Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך לביצוע כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל פלואורסצנטי (FSEC) על חלבוני ממברנה כדי להעריך את איכותם לניתוח פונקציונלי ומבני במורד הזרם. מוצגות תוצאות FSEC מייצגות שנאספו עבור מספר קולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) בתנאים מסיסים בדטרגנטים וללא חומרי ניקוי.
Abstract
במהלך הבהרה מבנית של חלבון ממברנה ואפיון ביופיזיקלי, מקובל לנסות מבנים חלבוניים רבים המכילים תגים שונים, חתכים, מחיקות, החדרות שותפי היתוך ומוטציות מייצבות כדי למצוא אחד שאינו מצטבר לאחר מיצוי מהממברנה. יתר על כן, בדיקת חיץ כדי לקבוע את חומר הניקוי, התוסף, הליגנד או הפולימר המספק את המצב המייצב ביותר עבור חלבון הממברנה היא פרקטיקה חשובה. האפיון המוקדם של איכות חלבון הממברנה על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל פלואורסצנטי מספק כלי רב עוצמה להעריך ולדרג מבנים או תנאים שונים ללא צורך בטיהור חלבונים, וכלי זה גם ממזער את דרישת הדגימה. חלבוני הממברנה חייבים להיות מתויגים באופן פלואורסצנטי, בדרך כלל על ידי ביטוי שלהם עם תג GFP או דומה. ניתן להמיס את החלבון ישירות מתאים שלמים ולאחר מכן להבהיר אותו בצורה גסה באמצעות צנטריפוגה; לאחר מכן, החלבון מועבר במורד עמודת אי הכללת גודל, ועקבות פלואורסצנטיות נאספות. כאן מוצגת שיטה להפעלת FSEC ונתוני FSEC מייצגים על מטרות GPCR קולטן ספינגוזין-1-פוספט (S1PR1) וקולטן סרוטונין (5HT2AR).
Introduction
כרומטוגרפיית אי הכללת גודל (SEC), הידועה גם בשם כרומטוגרפיית סינון ג'ל, משמשת בדרך כלל במדעי החלבונים1. במהלך SEC, חלבונים מופרדים בהתבסס על הרדיוס ההידרודינמי שלהם, שהוא פונקציה של גודל החלבון וצורתו2. בקצרה, הפרדה זו מושגת על ידי יישום דגימות החלבון תחת זרימה על מצע ארוז של חרוזים נקבוביים הפועלים כמסננת מולקולרית. החרוזים המשמשים הם לעתים קרובות צולבים עם טווח מוגדר של גדלי נקבוביות כדי לאפשר לחלבונים להיכנס או להיות מחוץ לנקבוביות החרוזים 3,4,5,6,7. חלבונים בעלי רדיוסים הידרודינמיים קטנים יותר מבלים חלק גדול יותר של זמן בתוך הנקבוביות, ולכן זורמים דרך המיטה הארוזה בקצב איטי יותר, בעוד שחלבונים גדולים יותר מבלים חלק גדול יותר מהזמן מחוץ לחרוזים (הנפח המוחרג) ונעים דרך המיטה הארוזה בקצב מהיר יותר. SEC יכול לשמש כשלב טיהור חלבון כאשר נעשה שימוש בטור הכנה1. כאשר נעשה שימוש בעמודה אנליטית, ניתן להשתמש ב-SEC כדי לנתח את איכות החלבון ותכונותיו2. לדוגמה, צברי חלבונים שעשויים להימצא בדגימה ולהצביע על חלבון באיכות ירודה נוטים להיות גדולים מאוד, כלומר הם נעים רק בנפח המוחרג, ולכן הם מדוללים מהעמודה בנקודה המוקדמת ביותר; אמצעי אחסון זה מכונה אמצעי אחסון ריק או ריק עמודה. יתר על כן, ניתן להשתמש בתקני משקל מולקולרי כדי לכייל את העמודה, מה שמאפשר אינטרפולציה של משקל מולקולרי משוער של החלבון המעניין מעקומה סטנדרטית.
בדרך כלל, ספיגת החלבון ב-280 ננומטר משמשת לניטור פליטת החלבון מעמודת אי הכללת גודל. זה מגביל את השימוש ב-SEC ככלי ניתוח עד שהחלבון המעניין יהיה נקי במידה רבה מחלבונים מזהמים, למשל, בשלב האחרון של טיהור החלבון. עם זאת, SEC פלואורסצנטי (FSEC) משתמש בחלבון בעל עניין המסומן באופן פלואורסצנטי. לכן, אות פלואורסצנטי יכול לשמש כדי לפקח באופן ספציפי על eution של חלבון עניין בנוכחות חלבונים אחרים או אפילו תערובות גסות 8,9. יתר על כן, מכיוון שאותות פלואורסצנטיים רגישים מאוד, ניתן לבצע ניתוח מוצלח על דגימות עם כמויות חלבון נמוכות במיוחד. החלבון המעניין מסומן לעתים קרובות באופן פלואורסצנטי על ידי הכללת חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) או תג GFP משופר (eGFP) במבנה הביטוי. לאחר מכן ניתן לנטר את האות הפלואורסצנטי על ידי עירור ב 395 ננומטר או 488 ננומטר וזיהוי הפליטה הפלואורסצנטית ב 509 ננומטר או 507 ננומטר עבור GFP או eGFP, בהתאמה10.
היתרון של שימוש באות פלואורסצנטי לניטור פליטת חלבונים מעמודת SEC הופך את FSEC לכלי רב ערך לניתוח דגימות חלבון ממברנות כאשר רמות הביטוי נמוכות במיוחד בהשוואה לחלבונים מסיסים. באופן מכריע, ניתן לנתח את האיכות והתכונות של חלבוני הממברנה ישירות לאחר המסיסות מליזטים גולמיים ללא צורך לייעל את תהליך הטיהור תחילה11,12. מסיבות אלה, FSEC יכול לשמש לניתוח מהיר של איכות חלבון הממברנה תוך בחינת הגורמים השונים שעשויים להידרש כדי לשפר את ההתנהגות של חלבון הממברנה בתמיסה. לדוגמה, מקובל לנסות מבנים רבים המכילים תגים שונים, חיתוכים, מחיקות, החדרות שותפי היתוך ומוטציות מייצבות כדי למצוא מבנה שאינו מצטבר לאחר חילוץ מהממברנה13,14. יתר על כן, בדיקת חיץ לקביעת חומר הניקוי, התוסף, הליגנד או הפולימר המספק את המצב המייצב ביותר עבור חלבון הממברנה יכולה להגדיר את הרכב החיץ הטוב ביותר לטיהור חלבונים או למתן יציבות לשימושים במורד הזרם, כגון בדיקות ביופיזיות או אפיון מבני.
לפיכך, המטרה הכוללת של שיטת FSEC היא לאסוף פרופיל אלוציה של עמודת SEC עבור חלבון קרום המטרה המעניין. יתר על כן, כאשר נעשה שימוש בפלואורסצנטיות, עקבות SEC אלה נאספות בנקודה המוקדמת ביותר האפשרית באופטימיזציה של המבנים והתנאים לפני כל טיהור ממושך. מעקב FSEC יכול לשמש ככלי השוואתי כדי לשפוט את הסבירות להצלחה של טיהור חלבון ממברנה עם תנאי חיץ שונים או מבנים חלבון הממברנה. בדרך זו, אוסף פרופילי FSEC יכול לשמש כתהליך איטרטיבי מהיר כדי להגיע לתכנון מבנה אופטימלי והרכב חיץ לפני ההשקעה מאמץ לייצר את כמויות החלבון הטהור הדרושות לשיטות ניתוח אחרות.
Protocol
1. חומרי ניקוי והכנת חיץ עבור FSEC
- הכינו תמיסת מלאי חומרי ניקוי.
- להכנת תמיסת מלאי של 20 מ"ל, שקלו 4 גרם אבקת דודציל מלטוזיד (DDM) ו-0.4 גרם אבקת כולסטריל המיסוקצינאט (CHS), והגיעו ל-20 מ"ל עם H2O מזוקק ברמת מעבדה.
- לאחר הוספת כל הרכיבים, יש לערבב עם היפוך מקצה לקצה ב-4°C עד שהרכיבים מסיסים לחלוטין. מומלץ לערבב לילה מקצה לקצה ב-4°C.
- יש להצטייד ולאחסן את מלאי חומרי הניקוי בטמפרטורה של -20°C עד לשימוש. אם יש צורך להשתמש במלאי באופן מיידי, אחסנו את חומר הניקוי על קרח.
הערה: מלאי חומרי הניקוי הסטנדרטי ששימש בעבודה זו היה תערובת CHS של 20% (w/v) DDM ו-2% (w/v) CHS (ראה טבלת חומרים). ניתן להשתמש בדטרגנטים שונים (למשל, לאוריל מלטוז נאופנטיל גליקול; LMNG), או ניתן לבדוק את השימוש במיצוי ללא חומרי ניקוי עם פולימרים כגון חומצה סטירן-מאלית (SMA). זה צריך להיות מוכרע בעת תכנון תנאי הניסוי להיבדק.
- הכינו מאגר מסיסות.
- הכינו חיץ מסיסות על ידי שילוב המשקל או הנפח הנכון של הרכיבים כדי להשיג ריכוז סופי של 100 mM HEPES, 200 mM NaCl, 20% (v/v) גליצרול וקוקטייל מעכב פרוטאז 1x (ראו טבלת חומרים) בכד.
הערה: במחקר הנוכחי, הכנת 50 מ"ל של חיץ מסיסות הספיקה לעיבוד חמש דגימות. - הוסף נפח 0.7 (למשל, 35 מ"ל אם מייצרים 50 מ"ל חיץ) של H2O מזוקק ברמת מעבדה לכד.
- ערבבו על מערבל מגנטי, ובאמצעות מד pH, התאימו את רמת החומציות של החיץ ל-7.5 על ידי תוספת טיפתית של NaOH מרוכז.
- באמצעות גליל מדידה, טען את המאגר לנפח הסופי הנדרש ב- H2O מזוקק ברמת מעבדה.
- הכינו חיץ מסיסות על ידי שילוב המשקל או הנפח הנכון של הרכיבים כדי להשיג ריכוז סופי של 100 mM HEPES, 200 mM NaCl, 20% (v/v) גליצרול וקוקטייל מעכב פרוטאז 1x (ראו טבלת חומרים) בכד.
- הכן את מאגר ההפעלה של ה- SEC.
- הכן את מאגר ההפעלה של SEC על ידי שילוב המשקל או הנפח הנכון של הרכיבים כדי להשיג ריכוז סופי של 100 mM HEPES, 150 mM NaCl ו- 10% (v/v) גליצרול בכד.
הערה: במחקר הנוכחי, הכנת 600 מ"ל של חיץ SEC הספיקה להפעלת חמש דגימות. - הוסף נפח 0.7 (למשל, 420 מ"ל אם מייצרים 600 מ"ל של חיץ) של H2O מזוקק ברמת מעבדה לכד.
- ערבבו על מערבל מגנטי, ובאמצעות מד pH, התאימו את רמת החומציות של החיץ ל-7.5 על ידי תוספת טיפתית של NaOH מרוכז.
- באמצעות גליל מדידה, טען את המאגר לנפח הסופי הנדרש ב- H2O מזוקק ברמת מעבדה.
- סנן את מאגר ה- SEC דרך מסנן נקבוביות 0.45 מיקרומטר בעל ראש בקבוק מתחת לוואקום (ראה טבלת חומרים).
- לאחר שהמאגר עבר דרך המסנן, נטרל אותו על ידי השארתו מתחת לוואקום עד שלא יופיעו עוד בועות בעת ניעור.
- הוסף ריכוז סופי של 0.03% (w/v) DDM ו- 0.003% (w/v) CHS למאגר ה- SEC על-ידי הוספת הנפח הנדרש של מלאי חומרי הניקוי שהוכן בשלב 1 (לדוגמה, 0.9 מ"ל אם מייצרים 600 מ"ל של מאגר SEC).
- יש לקרר מראש את החיץ לפני השימוש.
הערה: ניתן להשתמש במאגרים שונים בהתאם לתנאים שנבדקו. לדוגמה, אם בודקים את ההשפעה של דטרגנטים שונים על החלבון המעניין, יהיה צורך ליצור חיץ עם אותו חומר ניקוי כמו זה המשמש למסיסה של החלבון. אם בודקים תנאים נטולי חומרי ניקוי עם SMA, יש להשמיט לחלוטין את חומר הניקוי ממאגר ה-SEC. עם זאת, עיין בסעיף הדיון לקבלת פרטים נוספים על שינויים בפרוטוקול לבדיקת חומרי ניקוי.
- הכן את מאגר ההפעלה של SEC על ידי שילוב המשקל או הנפח הנכון של הרכיבים כדי להשיג ריכוז סופי של 100 mM HEPES, 150 mM NaCl ו- 10% (v/v) גליצרול בכד.
2. הכנת מדגם ל- FSEC
- הכינו את כדורי התא.
הערה: נקודת המוצא לבדיקה היא קצירת גלולת התא מתרבית ביטוי תאי תרחיף של חלבון מעניין אחר המתויג GFP (או חלבון אחר המסומן פלואורסצנטית). העיתוי והתנאים המדויקים לקציר יהיו תלויים בחלבון המתבטא, בקו התא שבו משתמשים, בתנאים שבהם התאים שגדלו ובשיטה שבה ביטוי החלבונים הושרה. פרטים אלה חורגים מתחום פרוטוקול זה. במחקר זה, 0.5-1 גרם של גלולת תא Sf21 שימש לכל מצב להיבדק, המקביל 25-50 מ"ל של תרבית 2-3 ימים לאחר ההדבקה עם כ 4 x 106 תאים קיימא / מ"ל של דילול 1:20 של P2 baculovirus. שים לב שהפרוטוקול המתואר כאן נבדק ונמצא שהוא עובד באותה מידה עם משקלים רטובים דומים של כדורי תאים מקווי תאים אאוקריוטים אחרים (למשל, HEK293E).- כאשר התאים מתרביות התרחיף מוכנים לקציר, להעביר 25-50 מ"ל תרבית aliquots 50 מ"ל צינורות חרוטיים.
- אזנו את הצינורות, והשתמשו בצנטריפוגה על ספסל בדלי מתנדנד החוצה (ראו טבלת חומרים) במהירות של 2,000 x גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר כדי לכופף את התאים.
- הסר והשליך את הסופרנאטנט של התרבית על ידי הטייה עדינה שלו, או השתמש בצינור 50 מ"ל עם מילוי פיפט אם גלולת התא רופפת במיוחד.
- אם התאים ישמשו מיד לניתוח, הניחו את גלולת התא על קרח, והמשיכו ישירות לשלב 5. אם רוצים לשמור את התאים לשימוש בשלב מאוחר יותר, הקפיאו את התאים על ידי מיקומם בטמפרטורה של -80°C.
- אם גלולת התא אוחסנה בטמפרטורה של -80°C, הפשירו אותה במהירות על ידי דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות או עד שהדגימה כבר לא קפואה. העבר את הדגימה מיד לקרח לאחר שלב זה.
- השהה מחדש והמיס את הדגימה.
- הוסף 2 מ"ל של מאגר המסיסות (שלב 1.2) לכדורית התא.
- יש לדגור עם היפוך מקצה לקצה ב-4°C למשך 15-30 דקות עד לקבלת מרקם הומוגני.
- הוסף חומר ניקוי מעורבב מראש (שלב 1.1) (למשל, 100 μL של 20% DDM / 2% CHS מלאי) לקבלת ריכוז סופי של 1% DDM / 0.1% CHS.
- מסיס למשך 30 דקות עם היפוך מקצה לקצה ב-4°C.
הערה: במידת הצורך, ניתן לבדוק מספר תנאים במקביל. מספר הדגימות המקבילות שניתן לעבד בבת אחת יהיה תלוי במערכת הזמינה להפעלת ניסוי ה- SEC. בהתקנה המתוארת כאן, ניתן היה לעבד עד חמש דגימות בכל פעם.
- בצע שלב צנטריפוגה במהירות נמוכה.
- צנטריפוגה את הדגימה בצנטריפוגה צוננת מראש (4°C) בדלי מתנודד החוצה ב 2,000 x גרם במשך 15 דקות.
- בצע שלב צנטריפוגה במהירות גבוהה.
- העבר בזהירות את הסופרנאטנט מהצנטריפוגה במהירות נמוכה לצינורות אולטרה-צנטריפוגה (למשל, צינורות 0.5-2 מ"ל) באמצעות מחט קהה המחוברת למזרק 5 מ"ל, תוך זהירות שלא להפריע לגלולה מהסחרור במהירות נמוכה.
- אזנו זוגות צינורות למשקל של 0.05 גרם, ומקמו אותם ברוטור אולטרה-צנטריפוגה בזווית קבועה (ראו טבלת חומרים).
- צנטריפוגה ב-4°C למשך 30 דקות ב-250,000 x גרם.
3. כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC)
- הכינו את מערכת הכרומטוגרפיה הנוזלית החלבונית המהירה (FPLC) ואזן את העמודה.
- הכן את המערכת בהתאם להוראות היצרן (ראה טבלת חומרים), לדוגמה, על ידי מילוי המערכת במאגר SEC וטיהור משאבות האוויר.
- חבר את עמודת ה-SEC ל-FPLC, וודא שאף אוויר לא נכנס לעמודה. זה מושג על ידי הפעלת לחץ אחורי על עמודת SEC עם מזרק מלא מים (מחובר לתחתית העמודה) על מנת לבצע חיבור טיפה לטיפה עם נתיב הזרימה של מערכת FPLC.
- יש לאזן מראש את עמודת ה-SEC על-ידי שטיפתה תחילה בנפחים של 1.5 עמודות (36 מ"ל עבור עמודה של 24 מ"ל) של H2O מזוקק ומסונן ברמת מעבדה, ולאחר מכן נפחי 1.5 עמודות של מאגר SEC בקצב הזרימה והלחץ המומלצים עבור העמודה (ראה טבלת חומרים).
הערה: מערכת FPLC ששימשה במחקר זה לביצוע FSEC הייתה בסביבה קרה והותקנה לה שסתום לולאה בעל חמישה מצבים וקולט שברי צלחת בעל שישה מצבים. הגדרה זו מאפשרת לטעון חמש דגימות ולרוץ ברצף לאורך אותה עמודה באופן אוטומטי ללא צורך בהתערבות ידנית בין הריצות. לצורך הרצת ניסויי ה-SEC, נעשה שימוש בטור מסחרי ארוז מראש של 24 מ"ל (ראו טבלת חומרים), שהכיל שרף שאפשר לפענוח חלבונים בטווח המשקל המולקולרי של 10-600 kDa . אם החלבון המעניין גדול במיוחד, ניתן להשתמש במטריצת עמודות חלופית במקום, המאפשרת הפרדה של חלבונים עד 5,000 kDa במשקל מולקולרי. שימו לב שנוכחות של חומר ניקוי/מיצלה שומני תגדיל את הגודל הכולל של חלבון הממברנה ב->150 kDa, בהתאם לחלבון ולחומר הניקוי שבו משתמשים.
- החל את הדגימה על העמודה והפעל את ניסוי SEC.
- מעבירים את הסופרנאטנט ממדרגת הצנטריפוגה המהירה למזרק בנפח 1 מ"ל באמצעות מחט קהה המחוברת למזרק. זה מאפשר שחזור דגימה מצינור הצנטריפוגה מבלי להפריע לכדור.
- הגדר את לולאת הדגימה להיטען. מלא לולאת דגימה של 500 μL על ידי הזרקת 600-700 μL של הדגימה מהמזרק ליציאת הטעינה. בהתאם למערכת בשימוש, שלב טעינה זה יכול להיות מתוכנת לתוך השיטה כדי להבטיח שלא נעשות טעויות.
- במהלך השיטה, הזריקו את הדגימה מהלולאה לתוך העמודה על ידי ריקונה עם 4 מ"ל של חיץ SEC בקצב הזרימה והלחץ המומלצים לעמודה (ראה טבלת חומרים).
- הפעל את העמודה באותו קצב זרימה עד שאמצעי אחסון של 1.5 עמודות (36 מ"ל עבור עמודה של 24 מ"ל) של המאגר יעברו למטה.
- ב- 0.25 מנפח העמודה (6 מ"ל עבור עמודה של 24 מ"ל), התחל לאסוף שברים של 0.2 מ"ל כדי לאסוף 90 שברים.
הערה: מכיוון שנפח הריק של העמודה צפוי להיות 0.3 נפחי עמודות, התחלת איסוף השברים מיד לפני כן מבטיחה ניטור של כל החלבון, כולל כל חלבון שנמצא בנפח הריק.
4. איסוף וניתוח עקבות פלורסנט
- העבר את הדגימות מאספן השברים (שלב 3.2.5) לצלחת של 96 בארות, וקרא את האות הפלואורסצנטי.
- לפני ביצוע קריאת פלואורסצנטיות, לדלל את הדגימות שנאספו. באמצעות פיפטה רב-ערוצית, מעבירים 90 מיקרוליטר של H2O מזוקק ברמת מעבדה ממאגר לכל באר של צלחת שטוחה אטומה בעלת 96 בארות (ראו טבלת חומרים).
- אם שברים נאספו לבלוק של 96 בארות במהלך שלב 3.2.5, השתמש בפיפט רב-ערוצי כדי להעביר 10 μL של שברי SEC מהבלוק לצלחת התחתונה האטומה בעלת 96 הקידוחים, וערבב על-ידי פיפטציה למעלה ולמטה. אחרת, אם שברי SEC נאספו לתוך צינורות בודדים במהלך שלב 3.2.5, העבר 10 μL מכל שבר לצלחת התחתונה השטוחה האטומה של 96 בארות בזה אחר זה, ופיפס למעלה ולמטה בכל פעם כדי לערבב את הדגימות.
- הניחו את הצלחת התחתונה השטוחה האטומה בעלת 96 הבארות בקורא הלוחות, ומדדו את הפלואורסצנטיות. אם GFP היא תווית הפלואורסצנטית (המשמשת כאן), הגדר את העירור קרוב ככל האפשר ל- 488 ננומטר, וזהה את הפליטה הפלואורסצנטית קרוב ככל האפשר ל- 507 ננומטר.
הערה: הדילול הנדרש לפני ביצוע קריאת הפלואורסצנטיות יהיה תלוי בכמות הכוללת של חלבון מעניין הקיים בתרבות הביטוי וברגישות של קורא הלוחות בו נעשה שימוש. בדוגמאות שהוצגו במחקר זה, הדגימות דוללו פי 10 במים. כהצעה לנקודת התחלה, יש לדלל את השברים פי 5-10 במים או בחיץ לפני הגילוי. אם אות המעקב המוקלט של FSEC נמוך במיוחד, ניתן להשתמש במקום זאת בדילולים קטנים יותר או אפילו במדגם לא מדולל. המכשיר ששימש לזיהוי במחקר זה היה קורא לוחות המסוגל לעירור ב 488 ננומטר ולזהות פליטה פלואורסצנטית ב 507 ננומטר (ראה טבלת חומרים).
- התווה את עקבות FSEC.
- יצא את הנתונים מקורא הלוחות בתבנית גולמית (טקסט גולמי או קובץ ערכים המופרדים באמצעות פסיקים). נתונים גולמיים אלה ישורטטו על ציר Y של מעקב FSEC.
- עבור ציר X, חשב את הנפח שבו נאסף כל שבר. הבאר הראשונה צריכה להיות נפח השבר הראשון שבו נאסף השבר הראשון כדי להסביר את עיכוב השבר (6 מ"ל בדוגמה זו). השברים לאחר מכן חייבים להגדיל ברצף על ידי נפח השבר שנאסף (0.2 מ"ל בדוגמה זו).
- לאחר חישוב נתוני ציר X וציר Y, העתק והדבק את הנתונים בתוכנת הגרפים (ראה טבלת חומרים) על מנת לשרטט את האות הפלואורסצנטי בכל באר כנגד הנפח שבו הוא נפלט מהעמודה.
הערה: איור 1 מציג ייצוג סכמטי של השלבים הדרושים להפעלת ניסוי FSEC.
- נתח את עקבות FSEC.
- יש להעריך את כמות פליטת החלבון בנפח הריק (כ-8 מ"ל לעמודה של 24 מ"ל), מה שמצביע על כך שהחלבון גדול מאוד בגודלו וסביר להניח שהוא פרוש/מצטבר.
- העריכו את כמות החלבון הנפלטת בפסגות מאוחרות יותר, המעידות על חלבון מקופל. זה צפוי להיות בין 10 מ"ל ל -16 מ"ל עבור עמוד של 24 מ"ל, תלוי בגודל החלבון (כאשר הוא משויך למיצלה דטרגנט/שומנים). שימו לב היטב לצורת השיא, במיוחד אם מדובר בפסגה רחבה או מפוצלת המשתרעת על פני יותר מ 3-4 מ"ל (עבור עמודה של 24 מ"ל), שכן זה מצביע על דגימה polydisperse.
- חשב את היחס בין גובה השיא המונומרי לגובה שיא הריק על ידי חלוקת האות המרבי המוקלט בשיא המונומר באות המרבי בשיא הריק.
הערה: ערך זה מייצג את מדד הפיזור האחיד ומאפשר מדידה כמותית של איכות החלבון; ערכים גדולים יותר מצביעים על האיכות הטובה ביותר האפשרית, בעוד שערכים מתחת ל-1 מצביעים על דגימות בעייתיות, מכיוון שיש בהן יותר חלבון מצטבר מאשר חלבון מקופל. - אם יש להשוות מספר ריצות FSEC והתכונה החשובה ביותר היא כמות המונומר בכל מקרה, התווה את העקבות כאות הגולמי שהוקלט על ידי קורא הלוחות (לדוגמה, RFU).
הערה: אם השוואה של כמות המונומר לעומת החלבון המקופל חשובה יותר, יש לנרמל את האות לאחוז מסך האות באמצעות קריאות המינימום והמקסימום במעקב, אשר ידגישו את ההבדלים ביחס בין חלבון מצטבר ומונומרי בין העקבות.
איור 1: ייצוג סכמטי של השלבים הדרושים לביצוע ניסוי FSEC. (1) תאים המבטאים את החלבון המתויג פלואורסצנטית של עניין הם מסיסים . (2) המסיסות הגולמית מובהרת תחילה בסחרור במהירות נמוכה, ואחריו (3) סחרור במהירות גבוהה. (4) הסופרנאטנט המובהר של הדגימה נטען ומופעל על עמודת SEC מתאימה, ו-(5) השברים נאספים. (6) דגימות של השברים מועברות ללוח של 96 בארות, ואות פלואורסצנטי GFP מזוהה באמצעות קורא לוחות כדי (7) לשרטט את עקבות FSEC. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Representative Results
ראשית, נחקרו הטווח הדינמי והגבולות התחתונים של זיהוי eGFP עבור קורא הלוחות ששימש במחקר זה. תקן eGFP מטוהר של ריכוז ידוע דולל בנפח סופי של 50 μL ל-50 ng·μL−1, 25 ng·μL−1, 12.5 ng·μL−1, 6.25 ng·μL−1, 3.125 ng·μL−1, 1.5625 ng·μL−1, 0.78125 ng·μL−1 ו-0.390625 ng·μL−1, והפלואורסצנטיות נקראה באמצעות עירור של 488 ננומטר ופליטה של 507 ננומטר (איור 2) ). ניסוי זה הצביע על כך שלקורא הלוחות הייתה מגבלת זיהוי נמוכה יותר של 30 ננוגרם של חלבון המסומן ב-eGFP לכל באר וטווח דינמי של עד 500 ננוגרם של חלבון המסומן ב-eGFP לכל באר לפני רוויית האותות. אם נשתמש בערך עבור הגבול התחתון ובהנחה שאלוציית החלבון מוגבלת ל-0.33 מנפח העמודה, נדרש רק 1.28 מיקרוגרם של חלבון eGFP המסומן כחלבון מעניין עבור טעינת עמודת SEC על מנת שניתן יהיה להבחין באות FSEC ניתן לזיהוי.
איור 2: עקומת תקן eGFP. גרף פיזור של האות הפלואורסצנטי עבור תקן eGFP מטוהר מדולל ל- 50 ng·μL−1, 25 ng·μL−1, 12.5 ng·μL−1, 6.25 ng·μL−1, 3.125 ng·μL−1, 1.5625 ng·μL−1, 0.78125 ו- 0.390625 ng·μL−1. (A) כל הדילולים מוצגים, כולל אלה עם האות הרווי. (B) גרף פיזור מוגדל הכולל רק את התקנים הכלולים בטווח הדינמי של קורא הלוחות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
שנית, עמודת 24 מ"ל ששימשה למחקר זה כוילה עם תקני משקל מולקולרי. תוך שימוש באותם תנאי חיץ וריצה ששימשו לניתוח FSEC, תקני המשקל המולקולרי דקסטרן כחול (>2,000 kDa), פריטין (440 kDa), אלדולאז (158 kDa), קונאלבומין (75 kDa) ואובלבומין (43 kDa) הוזרקו בנפרד ועברו דרך העמודה, ועקבות אלוציה נאספו בספיגה של 280 ננומטר. נפחי האלוציה שתועדו היו 8.9 מ"ל, 12.4 מ"ל, 15.2 מ"ל, 16.9 מ"ל ו-18 מ"ל, בהתאמה. כאשר נפחי אלוציה אלה הומרו ל-Kav (משוואה 1) ושורטטו כנגד משקלים מולקולריים של לוג, עקומה סטנדרטית יכולה להתאים. זה איפשר להעריך את המשקל המולקולרי של GPCRs שנבדקו במחקר זה באמצעות אינטרפולציה של העקומה הסטנדרטית (איור 3). לדוגמה, עקבות FSEC של קולטן הסרוטונין GPCR 2A (5HT2AR) לאחר מסיסות בחומר הניקוי DDM הצביעו על נפח elution של 13.4 מ"ל. נפח אלוציה 5HT2AR זה נופל בין נפחי אלוציה אלה שנרשמו עבור פריטין ואלדולאז ומספק משקל מולקולרי מוערך של כ -300 kDa. מבנה 5HT 2A R ששימש במחקר זה הוא בערך 50 kDa (כולל תג eGFP), כלומר אם מניחים ש- 5HT2AR הוא מונומרי, ניתן לייחס250kDa של משקל מולקולרי למיצלה דטרגנט DDM/שומנים. המשוואה להמרת נפחי אלוציה היא כדלקמן (משוואה 1):
(משוואה 1)
כאשר V e הוא נפח ה- e- elution, V 0 הוא אמצעי האחסון של ריק העמודה, ו- Vc הוא נפח העמודה הכולל.
איור 3: עקומת כיול של עמודת SEC באמצעות תקני משקל מולקולריים . (A) עקבות FSEC מייצגות של 5HT2AR המסיסות ב-DDM, כאשר מיקומי האלוטיון היחסיים של תקני המשקל המולקולרי מסומנים דקסטרן כחול (Void), פריטין, אלדולאז, קונאלבומין ואובלבומין. פריטין, אלדולאז, קונאלבומין ואובלבומין צבועים בירוק, סגול, אדום וציאן, בהתאמה. (B) עקומת כיול המשקל המולקולרי באמצעות מיקומי האלוציה של התקנים לאחר ההמרה ל-Kav (משוואה 1) המשורטטת כנגד המשקל המולקולרי של לוג (Mr). ה-Mr של 5HT2AR ב-DDM עבר אינטרפולציה מהעקומה באמצעות Kav ומוצג על העקומה (ריבוע כחול). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
לאחר מכן נעשה שימוש ב-FSEC כדי להעריך את האיכות והמאפיינים של קולטן GPCR sphingosine-1-phosphate (S1PR1)15. תאי חרקים המבטאים S1PR1 אנושי המתויג ב-GFP עובדו עבור FSEC כמתואר בפרוטוקול (איור 1).
ראשית, תנאי מיצוי הממברנות האופטימליים נחקרו על-ידי בדיקת הדטרגנטים DDM ו-LMNG כנגד מיצוי ללא חומרי ניקוי באמצעות SMA (איור 4A). מדד הפיזור החד-פעמי שימש להערכת איכות דגימת החלבון והיחס בין החלבון בחלל (~ 8 מ"ל שימור עמודות) בהשוואה למדגם החד-פיזור (שימור טורים של 14-15 מ"ל). הדגימה המסיסה ב- LMNG הציגה פרופיל FSEC מעולה עם צורת שיא מונומר טובה יותר ושיא צבירת חלבון נמוך יותר, מה שמצביע על כך שמסיסות וטיהור ב- LMNG היו התנאים המייצבים ביותר עבור חלבון ממברנה זה. לעומת זאת, הדגימה המסיסה ב-DDM הייתה בעלת פרופיל FSEC נמוך יחסית, עם שיא צבירה גדול יותר ושיא מונומרי רחב יותר, מה שמצביע על פיזור רב בדגימה.
שנית, ההשפעה של הוספת ליגנד על פרופיל FSEC נחקרה על ידי הוספת ספינגוזין-1-פוספט (S1P) לדגימה במהלך מסיסות. במקרה זה, DDM שימש כמגיב מסיסות, ועקבות FSEC של S1PR1 בנוכחות ובהיעדר S1P הושוו (איור 4B). הדגימה המסיסה, בנוכחות S1P, הראתה עקבות FSEC מעולים עם צבירה מופחתת. זה הצביע על כך שטיהור בנוכחות ליגנד היה יתרון לשיפור איכות דגימת החלבון על ידי ייצוב הקולטן בתמיסה, אך היה גם יתרון גם כסמן חלופי לפעילות החלבון, שכן התוצאות הצביעו על כך שהחלבון מקופל כראוי וכשיר לקשירת ליגנדים.
איור 4: FSEC באמצעות תמצית גולמית של S1PR 1 המציינת תנאי מיצוי אופטימליים של הממברנה וקשירת ליגנד. (A) השוואה בין עקבות FSEC של S1PR1 המסיסים בקו-פולימר חומצה סטירן-מאלית (SMA; כחול), לאוריל מלטוז נאופנטיל גליקול (LMNG; אדום), או דודציל מלטוזיד (DDM; שחור). (B) השוואה של עקבות FSEC של S1PR 1 המסיס ב- DDM בנוכחות (אדום) או היעדרו (שחור) של האגוניסט ספינגוזין-1-פוספט (S1P). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
FSEC שימש גם כדי לחקור את היציבות ארוכת הטווח של 5HT2AR בתנאים שונים. 5HT 2A R אנושי מתויג GFP הוסס מקרום תאי חרקים בפולימר דטרגנט (DDM) אוSMAונותח על-ידי FSEC בכמה נקודות זמן לאחר אחסון ב-4°C או בטמפרטורת החדר (איור 5). לאחר מספר ימי דגירה, 5HT2AR ב-DDM הראה ירידה משמעותית בגובה השיא המונומרי בשתי הטמפרטורות, ונצפו עליות משמעותיות בשיא המצרפי. לעומת זאת, 5HT2AR בחלקיק שומנים SMA (SMALP) לא הראה ירידה משמעותית בגובה השיא המונומרי במהלך הניסוי, מה שמצביע על כך שהחלבון ב-SMALP נשאר יציב למשך זמן רב יותר, אפילו בטמפרטורות שליליות. זה עשוי להיות חשוב כאשר בוחנים הכנות חלבוניות ליישומים ביופיזיים במורד הזרם, כגון ניסויי תהודה פלסמונית פני השטח (SPR), שעבורם יש דרישה שהדגימה תהיה יציבה ופעילה לאורך תקופת זמן ארוכה לצורך סיום מוצלח של ניסויי הקשירה.
איור 5: השפעת הזמן והטמפרטורה על האיכות של 5HT 2A R שמופקים מהממברנה באמצעות DDM או SMALP, כפי שנותח על-ידי FSEC. (A) עקבות FSEC מייצגים של 5HT2AR מסיסים ב-DDM ומאוחסנים בטמפרטורת החדר למשך יום אחד (אפור), יומיים (ירוק) או 5 ימים (כחול). (B) היסטוגרמות של גובה השיא המונומרי המנורמל עבור דגימות DDM המאוחסנות ב- 4 ° C (כחול) או RT (ירוק) בהשוואה לדגימות SMALP המאוחסנות ב- 4 ° C (אפור) או RT (שחור). קווי שגיאה מייצגים את ה- SEM. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Discussion
הגישות השיטתיות הגנריות לבדיקת מצבים עם FSEC המוצגות כאן מאפשרות אופטימיזציה מהירה של פרמטרים של מסיסות וטיהור לייצור חלבוני ממברנה. משמעות הדבר היא כי חלבוני ממברנה יציבים ופעילים מבחינה תפקודית יכולים להיות מיוצרים במהירות עבור מחקרים ביופיזיים ומבניים. יתר על כן, ניתן להפעיל FSEC באמצעות ציוד מעבדה שככל הנראה כבר קיים במעבדות חלבון ממברנה, ולכן אין דרישה לרכישת מכשיר מומחה להפעלת הבדיקות.
שלבים קריטיים
הזמן שלוקח בין נקודת המסיסות מתאים בחומר ניקוי לנקודה שבה הדגימה מועברת במורד עמודת SEC (שלבים 2.1.5-3.2.5) הוא קריטי לזמן, ואסור שיהיו הפסקות בין שלבים אלה. כל השלבים צריכים להתבצע ב 4 ° C או על קרח, ואת הזמן שלקח לבצע צעדים אלה צריך להישמר למינימום האפשרי. אילוצי זמן וטמפרטורה אלה נחוצים על מנת לרשום את פרופיל FSEC עבור חלבון הממברנה לפני כל התפתחות פוטנציאלית או התפרקות. לאחר שחלבון הממברנה היה מסיס, קיים סיכון גדול יותר לפתיחה, צבירה והתפרקות, אפילו ב -4 מעלות צלזיוס. באופן אידיאלי, כל הדגימות שעבורן יש להשוות את עקבות FSEC צריכות לעבור את עמודת ה- SEC באותו משך זמן לאחר שלב המסיסות. בפועל, זה קשה, במיוחד אם הדגימות מועברות ברצף לאורך עמודה אחת, אך ניתן לאסוף עד חמש עקבות SEC בהפרש של 3 שעות זו מזו, ובמסגרת זמן זו, לא אמורה להיות השפלה משמעותית.
פתרון בעיות
אם, בעת ביצוע ניסוי FSEC, יש אות פלואורסצנטי נמוך או לא, ייתכן שחלבון הממברנה המעניין לא ביטא את קו התאים שנבחר, יש לו ביטוי נמוך מאוד של קו התאים שנבחר, או לא היה מסיס בחומר הניקוי שנבחר. אם הדגימות היו מדוללות לפני איסוף אות הפלואורסצנטיות ורישום עקבות FSEC, צעד ראשון פשוט יהיה לנסות דילול נמוך יותר או ללא דילול של שברי SEC. אם זה עדיין לא מניב עקבות FSEC הניתנים לפרשנות, יש לבדוק את הביטוי והמסיסות של החלבון.
ניתוח ביטוי החלבון יכול להיות מושג על ידי בדיקת הפלואורסצנטיות של המדגם לאחר שלב 2.2.2. אם יש אות פלואורסצנטי נמוך מאוד או ללא אות כלל מדגימה זו (למשל, אות קרוב מאוד לרקע), סביר להניח שיש בעיה עם ביטוי החלבון. ניתן לנקוט צעדים לשיפור רמות הביטוי של חלבון הממברנה, כגון מעבר לקו תאים חלופי או התאמת תנאי הגידול, השראת הביטוי והזמן בין האינדוקציה/זיהום/טרנספקציה לבין הקציר. עם זאת, ביטוי חלבון גרוע במיוחד יכול להצביע על חלבון קרום לא יציב, ולכן, בחירת מבנה גרועה.
אם הביטוי נבדק ויש אות פלואורסצנטי ברור מעל הרקע לפני FSEC, ניתן לבדוק את יעילות המסיסות על ידי מדידת האות הפלואורסצנטי הנותר של הדגימה לאחר שלב 2.4.3 (חלבון ממברנה מסיס) בהשוואה לדגימה לאחר שלב 2.2.2 (חלבון כולל). מקובל שיעילות המסיסות היא 20%-30% ועדיין מאפשרת ניתוח וטיהור מוצלחים של חלבון הממברנה. עם זאת, אם יעילות המסיסות נמוכה מ-20%, ייתכן שיהיה צורך בדטרגנט שונה למסיסות או בתנאי מסיסות שונים. אם הניסיונות לשפר את המסיסות אינם מצליחים, הדבר יכול להצביע על חלבון קרום לא יציב במיוחד, ולכן בחירת מבנה גרועה.
אם שיא פליטה מאוחר מאוד נצפה בעקבות FSEC (למשל, 18-24 מ"ל), זה מצביע על כך שלחלבון הפלואורסצנטי יש משקל מולקולרי חלבוני נמוך בהרבה מהצפוי. זה יכול להיגרם על ידי חלבון הממברנה של עניין להיות מפורק, וכתוצאה מכך GFP "חופשי". יש לבדוק אם החלבון שלם לפני ואחרי המסיסות באמצעות פלואורסצנטיות GFP בג'ל. אם נראה שהחלבון המעניין מתפרק או עובר פרוטאוליזה, ניתן להגדיל את כמות מעכבי הפרוטאז פי שניים עד פי ארבעה. עם זאת, רגישות גבוהה לפרוטאזות או חלבון מפורק עוד לפני המסיסות יכולה להצביע על חלבון לא יציב במיוחד, ולכן בחירת מבנה גרועה.
שינויים ויישומים נוספים של FSEC
בדרך כלל, התג הפלואורסצנטי המשמש ב- FSEC הוא GFP או eGFP, כמתואר בפרוטוקול זה. עם זאת, קיימים תגי חלבון פלואורסצנטיים רבים ושונים. בחירת התג הפלואורסצנטי לשימוש תלויה בכך שיש קורא לוחות שיכול להשיג את פרמטרי העירור והפליטה הנכונים כדי להקליט את האות הפלואורסצנטי עבור התג הפלואורסצנטי שנבחר ובעל פלואורופור עם שינוי מועט או ללא שינוי בתפוקה הקוונטית בתנאי סביבה שונים. יתר על כן, FSEC אינו מוגבל לחלבונים פלואורסצנטיים, אך יכול לעבוד באותה מידה גם עם חלבון שסומן בצבע פלואורסצנטי. לדוגמה, ניתן להשתמש בצבע NTA, אשר ייקשר באופן חיובי למבנים של חלבון ממברנה מתויג היסטידין. יתר על כן, נוגדן מסומן פלואורסצנטית המסומן כימית בצבע פלואורסצנטי וספציפי לקשירת חלבון הממברנה המעניין או תג טיהור הכלול במבנה חלבון הממברנה יכול לסמן בעקיפין מטרה עבור FSEC.
בעת ביצוע סינון חומרי ניקוי באמצעות FSEC, ניתן לבחור אם המאגר המשמש להפעלת עמודת SEC צריך להכיל את חומר הניקוי התואם שבו החלבון היה מסיס או אם יש להשתמש בדטרגנט סטנדרטי בכל הריצות. ייצוג מדויק יותר של התנהגות החלבון יתקבל אם כל הניסוי יבוצע עם חומר הניקוי התואם לכל אורכו. עם זאת, זה יכול לגזול זמן רב ובזבזני של חומר ניקוי אם יש צורך לאזן מחדש את העמוד בחומר ניקוי חדש לפני כל ריצה. יתר על כן, מכיוון שהמטרה העיקרית של בדיקת חומרי ניקוי היא להשוות עקבות, המגמות יישארו בעקבות גם אם התנאים אינם אידיאליים. לפיכך, ניתן להגיע לפשרה לפיה החלבון מסיס בחומר הניקוי המעניין, אך הטור מופעל בחיץ סטנדרטי עם חומר ניקוי יחיד בכל הריצות (למשל, DDM)11, מה שיכול לחסוך זמן וחומרים מתכלים לחומרי ניקוי.
על ידי שינוי ציוד FLPC בשימוש, התפוקה של פרוטוקול FSEC ניתן להגדיל באופן משמעותי, ואת דרישת המדגם ניתן למזער. לדוגמה, מערכת FPLC או HPLC יכולה להיות מצוידת בדוגמית אוטומטית, עמודה אנליטית קטנה יותר של נפח מיטה (כגון עמודת SEC אנליטית של 3.2 מ"ל), וגלאי פלואורסצנטי מובנה לניטור עקבות FSEC רציפים ישירות מהעמודה. ההתקנה שתתקבל תאפשר לבצע יותר ריצות FSEC בפרק זמן קצר יותר ותסיר את שלב התוויית הידניים, ובכך תאפשר למספר רב יותר של תנאים להיבדק במסגרת זמן קצרה יותר. יתר על כן, דרישת הדגימה תצומצם עוד יותר, מכיוון שיהיה צורך להכין פחות דגימות ולהעמיס אותן על עמודת FSEC עבור כל ריצה. זה יפתח אפשרויות לצמצום תרבויות הביטוי לפורמט מבוסס לוחות, מכיוון שיידרש חומר כה מועט לניתוח.
חוזקות וחולשות של FSEC בהשוואה לשיטות אחרות
החיסרון של FSEC הוא שיש לתכנן את מבני חלבון הממברנה כך שיציגו את התווית הפלואורסצנטית, ועם ההקדמה קיימת אפשרות קטנה שמיקום התווית עלול להפריע לתפקוד או לקיפול של חלבון הממברנה המעניין. בנוסף, פרוטוקול FSEC, כמתואר כאן, עוקב אחר המאפיינים של חלבון ממברנה בנוכחות ליזט התא, שהוא תערובת גסה של חלבונים. התנהגותו של חלבון ממברנה בסביבה זו עשויה להיות שונה מאשר כאשר חלבון הממברנה המעניין נתון לעמודת SEC מוכנה בסוף הטיהור כאשר הוא מבודד לחלוטין מחלבונים אחרים. יתר על כן, FSEC מספק מדד איכותי למדי של איכות החלבון. עם זאת, על ידי המרת עקבות FSEC למדד חד-פיזור, כמתואר בשלב 4.3.3 של הפרוטוקול, ניתן לקבל מדד כמותי של איכות החלבון.
FSEC אינה השיטה היחידה שניתן להשתמש בה בניתוח מוקדם של מבני חלבון ממברנה, תנאי מסיסות והרכב חיץ טיהור. לגישות החלופיות יש יתרונות וחסרונות על פני FSEC. לדוגמה, קיימות בדיקות יציבות תרמיות מבוססות פלואורופור, במיוחד השימוש בצבע 7-diethylamino-3-(4′-maleimidylphenyl)-4-methylcoumarin (CPM)16,17. היתרון של שיטה זו הוא שבניגוד ל- FSEC, המספק מדד איכותי לאיכות החלבון, מבחני יציבות תרמית מספקים מדד כמותי בצורה של טמפרטורת התכה יחסית. יתר על כן, אין דרישה להכניס תג פלואורסצנטי על מבנה החלבון. עם זאת, החסרונות של בדיקות יציבות תרמית בהשוואה ל- FSEC הם שיש להשתמש בחלבון מטוהר וכי הבדיקה אינה תואמת את כל מבני החלבון, מכיוון שהיא מסתמכת על עמדות היתרון של שאריות ציסטאין טבעיות בחלבון המקופל.
שיטה נוספת שיש לה קווי דמיון הן למבחני FSEC והן למבחני יציבות תרמית מבוססי פלואורופור היא בדיקה המודדת את רגישות הטמפרטורה של חלבון ממברנה. בבדיקה זו, החלבון מאותגר בטמפרטורות שונות, והחלבון שנשאר בתמיסה לאחר זיהוי הצנטריפוגה. הזיהוי בשיטה זו נעשה במספר דרכים, כולל מדידת הפלואורסצנטיות בתמיסה18, הפלואורסצנטיות של רצועת ג'ל SDS-PAGE19, או עוצמת האות בכתם מערבי20. עם זאת, חסרון משמעותי של גישות אלה הוא כי הבדיקה היא מאוד אינטנסיבית עבודה נוטה רעש גבוה בתוצאות, כמו כל נקודת טמפרטורה בודדת יש לאסוף בנפרד.
לבסוף, ניתן להשתמש במספר טכניקות ביופיזיקליות מתקדמות יותר כדי להעריך את איכות חלבון הממברנה באופן דומה ל- FSEC, לדוגמה, ניתוח פיזור המושרה על ידי זרימה21, תרמופורזה מיקרוסקולית22, או SPR. למרות גישות חזקות מאוד, החיסרון של שיטות אלה הוא הדרישה למכשירים מיוחדים מאוד להריץ את הניתוחים.
לסיכום, FSEC מספק כלי רב ערך לשימוש בקמפיינים לייצור חלבון ממברנה, ולמרות שהוא אינו האפשרות היחידה, יש לו מספר יתרונות מובהקים על פני שיטות אחרות, כמפורט לעיל. אימות צולב של התוצאות על ידי בדיקות אורתוגונליות מומלץ תמיד, ואף אחת מהשיטות שנדונו לעיל אינה סותרת זו את זו.
Disclosures
Peak Proteins הוא ארגון מחקר קבלני המספק ביטוי חלבונים, טיהור, ספקטרומטריית מסות וקביעה מבנית תמורת תשלום.
Acknowledgments
ברצוננו להודות על העזרה והתמיכה של כל צוות Peak Proteins. מצוות מדעי התא, ברצוננו להודות לאיאן המפטון על תובנותיו יקרות הערך והדרכתו בביטוי תאי חרקים. ברצוננו להודות למארק אבוט על שסיפק את המשאבים וההזדמנות להמשיך בפרויקט זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL and 5 mL plastic syringes | Generic | - | Syringes for transfer of samples |
| 10x EDTA Free Protease inhibitor cocktail | Abcam | ab201111 | Protease inhibitors |
| 15 mL tubes | Generic | - | 15 mL tubes for pellet preparation and solubilisation |
| 2 mL ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344625 | Tubes for ultra-centrifuge rotor |
| 50 mL tubes | Generic | - | 50 mL tubes for cell harvest |
| 96 deep-well blocks | Greiner | 15922302 | For collecting 0.2 mL SEC fractions |
| ÄKTA V9-L loop valve | Cytiva | 29011358 | 5 posiiton loop valve for the ÄKTA FPLC system |
| ÄKTA F9-C fraction collector | Cytiva | 29027743 | 6 position plate fraction collector for the ÄKTA FPLC system |
| ÄKTA pure 25 L | Cytiva | 29018224 | FPLC system for running the experiment |
| Benchtop centrifuge (e.g. Fisherbrand GT4 3L) | Fisher Scientific | 15828722 | Centrifuge for low-speed spin |
| Blunt end filling needles | Generic | - | For transfer of samples |
| Bottle top vacuum filter | Corning | 10005490 | Bottle top vacuum filter for filtering SEC buffers |
| Cholesteryl hemisuccinate (CHS) | Generon | CH210-5GM | Additive for detergent solubilisation |
| Disposable multichannel reseviour | Generic | - | Resevior for addition of water or buffer to 96-well micro-plate |
| Dodecyl maltoside (DDM) | Glycon | D97002-C-25g | Detergent for solubilisation |
| eGFP protein standards | BioVision | K815-100 | eGFP standards for fluorescent calibration curve |
| Glycerol | Thermo Scientific | 11443297 | Glycerol for buffer preparation |
| HEPES | Thermo Scientific | 10411451 | HEPES for buffer preparation |
| High molecular weight SEC calibration standards kit | Cytiva | 28403842 | Molecular weight calibration kit for SEC |
| Lauryl maltose neopentylglycol (LMNG) | Generon | NB-19-0055-5G | Detergent for solubilisation |
| Low molecular weight SEC calibration standards kit | Cytiva | 28403841 | Molecular weight calibration kit for SEC |
| MLA-130 ultra-centrifuge rotor | Beckman Coulter | 367114 | Rotor for ultracentrifuge that fits 2 mL capacity tubes |
| Opaque 96-well flat-bottom micro-plate | Corning | 10656853 | 96-well for reading fluorescent signal in plate reader |
| Optima MAX-XP ultra-centrifuge | Beckman Coulter | 393315 | Centrifuge for high-speed spin |
| pH meter | Generic | - | For adjusting the pH of buffers during preparation |
| Prism | GraphPad | - | Graphing software for plotting traces |
| Rotary mixer | Fisher Scientific | 12027144 | Mixer for end over end mixing in the cold |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | 10316943 | Sodium chloride for buffer preparation |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 10488790 | Sodium hydroxide for buffer preparation |
| Spectramax ID3 Plate Reader | Molecular Devices | 735-0391 | Micro-plate reader capable of reading fluorescence |
| Stirrer plate | Generic | - | For stirring buffers during preparation |
| Styrene maleic acid (SMA) | Orbiscope | SMALP 300 | Polymer for detergent free extraction |
| Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | SEC column for running the experiment. The bed volume of this column is 24 mL. The recommended flow rate for this column in 0.9 ml/min (in water at 4 °C). The maximum pressure limit for this column is 5 MPa. |
| Vacuum pump | Sartorius | 16694-2-50-06 | For filtering and degassing buffers |
References
- Burgess, R. R. A brief practical review of size exclusion chromatography: Rules of thumb, limitations, and troubleshooting. Protein Expression and Purification. 150, 81-85 (2018).
- Erickson, H. P. Size and shape of protein molecules at the nanometer level determined by sedimentation, gel filtration, and electron microscopy. Biological Procedures Online. 11 (1), 32-51 (2009).
- Lathe, G. H., Ruthven, C. R. J. The separation of substances and estimation of their relative molecular sizes by the use of columns of starch in water. Biochemical Journal. 62 (4), 665-674 (1956).
- Lathe, G. H., Ruthven, C. R. The separation of substances on the basis of their molecular weights, using columns of starch and water. Biochemical Journal. 60 (4), (1955).
- Polson, A. Fractionation of protein mixtures on columns of granulated agar. Biochimica et Biophysica Acta. 50 (3), 565-567 (1961).
- Hjertén, S., Mosbach, R. 34;Molecular-sieve" chromatography of proteins on columns of cross-linked polyacrylamide. Analytical Biochemistry. 3 (2), 109-118 (1962).
- Porath, J., Flodin, P. Gel filtration: A method for desalting and group separation. Nature. 183 (4676), 1657-1659 (1959).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A Fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).
- Newstead, S., Kim, H., von Heijne, G., Iwata, S., Drew, D. High-throughput fluorescent-based optimization of eukaryotic membrane protein overexpression and purification in Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (35), 13936-13941 (2007).
- Vaidehi, N., Grisshammer, R., Tate, C. G. How can mutations thermostabilize G-protein-coupled receptors. Trends in Pharmacological Sciences. 37 (1), 37-46 (2016).
- Hardy, D., Bill, R. M., Jawhari, A., Rothnie, A. J. Overcoming bottlenecks in the membrane protein structural biology pipeline. Biochemical Society Transactions. 44 (3), 838-844 (2016).
- Hanson, M. A., et al. Crystal structure of a lipid G protein-coupled receptor. Science. 335 (6070), 851-855 (2012).
- Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
- Harborne, S. P. D., King, M. S., Kunji, E. R. S. Thermostability assays: A generic and versatile tool for studying the functional and structural properties of membrane proteins in detergents. Biophysical Journal. 118 (4), 105-121 (2020).
- Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins. Nature Communications. 9 (1), 4253 (2018).
- Harborne, S. P. D., et al. IMPROvER: The Integral Membrane Protein Stability Selector. Scientific Reports. 10 (1), 15165 (2020).
- Ashok, Y., Nanekar, R., Jaakola, V. -P. Defining thermostability of membrane proteins by western blotting. Protein Engineering Design and Selection. 28 (12), 539-542 (2015).
- Pedersen, M. E., Østergaard, J., Jensen, H. Flow-induced dispersion analysis (FIDA) for protein quantification and characterization. Methods Mol Biol. 1972, 109-123 (2019).
- Wienken, C. J., Baaske, P., Rothbauer, U., Braun, D., Duhr, S. Protein-binding assays in biological liquids using microscale thermophoresis. Nature Communications. 1 (1), 100 (2010).
