Waiting
Elaborazione accesso...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Immunfärgningsbaserad detektion av dynamiska förändringar i röda blodkroppsproteiner

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64843
Automatic Translation
1, 2
1Department of Molecular and Cellular Sports Medicine, German Sport University Cologne, 2Biorheology Research Laboratory, Menzies Health Institute, Griffith University Gold Coast

Summary

Att fånga dynamiska förändringar i proteinaktiveringen av enukleerade röda blodkroppar innebär metodologiska utmaningar, som bevarande av dynamiska förändringar i akuta stimuli för senare bedömning. Det presenterade protokollet beskriver provberednings- och färgningstekniker som möjliggör bevarande och analys av relevanta proteinförändringar och efterföljande detektion.

Abstract

Antikroppsmärkning av röda blodkroppar (RBC) proteiner är en vanligt använd, semikvantitativ metod för att upptäcka förändringar i det totala proteininnehållet eller akuta förändringar i proteinaktiveringstillstånd. Det underlättar bedömningen av RBC-behandlingar, karakterisering av skillnader i vissa sjukdomstillstånd och beskrivning av cellulära koherencies. Detektion av akut förändrad proteinaktivering (t.ex. genom mekanotransduktion) kräver adekvat provberedning för att bevara annars tillfälliga proteinmodifieringar. Grundprincipen innefattar immobilisering av målbindningsställena för de önskade RBC-proteinerna för att möjliggöra initial bindning av specifika primära antikroppar. Provet bearbetas vidare för att garantera optimala förhållanden för bindning av den sekundära antikroppen till motsvarande primära antikropp. Valet av icke-fluorescerande sekundära antikroppar kräver ytterligare behandling, inklusive koppling av biotin-avidin och applicering av 3,3-diaminobensidintetrahydroklorid (DAB) för att utveckla färgningen, som måste kontrolleras i realtid under ett mikroskop för att stoppa oxidationen och därmed färgningsintensiteten i tid. För färgningsintensitetsdetektering tas bilder med ett vanligt ljusmikroskop. Vid en modifiering av detta protokoll kan en fluoresceinkonjugerad sekundär antikropp appliceras istället, vilket har fördelen att inget ytterligare utvecklingssteg är nödvändigt. Denna procedur kräver emellertid ett fluorescensmål fäst vid ett mikroskop för färgningsdetektering. Med tanke på dessa metoders semikvantitativa karaktär är det absolut nödvändigt att tillhandahålla flera kontrollfläckar för att ta hänsyn till icke-specifika antikroppsreaktioner och bakgrundssignaler. Här presenterar vi både färgningsprotokoll och motsvarande analytiska processer för att jämföra och diskutera respektive resultat och fördelar med de olika färgningsteknikerna.

Introduction

Röda blodkroppar (RBC) passerar hjärt-kärlsystemet i 70 till 140 dagar, med en genomsnittlig RBC-ålder på cirka 115 dagar 1,2. Senescenta eller skadade röda blodkroppar avlägsnas från cirkulationen genom erytrofagocytos, en effektiv clearingprocess som drivs av makrofager3. Den förutbestämda livslängden för dessa celler är en konsekvens av att cellorganellerna överlämnas, inklusive kärnan, mitokondrierna och ribosomerna, under differentiering och mognad4. Således saknar cirkulerande RBC ett translationellt maskineri, vilket utesluter syntesen av nya proteiner3. Det följer att dynamiska, posttranslationella modifieringar av befintliga proteiner representerar den enda livskraftiga mekanismen för akut, biokemisk reglering som svar på extracellulära och intracellulära stressfaktorer som verkar på RBC5.

Mekaniska krafter verkar vara de viktigaste extracellulära signalerna som orsakar aktivering eller modulering av biokemiska vägar inom RBC. Upptäckten av det mekanokänsliga proteinet, Piezo1, i RBC-membran6 inspirerade flera forskningslinjer som undersökte mekaniskt aktiverad signalering i dessa celler7. Till exempel har de senaste framstegen visat att de fysikaliska egenskaperna hos RBC aktivt regleras av akuta och dynamiska förändringar av proteiner8, vilket inkluderar posttranslationell fosforylering och ubiquitinering9. Eftersom dessa normala modifieringar skiljer sig åt i vissa sjukdomar 9,10,11, verkar det vara av vetenskapligt och kliniskt intresse att bestämma aktiveringstillståndet för RBC-proteiner, särskilt i förhållande till mekanobiologiska processer.

Bestämningen av akuta förändringar i RBC-proteinaktiveringstillstånd innebär vissa metodologiska utmaningar. Till exempel kräver lagring av RBC-prover för senare analys bevarande av de modifierade RBC-proteinerna, eftersom posttranslationella modifieringar inte är hållbara. Dessutom är klassiska proteindetekteringsmetoder (t.ex. western blotting) notoriskt svåra att standardisera i RBC på grund av det låga överflödet av proteiner i förhållande till hemoglobin, vilket står för ~ 98% av proteininnehållet i dessa celler12. Således har antikroppsbaserad färgning av kemiskt bevarade röda blodkroppar varit den valda metoden vid undersökning av akuta modifieringar av viktiga RBC-proteiner, såsom den RBC-specifika isoformen av kväveoxidsyntas (RBC-NOS)13,14. RBC-NOS har visat sig enzymatiskt producera kväveoxid (NO), vilket verkar oumbärligt för väsentliga RBC-egenskaper, inklusive RBC-deformerbarhet15,16,17. Posttranslationella modifieringar av RBC-NOS reglerar katalytisk enzymaktivitet, där fosforylering av serin 1177-återstoden beskrivs för att öka enzymaktiviteten, medan fosforylering av resterna serin 114 eller treonin 495 har kopplats till minskad RBC-NOS-aktivitet18,19.

Sammantaget bidrar tillfälliga modifieringar av RBC-proteiner till viktig cellulär funktion, och standardiserade protokoll som möjliggör detektion av dessa modifierade proteiner är av högt värde. Här presenterar vi två distinkta protokoll som utnyttjar specifika antikroppar för att underlätta detektion av RBC-NOS-proteinaktivering och diskuterar rekommendationer för dataanalys och tolkning.

Prestanda för de beskrivna protokollen bedömdes genom mätning av den välrapporterade ökningen av fosforyleringen av RBC-NOS vid serin 1177-återstoden som svar på mekaniska krafter som återspeglar de som förekommer i den humana vaskulaturen (5 Pa).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen som beskrivs här är i linje med Helsingforsdeklarationen och godkändes av etikkommittéerna vid det tyska idrottsuniversitetet i Köln (9/16/2013) och Griffith University (2019/808). Volontärer screenades för att säkerställa frånvaron av relevanta patologier och gav skriftligt informerat samtycke.

1. Färgning av RBC-proteiner med hjälp av immunhistokemiska protokoll

OBS: En detaljerad lista över nödvändiga kemikalier och material finns i materialförteckningen. I följande avsnitt beskrivs beredningen av de erforderliga lösningarna, följt av en detaljerad beskrivning av det immunhistokemiska protokollet (figur 1).

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av de enskilda steg som krävs för immunhistokemisk färgning och immunofluorescensfärgning av RBC-NOS vid fosforyleringsställe 1177. Ett typiskt arbetsflöde för de presenterade protokollen som sträcker sig från lösningsberedning och blodprovtagning till antikroppsbaserad detektion och visualisering presenteras. Klicka här för att se en större version av denna figur.

  1. Insamling av blodprov
    1. Ta blodprover (10 ml helblod) från sju friska män. Volontärerna var friska individer som enligt uppgift var fria från kardiovaskulära, hematologiska, neurologiska, endokrina eller metaboliska sjukdomar. Volontärerna var också icke-rökare.
    2. Samla blod med en steril nål och spruta från en framträdande ven i underarmens antecubitala region och överför omedelbart till rör belagda med ett av följande antikoagulantia: natriumheparin (för immunhistokemi) eller etylendiamintetraättiksyra (EDTA; för fluorescerande märkning).
    3. Utsätt de antikoagulerade blodproverna för exakt kontrollerade mekaniska krafter med hjälp av ett klippsystem av Couette-typ, enligt beskrivningen före 7,20.
      1. Klippapparaten består av en roterbar kopp och en stationär bob, åtskilda av ett mellanrum på 300 μm. Överför blodprovet till gapet, vilket gör att koppens exakt kontrollerbara rotationshastighet utövar välkontrollerade mekaniska krafter på provet. Representativa data som presenteras här producerades genom att tillämpa mekaniska krafter som reflekterar de som förekommer inom den mänskliga vaskulaturen (5 Pa) under längre varaktigheter (300 s).
  2. Framställning av lösningar som är nödvändiga för immunfärgning
    1. Förbered lösningarna enligt tabell 1. Lösningarna kan framställas innan immunfärgningsproceduren utförs och förvaras vid given temperatur tills de behövs.
      OBS: Lagringstiden kan variera mellan kemikalierna. Kontrollera säkerhetsdatabladet.
  3. Provberedning
    1. Bearbeta helblod omedelbart efter utsättning eller experimentell behandling (i förekommande fall, t.ex. mekanisk stimulans i våra prover, se steg 1.1.3) för att kunna upptäcka kortvariga effekter, till exempel efter skjuvspänningsapplicering, träning, kortvarig hypoxiexponering etc.
    2. Utför RBC-proteinfixering med formaldehyd enligt följande: späd helblod i ett förhållande av 1: 2 i 4% paraformaldehydlösning i 20 minuter vid rumstemperatur (RT). Centrifugera provet vid 132 x g i 3 minuter vid rumstemperatur och avlägsna försiktigt supernatanten genom pipettering.
    3. Återsuspendera RBC-pelleten i två volymer 0,1 mol/l fosfatbuffrad saltlösning (PBS) (spädning 1:3) och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur. Upprepa centrifugeringen enligt beskrivningen ovan och avlägsna supernatanten, som ska vara klar, genom pipettering. Återsuspendera RBC-pelleten i en volym 0,1 mol/L PBS (spädning 1:2).
    4. Förbered blodutstryk enligt följande: märk ett mikroskopglas med prov-ID, applicerad antikropp etc. med en alkoholresistent penna (t.ex. penna). Tillsätt sedan 10 μL av den beredda RBC-lösningen precis ovanför etikettfältet.
    5. Placera ett andra glas på provet i en vinkel på cirka 45° och fördela provet jämnt längs objektglaset. Värmefixera bilden över en Bunsen-brännare genom att hålla provet över brännaren med konstant rörelse i 5-7 sekunder.
      OBS: Det rekommenderas att lufttorka proverna före värmefixering. Proverna kan förvaras vid rumstemperatur tills färgning (figur 2).
  4. Färgning av immunhistokemi
    1. Markera två områden på varje objektglas: ett testområde där röda blodkroppar inkuberas med respektive primär och sekundär antikropp och ett kontrollområde där den primära antikroppen ersätts med en kontrolllösning. Detta område fungerar som en inom analyskontroll för att bestämma bakgrundssignalen för RBC: erna.
    2. Förbered lösningar före eller under proceduren, enligt tabell 2. En volym på 300 μL behövs per testområde och 200 μL per kontrollområde.
      OBS: Det är viktigt att notera att dessa antikroppsbaserade färgningsprocedurer ger semikvantitativa, snarare än kvantitativa, data. För att säkerställa att meningsfulla slutsatser kan dras från de framtagna uppgifterna krävs därför absolut lämpliga kontrollprover (dvs. för att ge en referenspunkt för de bedömda relativa förändringarna i proteinaktivering).
    3. För trypsinsmältning, tina 0,1% trypsin och balansera till RT. Markera två områden på varje glas med en fettpenna: ett testområde (2/3 av bilden) och ett kontrollområde (1/3 av bilden). Applicera försiktigt trisbuffrad saltlösning (TBS) med överföringspipetter för att tvätta provområdena. Låt TBS sitta i 30 sekunder och häll sedan av det. Upprepa tvättsteget.
      Lägg till följande lösningar till både kontroll- och testområdet, om inte annat beskrivs. Områdena måste täckas tillräckligt med respektive lösning. Applicera lösningarna med engångsöverföringspipetter och byt pipetter efter varje lösning.
    4. Tillsätt 0,1% trypsin, täck glasen med en specialbyggd inkubationskammare med antingen lock eller aluminiumfolie och inkubera i 30 minuter vid 37 ° C i en inkubator. Efter inkubation, stoppa enzymreaktionen genom att tillsätta kranvatten. Häll av lösningen. Tvätta båda områdena 3x med TBS, som beskrivits ovan.
    5. För blockering av peroxidasaktivering, tillsätt metanollösning och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur. Täck över objektglasen under den tiden. Häll av lösningen.
      Anmärkning: För immunofluorescensdetektion (avsnitt 2) kan detta steg utelämnas, eftersom blockeringen av endogena peroxidaser tjänar till att förhindra artefaktiska signaler orsakade av detektion med pepparrotsperoxidas (HRP) och 3,3′-diaminobensidinhydrat (DAB).
    6. Tvätta båda områdena 3x med TBS, enligt beskrivningen i steg 1.4.3. Tillsätt 3% skummjölkslösning och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur för att blockera. Häll av lösningen. Tvätta inte efteråt.
    7. Tillsätt endast primär antikropp (AB) till testområdet. Lägg till AB-kontrolllösning (se tabell 2) i kontrollområdet. Inkubera proverna vid 4 °C över natten. Täck glas under den tiden för att förhindra torkning.
      Undvik att överföra lösningarna från testet till kontrollområdet, eftersom detta påverkar kontrollvärdena.
    8. Häll av antikroppslösningen. Tvätta båda områdena 3x med TBS, enligt beskrivningen i steg 1.4.3.
    9. Utför ett blockeringssteg för att förhindra ospecifik bindning. Tillsätt 3% normalt getserum och inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur. Häll av lösningen.
    10. Tillsätt den sekundära antikroppslösningen och inkubera i 30 minuter vid RT. Häll av antikroppslösningen. Tvätta områdena 3x med TBS, enligt beskrivningen i steg 1.4.3.
  5. Utveckling av färgning och lock
    1. Utför den avidinkopplade HRP-reaktionen (se spädning i tabell 2) genom att tillsätta utspädd avidinperoxidaslösning och inkubera i 30 minuter vid RT. Häll av lösningen.
    2. Bered DAB-blandningen för att utveckla immunfärgningen före användning, enligt tabell 3.
      VARNING: DAB är farligt. Överväg faroangivelserna H341 (misstänks orsaka genetiska defekter) och H350 (kan orsaka cancer). Tänk på följande skyddsangivelser: P201, P202, P280, P308+P313, P405 och P501.
    3. Utför DAB-kontrollfärgning enligt följande: samla upp HRP-lösningen från steg 1.5.1 från ett objektglas och blanda med en liten volym (t.ex. 1 ml) beredd DAB-lösning i ett separat centrifugrör före färgning. Blandningen ska utveckla en brun / grå färg.
    4. Placera objektglasen under ett mikroskop (förstoring på minst 200x) och lägg till DAB-lösning till båda områdena. Övervaka färgningen av RBC: erna kontinuerligt och stoppa färgningen genom att ta bort DAB-lösningen med en engångspipett innan bakgrunden börjar färga. För RBC-NOS serine 1177-färgning är DAB-inkubationstiden cirka 17 min.
    5. Utför provuttorkning. Placera objektglasen i ett glasställ och sänk ner i 5 s vardera i etanollösningar av olika utspädningar, med början med 70%, följt av 96% och sedan 100% och slutligen i xylol. Ta bort bilderna från racket och placera på en vävnad, med röda blodkroppar överst för att absorbera överflödig vätska.
    6. Tillsätt två eller tre droppar monteringsmedium i hela bilden. Täck över bilden med ett täckglas. Undvik att inkludera luftbubblor, eftersom detta hindrar den mikroskopiska utvärderingen. Torka proverna åtminstone över natten i ett dragskåp.
  6. Utföra mikroskopisk utvärdering
    1. För visualisering och avbildning, placera bilder i ett överfört ljusmikroskop med en förstoring på minst 200x. Se till att mikroskopet är kopplat till en kamera för att ta bilder av de färgade röda blodkropparna.
    2. Slå på mikroskopljuskällan. Slå på den mikroskopanslutna kameran och starta programvaran för mikroskopkontroll. Använd ljusfältsmikroskopi för att bestämma lämplig fokus genom att vrida på de grova och fina fokusjusteringsknapparna och hitta fokusnivån där RBC är synliga.
    3. Ställ in bakgrundsvärdena för bilderna på 220 ± 5 gråvärden, mätt på tre cellfria områden på bilden. För att göra det, öppna den första bilden med hjälp av den fritt tillgängliga programvaran ImageJ. Välj alternativet Medelgråvärden med panelen Ange mått. Använd den ovala ikonen för att mäta det grå värdet med kommandot Mät. Om de uppmätta värdena ligger utanför intervallet, justera bakgrundsljuset vid mikroskopet i enlighet därmed. Upprepa dessa steg tills bakgrundsvärdena är korrekta.
      Dessa bakgrundsvärden bör ligga inom det angivna intervallet för alla bilder som tas. Annars är uppgifterna inte jämförbara.
    4. För analys av RBC-gråvärde, markera kanten på varje RBC med hjälp av ovalmarkeringsverktyget i ImageJ-programvaran. Bestäm gråvärdena för enskilda röda blodkroppar med kommandot Mät. Mät gråvärdena för minst 50 röda blodkroppar från testet och minst 10 röda blodkroppar från kontrollområdet.
      OBS: Det totala antalet analyserade RBC kan justeras individuellt. Ju fler röda blodkroppar som analyseras, desto mer meningsfullt blir resultatet. Det totala antalet analyserade RBC bör dock vara jämförbart för varje tillstånd, ämne etc. inom ett givet experiment.
      1. Undvik analys av röda blodkroppar nära fettpennan, eftersom färgning kan vara ofullständig i detta område. Undvik analys av överlappande röda blodkroppar, eftersom detta påverkar färgningsintensiteten. Använd endast RBC:er som är separerade från andra RBC:er. Analysera minst fem bilder från testet och minst två bilder från kontrollområdet för utvärdering av 50/10 RBC:er. Inkludera RBC: er från varje bild i den slutliga analysen.
    5. För att beräkna färgningsintensiteten, beräkna de slutliga signalerna som:
      (individuellt testområde RBC - genomsnittlig testområdesbakgrund) - (individuellt kontrollområde RBC - genomsnittlig kontrollområdesbakgrund)

Figure 2
Figur 2: Skildring av fixeringsprocessen och generering av blodutstryk. (Schema skapat med BioRender.com.) Utspädda blodprover fixeras kemiskt i paraformaldehyd, centrifugeras sedan och tvättas med fosfatbuffrad saltlösning. Slutligen smutsas återsuspenderat blod på en glasskiva och fixeras termiskt via svävning över en Bunsen-brännare. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tabell 1: Berednings- och förvaringsförhållanden för lösningar som är nödvändiga för immunhistokemisk färgning. Lösningen kan beredas före protokollet. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 2: Beskrivning av antikroppslösningar för omedelbar användning. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

Tabell 3: Komponenter och protokoll för beredning av DAB-lösning för omedelbar användning. Klicka här för att ladda ner denna tabell.

2. Fluorescerande märkning av RBC-proteiner

OBS: I följande avsnitt beskrivs en anpassning av det immunhistokemiska protokollet, utvecklat i syfte att möjliggöra användning av antikroppar med fluorescerande konjugat (figur 1).

Blodprovsberedningen för immunofluorescensprotokollet är identisk med den som beskrivs i avsnitt 1, så följande avsnitt börjar med färgning av prover.

  1. Immunofluorescens färgning
    1. Inkubera med den sekundära, fluorescerande konjugerade antikroppen (för volymen, se steg 1.4.2) i 30 minuter vid RT skyddad från ljus, med antingen en specialbyggd inkubationskammare eller aluminiumfolie.
    2. Häll av den sekundära antikroppslösningen och tvätta proverna 3x med TBS. Låt proverna tvättas så att de inte torkar ut.
    3. Häll av TBS och ta bort proverna från provstället ett i taget för att förhindra långvarig ljusexponering. För uttorkning av proverna, exponera objektglasen för olika etanollösningar för ~ 5 s vardera, med början med 70%, följt av 90% och slutligen 100%. Exponera objektglasen för xylol/xylenlösning i 5 sekunder.
    4. Förbered ett täckglas med två eller tre droppar monteringsmedium och montera sedan bilden med täckglaset. Säkerställ jämn fördelning av monteringsmediet genom att applicera lätt tryck med pincett eller ett liknande, sterilt metallinstrument. Eliminera luftbubblor, som annars kan störa avbildning, med samma instrument. Låt proverna torka över natten i ett mörkt och torrt utrymme.
  2. Mikroskopisk utvärdering
    1. För visualisering och avbildning, placera bilden på mikroskopsteget med en total förstoring på minst 400x. Slå på mikroskopljuskällan och lysrörskällan och se till att lysrörskällan justeras till maximal intensitet.
    2. Slå på den mikroskopanslutna kameran och starta programvaran för mikroskopkontroll. Använd ljusfältsmikroskopi för att bestämma lämplig fokus genom att vrida på de grova och fina fokusjusteringsknapparna och hitta fokusnivån där RBC är synliga.
      OBS: Överdriven exponering för ljus kan orsaka fotoblekning av de fluorescerande konjugaten. Man kan använda en bild från ett tidigare experiment för detta ändamål, för att minimera ljusexponeringen av de bilder som ännu inte analyserats.
    3. Bestäm optimal laserintensitet genom att inspektera röda blodkroppar i kontrollområdet. Se till att intensiteten är tillräckligt hög för att RBC: er är synliga, samtidigt som de inte producerar en stor bakgrundssignal. Se till att intensiteten och exponeringstiden är konsekvent mellan områden och prover för att säkerställa jämförbarhet.
    4. Ta ljusfält och fluorescerande bilder i minst tre distinkta områden av testområdet på bilden, slumpmässigt markerade. För att välja ett område, panorera bort från kanterna på bilden som är markerade med lipidpennan med hjälp av mikroskopstegskontrollerna. Välj ett område som uppvisar enhetlig fördelning av ett enskilt RBC-lager.
    5. Ställ in exponeringstiden till 1 s för fluorescerande bilder och ta en bild med hjälp av programvarukontrollerna i programvaran för mikroskopkontroll. Byt till ljusfältsläge, ställ in exponeringstiden på "Auto" och ta motsvarande ljusfältsbild.
    6. Ta ljusfält och fluorescerande bilder i minst två distinkta slumpmässigt utvalda områden i bildens kontrollområde genom att upprepa steg 2.2.3.
    7. Spara bilderna i .tif format för att bevara pixlarnas ursprungliga gråvärden, förhindra komprimering och överföra metadata för förvärvet.
    8. Mät gråvärdena för de avbildade röda blodkropparna. Öppna ImageJ (eller FIJI21; se kompletterande fil 1). Bestäm gråvärdena för enskilda RBC. Markera därför varje enskild cell med ovalmarkeringsverktyget och analysera med kommandot Mät.
      RBC bör inte analyseras om de överlappar andra celler, eftersom detta kan öka den resulterande signalen.
    9. Markera mellan tre och fem områden som är fria från röda blodkroppar och bestäm gråvärdena för att ge ett mått på bakgrundssignalen. Analysera minst 150 RBC:er från minst tre distinkta bilder för varje testområde och minst 50 RBC:er från minst två distinkta bilder för varje kontrollområde.
      OBS: Analys av fler celler / områden kan rekommenderas för att minimera variationen. Med tanke på att RBC-populationen till sin natur är heterogen kan cellcellvariabiliteten i signalen vara signifikant, beroende på proteinet av intresse.
    10. Utför alternativ dataanalys av tagna bilder med makrokommandot. Skapa/installera ett makrokommando via FIJI-versionen av ImageJ för automatisk markering, bakgrundskorrigering och gråvärdesanalys av en viss bild.
      OBS: Denna rutin använder automatiserad tröskel för att upptäcka cellerna som finns i en given bild med hjälp av en kopia av originalbilden, vilket ger ett överlägg som läggs på originalbilden för att extrahera gråvärden för fluorescerande RBC. Makrot deponeras som en .ijm-fil, som kompletterande kodningsfil 1.
    11. Öppna bildfilen i .tif format som är klart för analys i FIJI. Öppna makrot RBC fluorescence.ijm (kompletterande kodningsfil 1) och klicka på Kör.
      OBS: Makrot är inställt för bilder som tagits med 600x förstoring och ett stort signal-brusförhållande. Automatiskt urval av celler bör granskas av prövaren.
  3. Beräkna slutsignalerna som:
    (testområde RBC - testområdesbakgrund) - (kontrollområde RBC - kontrollområdesbakgrund) för manuell analys;
    (testområde - kontrollområde) för automatiserad analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Det presenterade protokollet, som beskriver metoder som underlättar detektion av akuta förändringar i RBC-proteiner, testades på en välkänd mekaniskt känslig proteinförändring: fosforylering av RBC-NOS vid serin 1177-resten. Helblod erhölls från friska frivilliga och delades därefter upp i två separata alikvoter. Ett givet blodprov utsattes för mekanisk skjuvspänning av fysiologisk storlek (5 Pa) i 300 s, vilket tidigare visat sig framkalla RBC-NOS-fosforylering vid serin 117714. Omedelbart efter att den mekaniska skjuvexponeringen upphört fixerades blodprovet i paraformaldehyd. Som kontroll exponerades ett blodprov, laddades in i klippanordningen och lämnades att vila i 300 s före fixering i paraformaldehyd. Signalen av antikroppar riktade mot RBC-NOS fosforylerad vid serin 1177-återstoden i vila och som svar på mekanisk kraftexponering bedömdes med användning av både immunhistokemi (figur 3A,B) och immunofluorescens (figur 3C,D). Saxade och icke-skjuvade prover producerade statistiskt signifikant olika signaler [Friedman-test: χ2 (3) = 18,71, p = 0,0003]. En jämförbar, ungefär trefaldig ökning av signalen av antikroppar riktade mot RBC-NOS fosforylerad vid serin 1177-återstoden detekterades som svar på mekanisk kraftexponering av röda blodkroppar, jämfört med respektive oskjuvade celler (båda p < 0,01) vid bedömning med antingen det immunhistokemiska eller immunofluorescensprotokollet (figur 3E).

Således indikerar jämförelse av de erhållna resultaten med båda metoderna utmärkt överensstämmelse mellan de presenterade protokollen, vilka också framgångsrikt och tillförlitligt detekterade ökad RBC-NOS-fosforylering som svar på mekanisk stimulering.

Figure 3
Figur 3: Representativa poolade data från immunohistokemisk (A,B) och immunofluorescerande (C,D) färgning av RBC-NOS serin 1177 fosforylering efter mekanisk skjuvning. Analys av signalintensiteten från dessa prover presenteras i (E), där vita staplar återspeglar data som erhållits med HRP-färgning och svarta staplar representerar data som erhållits med den fluorescerande metoden. Blod bereddes antingen i vila eller omedelbart efter exponering för mekanisk kraft (dvs. skjuvning). N = 7 blodprover erhölls från olika givare. Data visas som medelvärde ± medelfel av medelvärdet. **p < 0,01, bestämd med hjälp av ett icke-parametriskt Friedman-test. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande fil 1: Automatiserad semikvantitativ bildanalys råkod med steg-för-steg-anteckningar för bilder av immunofluorescerande röda blodkroppar. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande kodningsfil 1: Kompilerad kod kompatibel med FIJI/ImageJ-programvara för att köra automatiserad bildanalys av immunfluorescerande röda blodkroppar. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Ny litteratur tyder starkt på att RBC-NOS-proteinet är av avgörande betydelse för regleringen av RBC-deformerbarhet 15,22,23, vilket i sin tur underlättar deras passage genom smala kapillärer 24. Proteinaktiviteten beror i hög grad på posttranslationella proteinmodifieringar, särskilt fosforylering av vissa rester18. Fokus ligger på fosforyleringsstället 1177, som relaterar till aktiveringen av RBC-NOS-proteinet23. Förändringar av detta protein har visats i en mängd olika sjukdomar 25,26,27,28,29, så undersökning av dessa förändringar kan ge värdefull kunskap inte bara för förståelsen av vissa sjukdomar utan också för att utveckla och styra specifika terapier30.

Flera stimuli har identifierats för att öka RBC-NOS serin 1177 fosforylering22, men mekaniska krafter verkar vara en viktig extracellulär stimulans som orsakar aktivering eller modulering av RBC-NOS-proteinet 13,18,31,32. Moduleringar av RBC-NOS-aktivitet är dock ganska tillfälliga33; Således måste analys/bevarande av skjuvberoende förändringar utföras omedelbart. Immunhistokemiska och senare immunofluorescensprotokoll utvecklades för att underlätta bevarande och analys av akuta, regulatoriska modifieringar av RBC-NOS.

Resultaten som presenteras här, erhållna via immunohistokemiska och immunofluorescensprotokoll, visar en hög grad av överensstämmelse avseende ökad fosforylering av RBC-NOS serin 1177 efter skjuvexponering. Således är båda protokollen lämpliga för undersökning av övergående posttranslationella förändringar av RBC-proteiner, och respektive experimenter kan bestämma vilken metod de kan använda i respektive laboratorium, med tanke på lokalt tillgängliga resurser och infrastruktur. Med tanke på den stora kommersiella tillgängligheten av antikroppar riktade mot proteiner, både i deras ursprungliga tillstånd eller efter posttranslationella modifieringar, är de nuvarande analyserna anpassningsbara för ett stort antal mål. Således presenterar de användbara verktyg för att bedöma RBC-signalering14,27,34.

Vissa aspekter bör beaktas under förfarandet. De nämnda antikropparna är inte specifikt utvecklade för att appliceras i röda blodkroppar. Istället är dessa specifika NOS-antikroppar av endoteltyp (eNOS). Eftersom eNOS och RBC-NOS verkar dela stor homologi22,23 har eNOS-specifika antikroppar traditionellt använts för att visualisera RBC-NOS-aktivering. Det är viktigt att notera att antikroppar riktade mot de inducerbara (iNOS) eller neuronala (nNOS) isoformerna inte producerar signaler i RBC, vilket stöder att RBC-NOS delar signifikant strukturell likhet med eNOS22. Lämplig utspädning måste testas innan någon antikropp används i experimentet, eftersom leverantörens rekommenderade data inte kan tillämpas på RBC-experiment utan testning. Vidare kräver ett byte av distributionsföretag överdriven testning av olika utspädningar före användning. Vi rekommenderar att du följer ett mycket systemiskt tillvägagångssätt när du testar nyligen framställda antikroppar / kemikalier; Nya komponenter bör testas med dos-responsmetoder, där endast de specifika stegen för införande av den nya komponenten bör ändras. Positiva kontroller (dvs. stimulering av RBC-NOS-aktivering) bör tillhandahållas genom att jämföra skjuvat med oklippt blod, som presenteras här. Alternativt har farmakologisk stimulering av RBC-NOS-fosforylering med 350 pM insulin visat sig resultera i ökad RBC-NOS-fosforylering, liknande den som observerats med mekanisk kraftapplikation7.

Begränsningarna hos de presenterade detektionsmetoderna sträcker sig till vanliga begränsningar av metoder som förlitar sig på specificiteten hos kommersiellt erhållna primära antikroppar (t.ex. western blot). För det första måste en primär antikropp riktad mot antigenet av intresse finnas tillgänglig. Om den finns tillgänglig måste antikroppen vara specifik för målet, vilket kan bekräftas genom funktionella åtgärder (dvs. farmakologisk behandling med aktivatorer/hämmare) eller med användning av western blotting. Dessutom måste de data som produceras med de beskrivna metoderna tolkas noggrant. Det vill säga de presenterade metoderna är semikvantitativa, vilket ger information om förändringar i proteinmodifieringar i förhållande till lämpliga kontrollprover. Den semikvantitativa utvärderingen som presenteras här hänvisar alltid till aktiveringen av enzymet och bör inte förväxlas med enzymaktiviteten. Mätningar av enzymaktivitet kräver separata analyser, såsom arginin-citrullinanalysen som mäter omvandlingshastigheten (fmol/min) av [3 H] L-arginin till [3H] citrullin eller [14 C] L-arginin till [14C] citrullin 35,36. För att kontrollera om en ökad RBC-NOS-aktivering också åtföljs av högre NO-nivåer och/eller ökade RBC-deformerbarhetsvärden bör ytterligare analys av NO-koncentrationen till exempel utföras. Dessutom, för att utesluta RBC-NOS som en källa till NO, bör NOS-hämmare såsom L-NIO användas15.

Det kan sammanfattas att de metoder som presenteras här är väl utvecklade för att analysera förändringar i RBC-NOS-aktivering som svar på applicerade stimuli i förhållande till ostimulerade kontrollceller. Dessa metoder bidrar således till förståelsen av hur mekanisk stress påverkar funktionerna hos RBC-proteiner, som är kritiska för cellulär funktion, och i slutändan avgörande för adekvat perfusion av arbetsvävnad och gasutbyte.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alla författare har avslöjat att det inte finns några intressekonflikter.

Acknowledgments

LK erkänner stödet från ett stipendium från Australian Government Research Training Program.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate Sigma/Merck D5637 DAB
Ammoniumchloride  Merck /Millipore 101145 NH4Cl
Centrifuge 5427 R  Eppendorf 5409000010
Coverslips VWR 631-0147 
di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate  Merck /Millipore 106580 Na2HPO4. 2 H2O
Disposable transfer pipettes VWR 612-6803
Entellan Merck /Millipore 107961 rapid mounting medium for microscopy
Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) Hofmann 642
Glucose-Oxidase Sigma/Merck G2133
Grease pencil  Dako S 2002
Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase Sigma/Merck E-2886 HRP
Hydrochloric acid  Merck /Millipore 109057 HCl
Hydrogen peroxide, 30% Merck /Millipore 107203 H2O2
ImageJ Software Freeware
Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) RR Mechatronics Ektacytometer instrument used for shearing
Methanol Merck /Millipore 106009
Microscope slides VWR 630-1985
Nickel(II)-sulfate Hexahydrate  Sigma/Merck N4882 NiSO4.6H2O
Normal Goat serum Agilent/DAKO X0907 NGS
Paraformaldehyde Merck /Millipore 818715 PFA
Pipettes Eppendorf Reference 2 VWR 613-5836/ 613-5839
Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) Merck/Millipore 07-428-I Primary Antibody
Reaction tubes, 2ml Eppendorf 30120094
Secondary Antibody goat anti rabbit Agilent/DAKO E0432 Secondary Antibody
Skim milk powder Bio-Rad 170-6404
Sodium chloride  Merck /Millipore 106404 NaCl
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate Merck /Millipore 106346 NaH2PO4.H2O
Sodium hydroxide, 1 M Merck /Millipore 150706 NaOH
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Merck /Millipore 108382 Tris
Trypsin Sigma/Merck T7409
Tween20  Merck /Millipore 822184
Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F Merck /Millipore WHA1825047
Xylol VWR Chemicals 2,89,73,465
ß-D-Glucose monohydrate Merck /Millipore 14431-43-7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cohen, R. M., et al. Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c. Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).
  2. Mock, D. M., et al. Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities. Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).
  3. Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. How do red blood cells die? Frontiers in Physiology. 12, 655393 (2021).
  4. Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals. Frontiers in Physiology. 8, 1076 (2017).
  5. Pretini, V., et al. Red blood cells: chasing interactions. Frontiers in Physiology. 10, 945 (2019).
  6. Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
  7. Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).
  8. Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Active modulation of human erythrocyte mechanics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).
  9. Strader, M. B., et al. Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease. Scientific Reports. 10 (1), 14218 (2020).
  10. Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as "signatures" for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients. Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).
  11. Grau, M., et al. High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia. British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).
  12. Sae-Lee, W., et al. The protein organization of a red blood cell. Cell Reports. 40 (3), 111103 (2022).
  13. Suhr, F., et al. Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway. PLoS One. 7 (9), e45982 (2012).
  14. Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation. Frontiers in Physiology. 10, 36 (2019).
  15. Grau, M., et al. RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability. PLoS One. 8 (2), e56759 (2013).
  16. Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell. Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).
  17. Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effects of nitric oxide on red blood cell deformability. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).
  18. Suhr, F., et al. Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).
  19. Grau, M., et al. Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).
  20. Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment. Biology. 10 (1), 47 (2021).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects. Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).
  23. Kleinbongard, P., et al. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase. Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).
  24. McMahon, T. J. Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion. Frontiers in Physiology. 10, 1417 (2019).
  25. Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells. PLoS One. 10 (4), 0125206 (2015).
  26. Di Pietro, N., et al. Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients. Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).
  27. Grau, M., et al. Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).
  28. Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
  29. Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).
  30. Nader, E., et al. Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).
  31. Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes. The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).
  32. Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response. Life. 11 (1), 36 (2021).
  33. Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress. Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).
  34. Grau, M., et al. Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients. Scientific Reports. 9 (1), 11813 (2019).
  35. Methods in Nitric Oxide Research. Feelisch, M. , Wiley. Chichester. (1998).
  36. Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).

Tags

Biokemi utgåva 193 röda blodkroppar proteiner från röda blodkroppar mekanotransduktion immunhistokemi immunofluorescens kväveoxidsyntas
Immunfärgningsbaserad detektion av dynamiska förändringar i röda blodkroppsproteiner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Grau, M., Kuck, L.… More

Grau, M., Kuck, L. Immunostaining-Based Detection of Dynamic Alterations in Red Blood Cell Proteins. J. Vis. Exp. (193), e64843, doi:10.3791/64843 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter