Summary
抗生素持久性描述了敏感等基因人群中的小亚群暂时耐受高剂量杀菌抗生素的能力。本协议结合了在将 大肠杆菌 暴露于致死剂量的氧氟沙星后在分子和细胞水平上表征抗生素持久性表型的方法。
Abstract
抗生素持久性是指小细菌亚群暂时耐受高剂量杀菌抗生素的能力。在杀菌抗生素治疗后，大部分细菌种群被迅速杀死。杀伤的第一个快速阶段之后是杀伤率的大幅降低，因为持久性细胞仍然存活。通常，持久性是通过使用高剂量抗生素和规定的暴露时间进行的时间/杀伤测定在群体水平上确定的。虽然这种方法提供了有关持久性细胞水平和杀伤动力学的信息，但它未能反映持久性现象背后的内在细胞间异质性。这里描述的方案将经典的时间/杀伤测定与使用实时荧光显微镜的单细胞分析相结合。通过使用适当的荧光报告基因，活细胞的显微镜成像可以提供有关抗生素对细胞过程的影响的信息，例如染色体复制和分离，细胞伸长和细胞分裂。结合群体和单细胞分析可以对持久性表型进行分子和细胞表征。
Introduction
该协议旨在分析在单细胞和群体水平上响应特定抗生素治疗的细菌持久性表型。持久性描述了同基因群体中小亚群承受高剂量杀菌抗生素（氟喹诺酮类、氨基糖苷类、β-内酰胺类等）的能力，所谓的持久性细胞的最小抑制浓度（MIC）与大部分人群的抑制浓度相同。双相杀伤动力学，当测量细菌在抗生素存在下随时间推移的存活时，揭示了短暂耐药细胞的存在，最初快速根除非持久性细胞，随后对持久性细胞的杀伤速度要慢得多。去除抗生素后，这些细胞会产生基因相同的群体，当用相同的抗生素处理时，这些群体表现出相似的杀伤动力学1，2。与持久性相反，抗生素耐药性是在群体水平上定义的，通常是新生突变或赋予耐药质粒的水平基因转移的结果3。虽然导致耐药性的突变主要位于药物靶标或药物外排泵的促进者区域，但改变全基因组和靶向突变分析方法鉴定的持久性频率的基因已被证明是多种多样的2，3，4，5，6，7，8.因此，细菌细胞很可能通过多种途径9，10，11进入持久性状态，并且需要在单细胞水平上研究持久性现象的方法来表征这些持久性细胞的生理学。
最近与荧光显微镜结合使用的微流体工具的发展为持久性表型的表征铺平了道路，并强调了关键细胞过程（例如染色体复制12，DNA修复13和细胞分裂14）在持久性细胞形成中的作用。在本文中，我们描述了一种将经典微生物学测定与单细胞实时成像相结合的综合方法，以表征用高剂量氧氟沙星处理的指数生长的大肠杆菌培养物中产生的持久性细胞。此处描述的方案可用于研究其他细菌物种中的抗生素持久性现象，例如枯草芽孢杆菌15或条件（例如，β-内酰胺处理后的抗生素持久性16），并且可以很容易地修改以研究涉及表型异质性的许多现象17，18，19.此外，本文中描述的设置可以与其他荧光报告基因结合使用，以研究感兴趣的不同细胞参数，例如单细胞水平的pH20或ATP21的细胞内水平，这可能会对抗生素持久性现象产生新的见解。
Protocol
注意：使用无菌培养玻璃器皿、移液器吸头和生长培养基。在这里， 大肠杆菌 细胞在低自发荧光化学定义的培养基中生长（见 材料表）。接种在本生燃烧器存在的情况下进行，以尽量减少污染风险。
1. 细胞培养和生长曲线
- 在Luria-Bertaini（LB）琼脂平板上从冷冻甘油原液中划线感兴趣的菌株（如果需要，补充有选择性抗生素），并在37°C孵育过夜（15小时至19小时之间）以获得单个菌落。
注意：这里介绍的实验使用两种菌株，对应于wt菌株的大肠杆菌K-12 MG1655和同基因MG1655 hupA-mCherry菌株22。后一种菌株表达HU类核相关蛋白的荧光标记α亚基。hupA-mCherry报告器集成在hupA的原生位点。HU-mCherry作为代理来跟踪活细胞中的类核动力学，因为它以非特异性方式与DNA结合。 - 接种 5 mL 培养基（此处为 3-[N-吗啉基] 丙烷磺酸基培养基 [MOPS];表1，表2和表3）补充有葡萄糖0.4%和选择性抗生素（如果需要），在玻璃管（≥25mL）中分离菌落，并将管置于设置为37°C和每分钟180转（rpm）的振荡培养箱中过夜（15小时至19小时之间）。或者，可以使用塑料管、玻璃或塑料烧瓶（≥ 25 mL）代替玻璃管。
注意：在整个本文描述的实验中使用了补充有最终浓度为0.4%的甘油的MOPS培养基，除了在MOPS葡萄糖0.4%中进行的过夜培养物。补充葡萄糖的MOPS中 大肠杆菌 的生成时间短于MOPS甘油。在此步骤中使用MOPS葡萄糖0.4%而不是MOPS甘油0.4%可确保细胞在19小时内到达固定相。也可以使用其他生长培养基，例如补充有不同碳源的M9或富定义培养基（RDM）。然而，应该注意的是，生长速率和持久性频率因所用介质和/或碳而异23. - 第二天早上，将1mL培养物以2，300×g离心3分钟，弃去上清液，并将沉淀轻轻重悬于相同体积的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。测量 600 nm （OD 600 nm） 处的光密度，并计算初始OD 600 nm 为 0.01nm 所需的体积，最终体积为 2 mL。
- 将 2 mL MOPS 甘油 0.4% 培养基放入透明底部 24 孔板的孔中，并接种计算的过夜培养体积。将24孔板置于自动酶标仪（参见 材料表）中以监测OD600nm24 小时。将酶标仪设置为在37°C的温度和高轨道旋转（140rpm）下每15分钟测量OD600nm 。
注意：如果实验中使用的菌株编码荧光报告基因，请确保其生长速率与 wt 的生长速率相当，以避免在随后的实验中出现任何伪影，因为生长速率会影响抗生素的持久性频率23。由于极低细胞密度下的检测局限性以及对OD600 nm/菌落形成单位（CFU）关系的潜在菌株特异性影响，建议在处理未表征的菌株时通过监测CFU·mL-1 来评估生长动力学。
2.抗生素最小抑菌浓度的测定
注意：最低抑制浓度（MIC）定义为未观察到细菌生长的最低剂量的抗生素。需要对每种抗生素和菌株进行MIC的测定。在这里描述的实验中，使用了氟喹诺酮类抗生素氧氟沙星（OFX）。MIC的测定可以确认抗生素溶液已正确制备，抗生素具有活性，并且菌株对抗生素同样敏感。在这里，执行已发表的琼脂稀释方法以确定所用不同菌株的MIC到OFX24。给定抗生素对给定细菌菌株的MIC也可以通过肉汤稀释法24来确定。
- 制备用于MIC测定的板
- 通过将 5 mg OFX 溶解在 1 mL 超纯水中，为实验中使用的抗生素制备主储备溶液。加入 20 μL 37% HCl 以增加 OFX 的溶解度。
- 融化100mL无菌LB琼脂，并保持在55°C以避免凝固。准备六个小玻璃烧瓶（25 mL），并使用无菌移液管将5 mL液体LB琼脂培养基移液到每个烧瓶中。
- 在 90 μL 超纯水中稀释 10 μL 的 5 mg·mL-1 OFX 原储备液（母原液的 1：10 稀释度）。向含有 5 mL 琼脂培养基的六个玻璃烧瓶中分别加入 0 μL、2 μL、4 μL、6 μL、8 μL 或 10 μL 的 500 μg·mL-1 OFX 溶液中，以生成终浓度为 0 μg·mL−1、0.02 μg·mL−1、0.04 μg·mL−1 的 LB 琼脂培养基， 分别为0.06 μg·mL−1、0.08 μg·mL−1和0.1 μg·mL-1 OFX。通过旋转烧瓶几次来混合溶液。
注意：如果已知目标抗生素的MIC，则浓度范围应从低于实际MIC到高于实际MIC为止。如果 MIC 未知，建议使用log2 稀释系列的大浓度范围。在添加抗生素之前，请确保LB琼脂培养基已冷却，因为高温可能会使其失活。然而，重要的是在添加抗生素之前不要让LB琼脂培养基凝固，因为这可能导致抗生素在LB琼脂培养基中的非均匀分布。 - 使用无菌移液管将步骤2.1.3中制备的6种LB琼脂培养基中的每一种5mL以剂量递增的方式倒入6孔培养板中。让琼脂冷却直至凝固，并在使用前将板干燥。
注意：在进行测定的当天准备抗生素溶液和培养板。
- MIC 测定测定
- 将5mL LB培养基与玻璃管（≥25mL）中的分离菌落接种，并将玻璃管置于设置为37°C和180rpm的振荡培养箱中过夜（15小时至19小时之间）。
- 第二天早上，测量OD600nm，并将培养物稀释到试管中至PBS中的最终细胞密度为1 x 107 CFU·mL-1 。对于此处测试的菌株，1 x 107 CFU·mL−1 对应于 OD600 nm 为 0.0125。
注意：如果CFU·mL-1与OD 600 nm之间的相关性未知，则应建立CFU和OD 600 nm测量确定的生长曲线，以计算CFU·mL-1与OD 600 nm之间的相关因子。 - 将 2 μL 先前稀释的培养物点到干燥的 6 孔板的每个孔上。在将板放入37°C的培养箱中过夜（15小时至19小时之间）之前，让斑点干燥。
- 第二天，计算每个孔中形成的菌落。MIC对应于未检测到细菌生长的抗生素最低浓度的孔。
3. 点测定
注意：点测定方法是一种定性方法，可以估计活细胞（抗生素应激后能够产生集落的细胞）的数量。在定时杀灭测定之前进行点测定，以深入了解测试条件下使用的菌株的可行性，并告知定时杀灭测定期间所需的稀释度（见第4节）。
- 为了制备用于点测定的LB琼脂平板，将50mL的LB琼脂倒入方形培养皿（144cm2）中。每个时间点准备一个方形培养皿。让LB琼脂凝固，并在使用前干燥平板。
- 在玻璃管（≥25mL）中接种5mL培养基（MOPS葡萄糖0.4%），并将管置于设置为37°C和180rpm的振荡培养箱中过夜（15小时至19小时之间）。
- 第二天，测量OD600nm，并将培养物稀释到玻璃管（≥25mL）中的新鲜温度调节培养基（37°C，MOPS甘油0.4%）中至最终OD600nm ~0.001。让培养物在37°C的培养箱中以180rpm（15小时至19小时）生长过夜。
- 第二天，测量OD 600nm，并将培养物孵育至最终OD600nm为0.3。
- 孵育时，通过将 90 μL 的 0.01 M MgSO4 溶液放入除第一行（A 行）的孔之外的每个孔中来制备 96 孔板。96孔板将用于步骤3.7中的10倍系列稀释。
注意：在本实验中，在七个不同的时间点对两种菌株（wt 和 hupA-mCherry 菌株）一式三份进行测试。由于一块板由12根色谱柱组成，因此一块板可用于两个时间点，因此总共制备了四个板。 - 在OD 600nm为0.3时，提取每种细菌培养物的200μL 。这些样品对应于抗生素治疗前的t0（未处理）时间点，并允许在抗生素治疗前测定CFU·mL-1 。
- 将样品以2，300 x g 离心3分钟。在离心期间，将所需浓度的OFX加入液体培养物中，并在振荡的同时继续在37°C下孵育。
注意：这里使用浓度为5μg·mL-1 的OFX（相当于MIC乘以83倍）。在先前的研究中，该浓度用于表征OFX暴露25下的持久性现象。用于定时/杀灭测定的抗生素浓度可能因抗生素、培养基和细菌生长状态而异。 - 离心后，将细胞沉淀重悬于200μL的0.01M MgSO4 溶液中。将 100 μL 放入步骤 3.5 中制备的 96 孔板的空孔中。通过将 10 μL A 行的孔转移到含有 90 μL 0.01 M MgSO4 的 B 行孔中进行稀释。通过将 B 行中的 10 μL 孔转移到 C 行的孔中来继续连续稀释.重复直至达到 10−7 的稀释度（每次转移为 10 倍稀释）。
注意：在本实验中，每个时间点测试六种培养物（三种用于 wt 菌株，三种用于 hupA-mCherry 菌株）。根据该方案，使用多通道移液器同时对六种菌株进行连续稀释。为了尽量减少技术错误，移液器吸头在每次转移之间更换。 - 将每种稀释液的 10 μL 点到步骤 3.1 中制备的 LB 琼脂平板上。
注意：多通道移液器用于同时发现六种培养物的相同稀释度（例如，10−4 稀释液）。在点样过程中，应使用多通道移液器的第一挡块，而不推第二挡块，因为这会导致微滴被分配到板上。 - 在加入抗生素后的相关时间点，取出 200 μL 培养物，并按照步骤 3.8 中所述进行连续稀释。如步骤 3.9 中所述，点缀每次稀释液 10 μL。
注意：对于此处描述的实验，收集了七个时间点（t0，t1h，t2h，t3h，t4h，t5h，t6h）。对于与 wt 相比表现出更高的抗生素敏感性的菌株，可以在MgSO4 0.01 M中进行多次洗涤以去除残留的抗生素。 - 将板在37°C孵育过夜（15小时至19小时之间）。第二天，计算可以检测到菌落的两个最高稀释度的菌落数。理想情况下，琼脂平板上用于这些稀释液的斑点包含3至30个菌落，从而可以准确测定每个样品的CFU·mL-1 。
- 通过将计算出的每个时间点的CFU·mL-1除以t0处初始群体的CFU·mL-1来计算生存率。
4. 定时杀伤测定
注意：虽然斑点测定是一种易于使用的方法，用于估计给定抗生素的给定菌株的存活率，但定时杀灭测定可提供更高分辨率的存活率，并且用于准确量化细菌活力。杀伤曲线的轮廓可用于确定给定细菌菌株在给定条件下是否对抗生素敏感、耐受或耐药。此外，定时杀灭测定可以确定检测持久性现象（双相杀灭曲线第二斜率的开始）以及持久性频率所需的抗生素暴露时间。
- 准备LB琼脂平板用于定时电镀测定。将 25 mL LB 琼脂倒入培养皿 （±57 cm2） 中。每个时间点至少准备两个培养皿（每个时间点接种每个菌株两次稀释）。
- 让LB琼脂凝固，并干燥平板，然后向每个平板添加五到八个无菌玻璃珠。根据应变/条件/时间点倒置并标记板。
注意：玻璃珠允许细菌在步骤4.7和步骤4.9期间在琼脂平板上传播。或者，可以使用撒布器将细胞分散在琼脂平板上。 - 对于每个样品，制备含有 900 μL 0.01 M MgSO4 溶液的 10 倍系列稀释玻璃管。每个样品需要制备的稀释玻璃管数量对应于在斑点测定中检测菌落所需的稀释度。
- 在玻璃管（≥25mL）中接种5mL培养基（MOPS葡萄糖0.4%），并将管置于设置为37°C和180rpm的振荡培养箱中过夜（15小时至19小时之间）。
- 生长16小时后，测量OD 600nm，并将培养物稀释到玻璃管中的新鲜温度调节培养基（37°C，MOPS甘油0.4%）中至最终OD600nm~0.001。让培养物在37°C的培养箱中以180rpm（15小时至19小时）生长过夜。
- 第二天，测量OD 600nm，并将培养物孵育至最终OD600nm为0.3。
- 在OD 600nm为0.3时，取出100μL培养物，根据斑点测定中获得的数据稀释（在OD 600nm为0.3且不含抗生素的情况下，10-5稀释通常产生200-300菌落），并在步骤4.1-4.2制备的LB琼脂平板上平板100μL。 轻轻摇动平板以避免珠子接触培养皿边缘，因为这会导致细菌细胞在LB琼脂培养基上的非均匀扩散。抗生素治疗前的第一个样本对应于t0时间点（抗生素治疗前的CFU·mL-1）。
- 加入所需浓度的OFX，并在振荡的同时继续在37°C下孵育。
注意：这里使用浓度为5μg·mL-1 的OFX（相当于MIC乘以83倍）。 - 在加入抗生素后的相关时间点，取出100μL培养物，根据点测定中获得的数据稀释，并在步骤4.1-4.2制备的LB琼脂平板上平板100μL。如步骤4.7所述将细胞铺板。
注意：对于此处描述的实验，收集了七个时间点（t0，t1h，t2h，t3h，t4h，t5h，t6h）。对于与 wt相比表现出更高的抗生素敏感性的菌株，可以在MgSO4 0.01 M中进行多次洗涤以去除残留的抗生素。 - 将板在37°C孵育过夜（15小时至19小时之间）。第二天，计算可以检测到菌落的两个最高稀释度的菌落数。理想情况下，板应包含30-300个菌落，以便准确测定每个样品中的CFU·mL-1 。
- 通过对每个时间点的CFU·mL-1在t0处的CFU·mL-1进行归一化来计算存活率。将对数10 归一化 CFU·mL-1 绘制为时间的函数。
5. 微流控延时显微镜成像
注意：以下部分描述了微流体板的制备以及延时图像采集和图像分析程序。本实验的目的是在单细胞水平上观察和分析抗生素治疗后的持久性表型。在该实验期间收集的数据可用于产生广泛的结果，具体取决于所解决的问题和/或实验中使用的荧光报告基因。在这里描述的实验中，对细胞长度和HU-mCherry荧光22进行了定量分析，反映了持久性和非持久性细胞中的类核组织。
- 用于微流控延时显微镜的细菌细胞培养
- 将5mL培养基（MOPS甘油0.4%，如果需要，补充选择性抗生素）接种在玻璃管（≥25mL）中的分离菌落，并将管置于设置为37°C和180rpm的振荡培养箱中过夜（15小时至19小时之间）。
- 第二天，测量OD 600nm，并将培养物在玻璃管中的新鲜温度调节培养基（37°C，MOPS甘油0.4%）中稀释至最终OD600nm~0.001。让培养物在37°C和180rpm的振荡培养箱中生长过夜（15小时至19小时），以便在第二天获得早期指数期培养物。
- 微流控板的制备和延时显微镜成像
注意：微流体实验可以在市售的微流体装置（如此处所述）或内部生产的微流体系统中进行。- 从微流体板的每个孔中取出保存溶液（如果存在），并用新鲜培养基替换它。
注意：如果微流控板包含废物出口井，则应去除出口井的保存溶液，但不要用介质替换。 - 通过单击“ 密封 ”按钮或通过微流体软件（首先选择“工具”，然后选择“密封板”）使用歧管系统 密封微流控 板。
注意： 要密封板，应通过手动将板挤压到歧管上，对板和歧管施加均匀的压力。如果执行正确，注释“密封”应出现在 ONIX2 界面上。重要的是不要对载玻片施加任何压力，以避免任何破坏歧管的潜在风险。 - 密封后，执行第一个启动序列（单击微流体软件界面上的运行 液体启动序列 ）。
注意： 运行液体 灌注顺序对应于1-5孔在6.9 kPa下灌注5分钟，然后对于8井在6.9 kPa下灌注5分钟，在6.9 kPa下对6井进行最后一次灌注，持续5分钟。 运行液体灌注序列 允许去除可能仍然存在于连接不同孔的通道中的保护溶液。 - 在显微镜成像开始之前，将板在显微镜的恒温控制柜中以所需温度（此处为37°C）孵育至少2小时。
- 在开始实验之前开始第二次 运行液体启动序列 。
- 通过单击微流体软件界面上的密封来密封微流控板。用 200 μL 新鲜培养基替换孔 1 和孔 2 中的培养基，在孔 3 中用 200 μL 含有抗生素的新鲜培养基替换培养基（此处为 5 μg·mL−1），在孔 4 和孔 5 中用 200 μL 新鲜培养基替换培养基，在孔 6 中用 200 μL 新鲜培养基替换培养基，在孔 8 中用 200 μL 培养样品（来自步骤 5.1.2）稀释至OD 600 nm 在新鲜培养基中为 0.01。
- 如步骤5.2.2所述密封微流控板，并将板放在显微镜柜内的显微镜物镜上。
注意：在放置微流体板之前，请确保将一滴浸油滴在显微镜物镜上。 - 在微流控软件中，单击细胞加载以允许将 细胞加载 到微流控板中。
注意： 细胞加载 步骤包括8号井在13.8 kPa下灌注15秒，然后对6号井和8号井在27.6 kPa下灌注15秒，以及6.9 kPa下6井的最终灌注轮30秒。微流控板中细胞的密度对于实验至关重要。该微流体方案的第一部分包括在抗生素治疗之前在新鲜培养基中培养细菌6小时。生长6小时后，细胞密度必须足以检测稀有的持久性细胞（在本研究中使用的条件下，持久性细胞以10-4的频率生成）。如果细胞密度太高，则难以区分单个细胞，从而无法进行精确的单细胞分析。由于生长速率直接取决于培养基，因此在开始实验之前应评估显微镜视野中的细胞密度。 - 使用透射光模式设置最佳焦点，并选择几个观察适当细胞数的感兴趣区域 （ROI）（每个视场最多 300 个细胞）。
注意：选择至少 40 个 ROI 以确保对稀有的持久性细胞进行成像。 - 在微流体软件上，单击 创建协议。编程以6.9kPa注射新鲜培养基6小时（孔1-2），然后以6.9kPa注射含有抗生素的培养基6小时（孔3），最后以6.9kPa注射新鲜培养基20小时（孔4-5）。
注意：稀释至OD600nm 的细菌培养物为0.01，允许细菌在微流体室中生长6小时，确保细胞处于指数生长期。根据在加载步骤中引入微流体装置的细胞数量（参见步骤5.2.8），可以调整生长期的持续时间以获得每个ROI最多300个细胞。由于持久性是一种罕见现象，因此增加每个ROI的细胞数量可以提高观察持久性细胞的可能性。但是，每个ROI的细胞数不应超过300个细胞，因为这使得单细胞分析变得乏味。 - 在延时模式下使用透射光和荧光报告基因的激发光源每 15 分钟进行一帧的显微镜成像。这里，使用了用于mCherry信号的560 nm激发光源（580 nm LED，功率为10%，滤光片00 [530-585 ex，615LP em，蔡司]和mCherry的100 ms曝光）。蔡司兼容的Zen3.2软件用于细胞成像。
- 从微流体板的每个孔中取出保存溶液（如果存在），并用新鲜培养基替换它。
- 图像分析
注意：显微镜图像的打开和可视化是使用开源 ImageJ/Fiji 软件 （https://fiji.sc/）26 执行的。定量图像分析使用开源的ImageJ/Fiji软件和免费的MicrobeJ插件（https://microbej.com）27进行。在该协议中，使用了MicrobeJ 5.13I（14）版本。- 打开计算机上的 ImageJ/Fiji 软件，然后将超堆栈延时显微镜图像拖到斐济加载栏中。使用 “图像>颜色”>“合成” 来融合超堆栈的不同通道。如果延时实验的通道与所需颜色不对应（例如，相衬显示为红色而不是灰色），请使用 “图像>颜色”>“排列通道 ”将适当的颜色应用于通道。
- 打开 MicrobeJ 插件，使用手动编辑界面检测细菌细胞。删除自动检测到的单元格，并逐帧手动勾勒感兴趣的持久单元格。
注意：可以使用不同的设置来自动检测单个细胞。这里使用手动检测，因为分析的持久细胞形成长丝，很少使用自动检测正确检测。 - 检测后，使用 MicrobeJ 手动编辑界面中的 Result 图标生成 ResultJ 表。保存 ResultJ 文件，并使用 ResultJ 表深入了解单细胞分析感兴趣的不同参数。在该协议的情况下，输出HU-mCherry强度，细胞长度和单个细胞的细胞面积的平均荧光。
Representative Results
如上所述，用于持久细胞单细胞表型分析的菌株在MOPS甘油0.4%培养基中表征。随着时间的推移，对OD600nm 的监测显示 wt 和 hupA-mCherry菌株之间没有差异（图1）。这表明HU-mCherry融合蛋白的表达在这些条件下不影响生长。最初接种在OD600nm 为0.01的两种菌株的细菌细胞在接种后±8小时达到指数期。
OFX的MIC通过标准化方法（此处为连续琼脂稀释）测定24。MIC被定义为未检测到可见生长的最小浓度。两种菌株的OFX的MIC均为0.06 μg·mL−1，表明与同基因wt菌株相比，hupA-mCherry融合对OFX的敏感性没有影响（图2）。
我们进一步确定了致命的OFX治疗（83倍MIC）对本研究中使用的两种菌株的活力的影响。随着OFX暴露的活细胞数量随着时间的推移而减少，因此需要适当调整细菌培养物的稀释度，以达到每板30至300个菌落。为了确定随时间推移的适当稀释度，进行了点测定，其中使用多通道移液器将 10 μL 的 0 至 10−7 次连续 10 倍稀释液置于方形培养皿上。适当的稀释度是分离克隆可见的稀释液（例如，在t0 = 10−5，t1h = 10−4/10−3，t4h = 10−2/10-1时）（图3）。
虽然斑点测定是深入了解 OFX 介导的杀伤动力学的简单方法，但它无法准确确定杀伤动力学。当通过定时杀伤测定监测用OFX处理的指数生长细胞的活力时，观察到典型的双相曲线（图4）。曲线的第一个斜率反映了非持久性种群的快速杀戮（红色虚线）。在这里测试的条件下，高达99.9%的细胞在OFX存在下3小时后无法形成集落。第一阶段的杀伤之后是第二阶段，显示出较慢的杀伤率（蓝色虚线），这揭示了耐药持久性细胞的存在。在测试的条件下，持久性阶段在添加 OFX 后约 3 小时开始，突出了将细胞暴露于 OFX 超过 3 小时以研究持久性表型的必要性。重要的是，时间杀灭曲线表明 hupA-mCherry 融合蛋白对定时动力学没有影响。因此，编码翻译荧光融合的菌株可用于使用荧光显微镜监测持久性细胞。
我们进一步研究了单细胞水平的持久性现象。为此，将hupA-mCherry菌株引入微流体板中，该微流体板允许改变培养基条件（此处为生长，处理和恢复），同时对给定的ROI进行延时显微镜检查。在微流体实验的第一步中，将引入微流体装置的细胞注入生长培养基（MOPS甘油0.4%），并以~2小时的生成时间分开（图5和图6）。生长的第一阶段表明细胞在OFX处理之前是有活力的并且正在积极分裂。
在第一阶段的生长之后，将细胞灌注补充有5μg·mL−1 OFX的生长培养基6 h。一旦抗生素到达细胞，细胞分裂就会被阻断（图5 和 图6）。OFX处理6小时后，将细胞灌注新鲜培养基。虽然绝大多数细胞无法恢复生长（图5 和 图6），但一小部分细菌亚群能够伸长并产生丝状细胞25。这些细胞在OFX处理后能够分裂并产生活的子细胞，可以定义为持久性细胞。
由于此设置允许在治疗之前，期间和之后可视化持久性细胞，因此它不仅提供了有关恢复阶段持久性表型的信息，而且还提供了有关治疗前持久性细胞的生理状态的信息（图6）。在测试的条件下，持久性细胞在OFX处理之前与非持久性细胞的分裂相似，表明观察到的持久性细胞并非来自休眠亚群（图6）25。
在恢复阶段对持久细胞的细胞长度分析表明，每根细丝都有特定的伸长率。每个持久在第一次分裂之前达到的细胞长度因一个持久体而异。同样，第一次除法事件的时间也非常不均匀（图6）。分裂的持久性细丝产生多个子细胞，这些子细胞开始生长和分裂，在大多数情况下，类似于未处理的细胞（图7）。然后，细丝的连续分裂导致细胞长度逐渐减少，最终产生与OFX处理前具有相似细胞长度的子细胞（图6 和 图7B）。绝大多数细胞在OFX去除后无法诱导丝状。这个大的细胞群对应于死细胞（图5 和 图6）。
类核相关蛋白HU的荧光融合允许可视化核苷酸22的动力学。细胞内HU-mCherry的总荧光强度分析可用作DNA含量22，25的代理。在生长期（OFX处理之前），总mCherry荧光强度变化，反映了细胞周期中染色体复制和分离的动力学（图8）。添加 OFX 后，mCherry 荧光在细胞中部增加，表明类核压实，这已被证明是由双链 DNA 断裂的形成诱导的28（图 5）。双链DNA断裂是OFX作用机制的结果，OFX破坏II型拓扑异构酶DNA-gyrase和拓扑异构酶IV29，30。在大肠杆菌中，DNA旋转酶是OFX29，30的主要靶标。通过在双链传代机制的关键步骤结合其靶标，OFX抑制裂解DNA链的降级，最终导致双链DNA断裂的释放30。如上所述，OFX处理的持久细胞在恢复期间开始成丝25（图6）。细胞长度的增加与总mCherry荧光强度的增加相关，这反映了复制重启和细丝25中类核丰度的增加（图7a和图8）。对于死细胞，总mCherry荧光强度在处理和恢复阶段保持稳定，表明这些细胞在OFX去除后无法复制其染色体（图8）。还显示了在氧氟沙星治疗之前，期间和之后的大肠杆菌HU-mCherry细胞的微流体视频（视频1）。
图1：wt和hupA-mCherry E. coli菌株的生长监测。 wt（黑色）和hupA-mCherry（红色）的光密度监测（OD600 nm）。阴影和虚线表示生物一式三份的标准偏差。请点击此处查看此图的大图。
图 2：测定 OFX 对 wt 和 hupA-mCherry 大肠杆菌 菌株的 MIC。 在LB培养基中生长 wt （♦）和 hupA-mCherry （●），并在含OFX的LB琼脂的连续稀释液上点样2 μL（每个面板中的浓度，单位为μg·mL−1）。生长抑制在至少0.06μg·mL−1下可见。该图是生物一式三份的代表性实验。比例尺 = 1 厘米。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：暴露于 OFX 时 wt 和 hupA-mCherry 大肠杆菌菌株的点测定。 如方案（第3节）所述，将（A）wt和（B）hupA-mCherry菌株在MOPS甘油0.4%中生长，并用5μg·mL−1 OFX处理指数生长的细胞（OD600 nm = 0.3）。T0 对应于添加 OFX 之前的时间点。T1，T2，T3，T4，T5和T6对应于OFX添加后1-6小时。该图是生物一式三份的代表性实验。请点击此处查看此图的大图。
图 4：暴露于 OFX 时 wt 和 hupA-mCherry 大肠杆菌菌株的定时测定。 如方案（第4节）所述，在MOPS甘油0.4%中生长wt（♦）和hupA-mCherry（●）菌株，用5μg·mL−1 OFX处理指数生长的细胞（OD600 nm = 0.3）。虚线表示第一个“快速”（红色）杀伤阶段和第二个“慢速”（蓝色）杀伤阶段，对应于敏感和持续亚群（分别通过 T0 和 T2 之间以及 T3 和 T6 之间的线性回归获得）。误差线表示生物一式三份的标准偏差。请点击此处查看此图的大图。
图 5：使用微流体工具的 OFX 持久性和死细胞的代表性图像。 代表性显微镜图像显示了使用 hupA-mCherry 菌株进行的微流体实验的相关时间点（灰色相差，红色HU-mCherry信号）。表达标记的 hupA-mCherry 的细胞在微流控板中生长（此处为4小时），然后进行OFX攻击（5μg·mL−1）。在OFX存在下6小时后，将细胞注入新鲜培养基，使持久性细胞恢复。在OFX处理期间和OFX去除后的持久细胞及其后代细胞分别以绿色和蓝色突出显示。每个面板上都标明了相应的时间点。比例尺 = 5 μm。 请点击此处查看此图的大图。
图6：持续细胞和死细胞长度的显微镜延时分析。 死细胞（红色，n = 109）和持久细胞（灰色，n = 13）的细胞长度分析。OFX处理的开始（5 μg·mL−1）用红色虚线（5 h）表示，OFX去除用蓝色虚线表示。插图对应于添加 OFX 之前的生长阶段。实验一式三份进行。阴影和虚线表示死细胞群的标准偏差（n = 109）。 请点击此处查看此图的大图。
图7：OFX代表性持久性的显微镜延时分析。 （A）在OFX去除后8.5小时（微流控实验开始后18.5小时，包括4小时生长，6小时5μg·mL-1 OFX处理和8.5小时OFX去除后恢复）由丝分裂产生的代表性OFX持久性及其子细胞的Kymograph。一帧对应 15 分钟。比例尺 = 5 μm。 （B） 由 A 中的持久 kymograph 生成的掩模。受监视的持久单元格用蓝色轮廓表示，子单元格以不同的颜色突出显示。（C）从B生成的持久细胞谱系的示意图。颜色编码与 B 相同。请点击此处查看此图的大图。
图8：代表性持久细胞和死细胞的细胞长度和mCherry荧光分析。 在微流体延时实验中分析代表性持久性（黑色和红色实线）和代表性死细胞（黑色和红色虚线）的细胞长度（左轴）和总HU-mCherry荧光强度（右轴，以任意单位显示）。OFX处理的开始（5 μg·mL−1）用红色虚线表示，OFX去除用蓝色虚线表示。 请点击此处查看此图的大图。
视频1： 大肠杆菌 HU-mCherry细胞在氧氟沙星治疗之前，期间和之后的微流体视频。 微流体延时成像显示HU-mCherry细胞。将细胞在MOPS甘油0.4%中生长4小时。OFX处理6 h（5 μg·mL−1）后，将无抗生素培养基灌注到微流控板中，使持久细胞恢复。比例尺 = 5 μm。指示时间（以分钟为单位）。生长和恢复阶段用“MOPS-Gly”表示。0.4%“和”OFX 5 μg/mL“的 OFX 处理。 请点击此处下载此视频。
| 10x 拖把 | |||
| 储备液 | 1 L 10x MOPS 的储备溶液体积 | 10x MOPS基座的最终浓度 | |
| 拖把酸 | 1 M（使用 KOH 调节至 pH 7.4） | 400毫升 | 0，4 米 |
| 三辛 | 1 M（使用 KOH 调节至 pH 7.4） | 40毫升 | 0.04 米 |
| 二氧化铁4.7H2O | 0.01 米 | 10毫升 | 0.0001 米 |
| NH4厘升 | 1，9 米 | 50毫升 | 0.095 米 |
| K2SO4 | 0.276 米 | 10毫升 | 0.00276 米 |
| 氯化钙 2.2H2 O | 0.0005 米 | 10毫升 | 0.000005 米 |
| 氯化镁 2.6H2O | 0.528 米 | 10毫升 | 0.00528 米 |
| 氯化钠 | 直接添加 29.2 克 | 0，5 米 | |
| 蒸馏水 | 460毫升 | ||
| 微量营养素1000x（见表2） | 10毫升 | ||
表 1：10x MOPS 的组成。
| 微量营养素 1000x | ||
| 微量营养素浓度 1000x 储备液 | 10x MOPS基座的最终浓度 | |
| （NH4）6Mo7O24.4H2O | 0.000003 米 | 0.00000003 米 |
| H 3BO3 | 0.0004 米 | 0.000004 米 |
| 氯化钴 2.6H2 O | 0.00003 米 | 0.0000003 米 |
| 铜4.5H 2O | 0.00001 米 | 0.0000001 米 |
| 氯化锰 2.4H2 O | 0.00008 米 | 0.0000008 米 |
| 锌硫醚.7H2O | 0.00001 米 | 0.0000001米 |
表 2：1，000x 微量营养素的组成。
| MOPS 葡萄糖 0.4% 或 MOPS 甘油 0.4% | |||
| 储备液 | 1 L MOPS 葡萄糖 0.4 % 或 MOPS 甘油 0.4 % 的体积 | 最终浓度为 MOPS 葡萄糖 0.4% 或 MOPS 甘油 0.4% | |
| 10x 拖把 | 见表1 | 100毫升 | |
| K2HPO4 | 0.132 米 | 10毫升 | 0.00132 米 |
| 葡萄糖（对于 MOPS 葡萄糖 0.4%） | 20%（20 g在 100 mL 蒸馏水中） | 20毫升 | 0.40% |
| 甘油（用于MOPS甘油0.4%） | ≤99% | 4毫升 | 0.40% |
| 蒸馏水 | 0.4% MOPS 葡萄糖为 870 mL，0.4% MOPS 甘油为 886 mL | ||
表3：0.4%MOPS葡萄糖和0.4%MOPS甘油的组成。
Discussion
本文中提出的方案允许分析在群体和单细胞水平上观察到的对抗生素治疗响应的持久性表型。实验使用大肠杆菌MG1655菌株进行，该菌株在化学定义的培养基（MOPS甘油0.4%）中生长。对指数期培养物进行定时杀灭测定和显微镜实验。我们使用浓度为5μg·mL−1的氟喹诺酮类药物OFX来揭示持久性细胞。这里描述的方法可以应用于其他杀菌抗生素，例如β-内酰胺类、氨基糖苷类或抗菌化合物31。因此，可以使用其他细菌菌株、培养基或生长条件。在与此处描述的类似的设置中监测不同的荧光融合可用于在抗生素治疗之前、期间和之后跟踪细胞过程，例如 DNA 复制 32、DNA 修复25、33 和细胞分裂34。同样，可以利用荧光报告基因来研究细胞生理学的不同方面，例如细胞内pH35，ATP 36或ROS37水平。除了荧光融合之外，还可以应用化学染料。例如，hupA-mCherry融合可以用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）代替，DAPI是一种染色DNA38的荧光染料。然而，应避免使用这种荧光染料进行延时显微镜检查，因为这些染色技术会在延时实验期间扰乱细胞周期的动力学。或者，这种实验可以用相关时间点的快照成像的时程分析代替。
虽然这种荧光报告基因很有帮助，但通过分析相衬图像可以提取的信息量也不容忽视。在这里，我们监测了整个生长、OFX 处理和恢复阶段的细胞长度演变。基于相衬图像的其他参数，例如细胞宽度，相衬强度和细菌细胞的曲率，也可以通过使用适当的软件（例如MicrobeJ27）轻松提取。
总之，这里描述的程序可以应用于其他条件和细菌物种，以监测细胞对不断变化的环境或压力源的反应18，19。通过将其他荧光报告基因（转录和翻译报告基因、化学染料）与群体分析（如流式细胞术/FACS）结合使用，可以在多尺度框架中解决有趣的问题。
Disclosures
作者声明没有竞争利益。
Acknowledgments
Van Melderen实验室的工作得到了ARC行动2018-2023的支持，即国家科学研究基金会（FNRS CDR J.0182.21F）。T.O.由ULB奖学金支持。TS由FRIA奖学金（FNRS）支持。J.C.得到了博士后奖学金“临时研究”（FNRS）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Axio Observer | Zeiss | Inverted fluorescence microscope | |
| CaCl2.2H2O | Merck | 1.02382.0250 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| CellASIC ONIX Microfluidic System | Merck | CAX2-S0000 | Microfluidic system |
| CellASIC ONIX2 FG | Merck | ONIX2 1.0.1 | Microfluidic software |
| CellASIC ONIX2 Manifold Basic | Merck | CAX2-MBC20 | Manifold system |
| CoCl2.6H2O | Merck | 1.02539.0100 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| CuSO4.5H2O | Merck | 1.02790.0250 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| D-(+)-glucose | Sigma Aldrich | G7021-1KG | Carbon source for MOPS glucose 0.4% growth medium |
| E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) | BE10 | wt reference strain, lab strain | |
| E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT | BE16 | HU-mCherry fusion integrated via P1 transduction at the native locus, lab strain | |
| FeSO4.7H2O | VWR Chemicals | 24244.232 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| Fiji | ImageJ | https://fiji.sc/ | Image software; Schindelin et al. if used in publication |
| Glycerol | Merck | 56815 | Carbon source for MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| Greiner CELLSTAR® multiwell culture plate | Merck | M8812-100EA | 24-well clear flat bottom 2ml volume culture plate for automated plate reader |
| H3BO3 | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| Hamamatsu ORCA Flash 4.0 digital camera | Hamamatsu | C13440-20CU | Digital Image Acqusition |
| K2HPO4 | Merck | 1.05099.1000 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| KOH | Merck | 1.05029.1000 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| K2SO4 | Merck | 1.05153.0500 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| Luria-Broth agar medium | Invitrogen | 22700041 | Growth medium for plating assay |
| Luria-Broth medium | Invitrogen | 12780029 | Growth medium for MIC determination |
| MgCl2.6H2O | Merck | 1.05832.1000 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| MgSO4 | Merck | 7487-88-9 | Dilution solution for bacterial survival assay used at 10mM |
| MicrobeJ | Imagej/Fiji plugin | https://www.microbej.com/ | Microscopy image analysis plugin. Ducret et al.for in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. |
| Microfluidic Plates CellASIC ONIX | Merck | B04A-03-5PK | Plate for microfluidic system |
| MnCl2.4H2O | Merck | 1.05927.0100 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| MOPS, Free Acid ULTROL® Grade | Merck | 475898-500GM | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| NaCl | SIgma-Aldrich | S5886-1KG | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| (NH4)6Mo7O24.4H2O | Merck | 1.01180.0250 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| NH4Cl | Merck | 1.01145.0500 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| Ofloxacin | Merck | 82419-36-1 | Fluoroquinolone antibiotic used to treat the bacterial cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4, 1x | Merck | P3813 | Dilution buffer |
| GENESYS 10S UV-Visible Spectrophotometer | Thermofisher Scientific | 840-208200 | UV-Visible Spectrophotometer, Single/Six Cell Holder with PrinterMeasurement of optical density OD600nm |
| SoftMax Pro | Molecular Devices | Microplate reader software | |
| SpectraMax i3x | Molecular Devices | Microplate reader | |
| N-[Tris(hydroxyméthyl)-méthyl]-glycine | Merck | 1.08602.0250 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
| Zeiss® immersion Oil 518F | Zeiss | Immersion oil to increase resolution of microscope | |
| Zen3.2 Pro | Zeiss | Microscopic image acquisition and processing software | |
| ZnSO4.7H2O | Merck | 1.08883.0500 | For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium |
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