Summary
Protokol, bir fare modelinde hafif travmatik beyin hasarını tanımlar. Özellikle, hafif bir orta hat kapalı kafa travmasını indüklemek için adım adım bir protokol ve hayvan modelinin karakterizasyonu tam olarak açıklanmaktadır.
Abstract
İyi tanımlanmış patolojilere sahip travmatik beyin hasarının (TBI) yüksek oranda tekrarlanabilir hayvan modelleri, terapötik müdahaleleri test etmek ve bir TBI'nın beyin fonksiyonunu nasıl değiştirdiğinin mekanizmalarını anlamak için gereklidir. TBI'nın çoklu hayvan modellerinin mevcudiyeti, insanlarda görülen TBI'nın farklı yönlerini ve şiddetlerini modellemek için gereklidir. Bu makalede, hafif TBI'nın bir fare modelini geliştirmek için orta hat kapalı kafa travmasının (CHI) kullanımı açıklanmaktadır. Model hafif olarak kabul edilir, çünkü nörogörüntüleme veya brüt nöronal kayba dayalı yapısal beyin lezyonları üretmez. Bununla birlikte, tek bir etki, bilişsel bozukluğun yaralanmadan en az 1 ay sonra ölçülebilir olması için yeterli patoloji yaratır. Makalede, stereotaksik olarak yönlendirilen bir elektromanyetik darbeci kullanarak farelerde bir CHI'yi indüklemek için adım adım bir protokol tanımlanmıştır. Hafif orta hat CHI modelinin faydaları, yaralanmaya bağlı değişikliklerin düşük mortalite ile tekrarlanabilirliğini içerir. Model, nörogörüntüleme, nörokimyasal, nöropatolojik ve davranışsal değişiklikler için yaralanmadan 1 yıl sonrasına kadar geçici olarak karakterize edilmiştir. Model, aynı darbeci cihazı kullanarak kontrollü kortikal etkinin kafatası modellerini açmak için tamamlayıcıdır. Böylece, laboratuvarlar hem hafif diffüz TBI'yı hem de fokal orta-şiddetli TBI'yı aynı darbeci ile modelleyebilir.
Introduction
Travmatik beyin hasarı (TBI), genellikle düşmeler, spor yaralanmaları, fiziksel şiddet veya trafik kazaları ile ilişkili olan beyindeki dış bir kuvvetten kaynaklanır. 2014 yılında, Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri, 2.53 milyon Amerikalının TBI ile ilgili kazalar için tıbbi yardım almak üzere acil servisi ziyaret ettiğini belirledi1. Hafif TBI (mTBI) TBI vakalarının çoğunluğunu temsil ettiğinden, son birkaç on yılda, ağırlık düşüşü, piston tahrikli kapalı kafa travması ve kontrollü kortikal darbe, rotasyonel yaralanma, hafif sıvı perküsyon yaralanması ve patlama yaralanması modelleri 2,3'ü içeren birden fazla mTBI modeli benimsenmiştir. MTBI modellerinin heterojenliği, insanlarda görülen mTBI ile ilişkili farklı özellikleri ele almak ve beyin hasarı ile ilişkili hücresel ve moleküler mekanizmaların değerlendirilmesine yardımcı olmak için yararlıdır.
Yaygın olarak kullanılan kapalı kafa travması modellerinden ilk ve en yaygın kullanılan modellerden biri, bir nesnenin belirli bir yükseklikten hayvanın kafasına (anestezi uygulanmış veya uyanık) düşürüldüğü ağırlık düşürme yöntemidir2,4. Ağırlık düşürme yönteminde, yaralanmanın şiddeti, yapılan veya yapılmayan, kafa sabit veya serbest ve düşen nesnenin mesafesi ve ağırlığı 2,4 dahil olmak üzere çeşitli parametrelere bağlıdır. Bu modelin bir dezavantajı, yaralanmanın şiddetindeki yüksek değişkenlik ve solunum depresyonu ile ilişkili yüksek mortalite oranıdır 5,6. Yaygın bir alternatif, doğrudan maruz kalan dura (kontrollü kortikal darbe: CCI) veya kapalı kafatası (kapalı kafa travması: CHI) üzerinde yapılabilen pnömatik veya elektromanyetik bir cihaz kullanarak etkiyi vermektir. Piston tahrikli yaralanmanın güçlü yönlerinden biri, yüksek tekrarlanabilirliği ve düşük mortalitesidir. Bununla birlikte, CCI kraniyotomi 7,8 gerektirir ve kraniyotominin kendisi inflamasyonu indükler9. Bunun yerine, CHI modelinde, kraniyotomiye gerek yoktur. Daha önce de belirtildiği gibi, her modelin sınırlamaları vardır. Bu yazıda açıklanan CHI modelinin sınırlamalarından biri, ameliyatın stereotaksik bir çerçeve kullanılarak gerçekleştirilmesi ve hayvanın başının hareketsiz hale getirilmesidir. Tam kafa immobilizasyonu tekrarlanabilirliği sağlarken, bir mTBI ile ilişkili yaralanmaya katkıda bulunabilecek darbeden sonraki hareketi hesaba katmaz.
Bu protokol, bir farede ticari olarak temin edilebilen bir elektromanyetik darbe cihazı10 ile bir CHI etkisi gerçekleştirmek için temel bir yöntemi açıklar. Bu protokol, yüksek oranda tekrarlanabilir bir yaralanma elde etmek için ilgili kesin parametreleri detaylandırır. Özellikle, araştırmacı, yaralanma şiddetini kesin olarak tanımlamak için parametreler (yaralanma derinliği, bekleme süresi ve etki hızı) üzerinde hassas kontrole sahiptir. Tarif edildiği gibi, bu CHI modeli, hem yaygın hem de mikroskobik (yani, glia, aksonal ve vasküler hasarın kronik aktivasyonu) ve davranışsal fenotipler 11,12,13,14,15 olmak üzere bilateral patoloji ile sonuçlanan bir yaralanma üretir. Ek olarak, tarif edilen model, yaralanmadan 1 yıl sonra bile MRG'ye dayalı yapısal beyin lezyonlarını veya patolojideki brüt lezyonları indüklemediği için hafif olarak kabul edilir16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yapılan deneyler, Kentucky Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve çalışma sırasında hem ARRIVE hem de Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu kılavuzlarına uyuldu.
1. Cerrahi kurulum
NOT: Fareler 4-5/kafesli gruplar halinde yerleştirilir, muhafaza odasındaki nem oranı %43-%47 arasında ve sıcaklık 22-23 °C'de tutulur. Farelere yiyecek ve suya ad libitum erişimi verilir ve 12 saat / 12 saat ışık / karanlık döngüsüne maruz bırakılır (sabah 7 / akşam 7).
- Hayvan ameliyatını gerçekleştirmek için başlık veya özel cerrahi prosedür odası gibi belirlenmiş bir cerrahi alan kullanın.
- Cerrahi alanın bir ısıtma yastığı, elektromanyetik darbeci ile donatılmış stereotaksik bir çerçeve ve izofluran gazını uygulamak için tasarlanmış bir anestezi maskesi içerdiğinden emin olun (bkz. Şekil 1A).
- Ameliyata katılan cerrahın veya personelin temiz bir laboratuvar önlüğü, yüz maskesi, eldiven ve cerrahi şapka giydiğinden emin olun.
- Steril cerrahi aletler, steril pamuk uçlu aplikatörler ve gazlı bez pedler kullanın. Ameliyat günü boyunca fareler arasındaki aletleri sterilize etmek için sıcak boncuklu bir sterilizatör kullanın.
- Fareyi ameliyat öncesi bir alanda ameliyata hazırlamak için bir anestezi indüksiyon odası kullanın.
- Hayvanın sıcaklığını korumak için ısıtma pedleri kullanın, ameliyat sonrası fare tutma kafeslerini temizleyin ve ameliyattan sonra farenin doğru refleksini kaydetmek için zamanlayıcılar kullanın.
2. Ameliyat öncesi prosedür
- Baş destek aparatını hazırlayın (bkz. Şekil 1B).
- Haddelenmiş uç sırtını 1 mL lateks pipet ampulünden (şişirilebilir uç) çıkarın (bkz. Şekil 1C).
- Ampulü parafilm kullanarak boruya takın (bkz. Şekil 1C).
- Boruyu bir stopcock kullanarak 10 mL'lik bir şırıngaya bağlayın. Şırıngayı suyla doldurun (bkz. Şekil 1C).
NOT: 1 mL lateks pipet ampulü, darbe kuvvetini kulaklardan uzaklaştırmak için farenin başının altına yerleştirilecektir. Kullanmadan önce ampulden mümkün olduğunca fazla hava çıkarmaya çalışın, böylece ampul çoğunlukla suyla doldurulur, hava ile doldurulmaz.
- Darbeci kurulumu.
- 5 mm'lik prob ucunu seçin, aktüatörün alt ortasındaki pistona vidalayın (daha büyük silindirin içinde) ve aşırı kuvvet uygulamadan probu yavaşça sıkın. Darbeler arasındaki ucu tekrar sıkın (bkz. Şekil 1B).
- Darbeyi açmadan önce, Genişlet/Geri Çek düğmesinin ortadaki Kapalı konumuna yerleştirildiğinden emin olun. Ardından, aktüatördeki kabloyu darbeci kontrol kutusunun ön panelindeki jaka ve sensör kablosunu ön paneldeki jaka bağlayın. Ardından, arka paneldeki güç düğmesini açın (bkz. Şekil 1D).
NOT: Genişlet/Geri Çek geçiş düğmesinin kullanılmadığında ortadaki Kapalı konumda kalması gerekir. - Kontrol kutusunun sol tarafındaki büyük düğmeyi, ekranda 5,0 ± 0,2 m/sn darbe hızı görünene kadar döndürerek darbe hızını ayarlayın (bkz. Şekil 1D).
- Kasa, kasa 0,01'i okuyana kadar kadranları çevirerek kasa sayacını 100 ms'ye ayarlayın (bkz. Şekil 1D).
NOT: Bekleme, otomatik geri çekme gerçekleşmeden önceki temas zamanıdır. - Plastik silindirin genişlemesini önlemek için darbeci aktüatörü bir buz torbasına yerleştirin, bu da silindiri yerine kilitler, silindirin hareketini ve gelecekteki darbelerin yayılmasını önler (bkz. Şekil 1E).
- Fareyi ameliyat için hazırlayın.
- Ameliyattan önce fareyi görsel olarak inceleyin ve aşağıdaki koşullardan biri gözlenirse fareyi çalışmadan çıkarın: zayıf ceket durumu, uyuşukluk veya 4 aylık bir fare için zayıf ağırlık (<20 g).
- 1-2 dakika boyunca bir ısıtma yastığına yerleştirilmiş bir indüksiyon odası kullanarak% 100 oksijende% 4 -% 5 izofluran ile fareyi uyuşturun.
- Elektrikli bir saç kesme makinesi kullanarak kürkü ameliyat bölgesinden tıraş edin.
- Kafayı steril alkol hazırlama pedleriyle temizleyin ve ameliyatın başlamasından en az 15 dakika önce tıraş edilen kafa derisine topikal anestezi uygulayın.
- Ameliyattan önce fareyi temiz bir tutma kafesine geri koyun. En az 15 dakikalık topikal anestezik uygulamadan sonra (indüksiyon süresi) ameliyata başlayın.
NOT: Anestezi süresi, prosedürde kullanılan anesteziye bağlı olarak değişebilir.
- Stereotaksik çerçevenin, darbecinin ve dijital stereotaksik ekranın (bkz. Şekil 1F) kullanıma hazır olup olmadığını bir kez daha kontrol edin.
- Fareyi yaklaşık 3 dakika boyunca %100 oksijen içinde %4-%5 izofluran içeren izofluran indüksiyon odasına geri koyun.
- Fareyi baş aşamasına sabitleyin.
3. Cerrahi prosedür
- Hafif asetal reçine konik nokta kulak çubukları, bir ısırık çubuğu ve bir fare anestezi maskesi kullanarak fareyi stereotaksik çerçeveye sabitleyin (bkz. Şekil 1G,H). İzofluran gazı, oda havasında 100-200 mL / dak'da% 2 -% 3 oranında verilir. Anestezinin derinliğini sağlamak ve gaz seviyesini gerektiği gibi ayarlamak için farenin solunumunu dikkatlice izleyin.
- Kornea kurumasını önlemek için gözlere steril göz kayganlaştırıcısı uygulayın.
- Kafa derisini povidon-iyotlu çubuklarla ve steril alkol pedleriyle üç kez sterilize edin.
- Ayak parmağını sıkıştırma yanıtının eksikliğini doğrulayarak farenin derinlemesine uyuşturulduğundan emin olun.
- Bir neşter kullanarak gözler ve boyun arasında yaklaşık 1 cm'lik bir orta hat kafa derisi kesisi yapın ve kafatasını açığa çıkarın (bkz. Şekil 1I).
- Kafatasının 1-2 dakika kurumasını bekleyin.
- Bregma (koronal ve sagital sütürlerin kesişme noktası) ve lambda'yı (sagital ve lambdoid sütürlerin kesişme noktası) tanımlayın (bkz. Şekil 1J).
NOT: Referans olarak bir fare beyin atlası kullanılabilir. - Baş destek aparatını başın altına yerleştirin ve ampulü farenin başının dibine bastırana kadar suyla şişirin, ancak kafayı ısırık çubuğundan uzağa kaldırmayın.
NOT: Bu adım, CHI'den kaynaklanan olası kulak sorunlarını azaltmak için gereklidir. kulak çubuklarından kulağa zarar veren, yuvarlanma veya kanamaya neden olan herhangi bir hayvan, çalışmadan çıkarılmalı ve ötenazi yapılmalıdır. - Darbeciyi hayvanın kafasının üzerindeki yerine getirin.
- Genişlet/Geri Çek geçiş düğmesini (darbeci kontrol kutusunda) Genişlet'e yerleştirerek darbeciyi genişletin.
NOT: Ucu aşağı çekerek ucun tamamen uzatılıp uzatılmadığını kontrol ettiğinizden emin olun. - Darbeciyi bregma üzerinde ortalanana kadar hizalayın (bkz. Şekil 1K).
- Stereotaksik okuyucudaki dijital stereotaksik x ve y koordinatlarını 0'a sıfırlayın (dokunmatik ekran kontrolünde)
- Probu bregma'dan hedef koordinatlara doğru hareket ettirerek probu darbe yeri üzerinde hizalayın: medial-lateral = 0.0 mm, anterior-posterior = -1.6 mm.
- Temas sensörünü hayvanın kulağına klipsleyin.
- Yüzey ile ilk temas kurulana kadar uzatılmış prob ile prob ucunu yavaşça indirin. Bip sesinde durun.
- Stereotaksik okuyucudaki dijital stereotaksik z koordinatlarını 0 olarak sıfırlayın.
- Ucun kafatası ile aynı hizada olup olmadığını dikkatlice inceleyin (medial-lateral ve anterior-posterior düzlemler).
NOT: Prob ucunun konumlandırılması, kafatası kırıklarını ve kulak hasarını önlemek için bu işlemin en önemli adımıdır. - Geri çekme konumundaki kontrol kutusunun üzerindeki geçiş düğmesini yerleştirerek darbeciyi geri çekin. Uç geri çekilir ve çarpma zamanına kadar hayvanın kafasıyla artık temas etmez.
- Dorsal-ventral derinliği -1,2 mm'ye ayarlayarak darbe derinliğini ayarlayın.
NOT: Darbenin derinliği yaralanmanın ciddiyetini etkiler. Derinlik, farelerin farklı yaşları, ağırlıkları ve suşları için istenen yaralanma şiddetine göre titretilmelidir. Tutarlı bir yaralanma şiddetini korumak için derinliğin zaman içinde ayarlanması / yeniden titre edilmesi gerekebilir. Şiddeti nöropatolojik olarak değerlendirilebilir: mikroglia ve astrositler (IHC) ve davranışsal olarak: radyal kol su labirenti ve aktif kaçınma testi. - Anestezi derinliğini sağlamak ve gaz seviyesini gerektiği gibi ayarlamak için farenin solunumunu dikkatlice izleyin.
NOT: Genellikle, izofluran gazı yüzdesi darbeden önce 10-20 s boyunca düşürülmeli veya kapatılmalıdır. Solunumun hafifçe hızlanmasını yakından izleyin. Darbe anında solunum çok yavaşsa, hayvan apnenin etkisinden sonraki ilk 60 s içinde ölebilir. Bu, anestezinin derinliğini darbeden saniyeler önce ayarlayarak önlenebilir. - Çarpmak için sağ geçiş düğmesine basarak darbeyi tetikleyin. Prob ucu görüntülenen hızda aşağı iner ve ardından ayarlanan bekleme süresi boyunca aşağıda kalır ve geri çekilir.
NOT: Sham fareleri, CHI fareleri ile aynı muameleyi alır, ancak etki teslim edilmez. - Doğru zamanları (yan konumdan eğilimli konuma dönme süresi) kaydetmek için CHI darbesi verildikten hemen sonra zamanlayıcıyı başlatın veya fare sahte fareler için stereotaksik çerçeveden çıkarıldığında zamanlayıcıyı başlatın. Ortalama sağa dönme refleks süresi 5-15 dakikadır.
NOT: Doğru refleks süreleri, fare zorlanmasına ve yaşına bağlı olarak değişebilir. - Fareleri görünür kafatası kırıkları, kanamalar ve apne açısından değerlendirin. Depresif kafatası kırığı veya görünür kanaması olan fareleri çalışmadan çıkarın.
NOT: Kafatası kırıklarının derecelendirilmiş seviyeleri vardır. Kemiğin beyin dokusuna gözlemlenebilir şekilde baskı yaptığı dekompresyon kafatası kırıkları olan hayvanlar ötenazi yapılır (önce CO2 ve ikincil bir yöntem olarak kafa kesme). Darbeci uç doğru ayarlanmışsa, bu tip kafatası kırıkları son derece nadirdir. Bir kafatası kırığı meydana gelirse, daha yaygın sunum kafatası üzerinde küçük bir damla kan ve kafatasının hafif dokunsal bir kabalaşmasıdır, genellikle burun kemiğinin arka ucunu bağlayan dikiş boyunca. Bu fareler kayıtlarda olası kafatası kırığı olarak belirtilmiştir, ancak normalde çalışmadan dışlanmamaktadır. - Hayvanı stereotaksik çerçeveden çıkarın.
- Cildi birbirine zımbalayarak kafa derisini kapatın.
NOT: Emilebilir veya emilemeyen dikişler, zımbalara alternatif olarak kafa derisini kapatmak için kullanılabilir. - Kapalı insizyona steril pamuk uçlu bir aplikatör ile üçlü antibiyotik merhem uygulayın.
- Kurtarma için fareyi temiz bir tutma kafesine geri koyun. Kurtarma kafesinin yarısı, uyanıkken ısıdan uzaklaşma ve bilinçsizken hayvanın sıcaklığını koruma yeteneği sağlayan bir ısıtma yastığı üzerindedir (düşük ayar) (bkz. Şekil 1L).
NOT: Fare, kurtarma kafesinde yan tarafına yerleştirilir. Boğulmayı önlemek için, hayvanı yataksız bir kurtarma kafesine veya yataklar kafeste ise bir dokuya yerleştirin. - Genişlet/Geri Çek/Kapat geçiş düğmesini Merkez/Kapalı konumuna getirin.
NOT: Anahtar uzatma veya geri çekme konumunda bırakılırsa akım çalışmaya devam eder ve pistonun şişmesine neden olur. Darbeci daha sonra piston soğuyana kadar çalışmayacaktır. - Darbeyi tutucusundan çıkarın ve yavaşça buz torbasının üzerine yerleştirin.
NOT: Darbeciyi bir buz torbası üzerinde tutmak, darbecinin potansiyel şişmesini azaltmaya yardımcı olur. - Sağa çevirme refleksi oluşana kadar hayvanı izleyin ve sağa doğru süreyi belgeleyin (bkz. Şekil 1M).
NOT: Sağa dönük refleks, farenin eğilimli bir konuma döndüğü an olarak tanımlanır. Kafesin rahatsız edilmeden bırakılması gerekir; Kafese dokunulduğunda, hareket ettirildiğinde veya bazı seslere maruz kaldığında fare doğru olabilir. - Fareleri uyanık ve uyanık olduklarında ev kafeslerine geri getirin. Genellikle, yaralanmadan sonraki 1 saat içinde, hayvanlar tamamen bilinçli ve ayaktadır. Ayrıca, kafesin dibine biraz nemli yiyecek ekleyin.
4. Ameliyat sonrası bakım
- Hayvanları ameliyat sonrası 5 gün boyunca izleyin.
- Kilolarını ve solunum hızı (kalitatif solunum fonksiyonu), yürüyüş, vücut ve saç ceketi durumu, yeme, içme, dışkılama ve idrara çıkma gibi fiziksel/davranışsal değişiklikleri kaydedin.
- Herhangi bir rahatsızlık belirtisi için fareyi ve şişlik, eksüda veya kırmızı kenarlar, ordehiscence için cerrahi yarayı gözlemleyin. Hayvan ağrı ve rahatsızlık belirtileri gösteriyorsa (seslendirmeler, hareket etmeyen, hipotermi, içmiyor veya yemiyorsa) bir veterinere başvurun.
- Zımbaları ameliyattan 7-10 gün sonra anestezi altında ve bir ısıtma yastığı üzerinde çıkarın.
NOT: Emilemeyen dikişler kullanılıyorsa, ameliyattan 7-10 gün sonra anestezi altında alınmalıdır.
5. Temizlik
- Cerrahi alanı ve aletleri temizleyin ve sterilize edin.
- Her kullanımdan sonra ve günün sonunda alkol hazırlama pedleri ile prob ucunu temizleyin.
NOT: Darbeci fabrikada kalibre edilir ve zaman içinde ve kullanımda kararlı olduğu bildirilir. Rutin kalibrasyona gerek yoktur. Bununla birlikte, darbeci ve stereotaksik çerçeve rutin olarak incelenmelidir. Ayrıca, olası deneysel sürüklenmeyi değerlendirmek için doğru refleks süresi, mortalite ve nöropatoloji gibi model bitiş noktası çevreleri izlenmelidir.
6. Hariç tutma kriterleri
- 4 aylık bir fare için düşük kilolu <20 g, uyuşukluk ve kötü ceket durumu gibi kötü bir sağlık durumu olan ameliyattan önce hayvanları hariç tutun.
- Ameliyat sırasında depresif bir kafatası kırığı, ameliyatla ilgili görünür bir kanama veya kulak kanaması gibi komplikasyonları olan hayvanları hariç tutun.
- Aşağıdaki ameliyat sonrası semptomlarla hayvanları çalışmadan hariç tutun: yemek yememe ve / veya normal şekilde hareket etmeme, olağandışı seslendirmeler, kilo kaybı veya ameliyattan sonra yaranın normal şekilde iyileşmemesi.
NOT: Bu model, hafif TBI'nın tekrarlayan bir modeli olarak kullanılabilir. Fareler ikinci ameliyatı birincisinden 24 saat ayrı olarak alırsa, zımbalar veya dikişler çıkarılabilir ve aynı kesi kafatasını açığa çıkarmak için kullanılabilir. Ameliyatlar arasında daha uzun bir süre geçmesi durumunda yeni bir kesi yapılması gerekir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu stereotaksik elektromanyetik darbeci cihaz çok yönlüdür. Hem açık kafatası kontrollü kortikal darbe (CCI) hem de kapalı kafa travması (CHI) ameliyatı için kullanılır. Ayrıca, yaralanma şiddeti, darbe hızı, bekleme süresi, darbe derinliği, darbe ucu ve yaralanma hedefi gibi yaralanma parametreleri değiştirilerek modüle edilebilir. Burada 5.0 mm'lik çelik uçlu darbeci kullanan bir CHI ameliyatı anlatılmaktadır. Bu yaralanma hafif olarak kabul edilir çünkü yapısal beyin lezyonları yoktur. Yetişkin farelerde ölüm oranı %0,9'dan azdır11,14 ve yaşlı farelerde (>8 aylık) ~%2,5'e ulaşmak için hafifçe artar11. Mortalite, apne nedeniyle ilk 2 dakika boyunca meydana gelir; bu, darbeden önceki saniyelerde anestezi derinliğini dikkatlice izleyerek büyük ölçüde önlenebilir.
Bu CHI modelinin avantajı, etkinin kortikal dural yüzeyi (kraniyotomi) açığa çıkarmaya gerek kalmadan bilateral diffüz patoloji üretmesidir. Bunu etkili bir TBI modeli yapan bir diğer özellik, cerrahi prosedürü takiben kafatası kırıkları veya kulak sorunları nedeniyle farelerin% 1'inden azının çalışmanın dışında tutulmasıdır. Daha da önemlisi, model tek bir etki ile nöropatolojik ve davranışsal bozukluklar üretir, bu da tekrarlayan hafif CHI modelleriyle ilişkili deneysel karmaşıklığı azaltır15. Örneğin, mikroglia ve astrosit morfolojik değişikliklerinin tekrarlanabilir bir zamansal paterni11 tanımlanmıştır (Şekil 2A, B). Modeli doğrularken, anterior-posterior koordinatların başlangıç aralıklarının -1,5 mm ± 0,2 mm ve darbe derinliğinin 1,0 ± 0,2 mm olarak kullanılması önerilir. Koordinatların, farelerin yaşı ve gerginliğinin yanı sıra kullanılan ekipmanın markası ve modeli için ayarlanması gerekebilir. Ayarlar doğrulandıktan sonra, bir deneme için sabit tutulmalıdır. Validasyon için, yaralanmadan 3 gün sonra mikroglia ve astrositlerin nöropatolojik karakterizasyonu önerilir. İmmünohistokimyasal (IHC) boyama Bachstetter ve ark.18'deki yöntemler izlenerek tamamlandı. Spesifik olarak, 30 μm koronal serbest yüzen kesitler, tavşan anti-GFAP (1: 10.000) ile glial aktivasyon ve bir tavşan anti-IBA1 (1: 10.000) kullanan astrositler için boyandı. Hem GFAP hem de IBA-1'i tespit etmek için HRP konjuge keçi anti-tavşan IgG (1:200) kullanıldı. Dikkate alınan her bölgedeki lekelenmeyi ölçmek için niceleme yazılımı kullanılmıştır. Ek olarak, yaralanma sonrası 1 günde, neokortekste aksonal yaralanma belirteçleri bulundu ve mitokondriyal metabolizmadaki değişiklikler CHI16'dan 28 gün sonra bulundu (veriler gösterilmedi).
Modeli doğrulamak için ikincil son noktalar davranışsal testler olacaktır. Radyal kol su labirentinde (RAWM)12 tekrarlanabilir CHI kaynaklı eksiklikler ve aktif kaçınma13 davranışları bulunmuştur (Şekil 3). Fareler, Macheda ve ark.12'de açıklandığı gibi, özel bir öğrenme testi olan 8 kollu bir RAWM'de test edildi. Kısaca, fareler 4 günlük bir protokol boyunca toplam 28 denemede test edildi ve hedef kolda bulunan platformu bulmak için 60 sn vardı. Günlük toplam deneme sayısı yediydi; 1. Gün ve 2. Gün eğitim günleri, 3. ve 4. Günler ise sınav günleri olarak kabul edildi. Eğitim günlerinde, fareler görünür ve gizli denemeler arasında geçiş yaparak platformu bulmak için eğitildi; Test günlerinde, platform tüm denemeler sırasında gizlendi. Deneyler bir kamera kullanılarak kaydedildi ve davranış analizi için bir izleme sistemi kullanıldı (hata sayısı, toplam mesafe ve gecikme). Fareler yaralanmadan 2 hafta sonra test edildi. Cinsiyetin hiçbir etkisi olmasa da, CHI fareleri görevi başarıyla yerine getirmek ve platforma ulaşmak için daha fazla hata yaptı (Şekil 3A). Ayrıca, 6 kollu RAWM testinde11,14,15,16 da hafıza bozuklukları tespit edilmiştir. İlişkisel öğrenme temelli bir test olan aktif kaçınma, bu hafif CHI modeliyle ilişkili bilişsel eksiklikleri ölçmek için kullanılmıştır. fareler 5 günlük bir protokol kullanılarak test edildi ve 50 deneme / gün13'e maruz bırakıldı. Fareler, şartlı bir uyaranı (CS, ışık) onunla ilişkilendirerek hafif bir ayak şokunu (koşulsuz uyaran, ABD) önlemek için eğitildi. Zamanla, fareler CS sunulduğunda ABD'den kaçınmayı öğrendiler. CHI fareleri, sahte farelere kıyasla aktif kaçınmada bilişsel işlevi bozmuştur (Şekil 3B). Sahte dişi fareler erkeklere kıyasla önemli ölçüde daha hızlı öğrendi, ancak cinsiyet CHI farelerinde rol oynamadı13. Davranış, aktif/pasif kaçınma yazılımı kullanılarak kaydedildi. Yaralanmadan sonraki ilk haftanın ötesinde motor fonksiyonda tekrarlanabilir bir eksiklik tespit edilmemiştir11.
Bu hafif TBI modelinde, beyinde kaba yapısal lezyonlar bulunamadı ve tek bir etki bilateral glial aktivasyona ve mikroglia morfolojisinde değişikliklere neden oldu. Ayrıca, bilişsel eksiklikler bu TBI modeli ile ilişkilidir.
Şekil 1: Adım 1: Cerrahi alan kurulumu. (A) CHI ameliyatını gerçekleştirmek için gereken cerrahi alan ve aletlerin bir örneği (darbeci için buz paketi, darbeci ile donatılmış stereotaksik çerçeve, darbeci kontrol kutusu ve cerrahi aletler) gösterilmiştir. (B) 5 mm'lik çelik prob ucunun, ısırık çubuğunun ve kafa destek aparatının yakından görünümü, orta hat darbesi için gereken konumlandırmayı gösterir. (C) Baş destek aparatı, boruya parafilm ile tutturulmuş 1 mL lateks pipet ampulünden yapılmıştır. 10 mL'lik bir şırınga, ampulü şişirmek için suyla doldurulur, ampulü bir kez yerinde şişirmek için bir stopcock ile doldurulur. (D) Darbeci kontrol kutusu: (1) darbe hızını ayarlamak için büyük bir düğme, (2) bir bekleme sayacı, (3) bir uzatma/geri çekme geçiş anahtarı, (4) aşağı itildiğinde darbeyi sağlayacak bir geçiş anahtarı. (E) Kullanılmadığında, darbeci aşırı ısınmayı ve olası arızaları önlemek için bir buz torbası üzerinde tutulur. (F) Dijital stereotaksik ekran, x (anterior-posterior), y (medial-lateral) ve z (dorsal-ventral) koordinatlarını oluşturmak için kullanılır. Adım 2: Cerrahi işlem. (G,H) Anestezi uygulanan ve traş edilen fare stereotaksik çerçeveye sabitlenir, (I) (J) bregma'yı ortaya çıkarmak için bir orta hat insizyonu yapılır, (K) ameliyat sırasında darbeyi hizalamak için kullanılır. 3. Adım: Kurtarma. (L) Fare stereotaksik çerçeveden çıkarılır. Saç derisi zımbalanarak veya cildi birbirine dikerek kapatıldıktan sonra, yan tarafındaki temiz bir iyileşme kafesine yerleştirilir. (M) Fare, yuvarlanana ve sağa çevirme refleksi oluşana kadar izlenir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Bir CHI'den sonra astrosit (GFAP) ve mikroglia (IBA1) morfolojik değişikliklerinin zamansal paternleri. (A) Düşük büyütmede GFAP boyaması, CHI grubunun korteksinde görülen boyamadaki bölgesel artışı göstermektedir. Astrositlerin morfolojik görünümü, orta beyin bölümlerinden ve korteksin aynı bölgelerinden alınan daha yüksek büyütmeli insetslerde gösterilmiştir. (B) Yaralanmadan 1 gün, 7 gün ve 2 ay sonra kortekste IBA1-pozitif boyanma, CHI sonrası neokortekste mikroglia morfolojisinde değişiklikler gösterir (n = 7-14, 50/50 erkek / dişi). Fareler (CD-1/129 arka plan) ameliyat sırasında 8 aylıktı. Bu rakam 11'den uyarlanmış ve izin alınarak çoğaltılmıştır. Ölçek çubuğu = şekilde gösterildiği gibi 1 mm, 50 μm ve 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: RAWM'de CHI kaynaklı hafıza açıkları ve aktif kaçınma . (A) Yaralanmadan sonraki 2 haftada, hem CHI hem de sahte olarak çalıştırılan fareler RAWM görevini öğrenebildiler, ancak CHI fareleri sahte farelere kıyasla daha fazla hata yaptı (*** p < 0.0005); sahte (n = 20/20 erkek/kadın); CHI (n = 20/20 erkek/kadın). Fareler (C57BL / 6J) ameliyat sırasında 3-4 aylıktı. (B) Yaralanmadan sonraki 4 haftada, CHI ve sahte olarak çalıştırılan fareler aktif kaçınma görevini öğrenebildiler, ancak CHI fareleri sahte farelere kıyasla daha az ayak şokundan kaçındılar (*** p = 0.0005; **** p < 0.0001); sahte (n = 10/10 erkek/kadın); CHI (n = 9/10 erkek/kadın). Fareler (C57BL/6J) ameliyat sırasında 3-5 aylıktı. Veriler ortalama ± SEM olarak gösterilir. (A) Bu şekil 12'den uyarlanmış ve izin alınarak çoğaltılmıştır. (B) Bu şekil 13'ten uyarlanmış ve izin alınarak çoğaltılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Açıklanan modeli kullanarak tutarlı bir yaralanma modelinin yeniden oluşturulmasında birkaç adım yer almaktadır. İlk olarak, hayvanı stereotaksik çerçeveye doğru şekilde sabitlemek çok önemlidir. Hayvanın başı yanal olarak hareket edememeli ve kafatası aynı koordinatları okuyan bregma ve lambda ile tamamen düz olmalıdır. Kulak çubuklarının doğru yerleştirilmesi bu ameliyatın en zor yönüdür ve bu sadece uygulama ile öğrenilebilir. Kafatası düz değilse, CHI'yi indüklemeden önce kafa ayarlanmalıdır. kafa pozisyonunun ayarlanmaması kafatası kırığına neden olur. Kafatasının düz olduğunu değerlendirmek için, kafatası ile darbe ucu arasındaki boşluğa ucun etrafındaki tüm açılardan bakmak gerekir. Depresif kafatası kırıkları olan fareler, kafatası kırığı yaşamayan farelere kıyasla çok daha güçlü bir enflamatuar yanıta ve daha ciddi bir yaralanmaya sahip oldukları için deneylerden dışlanmalıdır19. Ek olarak, kafatası kırığı olan fareler, travma sonrası solunum depresyonu, ikincil rebound yaralanması ve sonunda ölüm20 gibi daha ciddi TBI sonuçları göstermektedir.
Bu çalışmada, hayvanın başı kulak çubukları ile sabitlenmiştir. Özellikle, büyük sıçan kulak çubuklarının değil, sadece konik bir noktaya sahip fareye özgü asetal reçine kulak çubuklarının kullanılması önerilir. Delinmeyen kauçuk uçlu kulak çubukları kullanmak mümkündür, ancak bu kulak çubukları kafatasını sıkıştırır, CHI'nin biyomekaniğini değiştirir ve daha az tekrarlanabilir. Ek olarak, herhangi bir dönme kuvvetine izin vermediği için kulak çubuklarının kullanılmasında bir sınırlama vardır. Bununla birlikte, kulak çubuklarının daha fazla tekrarlanabilirliği, kafa sabitlenmemişse üretilebilecek sınırlı sayıda dönme kuvvetinden daha ağır basar.
Bununla birlikte, kafayı kulak çubuklarıyla sabitlemek, darbe kuvvetlerinin tümü kulaklara yerleştirilirse, darbe anında kulağın yaralanmasına da neden olabilir. Kuvvetleri kulaklardan uzaklaştırmak için başın altına yerleştirilen bir baş destek aparatı geliştirilmiştir. Birden fazla yastık benzeri nesneyi test ettikten sonra, en iyi çalışan su ile doldurulmuş 1 mL lateks pipet ampulü oldu. Hayvanın başının altındaki pipet ampulü, hayvan stereotaksik çerçeveye girdikten sonra genişletilebilir, bu da sıkı bir şekilde oturmasını ve başın altında tam destek sağlamasını sağlar. Doğru yerleştirildiğinde, yaralanmadan sonra kulaklardan kanama veya kulak hasarının davranışsal belirtileri (yuvarlanma / baş eğme) olmamalıdır.
CHI modelinin bazı versiyonları, kafatası kırıklarının oluşumunu azaltmak için kauçuk uç probu 21,22 veya metal kask 23,24 kullanır. 5 mm'lik darbeci ucu kafatası ile aynı hizada olduğu sürece, hiçbirini kullanmaya gerek yoktur. Stereotaksik cerrahi konusunda geniş deneyime sahip olmayan yeni kullanıcıların, medial-lateral düzlemde kafatası ile aynı hizada olmayan uçla yaralanmayı indüklemeleri cazip gelebilir. Kafatası medial-lateral düzlemde düz değilse, bunun nedeni kulak çubuklarının doğru yerleştirilmemesidir. Bu sorunun tek çözümü, hayvanı darbeciden çıkarmak ve fareyi sahte bir yaralanmaya atamaktır. Uç anterior-posterior düzlemde aynı hizada değilse, ısırık çubuğunun yüksekliğinin ayarlanması ve ucun bregma ile yeniden hizalanması gerekir. Ayrıca, düz uçlu 5 mm'lik bir darbecinin kullanılması, daha küçük çaplı darbeci uçlara kıyasla kafatası kırıklarına neden olma şansını19 azaltır. Dikkate alınması gereken diğer önemli faktörler, konunun yaşı ve ağırlığının yanı sıra kafatası kalınlığı25 ve farelerin suşları26'dır.
İnsanlarda, hafif bir TBI, yaralanmadan sonraki ilk dakikalarda ölümle ilişkili değildir. Hayvanlarda, hafif bir yaralanma bile ölüme neden olabilir. Bununla birlikte, bu modelde, mortalite neredeyse her zaman cerrahi komplikasyonlarla ilişkilidir, tek başına yaralanma ile değil. Bir farenin darbeden sonra ölmesinin en yaygın nedeni anestezinin derinliğidir. Bu, ameliyat beklenenden daha uzun sürdüyse veya izofluran gazı o hayvan için gerekenden daha yüksek bir konsantrasyondaysa ortaya çıkabilir. Hayvanın solunumu yavaşsa veya zahmetliyse, bu, etkiyi vermeden önce anestezi derinliğinin azaltılması gerektiğinin bir işareti olabilir. Hayvanın nefesi darbe anında yavaşsa veya zorlanıyorsa, hayvanın apnesi olacak ve ölebilir.
Hafif TBI'nın birçok modeli vardır. Her birinin güçlü ve zayıf yönleri vardır ve bu model farklı değildir. Bildirildiği gibi, burada TBI'nın tek bir isabetli modeli açıklanmaktadır, ancak model tekrarlayan bir TBI15'e neden olmak için kullanılmıştır. Bu protokolde açıklanan adımlar, tekrarlayan bir TBI yaralanmasına neden olmak için tekrarlanabilir. Farklı TBI modellerini değerlendirirken, modelin modellemeye çalıştığı istenen patolojiye sahip olup olmadığını düşünmek önemlidir. Modelin ne kadar tekrarlanabilir olduğu da düşünülmelidir. Bunu veya herhangi bir TBI modelini kullanmanın başlangıç noktasının, modelin daha önce bildirildiği gibi çalıştığını bağımsız olarak doğrulamak ve karakterize etmek olması önemle tavsiye edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından R01NS120882, RF1NS119165 ve R01NS103785 ödül numaraları ve Savunma Bakanlığı ödül numarası AZ190017 altında desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri veya Savunma Bakanlığı'nın resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9 mm Autoclip Applier | Braintree scientific | ACS- APL | Surgery |
| 9 mm Autoclip Remover | Braintree scientific | ACS- RMV | Surgery |
| 9 mm Autoclip, Case of 1,000 clips | Braintree scientific | ACS- CS | Surgery (Staples) |
| Aperio ImageScope software | Leica BioSystems | NA | IHC |
| BladeFLASK Blade Remover | Fisher Scientific | 22-444-275 | Surgery |
| Cotton tip applicator | VWR | 89031-270 | Surgery |
| Digitial mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730D | Surgery |
| Dumont #7 Forceps | Roboz | RS-5047 | Surgery |
| Ear bars | Stoelting | 51649 | Surgery |
| EthoVision XT 11.0 | Noldus Information Technology | NA | RAWM |
| Fiber-Lite | Dolan-Jeffer Industries | UN16103-DG | Surgery |
| Fisherbrand Bulb for Small Pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | Head support apparatus |
| Gemini Avoidance System | San Diego Instruments | NA | Active avoidance |
| Heating Pad | Sunbeam | 732500000U | Surgery prep |
| HRP conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immuno Research laboratories | 111-065-144 | IHC |
| Induction chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530XS | Surgery prep |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC: 11695-6777-2 | Surgery |
| Mouse gas anesthesia head holder | Stoelting | 51609M | Surgery |
| Neuropactor Stereotaxic Impactor | Neuroscience Tools | n/a | Surgery: Formally distributed by Lecia as impact one |
| NexGen Mouse 500 | Allentown | n/a | Post-surgery, holding cage |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Head support apparatus |
| Peanut - Professional Hair Clipper | Whal | 8655-200 | Surgery prep |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) available Iodine, for laboratory | Ricca | 3955-16 | Surgery |
| Puralube Vet Oinment,petrolatum ophthalmic ointment, Sterile ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Surgery |
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | IHC |
| Rabbit anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | IHC |
| 8-arm Radial Arm Water Maze | MazeEngineers | n/a | RAWM |
| Scale | OHAUS CS series | BAL-101 | Surgery prep |
| Scalpel Handle #7 Solid 6.25" | Roboz | RS-9847 | Surgery |
| Sterile Alcohol Prep Pads (isopropyl alcohol 70% v/v) | Fisher Brand | 22-363-750 | Surgery prep |
| SumnoSuite low-flow anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Surgery |
| 10 mL syringe Luer-Lok Tip | BD Bard-Parker | 302995 | Head support apparatus |
| Timers | Fisher Scientific | 6KED8 | Surgery |
| Topical anesthetic cream | L.M.X 4 | NDC 0496-0882-15 | Surgery prep |
| Triple antibiotic ointment | Major | NDC 0904-0734-31 | Post-surgery |
| Tubing | MasterFlex | 96410-16 | Head support apparatus |
| Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Surgery prep |
References
- Capizzi, A., Woo, J., Verduzco-Gutierrez, M. Traumatic brain injury: An overview of epidemiology, pathophysiology, and medical management. The Medical Clinics of North America. 104 (2), 213-238 (2020).
- Bodnar, C. N., Roberts, K. N., Higgins, E. K., Bachstetter, A. D. A systematic review of closed head injury models of mild traumatic brain injury in mice and rats. Journal of Neurotrauma. 36 (11), 1683-1706 (2019).
- Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: Translational challenges and strategies. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 76, 396-414 (2017).
- Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M.
- Albert-Weissenberger, C., Varrallyay, C., Raslan, F., Kleinschnitz, C., Siren, A. L. An experimental protocol for mimicking pathomechanisms of traumatic brain injury in mice. Experimental and Translational Stroke Medicine. 4, 1 (2012).
- Chen, Y., Constantini, S., Trembovler, V., Weinstock, M., Shohami, E. An experimental model of closed head injury in mice: pathophysiology, histopathology, and cognitive deficits. Journal of Neurotrauma. 13 (10), 557-568 (1996).
- Dixon, C. E., Clifton, G. L., Lighthall, J. W., Yaghmai, A. A., Hayes, R. L. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 39 (3), 253-262 (1991).
- Schwulst, S. J., Islam, M. Murine model of controlled cortical impact for the induction of traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. (150), e60027 (2019).
- Cole, J. T., et al. Craniotomy: True sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
- Brody, D. L., et al. Electromagnetic controlled cortical impact device for precise, graded experimental traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 24 (4), 657-673 (2007).
- Webster, S. J., Van Eldik, L. J., Watterson, D. M., Bachstetter, A. D. Closed head injury in an age-related Alzheimer mouse model leads to an altered neuroinflammatory response and persistent cognitive impairment. The Journal of Neuroscience. 35 (16), 6554-6569 (2015).
- Macheda, T., Roberts, K. N., Morganti, J. M., Braun, D. J., Bachstetter, A. D. Optimization and validation of a modified radial-arm water maze protocol using a murine model of mild closed head traumatic brain injury. PLoS One. 15 (8), 0232862 (2020).
- Macheda, T., Snider, H. C., Watson, J. B., Roberts, K. N., Bachstetter, A. D. An active avoidance behavioral paradigm for use in a mild closed head model of traumatic brain injury in mice. Journal of Neuroscience Methods. 343, 108831 (2020).
- Bachstetter, A. D., et al. Attenuation of traumatic brain injury-induced cognitive impairment in mice by targeting increased cytokine levels with a small molecule experimental therapeutic. Journal of Neuroinflammation. 12, 69 (2015).
- Bachstetter, A. D., et al. The effects of mild closed head injuries on tauopathy and cognitive deficits in rodents: Primary results in wild type and rTg4510 mice, and a systematic review. Experimental Neurology. 326, 113180 (2020).
- Lyons, D. N., et al. A mild traumatic brain injury in mice produces lasting deficits in brain metabolism. Journal of Neurotrauma. 35 (20), 2435-2447 (2018).
- Yanckello, L. M., et al. Inulin supplementation mitigates gut dysbiosis and brain impairment induced by mild traumatic brain injury during chronic phase. Journal of Cellular Immunology. 4 (2), 50-64 (2022).
- Bachstetter, A. D., et al. Early stage drug treatment that normalizes proinflammatory cytokine production attenuates synaptic dysfunction in a mouse model that exhibits age-dependent progression of Alzheimer's disease-related pathology. The Journal of Neuroscience. 32 (30), 10201-10210 (2012).
- Zvejniece, L., et al. Skull fractures induce neuroinflammation and worsen outcomes after closed head injury in mice. Journal of Neurotrauma. 37 (2), 295-304 (2020).
- Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
- Yang, Z., et al. Temporal MRI characterization, neurobiochemical and neurobehavioral changes in a mouse repetitive concussive head injury model. Scientific Reports. 5, 11178 (2015).
- Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. Journal of Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
- Laskowitz, D. T., et al. COG1410, a novel apolipoprotein E-based peptide, improves functional recovery in a murine model of traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 24 (7), 1093-1107 (2007).
- Lloyd, E., Somera-Molina, K., Van Eldik, L. J., Watterson, D. M., Wainwright, M. S. Suppression of acute proinflammatory cytokine and chemokine upregulation by post-injury administration of a novel small molecule improves long-term neurologic outcome in a mouse model of traumatic brain injury. Journal of Neuroinflammation. 5, 28 (2008).
- Lillie, E. M., Urban, J. E., Lynch, S. K., Weaver, A. A., Stitzel, J. D. Evaluation of skull cortical thickness changes with age and sex from computed tomography scans. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (2), 299-307 (2016).
- Kawakami, M., Yamamura, K. Cranial bone morphometric study among mouse strains. BMC Evolutionary Biology. 8, 73 (2008).
