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Biology

Determinación de la duración de la fase S mediante la incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina en Saccharomyces cerevisiae

Published: October 21, 2022 doi: 10.3791/64490
Automatic Translation
1, 1, 1
1Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, Université de Montpellier, CNRS

Summary

Describimos dos protocolos complementarios para determinar con precisión la duración de la fase S en S. cerevisiae utilizando EdU, un análogo de la timidina, que se incorpora in vivo y se detecta mediante química Click por microscopía y citometría de flujo. Permite la fácil caracterización de la duración de la replicación del ADN y los defectos de replicación pasados por alto en los mutantes.

Abstract

La replicación del ADN eucariota es un proceso altamente regulado que garantiza que el plano genético de una célula se duplique correctamente antes de la segregación cromosómica. A medida que los defectos de síntesis de ADN subyacen a los reordenamientos cromosómicos, el monitoreo de la replicación del ADN se ha vuelto esencial para comprender la base de la inestabilidad del genoma. Saccharomyces cerevisiae es un modelo clásico para estudiar la regulación del ciclo celular, pero los parámetros clave de replicación del ADN, como la fracción de células en la fase S o la duración de la fase S, aún son difíciles de determinar. Este protocolo utiliza pulsos cortos y no tóxicos de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), un análogo de la timidina, en células de levadura TK-hENT1 diseñadas, seguidas de su detección por reacción Click para permitir la visualización y cuantificación de la replicación del ADN con alta resolución espacial y temporal tanto a nivel de célula única como de población mediante microscopía y citometría de flujo. Este método puede identificar defectos previamente pasados por alto en la fase S y la progresión del ciclo celular de los mutantes de levadura, lo que permite la caracterización de nuevos actores esenciales para garantizar la estabilidad del genoma.

Introduction

La estabilidad del genoma a través de la división mitótica está garantizada por la transmisión de un conjunto completo e igual de cromosomas a las dos progenies celulares producidas. Esto se basa en la finalización precisa de una serie de eventos que ocurren en un momento dado en cada fase del ciclo celular. En G 1, los orígenes de replicación se licencian tras la contratación de varios factores de licencia, incluido Cdc61. En la fase S, la duplicación del genoma completo se inicia a partir de múltiples orígenes de replicación activa y se realiza mediante maquinarias de replicación que se reúnen en focos microscópicamente visibles llamados fábricas de replicación2. En la fase M, las cromátidas hermanas duplicadas se unen y se biorientan en el huso mitótico para permitir su segregación a los polos opuestos de la célula mitótica3. La regulación, la finalización adecuada y la duración de cada fase son clave para garantizar la estabilidad del genoma. De hecho, la salida prematura de cualquiera de estas fases conduce a la inestabilidad del genoma. Por ejemplo, un G 1 más corto inducido por la deleción del inhibidor de CDK de levadura en ciernes Sic1 o por la sobreexpresión de ciclinas G1 alterará la fase S posterior 4,5,6. En consecuencia, estas desregulaciones, asociadas o no al estrés de replicación, resultan en roturas cromosómicas, reordenamientos y mala segregación 4,5,6. Por lo tanto, monitorear la duración de la fase S y, más ampliamente, la duración de las otras fases del ciclo celular puede ser crucial para identificar los defectos que ocurren en diferentes mutantes y en diferentes condiciones estresantes.

Un método tradicional para medir la duración de la fase del ciclo celular incluye citometría de flujo de contenido de ADN simple (Figura 1A) y se basa en un algoritmo de ajuste (disponible en la mayoría de los programas de citometría utilizados) utilizado para separar la población en fracciones de fase G1, S y G2 + M de los picos 1C y 2C. Las fracciones se multiplican por la población duplicando el tiempo7. Sin embargo, este método solo da valores estimados, requiere una distribución homogénea del tamaño de celda dentro de una fracción dada y no es aplicable a cultivos sincronizados. Para estudiar la duración de la fase S en células de mamíferos, se han desarrollado y utilizado ampliamente varios análogos de timidina, incluido EdU. Su absorción del medio extracelular y su fosforilación por la timidina quinasa (en lo sucesivo, TK) las ponen a disposición de las ADN polimerasas para incorporarlas en los sitios de síntesis de ADN (replicación, recombinación, reparación). Para evitar la ausencia del gen TK en las células de Saccharomyces cerevisiae , se han diseñado cepas de levadura para permitir la expresión estable y constitutiva del virus del herpes simple TK8 y el transportador de nucleósidos de equilibrio humano (hENT1)9. Una vez incorporado al ADN, EdU se detecta a través de la reacción selectiva de clic, que acopla químicamente su fracción alquina a fluorocromos modificados con azida10.

Este documento proporciona dos protocolos integrales optimizados para las células diseñadas con TK-hENT1 asíncronas y sincrónicas con etiquetas de pulso con EdU para visualizar y medir con precisión la duración y la dinámica de la replicación del ADN, así como la duración de las otras fases del ciclo celular, con alta resolución espacial y temporal tanto a nivel de célula única como de población mediante microscopía y citometría de flujo.

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Protocol

1. Cultivo celular de S. cerevisiae

NOTA: Las cepas de levadura utilizadas se enumeran en la Tabla 1

NOTA: La duración de la fase S se puede monitorear de diferentes maneras. Dependiendo de la pregunta a abordar, las células se pueden cultivar de forma asíncrona o sincrónica después de la detención de G1 .

  1. De células de S. cerevisiae de crecimiento asincrónico
    NOTA: Este método permite determinar el porcentaje de células en la fase S en una población celular de crecimiento asincrónico. Al determinar el tiempo de duplicación, se puede extrapolar la duración de la fase S (y las otras fases).
    1. Inocular células de S. cerevisiae en 10 ml de medio sintético completo (SC) a una concentración celular baja (5 × 104 células/ml) para un cultivo nocturno a 30 °C con agitación orbitaria a 130 rpm.
      NOTA: La concentración se mide con un contador de celdas. Para calcular eficientemente los tiempos de duplicación, se recomienda inocular el cultivo de un cultivo nocturno que todavía está en la fase exponencial (es decir, idealmente por debajo de 2 × 107 células/ml). No se recomienda cultivar células en medio rico (YPD), ya que la detección de EdU no es eficiente.
    2. Al día siguiente, diluir las células en 20 ml de medio SC fresco a la concentración final de 5 × 105 células/ml.
    3. Cultivar las células a 30 °C en un baño maría agitante con agitación horizontal a 120 rpm.
    4. Mida la concentración celular cada hora hasta que alcance 1 × 107 células/ml.
      NOTA: Este paso permite hacer una representación gráfica del aumento de la concentración celular con el tiempo. La fórmula utilizada para calcular los tiempos de duplicación se explica en la leyenda de la Tabla 2.
    5. Proceda en paralelo al paso 2 para el etiquetado de EdU cuando la concentración celular sea de aproximadamente 2 × 10 6-5 × 106 células/ml.
  2. De células de S. cerevisiae sincronizadas con G1
    NOTA: Este método permite determinar cuándo comienza y termina la fase S mediante citometría de flujo y/o análisis de microscopía.
    1. Inocular células de S. cerevisiae en 10 ml de medio SC a una concentración celular baja (5 × 104 células/ml) para un cultivo nocturno a 30 °C con agitación orbitaria a 130 rpm.
      NOTA: Consulte las notas después del paso 1.1.1.
    2. Al día siguiente, diluir las células en 20 ml de medio SC fresco a una concentración final de 2 × 10 6-3 × 106 células/ml.
    3. Añadir 40 μL de 1 mg/ml α factor diluido en agua.
    4. Cultivar las células a 30 °C con agitación orbital a 130 rpm durante 1 h.
    5. Añadir de nuevo 40 μL de 1 mg/ml de factor α diluido en agua.
    6. Cultivar las células a 30 °C con agitación orbital a 130 rpm durante 1 h.
    7. Visualice las células bajo un microscopio de luz para monitorear el arresto de G1 . Proceda si más del 90% de las celdas muestran un shmoo y las otras son células redondeadas y sin brotes.
      NOTA: Dependiendo del fondo utilizado, se recomienda sonicar las celdas antes de la visualización shmoo. Para el fondo W303, sonicate 2x, durante 2 s cada vez, a una amplitud de 40-50.
    8. Centrifugar durante 3 min a 1.500 × g. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
    9. Resuspender las células en 20 mL de medio SC.
    10. Repita los pasos 1.2.8-1.2.9 una vez.
      NOTA: El factor α se elimina con estos pasos y las células se liberan en el ciclo celular. Alternativamente, el factor α puede eliminarse filtrando las células de levadura con un filtro de nitrocelulosa de 1,2 μm utilizando un embudo colocado en un matraz de brazo lateral conectado a una bomba de vacío.
    11. Recoja 1 ml de células 2 veces cada 5 minutos y continúe con el paso 2 para el etiquetado de EdU.
      NOTA: Marque con pulsos las células de solo uno de los dos tubos con EdU. Las células no marcadas con pulsos se utilizan para distinguir las células EdU positivas de las células EdU negativas en un gráfico bivariado de yoduro de propidio (PI)-EdU.
    12. Añadir 400 μL de factor α de 1 mg/ml diluido en agua 30 min después de la liberación.
      NOTA: Esta dosis alta de factor α es necesaria para detener las células en la fase G1 del siguiente ciclo celular y para evitar que las células vuelvan a entrar en la fase S posterior.

2. Etiquetado EdU

  1. Transfiera 1 ml de cultivo celular a un tubo de microfuga de 2,0 ml que contenga 1 μL de 10 mM de EdU. Mezclar bien por inversión.
    NOTA: Para discriminar las células EdU positivas de las células EdU-negativas en un FACS bivariado PI-EdU, transfiera otro 1 ml de cultivo celular a un tubo de microfuga de 2,0 ml que contenga 1 μL de DMSO.
  2. Incubar durante 3-5 min a 30 °C bajo agitación en un baño maría agitante.
    NOTA: Tres minutos son suficientes para la detección de EdU con un microscopio; Se requieren 5 min para la detección óptima de EdU en un citómetro de flujo.
  3. Detenga la reacción con la adición de 100 μL de etanol al 100%.
    1. Detener la reacción con la adición de 100 μL de paraformaldehído al 20% si se requiere la medición del tamaño celular.
      NOTA: Si la arquitectura nuclear de las células mitóticas debe mantenerse intacta para análisis posteriores a la reacción Click, recomendamos fijar las células con paraformaldehído al 2% a temperatura ambiente (RT) en lugar de poner las células en hielo, ya que este último causa la despolimerización de los microtúbulos.
    2. Deje las celdas durante 20 minutos a RT bajo agitación suave en un balancín de velocidad variable a 20 inclinaciones / min para fijar las células antes de la adición de 100 μL de etanol al 100%.

3. Fijación celular y permeabilización

  1. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microfuga. Retire el sobrenadante con una pipeta de vacío.
  2. Resuspender el pellet celular en 500 μL de etanol al 70%. Mezclar bien por vórtice.
  3. Dejar actuar durante ≥1 h a RT a 20 inclinaciones/min en un balancín de velocidad variable para permeabilizar las células.
    NOTA: Las células cultivadas en medio SC no se granulan bien, ya que tienden a adherirse a las paredes de la microfuga. La adición de etanol mejora la granulación y reduce la pérdida celular. Las células pueden almacenarse a 4 °C durante la noche o durante períodos más largos a -20 °C.
  4. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microcentrífuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
  5. Lave las células 2 veces con 500 μL de etanol al 10% en PBS.
    NOTA: Los lavados son cruciales para eliminar la EdU no incorporada de las células.

4. Reacción de click-it

  1. Para análisis citométrico
    1. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microfuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
    2. Resuspender el pellet en 200 μL de PBS que contiene 0,1 mg/ml de RNasa A y 0,2 mg/ml de proteinasa K.
    3. Incubar durante 1-2 h a 50 °C con agitación ocasional (o durante la noche a 37 °C).
    4. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microcentrífuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
    5. Lave las células con 500 μL de PBS.
    6. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microfuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
    7. Resuspender el pellet celular en 200 μL de PBS + 1% de albúmina sérica bovina (BSA). Incubar durante 30 min en RT.
      NOTA: Los tiempos más largos no son necesarios e incluso son perjudiciales para la eficiencia de las reacciones de clic.
    8. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microcentrífuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
    9. Resuspender el pellet en 300 μL de PBS + 1% BSA.
    10. Distribuir las células entre dos tubos: 200 μL en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para la reacción Click y 100 μL en otro tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para la tinción Sytox Green.
    11. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microcentrífuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
    12. Para la tinción Sytox Green
      NOTA: Recomendamos encarecidamente tomar una alícuota para la tinción Sytox Green (sin Click) para obtener perfiles de referencia de contenido de ADN de alta calidad. De hecho, la reacción Click apaga fuertemente la fluorescencia intercalante, incluida la fluorescencia Sytox Green y PI. En consecuencia, la reacción Click puede distorsionar la lectura del contenido de ADN.
      1. Resuspender el pellet celular en 100 μL de PBS.
      2. Transfiera 10-30 μL (dependiendo de la concentración celular) a un tubo citómetro de flujo que contenga 300 μL de 50 mM de Tris-HCl, pH 7.5 y 0.5 μM Sytox Green.
      3. Sonicate 2x, durante 2 s cada vez, a una amplitud de 40-50.
      4. Dejar en la oscuridad hasta procesar las muestras en un citómetro de flujo.
        NOTA: Las células pueden mantenerse en esta etapa a 4 °C durante unos días.
    13. Para la reacción Click
      1. Prepare tampón de colorante azídico fresco mezclando los reactivos en el siguiente orden (cantidad para un tubo): 36 μL de PBS, 2 μL de 0,2 M CuSO4, 0,2 μL de 2 mM de azida Cy5 y 2 μL de ácido ascórbico 1 M.
        NOTA: Es posible preparar una mezcla maestra del tampón Azide Dye. Los reactivos deben mezclarse en el mismo orden que el mencionado anteriormente.
      2. Resuspender el pellet celular con 40 μL de mezcla de colorante azida recién hecha. Incubar a RT en la oscuridad durante 60 min.
      3. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microcentrífuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
      4. Lave las células 3 veces con 300 μL de etanol al 10% en PBS.
        NOTA: Los lavados son cruciales para eliminar toda la azida soluble de EdU-Cy5.
      5. Resuspender las células en 100 μL de 50 μg/mL PI en PBS. Dejar actuar durante 10 minutos en la oscuridad.
      6. Transfiera 10-30 μL de la suspensión celular (dependiendo de la concentración celular) a un tubo citómetro de flujo que contenga 300 μL de Tris-HCl de 50 mM, pH 7.5.
      7. Sonicate 2x, durante 2 s cada vez, a una amplitud de 40-50.
      8. Dejar en la oscuridad hasta procesar las muestras en un citómetro.
        NOTA: Las células pueden mantenerse en esta etapa a 4 °C durante unos días.
    14. Lea las muestras de Sytox Green usando un láser azul de excitación a 488 nm y un filtro 530/30 BP. Consulte la figura 1A para ver los resultados típicos. Lea las muestras bivariadas de PI-EdU en un diagrama de puntos utilizando un láser azul de excitación a 488 nm y un filtro 615/20 BP para el PI (eje x) y un láser rojo de excitación a 640 nm y un filtro 660/20 BP (eje y). Consulte la figura 1B para ver los resultados típicos.
      NOTA: La Figura 1C representa el resultado típico de PI-EdU bivariado FACS para células EdU-negativas. Permite la discriminación de las células EdU-negativas de las células EdU-positivas.
  2. Para análisis de microscopía
    1. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microcentrífuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
    2. Resuspender el pellet en 200 μL de PBS + 1% BSA. Incubar durante 30 min en RT.
    3. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microfuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
    4. Preparar tampón de colorante azídico fresco mezclando los reactivos en el siguiente orden (cantidad para un tubo): 36 μL de PBS, 2 μL de 0,2 M CuSO4, 0,2 μL de 2 mM de azida Dy-530, 2 μL de ácido ascórbico 1 M.
      NOTA: Se puede preparar una mezcla maestra del tampón Azide Dye fresco mezclando los reactivos en el orden antes mencionado.
    5. Resuspender el pellet con 40 μL de tampón Azide Dye recién hecho. Incubar a RT en la oscuridad durante 60 min.
    6. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microfuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
    7. Lave las células 2 veces con 300 μL de etanol al 10% en PBS.
      NOTA: Los lavados son cruciales para eliminar toda la azida soluble Dy-530.
    8. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microcentrífuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
    9. Resuspender las células en 100 μL de 0,5 μg/mL 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en PBS. Dejar actuar durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.
    10. Granular las células durante 2 min a 10.000 × g en una microcentrífuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
    11. Lavar con 300 μL de PBS para eliminar el exceso de DAPI.
    12. Granular las células durante 2 minutos a 10.000 × g en una microfuga. Deseche el sobrenadante con una pipeta de vacío.
    13. Resuspender el pellet con 10-50 μL de PBS dependiendo de la concentración celular.
    14. Sonicate 2x, durante 2 s cada vez, a una amplitud de 40-50.
      NOTA: Las células pueden mantenerse en esta etapa a 4 °C durante unos días.
    15. Pipetear 1,7 μL de las células en un portaobjetos de microscopio de vidrio y cubrir con un cubreobjetos limpio.
    16. Observe inmediatamente bajo un microscopio de fluorescencia con los filtros DAPI y TexasRed o Cy3.

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Representative Results

Para determinar la duración de la fase S y, más ampliamente, la duración de G 1 y G2 + M (paso del protocolo 1.1), las células de tipo salvaje W303 de S. cerevisiae (WT, Tabla 1) se cultivaron asíncronamente en medio SC durante 7 h. Cada hora, la concentración celular fue monitoreada para determinar el tiempo de duplicación (Figura 2B). En estas condiciones de crecimiento, el tiempo de duplicación calculado fue de 120 min ± 13 min a 25 °C (Tabla 2). Cuando las células estaban en la fase exponencial (2 × 10 6-5 × 106 células/ml), se marcó una alícuota de células marcadas con pulsos con EdU (10 μM) durante 5 min para seleccionar las células en la fase S y determinar el porcentaje de células que estaban en las fases G1, S y G2 + M. Se observaron tres poblaciones de células en un análisis bivariado del citómetro EdU-PI (Figura 1B). La discriminación entre las poblaciones EdU-negativo y EdU-positivo se realizó utilizando un experimento de control en el que las células no fueron marcadas con pulsos con EdU, sino que se llevó a cabo la reacción Click (Figura 1C). Las dos poblaciones negativas para EdU en las áreas inferior izquierda y inferior derecha que diferían en intensidad de PI correspondían a G1 y G2 + M, respectivamente (Figura 1B, C). Por lo tanto, la población superior (con una intensidad >1× 10 4-2 × 104) correspondió a las células EdU-positivas que estaban en la fase S en el momento del pulso (Figura 1B). Por lo tanto, el 27% ± el 5% de la población celular estaba en la fase G1, el 29% ± el 3% estaba en la fase S y el 44% ± el 2% estaba en G2 + M. Como el tiempo de duplicación fue de 120 min ± 13 min en estas condiciones, extrapolamos que las fases G1, S y G 2 + M duraron 32 min ± 4 min, 35 min ± 6 min y 53 min ± 7 min, respectivamente, a 25 °C (Tabla 2 y Tabla 3).

A continuación, nuestro objetivo fue validar este método y demostrar que es lo suficientemente sensible como para identificar mutantes con defectos de replicación del ADN que se han pasado por alto hasta ahora. Razonamos que los alelos sintonizables de pérdida de función de los factores involucrados en la replicación del ADN serían controles de validación ideales. Por lo tanto, utilizamos una cepa de levadura que contenía un mutante cdc6-1 sensible a la temperatura (Tabla 1)11. Cdc6 es un factor de licencia esencial que se expresa en M y G1 tardíos para ensamblar complejos de prereplicación (preRC) en sitios cromosómicos unidos a ORC que luego pueden usarse como orígenes de replicación. Por lo tanto, a una temperatura permisiva, su duración de la fase S debe ser la misma que la del WT, mientras que a una temperatura restrictiva, no debe ocurrir la replicación del ADN ya que no hay origen autorizado12. Sin embargo, a una temperatura semipermisiva, donde se autorizan menos orígenes pero hay suficientes para conferir viabilidad celular (nuestros datos no publicados; Barba Tena et al., en preparación), anticipamos diferentes duraciones para cada fase. Como era de esperar, según las pruebas de caída, las células cdc6-1 crecieron igual que las células WT a una temperatura permisiva (es decir, 25 ° C, Figura 2A), mostrando el mismo tiempo de duplicación (Figura 2B y Tabla 2), pero estaban muertas a 34 ° C o más (Figura 2A). De interés, a una temperatura semipermisiva (es decir, 28 °C), cdc6-1 fue viable (28 °C, Figura 2A). Sin embargo, el tiempo de duplicación fue mayor que para WT (Figura 2B y Tabla 2), y la duración de cada fase fue diferente. De hecho, en cdc6-1, G 1 fue ligeramente más corto (12 min ±1 min vs. 16 min ± 2 min), mientras que la fase S fue ligeramente extendida (34 min ± 4 min vs. 29 min ± 5 min), y la fase G2 + M fue significativamente más larga (77 min ± 4 min vs. 45 min ± 3 min) en comparación con WT (Figura 2C, D y cuadro 3). La fase S, sorprendentemente, no se extendió mucho, pero la intensidad media de la señal EdU disminuyó en un 25% (Figura 2C, D), lo que es consistente con una fase S iniciada desde menos orígenes. Además, mientras que las células WT positivas para EdU se distribuyeron homogéneamente entre las fases S temprana (S1) y tardía (S2) (Figura 2C, Figura Suplementaria S1A, fases tempranas [S1] y finales de S [S2] delimitadas con una línea discontinua vertical en la puerta superior), el 65% de las células cdc6-1 positivas para EdU se acumularon en la fase S tardía (Figura 2D, Figura Suplementaria S1B). Incluso no hubo una distinción clara entre las poblaciones S y G 2 + M (Figura 2D), lo que sugiere que las células lucharon para completar la fase S antes de entrar en la fase G2. Por lo tanto, este método es adecuado y sensible para identificar mutantes con defectos en la fase S (duración y/o distribución) y en la duración de la fase del ciclo celular.

Se ideó un método complementario para determinar cuándo las células comienzan y terminan su replicación del ADN y estimar la duración de la fase S utilizando células sincronizadas (paso del protocolo 1.2). Con este fin, utilizando α-factor con células sincronizadas en G1, las células se liberaron en medio SC y se recogieron cada 5 min. La duración de la fase S puede ser de aproximadamente 25 minutos en función del momento en que el contenido de ADN cambió de 1C a 2C en el perfil del citómetro de flujo Sytox Green (Figura 3A). Sin embargo, esta estimación depende de cuándo una fracción celular significativa de la población ha incorporado suficiente Sytox Green para ser visto en el perfil FACS. Los eventos de replicación temprana y tardía no se pueden detectar con este método. Para definir con precisión cuándo comienza y termina la fase S y cuánto dura, las células de fase S se seleccionaron de una alícuota de células al marcar el pulso con EdU (10 μM) durante 5 minutos cada 5 minutos después de la liberación de G1. Como era de esperar, dentro de los primeros 10 minutos después del lanzamiento, todas las células estaban en el área inferior izquierda (es decir, en G1, Figura 3B, Figura Suplementaria S2). Quince minutos después de la liberación, ya se detectó una fracción de células EdU positivas (comparar las dos primeras filas en la Figura Suplementaria S2 y la Figura Suplementaria S3, células tratadas con EdU y libres de EdU, respectivamente), lo que indica que la fase S había comenzado (Figura 3C). La progresión a través de la fase S fue observada por la nube celular moviéndose primero hacia arriba y luego hacia la derecha en el gráfico bivariado PI-EdU (Figura 3D-F). Finalmente, a los 35 min de la liberación, una fracción de células era EdU negativa pero con el doble de cantidad de ADN, lo que indica que esas células habían completado la fase S y estaban en la fase G2 + M (Figura 3G). Por lo tanto, la fase S dura 20 minutos en estas condiciones. Cabe destacar que, a pesar de la alta sincronía observada con la superposición del contenido de ADN detectado con Sytox Green, lo que sugiere que la fase S había terminado en toda la población 40 min después de la liberación, los análisis bivariados mostraron que algunas células terminaron la fase S 60 min después de la liberación y que la fase S estaba completa para toda la población 65 min después de la liberación (Figura 3H, I y figura suplementaria S2).

Además, la fase S y la síntesis de ADN pueden ser monitoreadas por microscopía. A partir de cada origen de replicación activada, la síntesis de ADN es llevada a cabo por dos replisomas atados, formando un foco de replicación nuclear que puede ser seguido por microscopía mediante la obtención de imágenes de una versión marcada de un factor de replicación y/o matriz de operadores y su correspondiente represor fusionado a una proteína fluorescente 2,13. Alternativamente, la síntesis de ADN puede ser detectada por microscopía utilizando análogos de timidina14,15. Utilizamos EdU para monitorear las regiones de ADN subnuclear que se someten a la síntesis de ADN. Con este fin, marcamos con pulsos células WT y cdc6-1 asíncronas con EdU (10 μM) durante 3 min a 28 °C y las visualizamos después de la reacción Click. Esperábamos detectar variaciones en las intensidades de la señal de EdU dependiendo de la tasa de síntesis de ADN y de la progresión celular en el ciclo celular durante el pulso EdU de 3 minutos (es decir, las células que pasan los 3 minutos completos en la fase S mostrarán una señal más fuerte que las que entran o salen de la fase S durante el pulso). En consecuencia, las células de fase S WT mostraron una señal de EdU en su núcleo que varió en intensidad (Figura 4A). La duración de la fase S se puede extrapolar fácilmente a partir de este análisis. De hecho, se determinó a partir de dos réplicas biológicas (se contaron al menos 150 células), que el 34% ± el 3% y el 38% ± el 3% de las células WT y cdc6-1 eran EdU positivas, respectivamente. Como en estas condiciones de crecimiento, el tiempo de duplicación fue de 90 min y 123 min para las células WT y cdc6-1, respectivamente (Tabla 2), extrapolamos que la fase S duró 31 min y 47 min, respectivamente. El primer resultado está en línea con el obtenido de nuestros análisis FACS (Tabla 3), lo que indica que la detección de células EdU positivas por microscopía permite determinar la duración de la fase S. Cabe destacar que este último es mayor que la duración de la fase S extrapolada de nuestros análisis FACS porque no hubo una distinción clara entre las poblaciones S y G2 + M (Figura 2D). Los focos de EdU se observaron fácilmente en las células WT (Figura 4B) pero fueron más tenues y menos en las células cdc6-1 (Figura 4C). Para descartar la posibilidad de que la diferencia de intensidad de la señal EdU entre las células WT y cdc6-1 dependiera del paso de la fase S, la intensidad se cuantificó a partir de células sincronizadas. Como era de esperar, la intensidad media de la señal de EdU fue tres veces menor en las células cdc6-1 (Figura 4D), consistente con la replicación del ADN iniciada a partir de menos orígenes de replicación. La señal EdU estaba restringida al núcleo, colocalizándose con una fuerte señal DAPI, y organizada en patrones globulares, consistentes con la organización de la replicación del ADN en regiones nucleares o fábricas de replicación. Es importante destacar que la EdU solo se detectó en células sin brotes o de brotes pequeños y nunca se presentó en células con brotes grandes, lo que indica que las células de levadura WT habían terminado de replicarse en el momento en que entraron en mitosis. Este método es, por lo tanto, sensible para visualizar la replicación del ADN a una alta resolución espacial, así como para detectar y cuantificar defectos leves de replicación del ADN.

Figure 1
Figura 1: Análisis representativos del FACS. (A) Análisis representativos de Sytox Green FACS para células WT cultivadas a 25 °C. (B,C) Análisis representativos de FACS bivariados EdU-PI para células WT cultivadas a 25 °C y marcadas por pulsos durante 5 min con EdU (10 μM) o 1 μL de DMSO. Los polígonos fueron los mismos en ambos análisis. C se utilizó para delinear las células EdU-negativas de las EdU-positivas (generalmente, el límite se establece en una intensidad >1× 10 4-2 × 104). La puerta del polígono superior delineaba las celdas positivas para EdU (fracción de fase S). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Fracción de células en las fases del ciclo celular G 1, S y G2 + M en poblaciones celulares asíncronas. (A) Las cepas WT y cdc6-1 se detectaron en diluciones seriadas de cinco veces en medio rico y se cultivaron a 25 °C, 28 °C o 34 °C. (B) Tiempo de duplicación de la población. Las células asíncronas WT y cdc6-1 se cultivaron a 25 °C o 28 °C, y la concentración celular se midió cada hora durante 7 h. (C,D) Análisis bivariado FACS de EdU-PI de células WT y cdc6-1 cultivadas a 28 °C y marcadas con pulsos durante 5 min con EdU (10 μM). Multiplicando el tiempo de duplicación de la población por la fracción de la fase S se obtiene la duración de la fase S. Las intensidades medias de las celdas EdU-positivas y EdU-negativas se calcularon como la media de la intensidad de cada valor en el polígono correspondiente. Las intensidades medias de las células WT y cdc6-1 EdU negativas (5.077 y 4.454, respectivamente) se normalizaron a 1. Las intensidades medias de las células WT y cdc6-1 EdU positivas (52.604 y 36.141, respectivamente) se dividieron por el factor de normalización utilizado para cada cepa. Los valores obtenidos fueron 10,4 y 8,1, respectivamente (es decir, una disminución del 25%, como se menciona en el texto). Abreviaturas: WT = tipo salvaje; EdU = 5-etinil-2'-desoxiuridina; FACS = clasificación celular activada por fluorescencia; IP = yoduro de propidio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Determinación de la duración de la fase S en células sincronizadas. (A) Análisis del curso temporal del contenido de ADN de las células WT después de la liberación del factor α a 28 °C. El tiempo indicado tiene en cuenta la duración del pulso EdU (5 min). (B-I) Análisis bivariados FACS de EdU-PI para células WT sincronizadas marcadas por pulsos durante 5 min con EdU (10 μM) y recogidas en los momentos indicados después de la liberación de la detención de G1. Abreviaturas: WT = tipo salvaje; EdU = 5-etinil-2'-desoxiuridina; FACS = clasificación celular activada por fluorescencia; IP = yoduro de propidio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Detección y cuantificación de EdU por microscopía. Las cepas asíncronas WT y cdc6-1 se cultivaron durante 2 h a 28 °C, y luego se marcaron por pulsos durante 3 min con EdU (10 μM) y se obtuvieron imágenes mediante microscopía de campo amplio utilizando filtros de excitación/emisión adecuados. (A) Imágenes representativas de microscopía de campo amplio para WT y (B,C) células individuales para WT y cdc6-1 visualizadas por DIC y teñidas con DAPI o para EdU, como se indica. Las barras de escala en (A) y (B,C) son 10 μm y 2 μm, respectivamente. (D) Mediciones de intensidad de EdU en células síncronas WT y cdc6-1 cultivadas a 28 °C 30 min después de la liberación de la detención de G1. El gráfico representa la agrupación de tres réplicas biológicas (se contaron al menos 50 células en cada réplica biológica). La media ± SD se muestran en el gráfico. Una prueba t de dos colas no pareada entre las células WT y cdc6-1 se indica por **** (p < 0,0001). Abreviaturas: WT = tipo salvaje; EdU = 5-etinil-2'-desoxiuridina; DIC = contraste de interferencia diferencial; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; U.A. = unidades arbitrarias. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Nombre Genotipo Figuras y tablas
WT (E3087): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 Fig.1, Fig.2A,B,C, Fig3, Fig.4A,B,D, Supp Fig.1,2,3 Tablas2,3
cdc6-1 (E5956): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(5x), AUR1c::ADH-hENT1 Fig.2A,B,D, Fig.4 C,D, Supp Fig.1, Tablas2,3
TK+ (E1000): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x) Supp Fig.4
TK+ hENT+ (E2031): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 Supp Fig.4
hENT+ (E2031): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, AUR1c::ADH-hENT1, RAD52-GFP, URA3::mCherry-TUB1 Supp Fig.4
CDC6-1 TK+ hENT+ (E3968): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, cdc6-1, RAD5, ura3::URA3/GPD-TK(7x), AUR1c::ADH-hENT1 Supp Fig.4
W303-1A (E001): MATa, ade2-1, trp1-1, can1-100, leu2-3,112, his3-11,15, RAD5, ura3-1 Supp Fig.4

Tabla 1: Lista de las cepas utilizadas en este estudio.

WT CDC6-1
25 °C 28 °C 25 °C 28 °C
Tiempo de duplicación (min) 120 90 118 123
SD ± 13 min ± 3 min ± 10 min ± 6 min

Tabla 2: Tiempos medios de duplicación de cepas WT y cdc6-1 cultivadas a 25 °C y 28 °C. Los tiempos de duplicación se calcularon a partir de tres réplicas biológicas (cuatro réplicas técnicas para cada réplica biológica) utilizando la siguiente fórmula: Δt × ln(2)/ln(Cf/Ci), donde Cf y Ci corresponden a las concentraciones celulares final e inicial, respectivamente, y Δt corresponde a la diferencia en minutos entre tf y ti, cuando se midieron Cf y Ci, respectivamente.

WT CDC6-1
25 °C 28 °C 25 °C 28 °C
Por ciento Duración
(min)		 Por ciento Duración
(min)		 Por ciento Duración
(min)		 Por ciento Duración
(min)
G1 27 32 18 16 13 16 10 12
S 29 35 32 29 28 34 28 34
G2+M 44 53 50 45 59 71 62 77
SD G1 ±5 ±4 ±3 ±2 ±2 ±1 ±1 ±1
SD S ±3 ±6 ±5 ±5 ±5 ±7 ±4 ±4
SD G2+M ±2 ±7 ±4 ±3 ±4 ±4 ±6 ±4

Tabla 3: Fracciones medias de células y duración de las fases G 1, S y G2 + M en células WT y cdc6-1 cultivadas a 25 °C y 28 °C. Las fracciones de células se determinaron a partir de tres réplicas biológicas (dos réplicas técnicas para cada réplica biológica). Las diferencias en la duración de G 1, S y G2 + M entre las células WT y cdc6-1 cultivadas a 28 °C fueron estadísticamente significativas (prueba t de dos colas no pareada, p <0,1).

Figura suplementaria S1: Fracción de células en las fases S temprana y tardía en células WT y cdc6-1 cultivadas a 28 °C. Se dibujaron dos polígonos idénticos llamados S1 y S2 para las fases S temprana y tardía, respectivamente, en la fracción de células EdU positivas para dividirlo en dos mitades en los análisis bivariados FACS de EdU-PI para (A) células WT cultivadas a 28 °C y (B) células cdc6-1 cultivadas a 28 °C. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S2: Progresión del ciclo celular de las células marcadas con pulso de EdU después de la liberación de la detención de G1 visualizada por FACS bivariado EdU-PI. Se marcó una alícuota de células marcada con pulso durante 5 min con 10 μM EdU cada 5 min después de la liberación de la detención de α factores a 28 °C y hasta 80 min, como se indica. Abreviaturas: EdU = 5-etinil-2'-desoxiuridina; FACS = clasificación celular activada por fluorescencia; IP = yoduro de propidio. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S3: Progresión del ciclo celular de las células tratadas con DMSO después de la liberación de la detención de G1 visualizada por FACS bivariado EdU-PI. Esto es lo mismo que la Figura Suplementaria 2, pero las células se incubaron durante 5 min con 1 μL de DMSO (dimetilsulfóxido). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura suplementaria S4: Toxicidad BrdU y EdU en células de levadura TK hENT1. Las células del genotipo indicado se detectaron en diluciones en serie de cinco veces en placas de YPD que contenían concentraciones crecientes de BrdU o EdU y se cultivaron durante 40 h a 30 °C. Abreviaturas: DMSO = dimetilsulfóxido; BrdU = bromodeoxiuridina; Edu = 5-etinil-2'-desoxiuridina; TK = timidina quinasa; hENT1 = transportador de nucleósidos de equilibrio humano. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

La levadura es un organismo modelo principal para estudios del ciclo celular, sin embargo, la caracterización de su fase S se ha visto obstaculizada durante mucho tiempo por su incapacidad para incorporar nucleósidos exógenos, como BrdU, que se utilizan como trazadores de la replicación del ADN. El equipamiento de la levadura con una alta expresión de herpes simple timidina quinasa (TK) y la adición de un transportador de nucleósidos humanos (hENT) ha resuelto en gran medida este problema15,16. EdU es más versátil que BrdU ya que su detección con azida fluorescente pequeña y química Click es susceptible de células de levadura permeabilizadas y análisis FACS, a diferencia de los anticuerpos anti-BrdU17. Aquí, optimizamos las condiciones de etiquetado y detección de EdU en esta cepa TK-hENT1 y demostramos que los defectos de replicación no detectados previamente se pueden cuantificar utilizando este protocolo mediante FACS o microscopía.

Estudiar un mecanismo biológico utilizando herramientas que pueden interferir con el mismo mecanismo es un problema común en biología. Como EdU tiene un efecto citotóxico conocido, buscamos concentraciones de EdU que no son tóxicas en la exposición crónica a la cepa TK-hENT1 modificada y encontramos que 10 μM es una dosis adecuada. Las células TK-hENT1 no proliferan a 25 μM EdU, mientras que las células TK solas o hENT1 solas soportan fácilmente 100 μM EdU (Figura suplementaria S4). Aunque las células de levadura son considerablemente más sensibles a EdU que BrdU, encontramos que la proliferación disminuyó solo después del segundo ciclo celular después de la exposición a EdU, lo que sugiere que debe incorporarse en ambas hebras para afectar la proliferación celular (datos no mostrados). Para permanecer seguros, utilizamos 10 μM EdU a lo largo de este protocolo, solo con pulsos cortos (3 min para microscopía; 5 min para FACS), y encontramos que esto era adecuado para una buena detección utilizando este protocolo optimizado.

Los defectos sutiles en la replicación del ADN pueden tener un fuerte impacto en los reordenamientos cromosómicos4. Por lo tanto, el desarrollo de técnicas y protocolos capaces de detectar estos defectos sutiles es clave para descubrir la etiología de las aberraciones cromosómicas. Aquí, mostramos que este protocolo optimizado de incorporación y detección de EdU puede medir hasta una reducción de tres veces en la intensidad de la señal (Figura 2 y Figura 4), lo que indica que la tasa de síntesis de ADN se reduce en células cdc6-1 sensibles a la temperatura cultivadas a 28 ° C, que, hasta el momento, no muestran defectos en los ensayos de viabilidad de la placa (Figura 2A ). Este protocolo de incorporación y cuantificación de EdU puede, por lo tanto, usarse para detectar otros mutantes para los cuales inicialmente no se sospechan defectos de replicación. Además, puede ser útil para detectar la síntesis de ADN mitótico (MiDAS), la síntesis de ADN dependiente de la recombinación meiótica u otra síntesis de ADN de tracto largo.

Un inconveniente es que la detección de EdU se puede realizar solo en células fijas, lo que impide el análisis en vivo como con PCNA-GFP u otras lecturas fluorescentes de replicación de ADN, que sufren de la alta fototoxicidad de los rayos láser utilizados para obtener imágenes. El crecimiento de células en un medio sintético es crucial para una mejor detección, ya que los restos de YPD parecen apagar significativamente la reacción de clic. Curiosamente, la singularización de las células de fase S utilizando el análisis bivariado de EdU-PI FACS en poblaciones sincronizadas permite estimar la duración de la fase S a 20 min en células individuales (Figura 3, Figura Suplementaria S2 y Figura Suplementaria S3). Sin embargo, incluso cuando la sincronía después de la liberación de α factores parece tan casi perfecta como en el análisis clásico de Sytox Green FACS (Figura 3A), queda claro a partir del análisis bivariado de EdU-PI FACS que las células entran en la fase S de forma relativamente asíncrona (Figura 3B-I).

Aquí, describimos tres métodos para determinar la duración de la fase S utilizando citometría de flujo y microscopía en células síncronas y asíncronas tanto a nivel de célula única como de población. Las duraciones promedio de la fase S determinadas en células WT asíncronas a nivel poblacional son similares utilizando citometría de flujo y microscopía, a 29 min y 31 min, respectivamente, mientras que nuestro enfoque sincronizado basado en células individuales muestra que la duración puede ser tan corta como 20 min (Figura 2, Figura 3, Figura 4 y Tabla 3 ). La discrepancia entre estos valores es sorprendente, pero puede explicarse fácilmente. De hecho, con nuestro enfoque basado en una sola célula, la duración de la fase S se determinó en función de los eventos más tempranos (es decir, las primeras células que entran y salen de la fase S, Figura 3C, G), pero no implica que la fase S dure 20 minutos en cada célula dentro de una población. Estos datos apoyarían la noción inesperada de que existe un cierto nivel de heterogeneidad en la duración de la fase S entre las células.

Los protocolos mejorados o las nuevas técnicas pueden derrocar dogmas de larga data o ideas novedosas. Hay tres que estos datos desafían. En primer lugar, se cree que la síntesis de ADN es concomitante con la aparición de brotes en S. cerevisiae. La Figura 4A-C muestra que la tinción de EdU es más fuerte en células sin brotes y con brotes pequeños, a pesar del retraso de etiquetado de 3 minutos, lo que indica que la fase S comienza claramente antes de la gemación, como se mostró anteriormente16. En segundo lugar, se informa que las células de levadura no tienen una fase G2, con husos mitóticos que se forman al mismo tiempo que la síntesis de ADN. Los pulsos muy cortos combinados con la detección sensible de EdU por FACS (Figura 3, Figura Suplementaria S2 y Figura Suplementaria S3) o microscopía (Figura 4) permiten determinar con precisión cuándo comienza y termina la fase S en células individuales. Al hacerlo, encontramos que la síntesis masiva de ADN termina 40 minutos después de la liberación del factor α (Figura 3, Figura Suplementaria S2 y Figura Suplementaria S3), mientras que los husos mitóticos cortos solo se forman 20 minutos más tarde16 (datos no mostrados). Concluimos que las células de levadura tienen una fase G2. En tercer lugar, se propuso recientemente que hasta el 30% de las células de levadura completan la síntesis de ADN en anafase-telofase18. Usando este protocolo optimizado, no detectamos la incorporación de EdU en células que muestran un huso de anafase/telofase (datos no mostrados), pero no podemos descartar que esta segunda ola de síntesis de ADN esté por debajo del umbral de detección utilizado. Dada la fuerte relación señal/ruido, consideramos que esta última opción es poco probable.

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Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Acknowledgments

Los autores desean agradecer a la Agence Nationale de la Recherche (ANR) y a la Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC) por las becas de doctorado a J.d.D.B.T. y a la Agence Nationale pour la Recherche (ANR) por su apoyo financiero (subvención ANR-18-CE12-0018-01). La citometría y la microscopía se realizaron en el centro de imágenes BioCampus de Montpellier MRI.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
α-factor  Genescript RP01002
Bovine Serum Albumin (BSA) Euromedex 04-100--812-E
Copper sulfate Sigma C1297
DAPI Sigma D9542
Di-sulfo-Cyanine5 azide (Cy5 azide) Interchim FP-JV6320 Alternative to Alexa647-Azide
Dy-530 azide Dyomics  530-10
EdU (5-ethynyl-2’-deoxyuridine) Carbosynth NE08701
Ethanol absolute Carlo Erba reagents P013A10D16 or equivalent
L- ascorbic acid Sigma A4544
Propidium iodide Sigma P4864
Proteinase K Euromedex EU0090
Rnase SIGMA R5000
Sytox Green Invitrogen S-7020
Equipment
Cell counter OLS CASY
Flow cytometer Agilent NovoSampler Pro
Shaking incubator Infors 444-4230 or equivalent
Shaking water bath Julabo SW22 or equivalent
Sonicator Sonics Vibra cell
Wide-field microscopy Leica THUNDER Imager or equivalent

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References

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Biología Número 188
Determinación de la duración de la fase S mediante la incorporación de 5-etinil-2'-desoxiuridina en <em>Saccharomyces cerevisiae</em>
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Barba Tena, J. d. D., Schwob, E.,… More

Barba Tena, J. d. D., Schwob, E., Talarek, N. Determination of S-Phase Duration Using 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine Incorporation in Saccharomyces cerevisiae. J. Vis. Exp. (188), e64490, doi:10.3791/64490 (2022).

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