også behandlet med biotin-fenol og H2O2. Fordelingen av proteinforhold for LAMP1-APEX versus kontrollgruppen er illustrert i figur 5A. Alle de endogene biotinylerte karboksylasene ble beriket av streptavidinbelagte perler, men forble uendret. Som vist i GO-termanalysen og proteinnettverksanalysen (figur 5B, C), ble både stabile lysosomale membranproteiner og forbigående lysosomale interaktorer relatert til endolysosomal handel og transport beriket i LAMP1-APEX proteomikk32,33,34.
Figur 1: Generell arbeidsflyt for lysosom nærhetsmerking proteomikk i hiPSC-avledede nevroner. Forkortelser: hiPSC = humanindusert pluripotent stamcelle; LAMP1 = lysosomalt assosiert membranprotein 1; APEX = askorbat peroksidase; dox = doxycyklin; BP = biotin-fenol; DCA = vaskemiddelkompatibel proteinanalyse; SA = streptavidin; LC-MS/MS = væskekromatografi-tandem massespektrometri; PCCA = propionyl-CoA karboksylase, et endogent biotinylert protein. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Mikroskopisk avbildning av hiPSC-avledede nevroner og LAMP1-APEX-aktivitet. (A) Brightfield-mikroskopibilder av forskjellige stadier av hiPSCs og hiPSC-avledede nevroner. (B) Fluorescensavbildning av LAMP1-APEX-aktivitet i nevronet. Biotinylerte signaler farget mot streptavidin kolokaliserer med LAMP1-farging utenfor kjernen (HOECHST). Skala barer = (A) 50 μm, (B) 1 μm. Forkortelser: hiPSC = humanindusert pluripotent stamcelle; LAMP1 = lysosomalt assosiert membranprotein 1; APEX = askorbat peroksidase; SA = streptavidin. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Optimalisering av perler-til-inngang-proteinforhold og enzymatisk proteinfordøyelse kan forbedre proteinidentifikasjoner og redusere interferens . (A) Eksempel på perletitreringsanalyse resultater fra dot-blot-analyse ved bruk av 50 μg inngangsprotein og forskjellige mengder streptavidinperler. (B) Trypsin / Lys-C-blanding resulterte i bedre protein / peptididentifikasjon og færre ubesvarte spaltninger enn trypsin alene. (C) Optimalisering av mengden trypsin/lys-C for fordøyelse av perler. Dette tallet er modifisert fra Frankenfield et al.22. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Normalisering av nærhetsmerking av proteomikkdata til en endogent biotinylert karboksylase, PCCA, kan redusere kvantifiseringsvariasjoner mellom biologiske replikasjoner. Dette tallet er modifisert fra Frankenfield et al.22. Forkortelse: PCCA = propionyl-CoA karboksylase. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Lysosom nærhetsmerking proteomikk beriket lysosomale membranproteiner og lysosomale interagerende proteiner i nevroner. (A) Spredningsplott av protein overflodsforhold av LAMP1-APEX versus ingen APEX-kontroll som viser berikede lysosomale membranproteiner og uendrede endogent biotinylerte proteiner. (B) GO-term analyse av proteomikk resultater som viser beriket cellulær komponent ved lysosomet. (C) STRING proteinnettverksanalyse som viser at proteiner direkte interagerer med agnproteinet (LAMP1), lysosomale membranproteiner og lysosomale interaktorer som membranhandelsproteiner. Dette tallet er modifisert fra Frankenfield et al.22. Forkortelser: LAMP1 = lysosomalt assosiert membranprotein 1; APEX = askorbat peroksidase; GO = gen ontologi. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Middels/buffer | Komponent | Protokoll | ||
| Kjellermembranmatrise (Matrigel) beleggløsning | 1% kjellermembranmatriselager, 99% DMEM/F12 medium | 1.1, 1.2 | ||
| Vitronektin belegg løsning | 5 μg/ml endelig konsentrasjon i PBS | 1.1 | ||
| E8 komplett medium med ROCK-hemmer | 98% E8 medium, 2% E8 supplement, 10 μM Y-27632 eller 50 nM Chroman1 | 1.1 | ||
| Neuron Induksjon medium | 97 % DMEM/F12 med HEPES, 1 % N2-tilskudd, 1 % ikke-essensielle aminosyrer (NEAA), 1 % L-glutamin, 2 μg/ml doksysyklin og ROCK-hemmer (10 μM Y-27632 eller 5 nM Chroman 1) | 1.2 | ||
| Neuron PLO belegg løsning | 0,1 mg/ml poly-L-ornitin (PLO), 100 mM borsyre, 25 mM natriumtetraborat, 75 mM natriumklorid, 1 M natriumhydroksid | 1.3 | ||
| Neuron medium | 98% kortikal nevronmedium, 2% B27 supplement, 10 ng / ml hjerneavledet nevrotrofisk faktor (BDNF), 10 ng / ml glial-avledet nevrotrofisk faktor (GDNF), 10 ng / ml NT-3, 0,2 μg / ml Laminin, 2 μg / ml doxycyklin | 1.3 | ||
| Slukket buffer | 10 mM natriumazid, 10 mM natriumaskorbat, 5 mM TROLOX i PBS | 2.2 | ||
| Buffer for cellelyse | 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0,2% SDS, 1% Triton, 1 mM Tris(2-karboksyetyl)fosfinhydroklorid (TCEP), 10 mM natriumazid, 10 mM natriumaskorbat, 5 mM TROLOX, proteasehemmer cocktail | 2.3 | ||
| TBS-T | 0,05 % Tween20, 20 mM Tris, 150 mM NaCl (pH 7,5) | 4.2 | ||
| Buffer A | SDS-buffer på 2 % | 5.2 | ||
| Buffer B | 50 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 2% Triton-X | 5.6 | ||
| Buffer C | 50 mM Tris-HCl, 250 mM NaCl, 0,5% SDS, 0,5% Triton-X | 5.6 | ||
| Buffer D | 2 m urea, 50 mM Tris-HCl | 5.6 | ||
Tabell 1: Komposisjoner av medier og buffere brukt i denne protokollen.
| Problem | Protokoll | Løsning/forslag | ||||
| iPSC kultur peeling av platen | 1.1 | Øk vitronektinbeleggkonsentrasjonen eller tiden. | ||||
| Noen iPSC-er differensierte ikke til nevroner | 1.2 | Øk behandlingstiden for celleoppløsningsløsning for å fullstendig dissosiere iPSC-er under d0-differensiering. | ||||
| Neuron kultur peeling av platen | 1.3 | Vasking og bytte av medium må være forsiktig og fra sideveggen på platen. | ||||
| Proteiner oppløses ikke helt etter acetonutfelling | 2.7 | Reduser tørketiden til proteinpelleten. Øk volumet av lysisbuffer og sonikat kort for å hjelpe oppløsning. | ||||
| Svake streptavidinfargingssignaler | 3 | Øk H2O2behandlingstiden til 2-3 s og virvle platen for jevn fordeling. | ||||
| Lavt signal om perler titreringsanalyse | 4.2 | Vent til membranen er helt tørket og tilsett mer supernatant på samme sted (kan gjentas opptil 3x) for å øke signalintensiteten. | ||||
| Magnetiske perler som ikke pellerer mot magnetisk stativ | 5 | Magnetisk perlemobilitet reduseres i buffer som inneholder ikke-vaskemiddel. Høyere ureakonsentrasjon opp til 4 M eller LC-MS-kompatibelt vaskemiddel kan brukes i vaskebuffer D. | ||||
| Tap av magnetiske perler under vask av perler | 5 | Øk ventetiden når prøverør plasseres på magnetperlene (1 min eller lenger) før du tar supernatant fra rørene. | ||||
| Enkeltladede forurensningstopper i LC-MS | 6 | Peptidopprydding ikke tilstrekkelig. Øk vaskevolum og tider under peptid avsalting. | ||||
| Peptidanalyse lavt signal | 7 | Resuspender peptidprøver i lavere volum for å øke peptidkonsentrasjonen. | ||||
| Overveldende streptavidinsignaler i LC-MS | 8 | Reduser mengden streptavidinperler. Hvis trypsin peak er også rikelig, redusere trypsin mengden. | ||||
| For mange ikke-spesifikke merkingsbakgrunn | 9 | Streptavidin perler vask var ikke tilstrekkelig. Fjern all gjenværende væske under hvert vasketrinn. Øk tiden og volumet for vask av perler. | ||||
Tabell 2: Feilsøking av problemer og løsninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved hjelp av denne LAMP1-APEX-sonden blir proteiner på og nær den lysosomale membranen biotinylert og beriket. Gitt den typiske lysosomdiameteren på 100-1,200 nm, gir denne metoden utmerket intracellulær oppløsning med en 10-20 nm merkingsradius. LAMP1 er et rikelig lysosomalt membranprotein og en klassisk markør for lysosomer, som fungerer som et utmerket agnprotein for lysosomal APEX-merking på endogent uttrykksnivå. Imidlertid eksisterer det også begrensninger ved bruk av LAMP1 for å målrette lysosomer, da LAMP1 også er tilstede i sene endosomer og ikke-nedbrytende lysosomer35. De fleste lysosomale markører uttrykkes også i sene endosomer, som til slutt modnes til lysosomer. Alternative agnproteiner for å målrette lysosomer er LAMPTOR, LAMP2 og TMEM19235,36,37. Det er viktig å merke seg at reaktive biotinradikaler ikke trenger inn i membranen. Derfor fanges de fleste lysosomale lumenproteiner ikke opp i denne LAMP1-APEX proteomikkmetoden. Lysosomale lumenproteiner kan oppnås ved lysosomal isolasjon via den tradisjonelle gradientsentrifugeringsmetoden eller lysosomal immunrensing 4,38. Imidlertid kan proteiner på lysosomal membran forstyrres under lysosomal isolasjon og miste informasjonen for forbigående og dynamiske lysosomale interaksjoner. Derfor kan lysosomal nærhetsmerking og lysosomal isolasjon kombineres for å få et komplett øyeblikksbilde av lysosomale aktiviteter både utenfor og inne i lysosomer.
For å minimere variabiliteten fra iPSC-nevronkulturen, må nevronbeleggstettheten være konsistent på tvers av alle biologiske replikasjoner og sammenligningsgrupper. De samme nivåene av nevronmodning og helse er også kritiske av denne grunn. Under APEX-aktivering må biotin-fenol og H2O2-tilsetning til cellene utføres ved tidligere blanding med varmt kulturmedium og deretter tilsette blandingen til cellene, etterfulgt av umiddelbar, mild risting for å sikre jevn fordeling. Bruken av H 2 O2reiser også bekymringer om oksidativt stress og forstyrrelser i cellens dynamiske mikromiljø. Selv om det ikke ble funnet signifikante endringer på proteinets overflodsnivå, ble flere peptider modifisert med metioninoksidasjon i H 2 O 2-behandlede versus kontrollneuroner22. Derfor er streng kontroll av H 2 O2-aktiveringstiden (1 min) avgjørende for å minimere oksidativt stress og redusere diffusjonen av biotinsky for å sikre en spesifikk merkingsradius rundt agnproteinet.
For ikke-polariserte cellelinjer som HEK og U2OS, kan celler høstes ved å pelletere etter nærhetsmerking for å fjerne supernatanten som inneholder fri biotin. Imidlertid må nevroner høstes ved direkte å legge cellelysebuffer til platen og skrape inn i rør for å unngå nevrittskader og prøvetap under pelletering. Tilstedeværelsen av fri biotin kan mette streptavidinperlene. Fullstendig fjerning av fritt biotin kan oppnås ved flere vasker og inkubasjon med slukkebuffer i nevroner og/eller proteinutfelling etter cellelyse. Siden forskjellige agnproteiner har forskjellige uttrykksnivåer, må det utføres en dot blot-analyse for hver nye APEX-sonde. Når det optimale perler / proteinforholdet er bestemt, bør mengden startprotein- og perlevolum være konsistent for alle replikasjoner for samme APEX-sonde. Ved sammenligning av forskjellige prober, som LAMP1-APEX versus cytosolic-APEX, anbefales det å bruke samme volum av perler, men variere mengden startprotein for å gjenspeile de optimale perlene / proteinforholdene for forskjellige APEX-prober. For ytterligere å redusere eksperimentelle variasjoner og øke gjennomstrømningen, kan stabil isotopmerking av aminosyrer i cellekultur (SILAC) utføres39. Multiplekset isobarisk merking kan også brukes til kjemisk merking av peptider etter proteinfordøyelse via TMT / iTRAQ / DiLeu-koder 20,40,41,42.
Nærhetsmerking har blitt mye brukt for å fange det cellulære og molekylære mikromiljøet i forskjellige organismer43. Imidlertid står nærhetsmerking fortsatt overfor mange tekniske utfordringer, for eksempel forurensning fra streptavidinsignaler, bruk av hydrogenperoksid for enzymaktivering og tilstedeværelsen av endogent biotinylerte mitokondrielle karboksylaser. Derfor krever nærhetsmerking proteomiske eksperimenter nøye planlegging og kvalitetskontroll. For å hjelpe forskere med å feilsøke eksperimentet med nærhetsmerking, gir vi en kort veiledning for vanlige problemer og løsninger i tabell 2. Nylig ble det utviklet en spaltbar nærhetsmerkingsmetode ved bruk av tiolspaltbar biotin25. Biotinylerte proteiner kan derfor spaltes av perler ved hjelp av et reduserende reagens som TCEP uten behov for fordøyelse på perler. Denne spaltbare biotinmetoden kan dramatisk redusere interferenssignaler fra streptavidin, endogent biotinylerte karboksylaser og ikke-spesifikk binding. Pågående innsats vil bruke denne spaltbare biotinmetoden til LAMP1-APEX proteomikk for å forbedre merkingsspesifisitet og nøyaktighet. Nærhetsmerkingssonder kan også utformes for å målrette mot andre subcellulære rom44. Mengden og typen proteiner som er identifisert, er avhengig av agnproteinets natur, dets intracellulære miljø og ekspresjonsnivået til nærhetsmerkingssonden. Denne endogene LAMP1-APEX proteomikkmetoden gir et verdifullt verktøy for å studere den dynamiske lysosomale aktiviteten i humane nevroner. Den detaljerte protokoll- og metodeoptimaliseringen gjelder også for andre nærhetsmerkingssonder og kjemisk biotinylering, og fungerer som en nyttig ressurs for proteomikksamfunnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Denne studien støttes av NIH-stipendet (R01NS121608). AMF anerkjenner ARCS-Metro Washington Chapter Scholarship og Bourbon F. Scribner Endowment Fellowship. Vi takker Michael Ward-laboratoriet ved National Institute for Neurological Disorders and Stroke (NINDS) for molekylærbiologisk støtte og i3Neuron-teknologiutviklingen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% (w/v) Saponin solution | Acros Organics | 419231000 | Flourescent Microscopy |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | cell detachment solution, Cell Culture |
| B27 Supplement | Fisher Scientific | 17504044 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| BDNF | PeproTech | 450-02 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A8806 | To make standard solutions to measure total protein concentrations |
| Brainphys neuronal medium | STEMCELL Technologies | 5790 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| CD45R (B220) Antibody Alexa Fluor 561 | Thermo Fisher Scientific | 505-0452-82 | Flourescent Microscopy |
| Chroman1 ROCK inhibitor | Tocris | 716310 | Cell Culture |
| cOmplete mini Protease Inhibitor | Roche | 4693123001 | cocktail inhibitor in Lysis Buffer |
| DC Protein Assay Kit II | Bio-Rad | 5000112 | To determine total protein concentrations of cell lysate |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | Proximity-labeling Reaction |
| DMEM/F12 medium | Thermo Fisher Scientific | 11320082 | Cell Culture, Dish Coating |
| DMEM/F12 medium with HEPES | Thermo Fisher Scientific | 11330057 | Cell Culture, Induction Medium |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | Flourescent Microscopy |
| Doxycycline hyclate, ≥98% (HPLC) | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Cell Culture, Induction Medium |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Cell Culture |
| Essential 8 Supplement (50x) | Thermo Fisher Scientific | A1517101 | Cell Culture |
| Extraction plate vacuum manifold kit | Waters | WAT097944 | For Peptide desalting |
| Formic Acid (FA) | Fisher Scientific | A11750 | For LC-MS analysis |
| GDNF | PeproTech | 450-10 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Hoechst dye | Thermo Fisher Scientific | 62239 | Flourescent Microscopy |
| HPLC grade methanol | Fisher Scientific | A452 | For Peptide desalting |
| HPLC grade water | Fisher Scientific | W5 | For Peptide desalting |
| Human induced pluripotent stem cells | Corriell Institute | GM25256 | Cell Culture |
| Hydrogen peroxide, ACS, 29-32% w/w aq. soln., stab. | Thermo Fisher Scientific | AA33323AD | Proximity-labeling Reaction |
| Iodoacetamide (IAA) | Millipore Sigma | I6125 | For Protein Digestion |
| Laminin | Fisher Scientific | 23017015 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| LC-MS grade Acetonitrile | Fisher Scientific | A955 | For LC-MS analysis |
| LC-MS grade water | Fisher Scientific | W64 | For LC-MS analysis |
| L-glutamine | Fisher Scientific | 25-030-081 | Cell Culture, Induction Medium |
| Matrigel | Thermo Fisher Scientific | 08-774-552 | basement membrane matrix, Cell Culture, Dish Coating |
| Mouse anti-human LAMP1 monoclonal antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | h4a3 | Flourescent Microscopy |
| N-2 Supplement (100x) | Fisher Scientific | 17-502-048 | Cell Culture, Induction Medium |
| Nitrocellulose Membrane, Precut, 0.45 µm, 7 x 8.5 cm | Bio-Rad | 1620145 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Non-essential amino acids (NEAA) | Fisher Scientific | 11-140-050 | Cell Culture, Induction Medium |
| NT-3 | PeproTech | 450-03 | Cell Culture, Cortical Neuron Medium |
| Oasis HLB 96-well solid phase extraction plate | Waters | 186000309 | For Peptide desalting |
| Odyssey Blocking Buffer (TBS) | LI-COR Biosciences | 927-50000 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Flourescent Microscopy |
| Phenol Biotin (1,000x stock) | Adipogen | 41994-02-9 | Proximity-labeling Reaction |
| Phosphate-buffered saline (PBS) without calcium or magnesium | Gibco | 10010049 | Cell Culture, Proximity-labeling Reaction, Flourescent Microscopy |
| Pierce Quantitative Colorimetric Peptide Assay | Thermo Fisher | 23275 | Peptide Concentration Assay |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Millipore Sigma | P3655 | Cell Culture, Dish Coating |
| Sodium Ascorbate | Sigma-Aldrich | A4034 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S8032 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer, Flourescent Microscopy |
| Sodium chloride | Thermo Fisher Scientific | S271500 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher Scientific | BP1311220 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 415413 | Cell Culture, Borate Buffer |
| Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732 | Cell Culture, Borate Buffer |
| SpeedVac concentrator | vacuum concentrator | ||
| Streptavidin Magnetic Sepharose Beads | Cytiva (formal GE) | 28-9857-99 | Enrich biotinylated proteins |
| Streptavidin, Alexa Fluor 680 Conjugate | Thermo Fisher Scientific | S32358 | To conduct dot blot assay for bead titration |
| Thermomixer | temperature-controlled mixer | ||
| Trifluoacetic acid (TFA) | Millipore Sigma | 302031 | For Peptide desalting |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Millipore Sigma | C4706 | For Protein Digestion |
| Tris-HCl | Thermo Fisher Scientific | BP152500 | Lysis Buffer, Dot blot assay buffer, Beads wash buffer |
| Triton-X | Thermo Fisher Scientific | BP151500 | Beads wash buffer |
| TROLOX | Sigma-Aldrich | 648471 | Proximity-Labeling Quench Buffer, Lysis Buffer |
| Trypsin/Lys-C Mix, Mass Spec Grade | Promega | V5073 | For Protein Digestion |
| TWEEN 20 | Millipore Sigma | P1379 | Dot blot assay buffer |
| Urea | Thermo Fisher Scientific | BP169500 | Beads wash and On-Beads Digestion Buffer |
| Vitronectin | STEMCELL Technologies | 7180 | Cell Culture, Dish Coating |
| Y-27632 ROCK inhibitor | Selleck | S1049 | Cell Culture |
References
- De Duve, C., Wattiaux, R.
- Ballabio, A., Bonifacino, J. S. Lysosomes as dynamic regulators of cell and organismal homeostasis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (2), 101-118 (2020).
- Lawrence, R. E., Zoncu, R. The lysosome as a cellular centre for signalling, metabolism and quality control. Nature Cell Biology. 21 (2), 133-142 (2019).
- Schröder, B. A., Wrocklage, C., Hasilik, A., Saftig, P.
- Lie, P. P. Y., Nixon, R. A. Lysosome trafficking and signaling in health and neurodegenerative diseases. Neurobiology of Disease. 122, 94-105 (2019).
- Leeman, D. S., et al. Lysosome activation clears aggregates and enhances quiescent neural stem cell activation during aging. Science. 359 (6381), 1277-1283 (2018).
- Wallings, R. L., Humble, S. W., Ward, M. E., Wade-Martins, R. Lysosomal dysfunction at the centre of Parkinson's disease and frontotemporal dementia/amyotrophic lateral sclerosis. Trends in Neurosciences. 42 (12), 899-912 (2019).
- Ferguson, S. M.
- Rost, B. R., et al. Optogenetic acidification of synaptic vesicles and lysosomes. Nature Neuroscience. 18 (12), 1845-1852 (2015).
- Liao, Y. C., et al. RNA granules hitchhike on lysosomes for long-distance transport, using annexin A11 as a molecular tether. Cell. 179 (1), 147-164 (2019).
- Kuijpers, M., et al. Neuronal autophagy regulates presynaptic neurotransmission by controlling the axonal endoplasmic reticulum. Neuron. 109 (2), 299-313 (2021).
- Lu, J., et al. Generation of serotonin neurons from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 34 (1), 89-94 (2016).
- Dolmetsch, R., Geschwind, D. H. The human brain in a dish: The promise of iPSC-derived neurons. Cell. 145 (6), 831-834 (2011).
- Wang, C., et al. Scalable production of iPSC-derived human neurons to identify tau-lowering compounds by high-content screening. Stem Cell Reports. 9 (4), 1221-1233 (2017).
- Fernandopulle, M. S., et al. Transcription factor-mediated differentiation of human iPSCs into neurons. Current Protocols in Cell Biology. 79 (1), 1-48 (2018).
- Sunbul, M., Andres, J. Proximity labeling: Methods and protocols. , Humana Press. (2019).
- Lam, S. S., et al. Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling. Nature methods. 12 (1), 51-54 (2015).
- Rhee, H. W., et al. Proteomic mapping of mitochondria in living cells via spatially restricted enzymatic tagging. Science. 339 (6125), 1328-1331 (2013).
- Lobingier, B. T., et al. An approach to spatiotemporally resolve protein interaction networks in living cells. Cell. 169 (2), 350-360 (2017).
- Paek, J., et al. Multidimensional tracking of GPCR signaling via peroxidase-catalyzed proximity labeling. Cell. 169 (2), 338-349 (2017).
- Fazal, F. M., et al. Atlas of subcellular RNA localization revealed by APEX-Seq. Cell. 178 (2), 473-490 (2019).
- Frankenfield, A. M., Fernandopulle, M. S., Hasan, S., Ward, M. E., Hao, L. Development and comparative evaluation of endolysosomal proximity labeling-based proteomic methods in human iPSC-derived neurons. Analytical Chemistry. 92 (23), 15437-15444 (2020).
- Li, J., Pfeffer, S. R. Lysosomal membrane glycoproteins bind cholesterol and contribute to lysosomal cholesterol export. eLife. 5, 21635 (2016).
- Chen, Y., et al. A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells. Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).
- Li, H., Frankenfield, A. M., Houston, R., Sekine, S., Hao, L. Thiol-cleavable biotin for chemical and enzymatic biotinylation and its application to mitochondrial TurboID proteomics. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 32 (9), 2358-2365 (2021).
- Li, H., et al. Integrated proteomic and metabolomic analyses of the mitochondrial neurodegenerative disease MELAS. Molecular Omics. 18 (3), 196-205 (2022).
- Cox, J., Mann, M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification. Nature Biotechnology. 26 (12), 1367-1372 (2008).
- Kong, A. T., Leprevost, F. V., Avtonomov, D. M., Mellacheruvu, D., Nesvizhskii, A. I. MSFragger: Ultrafast and comprehensive peptide identification in mass spectrometry-based proteomics. Nature Methods. 14 (5), 513-520 (2017).
- Frankenfield, A. M., Ni, J., Ahmed, M., Hao, L. How do protein contaminants influence DDA and DIA proteomics. bioRxiv. , (2022).
- Kuleshov, M. V., et al. Enrichr: A comprehensive gene set enrichment analysis web server 2016 update. Nucleic Acids Research. 44, 90-97 (2016).
- Szklarczyk, D., et al. STRING v11: Protein-protein association networks with increased coverage, supporting functional discovery in genome-wide experimental datasets. Nucleic Acids Research. 47, 607-613 (2019).
- Kissing, S., et al. Disruption of the vacuolar-type H+-ATPase complex in liver causes MTORC1-independent accumulation of autophagic vacuoles and lysosomes. Autophagy. 13 (4), 670-685 (2017).
- kleine Balderhaar, H. J., Ungermann, C. CORVET and HOPS tethering complexes - coordinators of endosome and lysosome fusion. Journal of Cell Science. 126 (6), 1307-1316 (2013).
- Zhang, M., Chen, L., Wang, S., Wang, T. Rab7: Roles in membrane trafficking and disease. Bioscience Reports. 29 (3), 193-209 (2009).
- Cheng, X. T., et al. Characterization of LAMP1-labeled nondegradative lysosomal and endocytic compartments in neurons. Journal of Cell Biology. 217 (9), 3127-3139 (2018).
- Eskelinen, E. -L. Roles of LAMP-1 and LAMP-2 in lysosome biogenesis and autophagy. Molecular Aspects of Medicine. 27 (5-6), 495-502 (2006).
- Sancak, Y., et al. Ragulator-rag complex targets mTORC1 to the lysosomal surface and is necessary for its activation by amino acids. Cell. 141 (2), 290-303 (2010).
- Abu-Remaileh, M., et al. Lysosomal metabolomics reveals V-ATPase- and mTOR-dependent regulation of amino acid efflux from lysosomes. Science. 358 (6364), 807-813 (2017).
- Ong, S. E., et al. Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
- Tao, W. A., Aebersold, R. Advances in quantitative proteomics via stable isotope tagging and mass spectrometry. Current Opinion in Biotechnology. 14 (1), 110-118 (2003).
- Hao, L., et al. Quantitative proteomic analysis of a genetically induced prostate inflammation mouse model via custom 4-plex DiLeu isobaric labeling. American Journal of Physiology - Renal Physiology. 316 (6), 1236-1243 (2019).
- Thompson, A., et al. Tandem mass tags: A novel quantification strategy for comparative analysis of complex protein mixtures by MS/MS. Analytical Chemistry. 75 (8), 1895-1904 (2003).
- Qin, W., Cho, K. F., Cavanagh, P. E., Ting, A. Y. Deciphering molecular interactions by proximity labeling. Nature Methods. 18, 133-143 (2021).
- Go, C. D., et al. A proximity-dependent biotinylation map of a human cell. Nature. 595 (7865), 120-124 (2021).
