Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Populatie- en eencellige analyse van antibioticapersistentie in Escherichia coli

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64550
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Bacterial Genetics and Physiology, Département de Biologie Moléculaire, Faculté des Sciences, Université Libre de Bruxelles (ULB)
* These authors contributed equally

Summary

Antibioticapersistentie beschrijft het vermogen van kleine subpopulaties binnen een gevoelige isogene populatie om tijdelijk hoge doses bacteriedodende antibiotica te verdragen. Het huidige protocol combineert benaderingen om het fenotype van antibioticapersistentie op moleculair en cellulair niveau te karakteriseren na blootstelling van Escherichia coli aan dodelijke doses ofloxacine.

Abstract

Antibioticapersistentie verwijst naar het vermogen van kleine bacteriële subpopulaties om tijdelijk hoge doses bacteriedodende antibiotica te verdragen. Bij bacteriedodende antibioticabehandeling wordt het grootste deel van de bacteriepopulatie snel gedood. Deze eerste snelle fase van het doden wordt gevolgd door een aanzienlijke afname van de snelheid van het doden omdat de persistercellen levensvatbaar blijven. Klassiek wordt de persistentie op populatieniveau bepaald door time/kill-tests uitgevoerd met hoge doses antibiotica en voor gedefinieerde blootstellingstijden. Hoewel deze methode informatie geeft over het niveau van persistercellen en de dodende kinetiek, weerspiegelt deze niet de intrinsieke cel-tot-cel heterogeniteit die ten grondslag ligt aan het persistentiefenomeen. Het hier beschreven protocol combineert klassieke time/kill assays met single-cell analyse met behulp van real-time fluorescentiemicroscopie. Door geschikte fluorescerende reporters te gebruiken, kan de microscopiebeeldvorming van levende cellen informatie verschaffen over de effecten van het antibioticum op cellulaire processen, zoals chromosoomreplicatie en -segregatie, celverlenging en celdeling. Het combineren van populatie- en eencellige analyse maakt de moleculaire en cellulaire karakterisering van het persistentiefenotype mogelijk.

Introduction

Dit protocol is bedoeld om het bacteriële persistentiefenotype te analyseren als reactie op specifieke antibioticabehandeling op eencellig en populatieniveau. Persistentie beschrijft het vermogen van kleine subpopulaties binnen een isogene populatie om hoge doses bacteriedodende antibiotica (fluoroquinolonen, aminoglycosiden, β-lactams, enz.) te doorstaan, waarbij de minimale remmende concentratie (MIC) van de zogenaamde persistercellen identiek is aan die van het grootste deel van de populatie. Bifasische dodingsdynamiek, bij het meten van bacteriële overleving in de loop van de tijd in de aanwezigheid van een antibioticum, onthult de aanwezigheid van tijdelijk drugtolerante cellen, met een initiële snelle uitroeiing van de niet-persisterende cellen, gevolgd door een veel langzamere dodingssnelheid van de persistercellen. Na verwijdering van antibiotica geven deze cellen aanleiding tot een genetisch identieke populatie die een vergelijkbare dodingsdynamiek vertoont wanneer ze met hetzelfde antibioticumworden behandeld 1,2. In tegenstelling tot persistentie wordt antibioticaresistentie gedefinieerd op populatieniveau en is het over het algemeen een gevolg van de novo mutaties of de horizontale genoverdracht van een resistentieverlenend plasmide3. Hoewel de mutaties die verantwoordelijk zijn voor resistentie zich meestal bevinden in het doelwit van het geneesmiddel of in de promotorgebieden van de effluxpompen van het geneesmiddel, hebben genen die de persistentiefrequentie veranderen die is geïdentificeerd door genoombrede en gerichte mutantanalysebenaderingen bewezen talrijk en divers te zijn 2,3,4,5,6,7,8 . Daarom is het waarschijnlijk dat bacteriële cellen de persistertoestand kunnen binnendringen via meerdere routes 9,10,11, en benaderingen om het persistentiefenomeen op eencellig niveau te onderzoeken zijn nodig om de fysiologie van deze persistercellen te karakteriseren.

De recente ontwikkeling van microfluïdische hulpmiddelen die worden gebruikt in combinatie met fluorescentiemicroscopie heeft de weg vrijgemaakt voor de karakterisering van het persistentiefenotype en de rol van belangrijke cellulaire processen, zoals chromosoomreplicatie12, DNA-reparatie 13 en celdeling14, in persistercelvorming benadrukt. In dit artikel beschrijven we een geïntegreerde aanpak die klassieke microbiologische assays combineert met single-cell live imaging om persistercellen te karakteriseren die worden gegenereerd in exponentieel groeiende Escherichia coli-culturen die worden behandeld met een hoge dosis ofloxacine. Het hier beschreven protocol kan worden toegepast om het antibioticumpersistentiefenomeen bij andere bacteriesoorten te bestuderen, zoals Bacillus subtilis15, of aandoeningen (bijv. Antibioticapersistentie na β-lactambehandeling 16) en kan gemakkelijk worden aangepast om de vele verschijnselen met fenotypische heterogeniteit17,18,19 te onderzoeken . Bovendien kan de opstelling die in dit artikel wordt beschreven, worden gecombineerd met andere fluorescerende reporters om verschillende cellulaire parameters van belang te onderzoeken, zoals intracellulaire niveaus van pH20 of ATP21 op eencellig niveau, wat mogelijk nieuwe inzichten kan opleveren in het fenomeen van antibioticapersistentie.

Protocol

OPMERKING: Gebruik steriel cultuurglaswerk, pipetpunten en groeimedium. Hier werden E. coli-cellen gekweekt in een chemisch gedefinieerd medium met een lage autofluorescentie (zie tabel met materialen). Inentingen werden uitgevoerd in de aanwezigheid van een Bunsen-brander om het risico op besmetting te minimaliseren.

1. Celkweek en groeicurve

  1. Streep de stam van belang van een bevroren glycerolvoorraad op een Luria-Bertaini (LB) agarplaat (indien nodig aangevuld met een selectief antibioticum) en incuber bij 37 °C gedurende een nacht (tussen 15 uur en 19 uur) om enkele kolonies te verkrijgen.
    OPMERKING: Het hier gepresenteerde experiment maakt gebruik van twee stammen, E. coli K-12 MG1655 die overeenkomen met de wt-stam en de isogene MG1655 hupA-mCherry-stam 22. De laatste stam drukt de fluorescentie-gelabelde α-subeenheid van het HU-nucleoïde-geassocieerde eiwit uit. De hupA-mCherry reporter is geïntegreerd op de native locus van hupA. HU-mCherry dient als een proxy om de nucleoïde dynamica in levende cellen te volgen terwijl het op een niet-specifieke manier aan DNA bindt.
  2. Ent 5 ml medium (hier, 3-[N-morpholino] medium op basis van propaansulfonzuur [MOPS]; Tabel 1, tabel 2 en tabel 3) aangevuld met glucose 0,4% en een selectief antibioticum (indien nodig) met een geïsoleerde kolonie in een glazen buis (≥25 ml), en plaats de buis in een schudincubator ingesteld op 37 °C en 180 omwentelingen per minuut (rpm) gedurende de nacht (tussen 15 uur en 19 uur). Als alternatief kunnen plastic buizen, glazen of plastic kolven (≥ 25 ml) worden gebruikt in plaats van glazen buizen.
    OPMERKING: MOPS-medium aangevuld met glycerol in een eindconcentratie van 0,4% werd gebruikt tijdens de experimenten die in dit artikel worden beschreven, behalve voor de nachtculturen die werden uitgevoerd in MOPS-glucose 0,4%. De generatietijd van E. coli in MOPS aangevuld met glucose is korter dan die in MOPS glycerol. Het gebruik van MOPS glucose 0,4% in plaats van MOPS glycerol 0,4% bij deze stap zorgt ervoor dat de cellen binnen 19 uur de stationaire fase bereiken. Andere groeimedia, zoals M9 of rich defined medium (RDM) aangevuld met verschillende koolstofbronnen, kunnen ook worden gebruikt. Er moet echter worden opgemerkt dat de groeisnelheid en de persistentiefrequentie verschillen, afhankelijk van het medium en/of de gebruikte koolstof23.
  3. Centrifugeer de volgende ochtend 1 ml cultuur bij 2.300 x g gedurende 3 minuten, gooi het supernatant weg en resuspensie de pellet voorzichtig in hetzelfde volume fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). Meet de optische dichtheid bij 600 nm (OD 600 nm) en bereken het volume dat nodig is voor een initiële OD600 nm van 0,01 in een eindvolume van 2 ml.
  4. Plaats 2 ml MOPS glycerol 0,4% medium in een put van een heldere onderste 24-putplaat en ent met het berekende nachtelijke kweekvolume. Plaats de 24-putplaat in een geautomatiseerde microplaatlezer (zie materiaaltabel) om de OD600 nm gedurende 24 uur te bewaken. Stel de microplaatlezer in om de OD600 nm elke 15 minuten te meten bij een temperatuur van 37 °C en met een hoge omloopsnelheid (140 tpm).
    OPMERKING: Als de stam die in het experiment wordt gebruikt codeert voor een fluorescerende reporter, zorg er dan voor dat de groeisnelheid vergelijkbaar is met die van de wt om artefacten in de volgende experimenten te vermijden, omdat de groeisnelheid de persistentiefrequentie van antibiotica beïnvloedt23. Vanwege detectiebeperkingen bij zeer lage celdichtheden en de potentiële stamspecifieke effecten op de OD600 nm/kolonievormende eenheden (CFU) relatie, wordt aanbevolen om de groeikinetiek te evalueren door de CFU·ml-1 te monitoren bij het werken met niet-gekarakteriseerde stammen.

2. Bepaling van de minimale remmende concentratie van de antibiotica

OPMERKING: De minimale remmende concentratie (MIC) wordt gedefinieerd als de laagste dosis antibioticum waarbij geen bacteriegroei wordt waargenomen. De bepaling van de MIC moet worden uitgevoerd voor elk antibioticum en stam. In de hier beschreven experimenten werd het fluoroquinolon-antibioticum ofloxacine (OFX) gebruikt. De bepaling van de MIC maakt het mogelijk om te bevestigen dat de antibioticumoplossing correct is bereid, het antibioticum actief is en de stammen even gevoelig zijn voor het antibioticum. Hier werd de gepubliceerde agarverdunningsmethode uitgevoerd om de MIC tot OFX van de verschillende gebruikte stammen te bepalen24. De MIC van een bepaald antibioticum voor een bepaalde bacteriestam kan ook worden bepaald via de bouillonverdunningsmethode24.

  1. Voorbereiding van de platen voor MIC-bepaling
    1. Bereid een stamoplossing voor het antibioticum dat in de experimenten wordt gebruikt door 5 mg OFX op te lossen in 1 ml ultrapuur water. Voeg 20 μL 37% HCl toe om de oplosbaarheid van de OFX te verhogen.
    2. Smelt 100 ml steriele LB-agar en houd deze bij 55 °C om stolling te voorkomen. Bereid zes kleine glazen kolven (25 ml) en pipetteer 5 ml vloeibaar LB-agarmedium in elke kolf met behulp van een steriele pipet.
    3. Verdun 10 μL van de 5 mg·ml-1 OFX masterstockoplossing in 90 μl ultrapuur water (1:10 verdunning van de masterstock). Voeg 0 μL, 2 μL, 4 μL, 6 μL, 8 μL of 10 μL van de 500 μg·mL-1 OFX-oplossing toe aan elk van de zes glazen kolven met 5 ml LB-agarmedium om LB-agarmedium te genereren met eindconcentraties van 0 μg·mL−1, 0,02 μg·mL−1, 0,04 μg·mL−1, 0,06 μg·ml−1, 0,08 μg·ml−1 en 0,1 μg·ml-1 OFX. Meng de oplossing door de kolven meerdere keren te draaien.
      OPMERKING: Als de MIC van het antibioticum van belang bekend is, moet het bereik van de concentraties van onder tot boven de werkelijke MIC reiken. Als de MIC onbekend is, wordt een groot concentratiebereik met een log 2-verdunningsreeks aanbevolen. Zorg ervoor dat het LB-agarmedium is afgekoeld voordat u het antibioticum toevoegt, omdat hoge temperaturen het kunnen inactiveren. Niettemin is het belangrijk om het LB-agarmedium niet te laten stollen voordat het antibioticum wordt toegevoegd, omdat dit kan leiden tot de niet-homogene verdeling van het antibioticum in het LB-agarmedium.
    4. Giet 5 ml van elk van de zes LB-agarmedia bereid in stap 2.1.3 op een dosisverhogende manier in een 6-well kweekplaat met behulp van een steriele pipet. Laat de agar afkoelen tot het stolt en droog de plaat voor gebruik.
      OPMERKING: Bereid de antibioticumoplossing en de kweekplaat voor op de dag dat de test wordt uitgevoerd.
  2. MIC-bepalingstest
    1. Ent 5 ml LB-medium met een geïsoleerde kolonie in een glazen buis (≥25 ml) en plaats de glazen buis in een schudincubator die is ingesteld op 37 °C en 180 tpm gedurende de nacht (tussen 15 uur en 19 uur).
    2. Meet de volgende ochtend de OD600 nm en verdun de cultuur in een reageerbuis tot een uiteindelijke celdichtheid van 1 x 107 CFU·ml-1 in PBS. Voor de hier geteste stammen komt 1 x 107 CFU·ml−1 overeen met een OD600 nm van 0,0125.
      OPMERKING: Als de correlatie tussen de CFU·ml-1 en OD 600 nm niet bekend is, moet de groeicurve bepaald door CFU- en OD 600 nm-metingen om de correlatiefactor tussen de CFU·ml-1 en OD600 nm te berekenen.
    3. Spot 2 μL van de eerder verdunde cultuur op elk putje van de gedroogde 6-well plaat. Laat de vlekken drogen voordat u de plaat 's nachts (tussen 15 en 19 uur) in een incubator bij 37 °C plaatst.
    4. Tel de volgende dag de kolonies die in elke put zijn gevormd. De MIC komt overeen met de put met de minimale concentratie antibioticum waar geen bacteriegroei wordt gedetecteerd.

3. Spottest

OPMERKING: De spottestmethode is een kwalitatieve benadering waarmee het aantal levensvatbare cellen (cellen die kolonies kunnen genereren na antibioticastress) kan worden geschat. De spottest wordt voorafgaand aan de time-kill assay uitgevoerd om inzicht te geven in de levensvatbaarheid van de stam die in de geteste omstandigheden wordt gebruikt en om te informeren over de verdunningen die nodig zijn tijdens de time-kill assay (zie rubriek 4).

  1. Om de LB-agarplaten voor te bereiden op spottests, giet u 50 ml LB-agar in een vierkante petrischaal (144 cm2). Bereid één vierkante petrischaal per tijdspunt. Laat de LB-agar stollen en droog de platen voor gebruik.
  2. Ent 5 ml medium (MOPS-glucose 0,4%) met een geïsoleerde kolonie in een glazen buis (≥25 ml) en plaats de buis in een schudincubator die is ingesteld op 37 °C en 180 tpm gedurende een nacht (tussen 15 uur en 19 uur).
  3. Meet de volgende dag de OD 600 nm en verdun de cultuur tot een vers temperatuuraangepast medium (37 °C, MOPS glycerol 0,4%) in een glazen buis (≥25 ml) tot een uiteindelijke OD600 nm van ~ 0,001. Laat de kweek 's nachts groeien in een incubator bij 37 °C bij 180 tpm (tussen 15 uur en 19 uur).
  4. Meet de volgende dag de OD 600 nm en incubeer de cultuur tot een uiteindelijke OD600 nm van 0,3.
  5. Bereid tijdens het incuberen 96-putplaten voor door 90 μL 0,01 M MgSO4-oplossing in elke put behalve de putjes van de eerste rij (rij A) te plaatsen. De 96-putplaten worden gebruikt voor 10-voudige seriële verdunning in stap 3.7.
    OPMERKING: In dit experiment werden twee stammen (wt en hupA-mCherry stam) getest in drievoud op zeven verschillende tijdstippen. Omdat één plaat uit 12 kolommen bestaat, kan één plaat voor twee tijdstippen worden gebruikt en dus zijn er in totaal vier platen voorbereid.
  6. Trek bij een OD600 nm van 0,3 200 μL van elke bacteriecultuur op. Deze monsters komen overeen met het t0 (onbehandelde) tijdstip voorafgaand aan de antibioticabehandeling en maken de bepaling van de CFU·ml-1 vóór de antibioticabehandeling mogelijk.
  7. Centrifugeer de monsters op 2.300 x g gedurende 3 minuten. Voeg tijdens de centrifugeertijd de gewenste concentratie OFX toe aan de vloeibare cultuur en blijf tijdens het schudden incuberen bij 37 °C.
    OPMERKING: Hier werd OFX gebruikt in een concentratie van 5 μg·ml-1 (overeenkomend met de MIC 83-voudig vermenigvuldigd). In een eerdere studie werd deze concentratie gebruikt om het persistentiefenomeen onder OFX-blootstelling te karakteriseren25. De antibioticaconcentratie die wordt gebruikt voor de time/kill-tests kan variëren, afhankelijk van het antibioticum, het kweekmedium en de staat van bacteriegroei.
  8. Na centrifugeren de celpellet resuspenderen in 200 μL van 0,01 M MgSO4-oplossing . Plaats 100 μL in de lege put van de in stap 3.5 bereide plaat met 96 putten. Voer een verdunning uit door 10 μL van de put in rij A over te brengen in de put in rij B met 90 μL van 0,01 M MgSO4. Ga door met de seriële verdunningen door 10 μL van de put in rij B over te brengen in de put in rij C. Herhaal dit totdat een verdunning van 10−7 is bereikt (waarbij elke overdracht een 10-voudige verdunning is).
    OPMERKING: In dit experiment werden zes culturen (drie voor de wt-stam en drie voor de hupA-mCherry-stam ) getest voor elk tijdspunt. Volgens het protocol wordt een muti-channel pipet gebruikt om de seriële verdunningen voor de zes stammen tegelijkertijd uit te voeren. Om de technische fout te minimaliseren, worden de pipetpunten tussen elke overdracht vervangen.
  9. Spot 10 μL van elke verdunning op de LB-agarplaten die in stap 3.1 zijn bereid.
    OPMERKING: Een meerkanaals pipet wordt gebruikt om tegelijkertijd dezelfde verdunning (bijv. een verdunning van 10−4 ) voor de zes culturen te herkennen. Tijdens het spotten moet de eerste stop van de meerkanaalspipet worden gebruikt zonder de tweede stop in te drukken, omdat dit ertoe kan leiden dat microdruppels op de plaat worden gedoseerd.
  10. Trek op relevante tijdstippen na de toevoeging van het antibioticum 200 μL van de cultuur op en voer seriële verdunningen uit zoals beschreven in stap 3.8. Spot 10 μL van elke verdunning zoals beschreven in stap 3.9.
    OPMERKING: Voor het hier beschreven experiment werden zeven tijdpunten verzameld (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). Voor stammen die een verhoogde antibioticagevoeligheid vertonen in vergelijking met de wt, kunnen meerdere wasbeurten in MgSO4 0,01 M worden uitgevoerd om resterende antibiotica te verwijderen.
  11. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende een nacht (tussen 15 uur en 19 uur). Tel de volgende dag het aantal kolonies bij de twee hoogste verdunningen waarvoor kolonies kunnen worden gedetecteerd. Idealiter bevatten de vlekken op de agarplaten voor deze verdunningen tussen de 3 en 30 kolonies, waardoor de CFU·ml-1 voor elk monster nauwkeurig kan worden bepaald.
  12. Bereken de overlevingsratio door de berekende CFU·ml-1 van elk tijdspunt te delen door de CFU·ml-1 van de initiële populatie op t0.

4. Time-kill assays

OPMERKING: Hoewel spottests een eenvoudig te gebruiken methode zijn om de overlevingskans van een bepaalde stam voor een bepaald antibioticum te schatten, geven time-kill-assays een overlevingskans met een hogere resolutie en worden ze uitgevoerd om de bacteriële levensvatbaarheid nauwkeurig te kwantificeren. Het profiel van de dodingscurve kan worden gebruikt om te bepalen of een bepaalde bacteriestam gevoelig, tolerant of resistent is voor het antibioticum in een bepaalde toestand. Bovendien maken time-kill assays het mogelijk om de tijd van blootstelling aan antibiotica te bepalen die nodig is om het persistentiefenomeen (begin van de tweede helling van de bifasische dodingscurve) en de persistentiefrequentie te detecteren.

  1. Bereid LB-agarplaten voor op de time-kill plating-assay. Giet 25 ml LB-agar in een petrischaaltje (±57 cm2). Bereid ten minste twee petrischalen per tijdspunt (twee verdunningen per tijdspunt per soort worden verguld).
  2. Laat de LB-agar stollen en droog de platen voordat u vijf tot acht steriele glasparels aan elke plaat toevoegt. Keer de platen om en label ze volgens de stam/conditie/tijdstip.
    OPMERKING: Glasparels zorgen voor de verspreiding van bacteriën op de agarplaten tijdens stap 4.7 en stap 4.9. Als alternatief kunnen de cellen op de agarplaat worden gedispergeerd met behulp van een spreader.
  3. Bereid voor elk monster 10-voudige glazen buisjes met seriële verdunning die 900 μL 0,01 M MgSO4-oplossing bevatten. Het aantal verdunningsglasbuizen per monster dat moet worden voorbereid, komt overeen met de verdunningen die nodig zijn om kolonies in de spottest te detecteren.
  4. Ent 5 ml medium (MOPS-glucose 0,4%) met een geïsoleerde kolonie in een glazen buis (≥25 ml) en plaats de buis in een schudincubator die is ingesteld op 37 °C en 180 tpm gedurende een nacht (tussen 15 uur en 19 uur).
  5. Meet na 16 uur groei de OD 600 nm en verdun de cultuur tot een vers temperatuuraangepast medium (37 °C, MOPS-glycerol 0,4%) in een glazen buis tot een uiteindelijke OD600 nm van ~ 0,001. Laat de kweek 's nachts groeien in een incubator bij 37 °C bij 180 tpm (tussen 15 uur en 19 uur).
  6. Meet de volgende dag de OD 600 nm en incubeer de cultuur tot een uiteindelijke OD600 nm van 0,3.
  7. Trek bij een OD 600 nm van 0,3 100 μL van de cultuur op, verdund volgens de gegevens verkregen in de spottest (bij een OD600 nm van 0,3 en zonder antibioticum geeft een verdunning van 10−5 gewoonlijk 200-300 kolonies) en plaat100 μL op de LB-agarplaten bereid in stappen 4.1-4.2. Schud de borden voorzichtig om te voorkomen dat de kralen in contact komen met de randen van de schotel, omdat dit kan leiden tot een niet-homogene verspreiding van de bacteriële cellen op het LB-agarmedium. Dit eerste monster voorafgaand aan de antibioticabehandeling komt overeen met het t0-tijdstip (CFU·ml-1 vóór behandeling met antibiotica).
  8. Voeg de gewenste concentratie OFX toe en blijf tijdens het schudden incuberen bij 37 °C.
    OPMERKING: Hier werd OFX gebruikt in een concentratie van 5 μg·ml-1 (overeenkomend met de MIC 83-voudig vermenigvuldigd).
  9. Trek op relevante tijdstippen na de toevoeging van het antibioticum 100 μL van de cultuur op, verdund volgens de gegevens verkregen in de spottest en plaat 100 μL op de LB-agarplaten bereid in stappen 4.1-4.2. Plaats de cellen zoals beschreven in stap 4.7.
    OPMERKING: Voor het hier beschreven experiment werden zeven tijdpunten verzameld (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). Voor stammen die een verhoogde antibioticagevoeligheid vertonen in vergelijking met de wt, kunnen meerdere wasbeurten in MgSO4 0,01 M worden uitgevoerd om resterende antibiotica te verwijderen.
  10. Incubeer de platen bij 37 °C gedurende een nacht (tussen 15 uur en 19 uur). Tel de volgende dag het aantal kolonies bij de twee hoogste verdunningen waarvoor kolonies kunnen worden gedetecteerd. Idealiter zouden de platen 30-300 kolonies moeten bevatten om een nauwkeurige bepaling van de CFU·ml-1 in elk monster mogelijk te maken.
  11. Bereken de overlevingsratio door de CFU·ml-1 op elk tijdstip te normaliseren met de CFU·mL-1 op t0. Plot de log10 genormaliseerde CFU·mL-1 als functie van de tijd.

5. Microfluïdische time-lapse microscopie beeldvorming

OPMERKING: In de volgende sectie wordt de voorbereiding van de microfluïdische plaat beschreven, evenals de time-lapse beeldacquisitie- en beeldanalyseprocedure. Het doel van dit experiment is om het persistentiefenotype bij antibioticabehandeling op eencellig niveau te observeren en te analyseren. De gegevens die tijdens dit experiment worden verzameld, kunnen worden gebruikt om een breed scala aan resultaten te genereren, afhankelijk van de behandelde vraag en / of de fluorescerende reporters die tijdens het experiment zijn gebruikt. In het hier beschreven experiment werd kwantitatieve analyse van de cellengte en HU-mCherry-fluorescentie22 uitgevoerd, die de nucleoïde organisatie in persister- en niet-persistercellen weerspiegelt.

  1. Bacteriële celkweek voor microfluïdische time-lapse microscopie
    1. Ent 5 ml medium (MOPS glycerol 0,4%, indien nodig aangevuld met een selectief antibioticum) met een geïsoleerde kolonie in een glazen buis (≥25 ml) en plaats de buis in een schudincubator die is ingesteld op 37 °C en 180 tpm gedurende de nacht (tussen 15 uur en 19 uur).
    2. Meet de volgende dag de OD 600 nm en verdun de cultuur in een vers temperatuuraangepast medium (37 °C, MOPS-glycerol 0,4%) in een glazen buis tot een uiteindelijke OD600 nm van ~ 0,001. Laat de kweek 's nachts groeien (tussen 15 uur en 19 uur) in een schuddende incubator bij 37 °C en 180 tpm om de volgende dag een vroege exponentiële fasecultuur te verkrijgen.
  2. Voorbereiding van de microfluïdische plaat en time-lapse microscopie beeldvorming
    OPMERKING: Microfluïdische experimenten kunnen worden uitgevoerd in in de handel verkrijgbare microfluïdische apparaten (zoals hier beschreven) of in intern geproduceerde microfluïdische systemen.
    1. Verwijder de conserveringsoplossing (indien aanwezig) uit elk putje van de microfluïdische plaat en vervang deze door een vers kweekmedium.
      OPMERKING: Als de microfluïdische plaat een afvoerput bevat, moet de conserveringsoplossing van de uitlaatput worden verwijderd, maar niet worden vervangen door het medium.
    2. Sluit de microfluïdische plaat af met het spruitstuksysteem door op de sealknop te klikken of via de microfluïdische software (selecteer eerst Tool, gevolgd door Seal Plate).
      OPMERKING: Om de plaat af te dichten, moet een gelijkmatige druk op de plaat en het spruitstuk worden uitgeoefend door de plaat handmatig tegen het spruitstuk te knijpen. Indien correct uitgevoerd, zou de opmerking "verzegeld" op de ONIX2-interface moeten verschijnen. Het is belangrijk om geen druk uit te oefenen op de glasplaat om elk potentieel risico op het breken van het spruitstuk te voorkomen.
    3. Eenmaal verzegeld, voert u een eerste priming-sequentie uit (klik op Run Liquid Priming Sequence op de microfluïdische software-interface).
      OPMERKING: Run Liquid Priming Sequence komt overeen met 5 minuten perfusie bij 6,9 kPa voor putten 1-5, gevolgd door 5 minuten perfusie bij 6,9 kPa voor put 8 en een laatste perfusieronde voor put 6 gedurende 5 minuten bij 6,9 kPa. De Run Liquid Priming Sequence maakt het mogelijk om de conserveringsoplossing te verwijderen die mogelijk nog aanwezig is in de kanalen die de verschillende putten verbinden.
    4. Incubeer de plaat in een thermostatisch geregelde kast van de microscoop op de gewenste temperatuur (hier 37 °C) gedurende minimaal 2 uur voor aanvang van de microscopiebeeldvorming.
    5. Start een tweede Run Liquid Priming Sequence voordat u met het experiment begint.
    6. Sluit de microfluïdische plaat af door op Seal off te klikken op de microfluïdische software-interface. Vervang het medium in put 1 en put 2 door 200 μL vers medium, in put 3 door 200 μL vers medium dat het antibioticum bevat (hier OFX bij 5 μg·ml−1), in put 4 en put 5 met 200 μL vers medium, in put 6 met 200 μL vers medium en in put 8 met 200 μL van het kweekmonster (vanaf stap 5.1.2) verdund tot een OD600 nm van 0,01 in het verse medium.
    7. Verzegel de microfluïdische plaat zoals beschreven in stap 5.2.2 en plaats de plaat op het microscoopobjectief in de microscoopkast.
      OPMERKING: Zorg ervoor dat u een druppel onderdompelingsolie op het microscoopobjectief plaatst voordat u de microfluïdische plaat plaatst.
    8. Klik in de microfluïdische software op Celladen om de cel in de microfluïdische plaat te laten laden.
      OPMERKING: De celbelastingsstap bestaat uit 15 s perfusie bij 13,8 kPa voor put 8, gevolgd door 15 s perfusie bij 27,6 kPa voor put 6 en put 8, en een laatste perfusieronde voor put 6 voor 30 s bij 6,9 kPa. De dichtheid van de cellen in de microfluïdische plaat is van cruciaal belang voor het experiment. Het eerste deel van dit microfluïdische protocol bestaat uit het kweken van bacteriën gedurende 6 uur in een vers medium vóór de antibioticabehandeling. Na 6 uur groei moet de celdichtheid voldoende zijn om de zeldzame persistercellen te detecteren (in de omstandigheden die in deze studie worden gebruikt, genereren de persistercellen met een frequentie van 10−4). Als de celdichtheid te hoog is, is het moeilijk om de individuele cellen te onderscheiden, wat een nauwkeurige eencellige analyse verhindert. Omdat de groeisnelheid direct afhankelijk is van het medium, moet de dichtheid van cellen in de microscopievelden worden beoordeeld voordat het experiment wordt gestart.
    9. Stel een optimale focus in met behulp van de transmissielichtmodus en selecteer verschillende interessante gebieden (ROIs) waar een geschikt celnummer wordt waargenomen (tot 300 cellen per veld).
      OPMERKING: Selecteer ten minste 40 ROI's om ervoor te zorgen dat de zeldzame persistercellen worden afgebeeld.
    10. Klik in de microfluïdische software op Een protocol maken. Programmeer de injectie van vers medium bij 6,9 kPa gedurende 6 uur (put 1-2), gevolgd door de injectie van het medium met het antibioticum bij 6,9 kPa gedurende 6 uur (goed 3) en ten slotte de injectie van vers medium bij 6,9 kPa gedurende 20 uur (putjes 4-5).
      OPMERKING: Een bacteriecultuur verdund tot een OD600 nm van 0,01 zorgt ervoor dat bacteriën gedurende 6 uur in de microfluïdische kamer kunnen groeien, waardoor de cellen zich in de exponentiële groeifase bevinden. Afhankelijk van het aantal cellen dat tijdens de laadstap in het microfluïdische apparaat wordt ingebracht (zie stap 5.2.8), kan de duur van de groeifase worden aangepast om tot 300 cellen per ROI te verkrijgen. Aangezien persistentie een zeldzaam fenomeen is, verbetert het verhogen van het aantal cellen per ROI de mogelijkheid om persistercellen te observeren. Het celaantal mag echter niet hoger zijn dan 300 cellen per ROI, omdat dit eencellige analyse vervelend maakt.
    11. Voer microscopiebeelden uit in time-lapse-modus met één frame om de 15 minuten met behulp van doorgelaten licht en de excitatielichtbron voor de fluorescerende reporter. Hier werd een 560 nm excitatielichtbron voor het mCherry-signaal gebruikt (580 nm LED bij 10% vermogen met filter 00 [530-585 ex, 615LP em, Zeiss] en 100 ms blootstelling voor mCherry). De Zeiss-compatibele Zen3.2-software werd gebruikt voor cell imaging.
  3. Beeldanalyse
    OPMERKING: Het openen en visualiseren van de microscopiebeelden wordt uitgevoerd met de open-source ImageJ/Fiji-software (https://fiji.sc/)26. De kwantitatieve beeldanalyse wordt uitgevoerd met behulp van de open-source ImageJ/Fiji-software en de gratis MicrobeJ-plug-in (https://microbej.com)27. In dit protocol werd de MicrobeJ 5.13I(14) versie gebruikt.
    1. Open de ImageJ/Fiji-software op de computer en sleep de hyperstack time-lapse microscopie-afbeeldingen naar de Fiji-laadbalk. Gebruik Afbeelding > Kleur > Samengesteld maken om de verschillende kanalen van de hyperstack samen te voegen. Als de kanalen van het time-lapse-experiment niet overeenkomen met de gewenste kleur (het fasecontrast wordt bijvoorbeeld weergegeven in rood in plaats van grijs), gebruikt u Afbeelding > Kleur > Kanalen rangschikken om de juiste kleur op de kanalen toe te passen.
    2. Open de MicrobeJ-plug-in en detecteer de bacteriële cellen met behulp van de handmatige bewerkingsinterface. Verwijder de automatisch gedetecteerde cellen en schets de persistercellen handmatig frame voor frame.
      OPMERKING: Verschillende instellingen kunnen worden gebruikt om individuele cellen automatisch te detecteren. Handmatige detectie werd hier gebruikt omdat de geanalyseerde persistercellen lange filamenten vormen, die zelden correct worden gedetecteerd met behulp van automatische detectie.
    3. Gebruik na detectie het pictogram Resultaat in de handmatige bewerkingsinterface van MicrobeJ om een ResultJ-tabel te genereren. Sla het ResultJ-bestand op en gebruik de tabel ResultJ om inzicht te krijgen in verschillende parameters die van belang zijn voor de eencellige analyse. In het geval van dit protocol werden de gemiddelde fluorescentie van de HU-mCherry-intensiteit, de cellengte en het celoppervlak van individuele cellen geëxporteerd.

Representative Results

Zoals hierboven beschreven, werden de stammen die werden gebruikt voor de eencellige fenotypische analyse van persistercellen gekarakteriseerd in MOPS glycerol 0,4% medium. De monitoring van de OD600nm in de loop van de tijd toonde geen verschil tussen de wt - en hupA-mCherry-stammen (figuur 1). Dit geeft aan dat de expressie van het HU-mCherry fusie-eiwit geen invloed had op de groei in deze omstandigheden. De bacteriële cellen van beide stammen die aanvankelijk werden ingeënt bij een OD600 nm van 0,01 bereikten de exponentiële fase ±8 uur na inenting.

De MIC van OFX werd bepaald met behulp van gestandaardiseerde methoden (hier seriële agarverdunning)24. MIC wordt gedefinieerd als de minimale concentratie waarbij geen zichtbare groei wordt gedetecteerd. De MIC van OFX voor beide stammen werd vastgesteld op 0,06 μg·ml−1, wat aangeeft dat de hupA-mCherry-fusie geen effect had op de gevoeligheid voor OFX in vergelijking met de isogene wt-stam (figuur 2).

We bepaalden verder het effect van een letale OFX-behandeling (83-voudige MIC) op de levensvatbaarheid van beide stammen die in deze studie werden gebruikt. Aangezien het aantal levensvatbare cellen in de loop van de tijd afneemt met OFX-blootstelling, moeten de verdunningen van bacterieculturen op de juiste manier worden aangepast om 30 tot 300 kolonies per plaat te bereiken. Om de juiste verdunningen in de loop van de tijd te bepalen, werd een spottest uitgevoerd, waarbij 10 μL van 0 tot 10−7 seriële 10-voudige verdunningen op vierkante petrischalen werden geplaatst met behulp van een meerkanaalspipet. De juiste verdunningen waren die waarbij geïsoleerde klonen zichtbaar waren (bv. bij t0 = 10−5, t1h = 10−4/10−3, t4h = 10−2/10−1) (figuur 3).

Hoewel de spottest een eenvoudige methode is om inzicht te krijgen in de kinetiek van OFX-gemedieerde moorden, slaagt het er niet in om de moorddynamiek nauwkeurig te bepalen. Wanneer de levensvatbaarheid van exponentieel groeiende cellen behandeld met OFX werd gecontroleerd door de time-kill assay, werd een typische bifasische curve waargenomen (figuur 4). De eerste helling van de curve weerspiegelt de snelle sterfte van de niet-persisterende populatie (rode stippellijn). In de hier geteste omstandigheden was tot 99,9% van de cellen niet in staat om kolonies te vormen na 3 uur in aanwezigheid van OFX. Deze eerste fase van het doden wordt gevolgd door een tweede fase, met een langzamere dodingssnelheid (blauwe stippellijn), die de aanwezigheid van drugstolerante persistercellen onthult. In de geteste omstandigheden begon de persisterfase ongeveer 3 uur na de OFX-toevoeging, wat de noodzaak benadrukte om de cellen langer dan 3 uur aan OFX bloot te stellen om de persisterfenotypen te onderzoeken. Belangrijk is dat de time-kill curve laat zien dat het hupA-mCherry fusie-eiwit geen effect had op de time-kill kinetiek. De stam die codeert voor de translationele fluorescerende fusie kan daarom worden gebruikt om de persistercellen te controleren met behulp van fluorescentiemicroscopie.

We gingen verder met het onderzoeken van het persistentiefenomeen op het niveau van één cel. Om dit te doen, werd de hupA-mCherry-stam geïntroduceerd in een microfluïdische plaat, die de verandering van mediumomstandigheden (hier, groei, behandeling en herstel) mogelijk maakte tijdens het uitvoeren van time-lapse microscopie op een bepaalde ROI. Tijdens de eerste stap van het microfluïdische experiment werden de cellen die in het microfluïdische apparaat werden geïntroduceerd, doordrenkt met groeimedium (MOPS-glycerol 0,4%) en gedeeld met een generatietijd van ~ 2 uur (figuur 5 en figuur 6). Deze eerste groeifase geeft aan dat cellen levensvatbaar waren en actief deelden vóór de OFX-behandeling.

Na deze eerste groeifase werden de cellen doordrenkt met groeimedium aangevuld met 5 μg·mL−1 OFX gedurende 6 uur. Zodra het antibioticum de cellen bereikte, werd de celdeling geblokkeerd (figuur 5 en figuur 6). Na 6 uur OFX-behandeling werden de cellen doordrenkt met vers medium. Terwijl de overgrote meerderheid van de cellen niet in staat was om de groei te hervatten (figuur 5 en figuur 6), was een kleine subpopulatie van bacteriën in staat om filamenteuze cellen te verlengen en te genereren25. Deze cellen, die in staat waren om levensvatbare dochtercellen te delen en te genereren na de OFX-behandeling, kunnen worden gedefinieerd als de persistercellen.

Omdat deze opstelling de visualisatie van de persistercellen voor, tijdens en na de behandeling mogelijk maakt, geeft het niet alleen informatie over het persisterfenotype tijdens de herstelfase, maar ook over de fysiologische toestand van de persistercellen vóór de behandeling (figuur 6). In de geteste omstandigheden deelden de persistercellen zich op dezelfde manier als niet-persistercellen voorafgaand aan de OFX-behandeling, wat aangeeft dat de waargenomen persistercellen niet afkomstig waren uit een slapende subpopulatie (figuur 6)25.

De cellengteanalyse van persistercellen tijdens de herstelfase onthulde dat elk filament een specifieke reksnelheid had. De cellengte die elke persister vóór de eerste deling bereikte, verschilde van de ene persister tot de andere. Ook de timing van de eerste divisie was zeer heterogeen (figuur 6). De delende persisterfilament genereerde meerdere dochtercellen, die begonnen te groeien en te delen, voor het grootste deel, vergelijkbaar met onbehandelde cellen (figuur 7). De opeenvolgende deling van de gloeidraad resulteerde vervolgens in een progressieve afname van de cellengte, waardoor uiteindelijk dochtercellen ontstonden met een vergelijkbare cellengte als vóór de OFX-behandeling (figuur 6 en figuur 7B). De overgrote meerderheid van de cellen was niet in staat om filamentatie te induceren na OFX-verwijdering. Deze grote celpopulatie komt overeen met de dode cellen (figuur 5 en figuur 6).

De fluorescerende fusie van het nucleoïde-geassocieerde eiwit HU maakt de visualisatie van de dynamiek van de nucleoïde22 mogelijk. De analyse van de totale fluorescentie-intensiteit van HU-mCherry in de cel kan worden gebruikt als een proxy voor het DNA-gehalte22,25. Tijdens de groeifase (vóór OFX-behandeling) varieerde de totale mCherry-fluorescentie-intensiteit, wat de dynamiek van chromosoomreplicatie en segregatie tijdens de celcyclus weerspiegelt (figuur 8). Na OFX-toevoeging nam de mCherry-fluorescentie toe in het midden van de cel, wat wijst op nucleoïde verdichting, waarvan is aangetoond dat deze wordt geïnduceerd door de vorming van dubbelstrengs DNA-breuken28 (figuur 5). Dubbelstrengs DNA-breuken zijn een gevolg van het werkingsmechanisme van OFX, dat de type II topoisomerases DNA-gyrase en topoisomerase IV29,30 corrumpeert. In E. coli is DNA-gyrase het primaire doelwit van OFX29,30. Door zijn doelwit te binden aan een kritieke stap van het dubbelstrengs passagemechanisme, remt OFX de degradatie van de gesplitste DNA-strengen, wat uiteindelijk leidt tot de afgifte van dubbelstrengs DNA-breuken30. Zoals hierboven beschreven, begonnen de persistercellen voor OFX-behandeling te filamenteren tijdens herstel25 (figuur 6). De toename van de cellengte correleerde met een toename van de totale mCherry-fluorescentie-intensiteit, die de replicatieherstart weerspiegelt en een toename van de nucleoïde-abundantie in het filament25 (figuur 7a en figuur 8). Voor dode cellen bleef de totale mCherry-fluorescentie-intensiteit stabiel tijdens de behandeling en tijdens de herstelfase, wat aangeeft dat deze cellen hun chromosomen niet konden repliceren na OFX-verwijdering (figuur 8). Microfluïdische video (Video 1) van E. coli HU-mCherry-cellen voor, tijdens en na behandeling met ofloxacine wordt ook getoond.

Figure 1
Figuur 1: Groeimonitoring van wt en hupA-mCherry E. coli stammen. Optische dichtheidsbewaking (OD600 nm) van wt (zwart) en hupA-mCherry (rood). De tinten en stippellijnen geven de standaardafwijkingen van de biologische drievouden aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: Bepaling van de MIC van OFX voor de stammen wt en hupA-mCherry E. coli. De wt () en hupA-mCherry (●) werden gekweekt in LB-medium en 2 μL werden waargenomen op seriële verdunningen van OFX-bevattende LB-agar (♦ concentratie aangegeven in elk paneel in μg·mL−1). Groeiremming is zichtbaar bij minimaal 0,06 μg·ml−1. De figuur is een representatief experiment van biologische drievoudigen. Schaalbalk = 1 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Spottest van wt - en hupA-mCherry E . coli-stammen bij blootstelling aan OFX. De (A) wt en (B) hupA-mCherry stammen werden gekweekt in MOPS glycerol 0,4% zoals beschreven in het protocol (sectie 3), en de exponentieel groeiende cellen (OD600 nm = 0,3) werden behandeld met 5 μg·mL−1 OFX. T0 komt overeen met het tijdstip vóór de toevoeging van OFX. T1, T2, T3, T4, T5 en T6 komen overeen met 1-6 uur na de OFX-toevoeging. De figuur is een representatief experiment van biologische drievoudigen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Time-kill assay van wt en hupA-mCherry E. coli stammen bij blootstelling aan OFX. De stammen wt () en hupA-mCherry (●) werden gekweekt in MOPS glycerol 0,4% zoals beschreven in het protocol (sectie 4), en de exponentieel groeiende cellen (♦ OD600 nm = 0,3) werden behandeld met 5 μg·mL−1 OFX. De stippellijnen geven de eerste "snelle" (rode) dodingsfase en de tweede "langzame" (blauwe) dodingsfase aan, overeenkomend met de gevoelige en persistente subpopulaties (verkregen door lineaire regressie tussen T0 en T2, evenals tussen respectievelijk T3 en T6). De foutbalken geven de standaardafwijkingen van de biologische drievouden aan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: Representatieve beelden van de OFX-persister en dode cellen met behulp van microfluïdische hulpmiddelen. Representatieve microscopiebeelden met de relevante tijdstippen van het microfluïdische experiment uitgevoerd met de hupA-mCherry-stam (fasecontrast in grijs, HU-mCherry-signaal in rood). De cellen die de gelabelde hupA-mCherry tot expressie brengen, werden gekweekt in een microfluïdische plaat (hier, 4 uur), gevolgd door een OFX-uitdaging (5 μg·mL−1). Na 6 uur in aanwezigheid van OFX werden de cellen doordrenkt met vers medium, waardoor de persistercellen zich konden herstellen. De persistercel en zijn nakomelingencellen tijdens de OFX-behandeling en na OFX-verwijdering worden respectievelijk groen en blauw gemarkeerd. De bijbehorende tijdstippen worden op elk paneel aangegeven. Schaalbalk = 5 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Microscopie time-lapse analyse van de lengte van de persister en dode cellen. Cellengteanalyse van dode cellen (in rood, n = 109) en persistercellen (in grijs, n = 13). Het begin van de OFX-behandeling (5 μg·ml−1) wordt aangegeven door de rode stippellijn (5 uur) en de OFX-verwijdering wordt aangegeven door de blauwe stippellijn. De inzet komt overeen met de groeifase vóór OFX-toevoeging. De experimenten werden in drievoud uitgevoerd. De tinten en stippellijnen geven de standaarddeviaties voor de dodecelpopulatie aan (n = 109). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 7
Figuur 7: Microscopie time-lapse analyse van een representatieve persister voor OFX. (A) Kymograaf van een representatieve OFX-persister en zijn dochtercellen gegenereerd door filamentdelingen gedurende 8,5 uur na OFX-verwijdering (18,5 uur na het begin van het microfluïdische experiment, bestaande uit 4 uur groei, 6 uur 5 μg·ml−1 OFX-behandeling en 8,5 uur herstel na OFX-verwijdering). Eén frame komt overeen met 15 min. Schaalbalk = 5 μm. (B) Masker gegenereerd door de persister-kymograaf in A. De bewaakte persistercel wordt aangegeven met een blauwe omtrek en de dochtercellen worden gemarkeerd in verschillende kleuren. (C) Schematische weergave van de persistercellijn gegenereerd uit B. De kleurcodering is identiek aan B. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 8
Figuur 8: Cellengte en mCherry fluorescentie analyse van representatieve persister en dode cellen. Analyse van de cellengte (linkeras) en de totale HU-mCherry fluorescentie-intensiteit (rechteras, weergegeven in willekeurige eenheden) van een representatieve persister (effen zwarte en rode lijnen) en een representatieve dode cel (onderbroken zwarte en rode lijn) tijdens het microfluïdische time-lapse-experiment. Het begin van de OFX-behandeling (5 μg·ml−1) wordt aangegeven door de rode stippellijn en de OFX-verwijdering door de blauwe stippellijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Video 1: Microfluïdische video van E. coli HU-mCherry cellen voor, tijdens en na de behandeling met ofloxacine. Microfluïdische time-lapse beeldvorming met HU-mCherry-cellen. De cellen werden gedurende 4 uur gekweekt in MOPS glycerol 0,4%. Na 6 uur OFX-behandeling (5 μg·ml−1) werd het antibioticavrije medium in de microfluïdische plaat geperfundeerd om de persistercellen te laten herstellen. Schaalbalk = 5 μm. De tijd (in min) wordt aangegeven. De groei- en herstelfasen worden aangegeven met "MOPS-Gly. 0,4%" en de OFX-behandeling met "OFX 5 μg/ml". Klik hier om deze video te downloaden.

10x MOPS
Voorraad oplossing Volume voorraadoplossing voor 1 L van 10x MOPS Eindconcentratie in 10x MOPS-basis
MOPS zuur 1 M (aangepast tot pH 7,4 met behulp van KOH) 400 ml 0,4 m
Tricine 1 M (aangepast tot pH 7,4 met behulp van KOH) 40 ml 0,04 m
FeSO4.7H2O 0,01 m 10 ml 0,0001 m
NH4cl 1,9 m 50 ml 0,095 m
K2DUS4  0,276 m 10 ml 0,00276 M
CaCl2,2H 2O 0,0005 M 10 ml 0,000005 m
MgCl 2,6H2O 0,528 m 10 ml 0,00528 m
NaCl direct toevoegen 29.2 g 0,5 m
Gedestilleerd water 460 ml
Micronutrimenten 1000x (zie tabel 2) 10 ml

Tabel 1: Samenstelling van 10x MOPS.

Micronutrimenten 1000x
Concentratie in Micronutriments 1000x stockoplossing Eindconcentratie in 10x MOPS-basis
(NH4)6Mo7O24.4H2O 0,000003 m 0,00000003 m
H3 BO3 0,0004 m 0,000004 m
CoCl2.6H 2O 0,00003 m 0,0000003 m
CuSO4,5H 2O 0,00001 m 0,0000001 m
MnCl 2,4 H2 O 0,00008 m 0,0000008 m
ZnSO.7H2O 0,00001 m 0,0000001m

Tabel 2: Samenstelling van 1.000x micronutriënten.

MOPS glucose 0,4% of MOPS glycerol 0,4%
Voorraad oplossing Volume voor 1 l MOPS glucose 0,4 % of MOPS glycerol 0,4 % Eindconcentratie in MOPS glucose 0,4% of MOPS glycerl 0,4%
10x MOPS zie tabel 1 100 ml
K2HPO4 0,132 m 10 ml 0,00132 M
Glucose (voor MOPS glucose 0,4%) 20% (20 g in 100 ml gedestilleerd water) 20 ml 0.40%
Glycerol (voor MOPS glycerol 0,4%) ≤99% 4 ml 0.40%
Gedestilleerd water 870 ml voor MOPS glucose 0,4% of 886 ml voor MOPS glycerol 0,4%

Tabel 3: Samenstelling van MOPS glucose 0,4% en MOPS glycerol 0,4%.

Discussion

Het protocol dat in dit artikel wordt gepresenteerd, maakt de analyse mogelijk van het persistentiefenotype dat wordt waargenomen als reactie op antibioticabehandeling op populatie- en eencellig niveau. De experimenten werden uitgevoerd met de E. coli MG1655-stam, die werd gekweekt in een chemisch gedefinieerd medium (MOPS-glycerol 0,4%). Time-kill assays en microscopie-experimenten werden uitgevoerd op exponentiële faseculturen. We gebruikten OFX, een fluoroquinolon, in een concentratie van 5 μg·ml−1 om de persistercellen te onthullen. De hier beschreven benaderingen kunnen worden toegepast op andere bacteriedodende antibiotica, zoals β-lactams, aminoglycosiden of antimicrobiële verbindingen31. Dienovereenkomstig kunnen andere bacteriestammen, media of groeiomstandigheden worden gebruikt. Het monitoren van verschillende fluorescerende fusies in een vergelijkbare opstelling als die hier wordt beschreven, kan nuttig zijn voor het volgen van cellulaire processen zoals DNA-replicatie32, DNA-reparatie25,33 en celdeling34 voor, tijdens en na de antibioticabehandeling. Op dezelfde manier kunnen fluorescerende reporters worden gebruikt om verschillende aspecten van celfysiologie te onderzoeken, zoals intracellulaire pH 35, ATP36 of ROS37-niveaus. Als alternatief voor fluorescerende fusies kunnen ook chemische kleurstoffen worden toegepast. De hupA-mCherry-fusie kan bijvoorbeeld worden vervangen door 4',6-diamidino-2-fenylindool (DAPI), een fluorescerende kleurstof die DNA38 kleurt. Het uitvoeren van time-lapse microscopie in combinatie met dergelijke fluorescerende kleurstoffen moet echter worden vermeden, omdat deze kleuringstechnieken de dynamiek van de celcyclus tijdens time-lapse-experimenten kunnen verstoren. Als alternatief kunnen dergelijke experimenten worden vervangen door tijdsloopanalyses van snap-shot imaging op relevante tijdstippen.

Hoewel dergelijke fluorescerende verslaggevers nuttig zijn, mag de hoeveelheid informatie die kan worden geëxtraheerd door de analyse van fasecontrastbeelden niet worden verwaarloosd. Hier volgden we de evolutie van de cellengte gedurende de groei, OFX-behandeling en herstelfasen. Andere parameters op basis van fasecontrastbeelden, zoals celbreedte, fasecontrastintensiteit en krommingen van de bacteriële cellen, kunnen ook gemakkelijk worden geëxtraheerd met behulp van geschikte software, zoals MicrobeJ27.

Samenvattend kan de hier beschreven procedure worden toegepast op andere aandoeningen en bacteriesoorten om cellulaire reacties op veranderende omgevingen of stressoren te controleren18,19. Door gebruik te maken van andere fluorescerende reporters (transcriptionele en translationele reporters, chemische kleurstof) in combinatie met een populatieanalyse, zoals flowcytometrie/FACS, kunnen interessante vragen in een multi-scale framework worden aangepakt.

Disclosures

De auteurs verklaren geen tegenstrijdige belangen te hebben.

Acknowledgments

Het werk in het Van Melderen lab wordt ondersteund door de ARC acties 2018-2023, het Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS CDR J.0182.21F). T.O. wordt ondersteund door een ULB-fellowship. T.S. wordt ondersteund door een FRIA fellowship (FNRS). J.C. wordt ondersteund door een postdoctoraal mandaat "chargé de recherches" (FNRS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axio Observer Zeiss Inverted fluorescence microscope
CaCl2.2H2O  Merck 1.02382.0250 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
CellASIC ONIX Microfluidic System  Merck CAX2-S0000  Microfluidic system
CellASIC ONIX2 FG Merck ONIX2 1.0.1  Microfluidic software
CellASIC ONIX2 Manifold Basic  Merck CAX2-MBC20 Manifold system
CoCl2.6H2O Merck 1.02539.0100 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
CuSO4.5H2O Merck 1.02790.0250 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
D-(+)-glucose Sigma Aldrich G7021-1KG Carbon source for MOPS glucose 0.4% growth medium
E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) BE10 wt reference strain, lab strain
E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT BE16 HU-mCherry fusion integrated via P1 transduction at the native locus, lab strain
FeSO4.7H2O  VWR Chemicals 24244.232 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Fiji ImageJ https://fiji.sc/  Image software; Schindelin et al. if used in publication
Glycerol Merck 56815 Carbon source for MOPS glycerol 0.4% growth medium
Greiner CELLSTAR® multiwell culture plate Merck M8812-100EA 24-well clear flat bottom 2ml volume culture plate for automated plate reader
H3BO3  Sigma-Aldrich B6768-1KG For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 digital camera Hamamatsu C13440-20CU Digital Image Acqusition
K2HPO4 Merck 1.05099.1000 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
KOH Merck 1.05029.1000 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
K2SO4  Merck 1.05153.0500 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Luria-Broth agar medium Invitrogen 22700041 Growth medium for plating assay
Luria-Broth medium Invitrogen 12780029 Growth medium for MIC determination
MgCl2.6H2O  Merck 1.05832.1000 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
MgSO4 Merck 7487-88-9 Dilution solution for bacterial survival assay used at 10mM
MicrobeJ  Imagej/Fiji plugin https://www.microbej.com/ Microscopy image analysis plugin. Ducret et al.for in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. 
Microfluidic Plates CellASIC ONIX Merck B04A-03-5PK  Plate for microfluidic system
MnCl2.4H2O Merck 1.05927.0100 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
MOPS, Free Acid ULTROL® Grade Merck 475898-500GM For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
NaCl SIgma-Aldrich S5886-1KG For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
(NH4)6Mo7O24.4H2O Merck 1.01180.0250 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
NH4Cl  Merck 1.01145.0500 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Ofloxacin Merck 82419-36-1 Fluoroquinolone antibiotic used to treat the bacterial cells
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4, 1x Merck P3813 Dilution buffer
GENESYS 10S UV-Visible Spectrophotometer Thermofisher Scientific  840-208200 UV-Visible Spectrophotometer, Single/Six Cell Holder with PrinterMeasurement of optical density OD600nm
SoftMax Pro Molecular Devices Microplate reader software
SpectraMax i3x Molecular Devices Microplate reader
N-[Tris(hydroxyméthyl)-méthyl]-glycine Merck 1.08602.0250 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Zeiss® immersion Oil 518F Zeiss Immersion oil to increase resolution of microscope
Zen3.2 Pro Zeiss Microscopic image acquisition and processing software
ZnSO4.7H2O  Merck 1.08883.0500 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balaban, N. Q., et al. Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence. Nature Reviews Microbiology. 17 (7), 441-448 (2019).
  2. Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).
  3. Pribis, J. P., Zhai, Y., Hastings, P. J., Rosenberg, S. M. Stress-induced mutagenesis, gambler cells, and stealth targeting antibiotic-induced evolution. mBio. 13 (3), 01074 (2022).
  4. Molina-Quiroz, R. C., Lazinski, D. W., Camilli, A., Levy, S. B. Transposon-sequencing analysis unveils novel genes involved in the generation of persister cells in uropathogenic Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6907-6910 (2016).
  5. Cameron, D. R., Shan, Y., Zalis, E. A., Isabella, V., Lewis, K. A genetic determinant of persister cell formation in bacterial pathogens. Journal of Bacteriology. 200 (17), 00303-00318 (2018).
  6. Cui, P., et al. Identification of genes involved in bacteriostatic antibiotic-induced persister formation. Frontiers in Microbiology. 9, 413 (2018).
  7. Li, T., et al. Identification of novel genes involved in Escherichia coli persistence to tosufloxacin. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 581986 (2020).
  8. Verstraeten, N., et al. Obg and membrane depolarization are part of a microbial bet-hedging strategy that leads to antibiotic tolerance. Molecular Cell. 59 (1), 9-21 (2015).
  9. Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli. BMC Microbiology. 13 (1), 25 (2013).
  10. Huemer, M., Mairpady Shambat, S., Brugger, S. D., Zinkernagel, A. S. Antibiotic resistance and persistence-Implications for human health and treatment perspectives. EMBO Reports. 21 (12), 51034 (2020).
  11. Wilmaerts, D., Windels, E. M., Verstraeten, N., Michiels, J. General mechanisms leading to persister formation and awakening. Trends in Genetics. 35 (6), 401-411 (2019).
  12. Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. Ploidy is an important determinant of fluoroquinolone persister survival. Current Biology. 31 (10), 2039-2050 (2021).
  13. Lemma, A. S., Soto-Echevarria, N., Brynildsen, M. P. Fluoroquinolone persistence in Escherichia coli requires DNA repair despite differing between starving populations. Microorganisms. 10 (2), 286 (2022).
  14. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).
  15. Morawska, L. P., Kuipers, O. P. Antibiotic tolerance in environmentally stressed Bacillus subtilis: Physical barriers and induction of a viable but nonculturable state. microLife. 3, (2022).
  16. Windels, E. M., et al. Enrichment of persisters enabled by a ß-lactam-induced filamentation method reveals their stochastic single-cell awakening. Communications Biology. 2 (1), 426 (2019).
  17. Leygeber, M., et al. Analyzing microbial population heterogeneity-Expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations. Journal of Molecular Biology. 431 (23), 4569-4588 (2019).
  18. Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. Response of Escherichia coli growth rate to osmotic shock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7807-7812 (2014).
  19. Shi, H., et al. Starvation induces shrinkage of the bacterial cytoplasm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (24), 2104686118 (2021).
  20. Goode, O., et al. Persister Escherichia coli cells have a lower intracellular pH than susceptible cells but maintain their pH in response to antibiotic treatment. mBio. 12 (4), 00909-00921 (2021).
  21. Manuse, S., et al. Bacterial persisters are a stochastically formed subpopulation of low-energy cells. PLoS Biology. 19 (4), 3001194 (2021).
  22. Fisher, J. K., et al. Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells. Cell. 153 (4), 882-895 (2013).
  23. Cabral, D., Wurster, J., Belenky, P. Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions. Pharmaceuticals. 11 (1), 14 (2018).
  24. Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).
  25. Goormaghtigh, F., Van Melderen, L. Single-cell imaging and characterization of Escherichia coli persister cells to ofloxacin in exponential cultures. Science Advances. 5 (6), (2019).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. 1 (7), 16077 (2016).
  28. Odsbu, I., Skarstad, K. DNA compaction in the early part of the SOS response is dependent on RecN and RecA. Microbiology. 160 (5), 872-882 (2014).
  29. Pham, T. D. M., Ziora, Z. M., Blaskovich, M. A. T. Quinolone antibiotics. MedChemComm. 10 (10), 1719-1739 (2019).
  30. Drlica, K., et al. Quinolones: Action and resistance updated. Current Topics in Medicinal Chemistry. 9 (11), 981-998 (2009).
  31. Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. How antibiotics kill bacteria: From targets to networks. Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 423-435 (2010).
  32. Reyes-Lamothe, R., Sherratt, D. J., Leake, M. C. Stoichiometry and architecture of active DNA replication machinery in Escherichia coli. Science. 328 (5977), 498-501 (2010).
  33. Lesterlin, C., Ball, G., Schermelleh, L., Sherratt, D. J. RecA bundles mediate homology pairing between distant sisters during DNA break repair. Nature. 506 (7487), 249-253 (2014).
  34. Alexeeva, S., Gadella, T. W. J., Verheul, J., Verhoeven, G. S., Den Blaauwen, T. Direct interactions of early and late assembling division proteins in Escherichia coli cells resolved by FRET: Bacterial division studied by spectral FRET. Molecular Microbiology. 77 (2), 384-398 (2010).
  35. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  36. Yaginuma, H., et al. Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging. Scientific Reports. 4, 6522 (2014).
  37. Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5, 5222 (2014).
  38. Kapuscinski, J. DAPI: A DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).

Tags

Biologie Antibioticum persistentie populatieanalyse eencellige analyse Escherichia coli ofloxacine fluorescentiemicroscopie microfluïdica
Populatie- en eencellige analyse van antibioticapersistentie in <em>Escherichia coli</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oms, T., Schlechtweg, T., Cayron,… More

Oms, T., Schlechtweg, T., Cayron, J., Van Melderen, L. Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (193), e64550, doi:10.3791/64550 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter