Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Immunfargingsbasert påvisning av dynamiske endringer i røde blodcelleproteiner

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64843
Automatic Translation
1, 2
1Department of Molecular and Cellular Sports Medicine, German Sport University Cologne, 2Biorheology Research Laboratory, Menzies Health Institute, Griffith University Gold Coast

Summary

Å fange dynamiske endringer i proteinaktiveringen av enucleated røde blodlegemer utgjør metodologiske utfordringer, som bevaring av dynamiske endringer i akutte stimuli for senere vurdering. Den presenterte protokollen beskriver prøvepreparering og fargeteknikker som muliggjør bevaring og analyse av relevante proteinendringer og påfølgende deteksjon.

Abstract

Antistoffmerking av røde blodlegemer (RBC) proteiner er en ofte brukt, semi-kvantitativ metode for å oppdage endringer i totalt proteininnhold eller akutte endringer i proteinaktiveringstilstander. Det letter vurderingen av RBC-behandlinger, karakterisering av forskjeller i visse sykdomstilstander og beskrivelse av cellulære sammenhenger. Påvisning av akutt endret proteinaktivering (f.eks. gjennom mekanotransduksjon) krever tilstrekkelig prøvepreparering for å bevare ellers midlertidige proteinmodifikasjoner. Det grunnleggende prinsippet inkluderer immobilisering av målbindingsstedene til de ønskede RBC-proteinene for å muliggjøre den første bindingen av spesifikke primære antistoffer. Prøven behandles videre for å garantere optimale betingelser for binding av det sekundære antistoffet til det tilsvarende primære antistoffet. Valget av ikke-fluorescerende sekundære antistoffer krever ytterligere behandling, inkludert biotin-avidin-kobling og påføring av 3,3-diaminobenzidin-tetrahydroklorid (DAB) for å utvikle fargingen, som må kontrolleres i sanntid under et mikroskop for å stoppe oksidasjonen, og dermed fargeintensiteten, i tide. For deteksjon av fargeintensitet tas bildene med et standard lysmikroskop. I en modifikasjon av denne protokollen kan et fluoresceinkonjugert sekundært antistoff påføres i stedet, noe som har fordelen at ingen videre utviklingstrinn er nødvendig. Denne prosedyren krever imidlertid et fluorescensmål festet til et mikroskop for fargingsdeteksjon. Gitt den semi-kvantitative karakteren av disse metodene, er det viktig å gi flere kontrollflekker for å ta hensyn til ikke-spesifikke antistoffreaksjoner og bakgrunnssignaler. Her presenterer vi både fargeprotokoller og tilhørende analytiske prosesser for å sammenligne og diskutere de respektive resultatene og fordelene ved de forskjellige fargeteknikkene.

Introduction

Røde blodlegemer (RBC) krysser kardiovaskulærsystemet i 70 til 140 dager, med en gjennomsnittlig RBC-alder på ca. 115 dager 1,2. Senescent eller skadede RBC fjernes fra sirkulasjonen ved erytrofagocytose, en effektiv clearingprosess drevet av makrofager3. Den forhåndsbestemte levetiden til disse cellene er en konsekvens av å overgi celleorganellene, inkludert kjernen, mitokondriene og ribosomene, under differensiering og modning4. Dermed er sirkulerende RBC blottet for et translasjonsmaskineri, og utelukker syntesen av nye proteiner3. Det følger at dynamiske, posttranslasjonelle modifikasjoner av eksisterende proteiner representerer den eneste levedyktige mekanismen for akutt, biokjemisk regulering som respons på ekstracellulære og intracellulære stressorer som virker på RBC5.

Mekaniske krefter ser ut til å være viktigste ekstracellulære signaler som forårsaker aktivering eller modulering av biokjemiske veier i RBC. Oppdagelsen av det mekanosensitive proteinet, Piezo1, i RBC-membraner6 inspirerte flere forskningslinjer som undersøkte mekanisk aktivert signalering i disse cellene7. For eksempel har nyere fremskritt vist at de fysiske egenskapene til RBC er aktivt regulert av akutte og dynamiske endringer av proteiner8, som inkluderer posttranslasjonell fosforylering og ubiquitinering9. Siden disse normale modifikasjonene er forskjellige i visse sykdommer 9,10,11, synes det å være av vitenskapelig og klinisk interesse å bestemme aktiveringstilstanden til RBC-proteiner, spesielt i forhold til mekanobiologiske prosesser.

Bestemmelsen av akutte endringer i RBC-proteinaktiveringstilstander utgjør noen metodologiske utfordringer. For eksempel krever lagring av RBC-prøver for senere analyse bevaring av de modifiserte RBC-proteinene, da posttranslasjonelle modifikasjoner ikke er holdbare. Videre er klassiske proteindeteksjonsmetoder (f.eks. Vestlig blotting) notorisk vanskelige å standardisere i RBC på grunn av den lave overflod av proteiner i forhold til hemoglobin, som står for ~ 98% av proteininnholdet i disse cellene12. Dermed har antistoffbasert farging av kjemisk bevarte RBC vært den valgte metoden ved undersøkelse av akutte modifikasjoner av viktige RBC-proteiner, som RBC-spesifikk isoform av nitrogenoksidsyntase (RBC-NOS)13,14. RBC-NOS har vist seg å produsere nitrogenoksid (NO) enzymatisk, noe som virker uunnværlig for essensielle RBC-egenskaper, inkludert RBC-deformabilitet15,16,17. Posttranslasjonelle modifikasjoner av RBC-NOS regulerer katalytisk enzymaktivitet, med fosforylering av serin 1177-resten beskrevet for å øke enzymaktiviteten, mens fosforylering av restene serin 114 eller treonin 495 har vært knyttet til redusert RBC-NOS-aktivitet18,19.

Samlet bidrar midlertidige modifikasjoner av RBC-proteiner til viktig cellulær funksjon, og standardiserte protokoller som muliggjør deteksjon av disse modifiserte proteinene er av høy verdi. Her presenterer vi to forskjellige protokoller som utnytter spesifikke antistoffer for å lette påvisning av RBC-NOS-proteinaktivering, og diskuterer anbefalinger for dataanalyse og tolkning.

Utførelsen av de beskrevne protokollene ble vurdert ved å måle den godt rapporterte økningen i fosforyleringen av RBC-NOS ved serin 1177-resten som respons på mekaniske krefter som reflekterer de som forekommer i den humane vaskulaturen (5 Pa).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollene beskrevet her er i samsvar med Helsinkideklarasjonen og ble godkjent av etikkomiteene ved det tyske idrettsuniversitetet Köln (16.9.2013) og Griffith University (2019/808). Frivillige ble screenet for å sikre fravær av relevante patologier og gitt skriftlig informert samtykke.

1. Farging av RBC-proteiner ved bruk av immunhistokjemiske protokoller

MERK: En detaljert liste over nødvendige kjemikalier og materialer finnes i materialfortegnelsen. De følgende avsnittene beskriver fremstillingen av de nødvendige løsningene, etterfulgt av en detaljert beskrivelse av immunhistokjemiprotokollen (figur 1).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av de enkelte trinnene som kreves for immunhistokjemisk og immunfluorescensfarging av RBC-NOS på fosforyleringssted 1177. En typisk arbeidsflyt av de presenterte protokollene som strekker seg fra løsningsforberedelse og blodprøvetaking til antistoffbasert deteksjon og visualisering presenteres. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Innsamling av blodprøve
    1. Ta blodprøver (10 ml fullblod) fra syv friske menn. De frivillige var friske individer som angivelig var fri for kardiovaskulære, hematologiske, nevrologiske, endokrine eller metabolske sykdommer. De frivillige var også ikke-røykere.
    2. Samle blod ved hjelp av en steril nål og sprøyte fra en fremtredende vene i den antecubitale regionen av underarmen, og overfør umiddelbart til rør belagt med en av følgende antikoagulantia: natriumheparin (for immunhistokjemi) eller etylendiamintetraeddiksyre (EDTA; for fluorescerende merking).
    3. Utsett de antikoagulerte blodprøvene for nøyaktig kontrollerte mekaniske krefter ved hjelp av et Couette-type skjæresystem, som beskrevet før 7,20.
      1. Skjæringsapparatet består av en roterbar kopp og en stasjonær bob, adskilt av et gap på 300 μm. Overfør blodprøven inn i gapet, noe som fører til at koppens nøyaktig kontrollerbare rotasjonshastighet utøver velkontrollerte mekaniske krefter på prøven. Representative data presentert her ble produsert ved å bruke mekaniske krefter som reflekterer de som forekommer i den menneskelige vaskulaturen (5 Pa) i lengre varighet (300 s).
  2. Fremstilling av løsninger som er nødvendige for immunfarging
    1. Forbered løsningene som i tabell 1. Løsningene kan fremstilles før immunfargingsprosedyren utføres og lagres ved gitt temperatur til det trengs.
      MERK: Lagringsvarigheten kan variere mellom kjemikaliene. Sjekk sikkerhetsdatabladet.
  3. Prøve forberedelse
    1. Behandle fullblod umiddelbart etter seponering eller eksperimentell behandling (der det er aktuelt; f.eks. mekanisk stimulus i våre prøver; se trinn 1.1.3) for å kunne oppdage kortvarige effekter, for eksempel etter skjærspenningspåføring, trening, kortvarig hypoksieksponering osv.
    2. Utfør RBC-proteinfiksering ved bruk av formaldehyd som følger: fortynn fullblod i forholdet 1: 2 i 4% paraformaldehydoppløsning i 20 minutter ved romtemperatur (RT). Sentrifuger prøven ved 132 x g i 3 minutter ved RT og fjern supernatanten forsiktig ved pipettering.
    3. Resuspender RBC-pelleten i to volumer med 0,1 mol/l fosfatbufret saltvann (PBS) (1:3 fortynning) og inkuber i 5 minutter ved RT. Gjenta sentrifugeringen som beskrevet ovenfor og fjern supernatanten, som skal være klar, ved pipettering. Hengi RBC-pelleten på nytt i ett volum på 0,1 mol/l PBS (1:2-fortynning).
    4. Forbered blodutstryk som følger: Merk et mikroskopglass med prøve-ID, antistoff påført, etc. ved hjelp av en alkoholbestandig penn (f.eks. blyant). Deretter tilsettes 10 μL av den forberedte RBC-løsningen rett over etikettfeltet.
    5. Plasser et nytt lysbilde på prøven i en vinkel på ca. 45° og fordel prøven jevnt langs lysbildet. Varmfiks lysbildet over en Bunsen-brenner ved å holde prøven over brenneren med konstant bevegelse i 5-7 s.
      MERK: Det anbefales å lufttørke prøvene før varmefiksering. Prøvene kan lagres ved RT til farging (figur 2).
  4. Farging av immunhistokjemi
    1. Merk to områder på hvert lysbilde: et testområde der RBCene inkuberes med det respektive primære og sekundære antistoffet, og et kontrollområde der det primære antistoffet erstattes av en kontrollløsning. Dette området fungerer som en analysekontroll for å bestemme bakgrunnssignalet til RBC-ene.
    2. Klargjør oppløsninger før eller under prosedyren, i henhold til tabell 2. Et volum på 300 μL er nødvendig per testområde og 200 μL per kontrollområde.
      MERK: Det er viktig å merke seg at disse antistoffbaserte fargeprosedyrene gir semi-kvantitative, snarere enn kvantitative, data. For å sikre at meningsfulle konklusjoner kan trekkes fra de produserte dataene, er det derfor absolutt nødvendig med passende kontrollprøver (dvs. for å gi et referansepunkt for de vurderte relative endringene i proteinaktivering).
    3. For trypsin fordøyelse, tine 0,1% trypsin og likevekt til RT. Merk to områder på hvert lysbilde ved hjelp av en fettblyant: et testområde (2/3 av lysbildet) og et kontrollområde (1/3 av lysbildet). Påfør tris-bufret saltvann (TBS) forsiktig ved hjelp av overføringspipetter for å vaske prøveområdene. La TBS sitte i 30 s og hell den av. Gjenta vasketrinnet.
      Legg til følgende løsninger for både kontrollen og testområdet, med mindre annet er beskrevet. Områdene må dekkes tilstrekkelig med den respektive løsningen. Påfør løsningene med engangsoverføringspipetter, og bytt pipetter etter hver løsning.
    4. Tilsett 0,1% trypsin, dekk lysbildene ved hjelp av et spesialbygd inkubasjonskammer med enten lokk eller aluminiumsfolie, og inkuber i 30 minutter ved 37 ° C i en inkubator. Etter inkubasjon, stopp enzymreaksjonen ved å tilsette vann fra springen. Hell av løsningen. Vask begge områdene 3x med TBS, som beskrevet ovenfor.
    5. For å blokkere peroksidaseaktivering, tilsett metanoloppløsning og inkuber i 30 minutter ved RT. Dekk lysbildene i løpet av den tiden. Hell av løsningen.
      MERK: For immunfluorescensdeteksjon (seksjon 2) kan dette trinnet utelates, gitt at blokkering av endogene peroksidaser tjener til å forhindre kunstig signal forårsaket av påvisning med pepperrotperoksidase (HRP) og 3,3'-diaminobenzidinhydrat (DAB).
    6. Vask begge områdene 3x med TBS, som beskrevet i trinn 1.4.3. Tilsett 3% skummet melkløsning og inkuber i 30 min ved RT for å blokkere. Hell av løsningen. Ikke vask etterpå.
    7. Legg kun primært antistoff (AB) til testområdet. Legg til AB-kontrollløsning (se tabell 2) i kontrollområdet. Inkuber prøver ved 4 °C over natten. Dekk lysbilder i løpet av den tiden for å forhindre tørking.
      MERK: Unngå å overføre løsningene fra testen til kontrollområdet, da dette vil påvirke kontrollverdiene.
    8. Hell av antistoffoppløsningen. Vask begge områdene 3x med TBS, som beskrevet i trinn 1.4.3.
    9. Utfør et blokkeringstrinn for å forhindre uspesifikk binding. Tilsett 3% vanlig geitserum og rug i 30 min ved RT. Hell av løsningen.
    10. Tilsett den sekundære antistoffløsningen og inkuber i 30 minutter ved RT. Hell av antistoffoppløsningen. Vask områdene 3x med TBS, som beskrevet i trinn 1.4.3.
  5. Utvikling av beis og deksel
    1. Utfør den avidinkoblede HRP-reaksjonen (se fortynning i tabell 2) ved å tilsette fortynnet avidin-peroksidaseoppløsning og inkubere i 30 minutter ved RT. Hell av løsningen.
    2. Forbered DAB-blandingen for å utvikle immunfargingen før bruk, i henhold til tabell 3.
      FORSIKTIG: DAB er farlig. Vurder faresetningene H341 (mistenkt for å forårsake genetiske defekter) og H350 (kan forårsake kreft). Vurder følgende forholdsregler: P201, P202, P280, P308+P313, P405 og P501.
    3. Utfør DAB-kontrollfarging på følgende måte: samle HRP-løsningen fra trinn 1.5.1 fra et lysbilde og bland med et lite volum (f.eks. 1 ml) forberedt DAB-løsning i et separat sentrifugerør før farging. Blandingen skal utvikle en brun / grå farge.
    4. Plasser lysbildene under et mikroskop (forstørrelse på minst 200x) og legg til DAB-løsning på begge områdene. Overvåk fargingen av RBC-ene kontinuerlig og stopp fargingen ved å fjerne DAB-løsningen med en engangspipette før bakgrunnen begynner å farge. For RBC-NOS serine 1177-farging er DAB-inkubasjonstiden ca. 17 min.
    5. Utfør prøve dehydrering. Plasser lysbildene i et glassstativ og senk i 5 s hver i etanolløsninger av forskjellige fortynninger, starter med 70%, etterfulgt av 96% og deretter 100%, og til slutt i xylol. Fjern lysbildene fra stativet og legg på et vev, med RBC øverst for å absorbere overflødig væske.
    6. Tilsett to eller tre dråper monteringsmedium gjennom hele lysbildet. Dekk lysbildet med et deksel. Unngå inkludering av luftbobler, da dette hindrer den mikroskopiske evalueringen. Tørk prøvene minst over natten i en avtrekkshette.
  6. Utføre mikroskopisk evaluering
    1. For visualisering og avbildning, plasser lysbilder i et overført lysmikroskop med en forstørrelse på minst 200x. Forsikre deg om at mikroskopet er koblet til et kamera for å ta bilder av de fargede RBC-ene.
    2. Slå på mikroskopets lyskilde. Slå på det mikroskopmonterte kameraet og start programvaren for mikroskopkontroll. Bruk lysfeltmikroskopi for å bestemme riktig fokus ved å vri på justeringsknappene for grovt og fint fokus og finne fokusnivået der RBC-er er synlige.
    3. Sett bakgrunnsverdiene i bildene til 220 ± 5 gråverdier, målt på tre cellefrie områder av lysbildet. For å gjøre det, åpne det første bildet ved hjelp av den fritt tilgjengelige programvaren ImageJ. Velg alternativet Middelgrå verdier ved hjelp av panelet Angi mål. Bruk det ovale ikonet til å måle den grå verdien ved hjelp av kommandoen Mål . Hvis de målte verdiene er utenfor området, juster bakgrunnslyset på mikroskopet tilsvarende. Gjenta disse trinnene til bakgrunnsverdiene er riktige.
      MERK: Disse bakgrunnsverdiene skal være innenfor det gitte området for alle bilder som tas. Ellers er dataene ikke sammenlignbare.
    4. For analyse av RBC-grå verdi markerer du kanten på hver RBC ved hjelp av det ovale markeringsverktøyet i ImageJ-programvaren. Bestem de grå verdiene for individuelle RBCer ved hjelp av kommandoen Mål . Mål de grå verdiene på minst 50 RBC fra testen og minst 10 RBC fra kontrollområdet.
      MERK: Det totale antallet analyserte RBC kan justeres individuelt. Jo flere RBC-er som analyseres, desto mer meningsfylt blir resultatet. Imidlertid bør det totale antall analyserte RBC være sammenlignbare for hver tilstand, emne, etc. innenfor et gitt eksperiment.
      1. Unngå analyse av RBC i nærheten av fettblyanten, da farging kan være ufullstendig i dette området. Unngå analyse av overlappende RBC, da dette påvirker fargeintensiteten. Bruk bare RBC-er som er atskilt fra andre RBC-er. Analyser minst fem bilder fra testen og minst to bilder fra kontrollområdet for evaluering av 50/10 RBC. Inkluder RBC-er fra hvert bilde i den endelige analysen.
    5. For å beregne fargeintensitet, beregne de endelige signalene som:
      (individuelt testområde RBC - gjennomsnittlig testområde bakgrunn) - (individuelt kontrollområde RBC - gjennomsnittlig kontrollområde bakgrunn)

Figure 2
Figur 2 Fremstilling av fikseringsprosessen og blodutstryksgenerering. (Ordning opprettet med BioRender.com.) Fortynnede blodprøver er kjemisk festet i paraformaldehyd, deretter sentrifugert og vasket med fosfatbufret saltvann. Til slutt blir resuspendert blod smurt på et glassglass og termisk festet via å sveve over en Bunsen-brennerflamme. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tabell 1: Fremstillings- og lagringsbetingelser for løsninger som er nødvendige for immunhistokjemisk farging. Løsningen kan utarbeides før protokollen. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 2: Beskrivelse av antistoffoppløsninger til umiddelbar bruk. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Tabell 3: Komponenter og protokoll for klargjøring av DAB-løsning for umiddelbar bruk. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

2. Fluorescerende merking av RBC-proteiner

MERK: Følgende avsnitt skisserer en tilpasning av den immunhistokjemiske protokollen, utviklet med sikte på å muliggjøre bruk av antistoffer med fluorescerende konjugater (figur 1).

Blodprøvepreparering for immunfluorescensprotokollen er identisk med den som er beskrevet i avsnitt 1, så følgende avsnitt starter fra farging av prøver.

  1. Farging av immunfluorescens
    1. Inkuber med det sekundære, fluorescerende konjugerte antistoffet (for volumet, se trinn 1.4.2) i 30 minutter ved RT beskyttet mot lys, enten ved bruk av et spesialbygd inkubasjonskammer eller aluminiumsfolie.
    2. Hell av den sekundære antistoffløsningen og vask prøvene 3x med TBS. La den endelige vasken ligge på prøvene for å forhindre at de tørker ut.
    3. Hell av TBS og fjern prøvene fra prøvestativet en om gangen for å forhindre langvarig lyseksponering. For dehydrering av prøvene, utsett lysbildene for forskjellige etanolløsninger for ~ 5 s hver, starter med 70%, etterfulgt av 90% og til slutt 100%. Utsett lysbildene til xylol / xylenoppløsning i 5 s.
    4. Forbered en dekselseddel med to eller tre dråper monteringsmedium og monter deretter lysbildet med dekselet. Sørg for jevn fordeling av monteringsmediet ved å påføre lett trykk med pinsett eller et lignende, sterilt metallinstrument. Fjern luftbobler, som ellers kan forstyrre avbildningen, med samme instrument. La prøvene tørke over natten på et mørkt og tørt sted.
  2. Mikroskopisk evaluering
    1. For visualisering og avbildning, plasser lysbildet på mikroskopstadiet med en total forstørrelse på minst 400x. Slå på mikroskoplyskilden og den fluorescerende lyskilden, og sørg for at den fluorescerende lyskilden er justert til maksimal intensitet.
    2. Slå på det mikroskopmonterte kameraet og start programvaren for mikroskopkontroll. Bruk lysfeltmikroskopi for å bestemme riktig fokus ved å vri på justeringsknappene med grov og fin fokus, og finne fokusnivået der RBC-er er synlige.
      MERK: Overdreven eksponering for lys kan forårsake fotobleking av fluorescerende konjugater. Man kan bruke et lysbilde fra et tidligere eksperiment til dette formålet, for å minimere lyseksponering av lysbildene som ennå ikke er analysert.
    3. Bestem optimal laserintensitet ved å inspisere RBC i kontrollområdet. Sørg for at intensiteten er høy nok til at RBC er synlig, mens du ikke produserer et stort bakgrunnssignal. Hold intensiteten og eksponeringstiden konsistent mellom områder og prøver for å sikre sammenlignbarhet.
    4. Ta lyse og fluorescerende bilder i minst tre forskjellige områder av testområdet på lysbildet, valgt tilfeldig. Hvis du vil merke et område, panorerer du bort fra kantene på lysbildet som er merket med lipidpennen, ved hjelp av mikroskoptrinnskontrollene. Velg et område som viser jevn fordeling av et enkelt RBC-lag.
    5. Sett eksponeringstiden til 1 s for fluorescerende bilder og ta et bilde ved hjelp av programvarekontrollene til mikroskopkontrollprogramvaren. Bytt til brightfield-modus, sett eksponeringstiden til 'Auto', og ta det tilsvarende brightfield-bildet.
    6. Ta lysfelt- og fluorescerende bilder i minst to distinkte, tilfeldig utvalgte områder av kontrollområdet til lysbildet ved å gjenta trinn 2.2.3.
    7. Lagre bildene i .tif format for å beholde de opprinnelige gråverdiene til bildepunkter, forhindre komprimering og overføre metadata for anskaffelsen.
    8. Mål de grå verdiene til de registrerte RBC-ene. Åpne ImageJ (eller FIJI21; se tilleggsfil 1). Bestem de grå verdiene til individuelle RBC-er. For dette formålet, merk hver enkelt celle med det ovale markeringsverktøyet, og analyser ved hjelp av kommandoen Mål .
      MERK: RBC bør ikke analyseres hvis de overlapper med andre celler, da dette kan øke det resulterende signalet.
    9. mellom tre og fem områder uten RBC, og bestem de grå verdiene for å gi et mål på bakgrunnssignalet. Analyser minst 150 RBC-er fra minst tre forskjellige bilder for hvert testområde, og minst 50 RBC-er fra minst to forskjellige bilder for hvert kontrollområde.
      MERK: Analyse av flere celler/områder kan anbefales for å minimere variabiliteten. Gitt at RBC-populasjonen er iboende heterogen, kan cellecellevariabilitet i signal være signifikant, avhengig av proteinet av interesse.
    10. Utfør alternativ dataanalyse av bilder som er tatt ved hjelp av makrokommando. Opprett/installer en makrokommando gjennom FIJI-utgaven av ImageJ for automatisk valg, bakgrunnskorrigering og gråverdianalyse av et gitt bilde.
      MERK: Denne rutinen bruker automatisert terskel for å oppdage cellene som er tilstede i et gitt bilde ved hjelp av en kopi av det opprinnelige bildet, og produserer et overlegg som pålegges det opprinnelige bildet for å trekke ut gråverdier av fluorescerende RBC. Makroen deponeres som en IJM-fil, som tilleggskodefil 1.
    11. Åpne bildefilen i .tif format som er klart for analyse i FIJI. Åpne makroen RBC fluorescence.ijm (Supplementary Coding File 1), og klikk Kjør.
      MERK: Makroen er konfigurert for bilder oppnådd med 600x forstørrelse og et stort signal-støy-forhold. Automatisk valg av celler bør gjennomgås av etterforsker.
  3. Beregn de endelige signalene som:
    (testområde RBC - testområde bakgrunn) - (kontrollområde RBC - kontrollområde bakgrunn) for manuell analyse;
    (testområde - kontrollområde) for automatisert analyse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den presenterte protokollen, som beskriver metoder som letter påvisning av akutte endringer i RBC-proteiner, ble testet på en velkjent mekanisk sensitiv proteinendring: fosforylering av RBC-NOS ved serin 1177-resten. Fullblod ble oppnådd fra friske frivillige og deretter delt inn i to separate alikoter. En gitt blodprøve ble utsatt for mekanisk skjærspenning av fysiologisk størrelse (5 Pa) i 300 s, som tidligere var vist å fremkalle RBC-NOS-fosforylering ved serin 117714. Umiddelbart etter opphør av mekanisk skjæreksponering ble blodprøven fiksert i paraformaldehyd. Som kontroll ble en blodprøve eksponert, lastet inn i skjæringsanordningen og latt hvile i 300 s før fiksering i paraformaldehyd. Signalet om antistoffer rettet mot RBC-NOS-fosforylert ved serin 1177-resten i hvile og som respons på mekanisk krafteksponering ble vurdert ved bruk av både immunhistokjemi (figur 3A,B) og immunfluorescens (figur 3C,D). Skjærede og ikke-skårne prøver ga statistisk signifikant forskjellige signaler [Friedman-test: χ2(3) = 18,71, p = 0,0003]. En sammenlignbar, omtrent tre ganger økning i signalet av antistoffer rettet mot RBC-NOS-fosforylert ved serin 1177-resten ble detektert som respons på mekanisk krafteksponering av RBC, sammenlignet med de respektive uskårne cellene (både p < 0,01) når de ble vurdert med enten immunhistokjemisk eller immunfluorescensprotokoll (figur 3E).

Dermed indikerer sammenligning av resultatene oppnådd med begge metodene utmerket samsvar mellom de presenterte protokollene, som også vellykket og pålitelig oppdaget økt RBC-NOS-fosforylering som respons på mekanisk stimulering.

Figure 3
Figur 3: Representative samlede data fra immunhistokjemisk (A,B) og immunfluorescerende (C,D) farging av RBC-NOS serin 1177 fosforylering etter mekanisk skjær. Analyse av signalintensiteten fra disse prøvene er presentert i (E), hvor hvite barer reflekterer data oppnådd ved bruk av HRP-farging, og svarte barer representerer data oppnådd ved hjelp av fluorescerende metode. Blodet ble enten klargjort i hvile eller umiddelbart etter eksponering for mekanisk kraft (dvs. skjær). N = 7 blodprøver ble tatt fra distinkte givere. Data vises som gjennomsnitt ± standardfeil av gjennomsnittet. **p < 0,01, bestemt ved hjelp av en ikke-parametrisk Friedman-test. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfil 1: Automatisert semi-kvantitativ bildeanalyse råkode med trinnvise merknader for bilder av immunfluorescerende røde blodlegemer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Supplerende kodefil 1: Kompilert kode kompatibel med FIJI/ImageJ-programvare for å kjøre automatisert bildeanalyse av immunfluorescerende røde blodlegemer. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nyere litteratur tyder sterkt på at RBC-NOS-proteinet er av avgjørende betydning for reguleringen av RBC-deformabilitet 15,22,23, noe som igjen letter passasjen gjennom smale kapillærer 24. Proteinaktivitet avhenger sterkt av posttranslasjonelle proteinmodifikasjoner, spesielt fosforylering av visse rester18. Fokuset av interesse ligger i fosforyleringsstedet 1177, som relaterer seg til aktiveringen av RBC-NOS-proteinet23. Endringer av dette proteinet har blitt vist i en rekke sykdommer 25,26,27,28,29, og dermed kan undersøkelse av disse endringene gi verdifull kunnskap, ikke bare for forståelsen av visse sykdommer, men også for å utvikle og veilede spesifikke terapier30.

Flere stimuli har blitt identifisert for å øke RBC-NOS serin 1177 fosforylering22, men mekaniske krefter ser ut til å være en viktig ekstracellulær stimulus som forårsaker aktivering eller modulering av RBC-NOS-proteinet 13,18,31,32. Imidlertid er modulasjoner av RBC-NOS-aktivitet ganske midlertidige33; Analyse/bevaring av skjæravhengige endringer må derfor utføres umiddelbart. Immunhistokjemiske, og senere immunfluorescensprotokoller, ble utviklet for å lette bevaring og analyse av akutte, regulatoriske modifikasjoner av RBC-NOS.

Resultatene som presenteres her, oppnådd via immunhistokjemiske og immunfluorescensprotokoller, viser et høyt nivå av enighet om økt fosforylering av RBC-NOS serin 1177 etter skjæreksponering. Dermed er begge protokollene egnet for undersøkelse av forbigående posttranslasjonelle endringer av RBC-proteiner, og den respektive eksperimentøren kan bestemme hvilken metode de kan bruke i deres respektive laboratorium, med tanke på lokalt tilgjengelige ressurser og infrastruktur. Gitt den brede kommersielle tilgjengeligheten av antistoffer rettet mot proteiner, både i deres opprinnelige tilstand eller etter posttranslasjonelle modifikasjoner, er de nåværende analysene tilpasningsdyktige for et betydelig spekter av mål. Dermed presenterer de nyttige verktøy for å vurdere RBC-signalering14,27,34.

Visse aspekter bør vurderes under prosedyren. De nevnte antistoffene er ikke spesifikt utviklet for å brukes i RBC. I stedet er disse spesifikke endotel-type NOS (eNOS) antistoffer. Siden eNOS og RBC-NOS ser ut til å dele stor homologi22,23, har eNOS-spesifikke antistoffer tradisjonelt blitt brukt til å visualisere RBC-NOS-aktivering. Det er viktig å merke seg at antistoffer rettet mot inducible (iNOS) eller neuronale (nNOS) isoformer ikke produserer signaler i RBC, noe som støtter at RBC-NOS deler signifikant strukturell likhet med eNOS22. Riktig fortynning må testes før antistoff brukes i forsøket, siden leverandøranbefalte data ikke kan brukes på RBC-eksperimentering uten testing. Videre krever et bytte av distribusjonsselskaper overdreven testing av ulike fortynninger før bruk. Vi anbefaler å følge en svært systemisk tilnærming ved testing av nye antistoffer/kjemikalier; Nye komponenter bør testes med dose-respons-tilnærminger, der bare de spesifikke trinnene som introduserer den nye komponenten bør endres. Positive kontroller (dvs. stimulerende RBC-NOS-aktivering) bør gis ved å sammenligne skåret med uskåret blod, som presentert her. Alternativt har farmakologisk stimulering av RBC-NOS-fosforylering med 350 pM insulin vist seg å resultere i økt RBC-NOS-fosforylering, lik den som observeres ved mekanisk kraftapplikasjon7.

Begrensningene i de presenterte deteksjonsmetodene strekker seg til vanlige begrensninger av metoder som er avhengige av spesifisiteten til kommersielt oppnådde primære antistoffer (f.eks. Western blot). Først må et primært antistoff rettet mot antigenet av interesse være tilgjengelig. Hvis tilgjengelig, må antistoffet være spesifikt for målet, som kan bekreftes ved funksjonelle tiltak (dvs. farmakologisk behandling med aktivatorer / inhibitorer) eller ved bruk av vestlig blotting. Videre må dataene som produseres via de beskrevne metodene tolkes nøye. Det vil si at de presenterte metodene er semi-kvantitative, og gir informasjon om endringer i proteinmodifikasjoner i forhold til passende kontrollprøver. Den semi-kvantitative evalueringen som presenteres her refererer alltid til aktiveringen av enzymet, og bør ikke forveksles med enzymaktiviteten. Målinger av enzymaktivitet krever separate analyser, for eksempel arginin-citrullinanalysen som måler konverteringshastigheten (fmol/min) på [3 H] L-arginin til [3H] citrullin eller [14 C] L-arginin til [14C] citrullin 35,36. For å verifisere om økt RBC-NOS-aktivering også ledsages av høyere NO-nivåer og/eller økte RBC-deformabilitetsverdier, bør for eksempel ytterligere analyse av NO-konsentrasjonen utføres. Videre, for å skille ut RBC-NOS som en kilde til NO, bør NOS-hemmere som L-NIO brukes15.

Det kan oppsummeres at metodene som presenteres her, er velutviklede for å analysere endringer i RBC-NOS-aktivering som respons på påførte stimuli i forhold til ustimulerte kontrollceller. Disse metodene bidrar dermed til forståelsen av hvordan mekanisk stress påvirker funksjonene til RBC-proteiner, som er kritiske for cellulær funksjon, og til slutt avgjørende for tilstrekkelig perfusjon av arbeidsvev og gassutveksling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere har opplyst at det ikke er noen interessekonflikter.

Acknowledgments

LK anerkjenner støtten fra et australsk regjeringsstipend for forskningsopplæringsprogram.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate Sigma/Merck D5637 DAB
Ammoniumchloride  Merck /Millipore 101145 NH4Cl
Centrifuge 5427 R  Eppendorf 5409000010
Coverslips VWR 631-0147 
di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate  Merck /Millipore 106580 Na2HPO4. 2 H2O
Disposable transfer pipettes VWR 612-6803
Entellan Merck /Millipore 107961 rapid mounting medium for microscopy
Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) Hofmann 642
Glucose-Oxidase Sigma/Merck G2133
Grease pencil  Dako S 2002
Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase Sigma/Merck E-2886 HRP
Hydrochloric acid  Merck /Millipore 109057 HCl
Hydrogen peroxide, 30% Merck /Millipore 107203 H2O2
ImageJ Software Freeware
Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) RR Mechatronics Ektacytometer instrument used for shearing
Methanol Merck /Millipore 106009
Microscope slides VWR 630-1985
Nickel(II)-sulfate Hexahydrate  Sigma/Merck N4882 NiSO4.6H2O
Normal Goat serum Agilent/DAKO X0907 NGS
Paraformaldehyde Merck /Millipore 818715 PFA
Pipettes Eppendorf Reference 2 VWR 613-5836/ 613-5839
Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) Merck/Millipore 07-428-I Primary Antibody
Reaction tubes, 2ml Eppendorf 30120094
Secondary Antibody goat anti rabbit Agilent/DAKO E0432 Secondary Antibody
Skim milk powder Bio-Rad 170-6404
Sodium chloride  Merck /Millipore 106404 NaCl
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate Merck /Millipore 106346 NaH2PO4.H2O
Sodium hydroxide, 1 M Merck /Millipore 150706 NaOH
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Merck /Millipore 108382 Tris
Trypsin Sigma/Merck T7409
Tween20  Merck /Millipore 822184
Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F Merck /Millipore WHA1825047
Xylol VWR Chemicals 2,89,73,465
ß-D-Glucose monohydrate Merck /Millipore 14431-43-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cohen, R. M., et al. Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c. Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).
  2. Mock, D. M., et al. Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities. Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).
  3. Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. How do red blood cells die? Frontiers in Physiology. 12, 655393 (2021).
  4. Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals. Frontiers in Physiology. 8, 1076 (2017).
  5. Pretini, V., et al. Red blood cells: chasing interactions. Frontiers in Physiology. 10, 945 (2019).
  6. Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
  7. Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).
  8. Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Active modulation of human erythrocyte mechanics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).
  9. Strader, M. B., et al. Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease. Scientific Reports. 10 (1), 14218 (2020).
  10. Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as "signatures" for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients. Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).
  11. Grau, M., et al. High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia. British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).
  12. Sae-Lee, W., et al. The protein organization of a red blood cell. Cell Reports. 40 (3), 111103 (2022).
  13. Suhr, F., et al. Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway. PLoS One. 7 (9), e45982 (2012).
  14. Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation. Frontiers in Physiology. 10, 36 (2019).
  15. Grau, M., et al. RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability. PLoS One. 8 (2), e56759 (2013).
  16. Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell. Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).
  17. Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effects of nitric oxide on red blood cell deformability. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).
  18. Suhr, F., et al. Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).
  19. Grau, M., et al. Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).
  20. Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment. Biology. 10 (1), 47 (2021).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects. Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).
  23. Kleinbongard, P., et al. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase. Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).
  24. McMahon, T. J. Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion. Frontiers in Physiology. 10, 1417 (2019).
  25. Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells. PLoS One. 10 (4), 0125206 (2015).
  26. Di Pietro, N., et al. Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients. Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).
  27. Grau, M., et al. Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).
  28. Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
  29. Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).
  30. Nader, E., et al. Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).
  31. Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes. The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).
  32. Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response. Life. 11 (1), 36 (2021).
  33. Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress. Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).
  34. Grau, M., et al. Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients. Scientific Reports. 9 (1), 11813 (2019).
  35. Methods in Nitric Oxide Research. Feelisch, M. , Wiley. Chichester. (1998).
  36. Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).

Tags

Biokjemi utgave 193 røde blodlegemer røde blodcelleproteiner mekanotransduksjon immunhistokjemi immunfluorescens nitrogenoksidsyntase
Immunfargingsbasert påvisning av dynamiske endringer i røde blodcelleproteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grau, M., Kuck, L.… More

Grau, M., Kuck, L. Immunostaining-Based Detection of Dynamic Alterations in Red Blood Cell Proteins. J. Vis. Exp. (193), e64843, doi:10.3791/64843 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter