Analisi della morfologia mitocondriale attraverso l'apprendimento supervisionato di simulazione

In questo articolo, dimostriamo l'utilità di uno strumento di apprendimento automatico basato sulla fisica per la segmentazione subcellulare¹ nelle immagini di microscopia a fluorescenza di cardiomioblasti fissi che esprimono marcatori mitocondriali fluorescenti.

I mitocondri sono i principali organelli che producono energia nelle cellule di mammifero. In particolare, i mitocondri sono organelli altamente dinamici e si trovano spesso in reti che cambiano costantemente in lunghezza e ramificazione. La forma dei mitocondri influisce sulla loro funzione e le cellule possono cambiare rapidamente la loro morfologia mitocondriale per adattarsi a un cambiamento nell'ambiente². Per comprendere questo fenomeno, la classificazione morfologica dei mitocondri come punti, bastoncelli o reti è altamente informativa³.

La segmentazione dei mitocondri è cruciale per l'analisi della morfologia mitocondriale nelle cellule. Gli attuali metodi per segmentare e analizzare le immagini al microscopio a fluorescenza dei mitocondri si basano sulla segmentazione manuale o su approcci convenzionali di elaborazione delle immagini. Gli approcci basati sulla soglia come Otsu⁴ sono meno accurati a causa degli elevati livelli di rumore nelle immagini al microscopio. Tipicamente, le immagini per l'analisi morfologica dei mitocondri presentano un gran numero di mitocondri, rendendo noiosa la segmentazione manuale. Gli approcci matematici come MorphoLibJ⁵ e gli approcci di apprendimento automatico semi-supervisionati come Weka⁶ sono molto esigenti e richiedono conoscenze specialistiche. Una revisione delle tecniche di analisi delle immagini per i mitocondri⁷ ha dimostrato che le tecniche basate sull'apprendimento profondo possono essere utili per il compito. In effetti, la segmentazione delle immagini nelle immagini della vita quotidiana per applicazioni come la guida autonoma è stata rivoluzionata con l'uso di modelli basati sul deep learning.

Il deep learning è un sottoinsieme dell'apprendimento automatico che fornisce algoritmi che apprendono da grandi quantità di dati. Gli algoritmi di deep learning supervisionati apprendono le relazioni da grandi insiemi di immagini annotate con le loro etichette di verità fondamentale (GT). Le sfide nell'utilizzo dell'apprendimento profondo supervisionato per segmentare i mitocondri nelle immagini al microscopio a fluorescenza sono duplici. In primo luogo, l'apprendimento approfondito supervisionato richiede un ampio set di dati di immagini di addestramento e, nel caso della microscopia a fluorescenza, fornire questo grande set di dati sarebbe un compito esteso rispetto a quando si utilizzano immagini tradizionali basate su telecamere più facilmente disponibili. In secondo luogo, le immagini di microscopia a fluorescenza richiedono annotazioni GT degli oggetti di interesse nelle immagini di addestramento, che è un compito noioso che richiede conoscenze specialistiche. Questo compito può facilmente richiedere ore o giorni del tempo dell'esperto per una singola immagine di cellule con strutture subcellulari etichettate in modo fluorescente. Inoltre, le variazioni tra gli annotatori rappresentano un problema. Per eliminare la necessità di annotazioni manuali e per poter sfruttare le prestazioni superiori delle tecniche di deep learning, è stato utilizzato un modello di segmentazione basato sul deep learning che è stato addestrato su immagini simulate. I simulatori basati sulla fisica forniscono un modo per imitare e controllare il processo di formazione delle immagini al microscopio, consentendo la creazione di immagini di forme note. Utilizzando un simulatore basato sulla fisica, è stato creato un ampio set di dati di immagini di microscopia a fluorescenza simulata dei mitocondri.

La simulazione inizia con la generazione della geometria utilizzando curve parametriche per la generazione di forme. Gli emettitori sono posizionati casualmente sulla superficie della forma in modo uniformemente distribuito in modo tale che la densità corrisponda ai valori sperimentali. Una funzione di diffusione del punto 3D (PSF) del microscopio viene calcolata utilizzando un'approssimazione computazionalmente efficiente⁸ del modello Gibson-Lanni⁹. Per abbinare fedelmente le immagini simulate con le immagini sperimentali, sia la corrente oscura che il rumore di ripresa vengono emulati per ottenere il realismo fotografico. Il GT fisico viene generato sotto forma di mappa binaria. Il codice per la generazione del dataset e il training del modello di simulazione è disponibile¹⁰ e il passaggio per la creazione di questo dataset simulato è descritto nella Figura 1.

Mostriamo l'utilità della segmentazione basata sul deep learning addestrata interamente su un set di dati simulato analizzando immagini al microscopio confocale di cardiomioblasti fissi. Questi cardiomioblasti esprimevano un marcatore fluorescente nella membrana esterna mitocondriale, consentendo la visualizzazione dei mitocondri nelle immagini di microscopia a fluorescenza. Prima di condurre l'esperimento fornito come esempio qui, le cellule sono state private del glucosio e adattate al galattosio per 7 giorni in coltura. La sostituzione del glucosio nei mezzi di crescita con galattosio costringe le cellule in coltura a diventare più ossidative e, quindi, dipendenti dai loro mitocondri per la produzione di energia^11,12. Inoltre, questo rende le cellule più sensibili al danno mitocondriale. I cambiamenti della morfologia mitocondriale possono essere indotti sperimentalmente aggiungendo un agente di disaccoppiamento mitocondriale come il cianuro di carbonile m-clorofenil idrazone (CCCP) al terreno di coltura cellulare¹³. La CCCP porta ad una perdita del potenziale di membrana mitocondriale (ΔΨm) e, quindi, provoca cambiamenti nei mitocondri da una morfologia più tubulare (simile a un bastoncello) a una più globulare (a punti)¹⁴. Inoltre, i mitocondri tendono a gonfiarsi durante il trattamento CCCP¹⁵. Mostriamo la distribuzione morfologica dei cambiamenti dei mitocondri quando i cardiomioblasti adattati al galattosio sono stati trattati con il disaccoppiatore mitocondriale CCCP. Le segmentazioni di deep learning dei mitocondri ci hanno permesso di classificarli come punti, bastoncelli o reti. Abbiamo quindi derivato metriche quantitative per valutare le lunghezze dei rami e l'abbondanza dei diversi fenotipi mitocondriali. Le fasi dell'analisi sono descritte nella Figura 2 e i dettagli della coltura cellulare, dell'imaging, della creazione di set di dati per la segmentazione basata sull'apprendimento profondo, nonché l'analisi quantitativa dei mitocondri, sono riportati di seguito.

NOTA: Le sezioni 1-4 possono essere omesse se si lavora con immagini al microscopio esistenti di mitocondri con condizioni sperimentali note.

1. Coltura cellulare

1. Coltivare le cellule H9c2 in DMEM senza glucosio integrato con 2 mM di L-glutammina, 1 mM di piruvato di sodio, 10 mM di galattosio, 10% FBS, 1% di streptomicina / penicillina e 1 μg / mL di puromicina. Lasciare che le cellule si adattino al galattosio per almeno 7 giorni in coltura prima degli esperimenti.
   NOTA: Le cellule H9c2 utilizzate qui sono state geneticamente modificate per esprimere mitocondri fluorescenti e hanno anche acquisito un gene di resistenza alla puromicina. L'aggiunta di questo antibiotico assicura la crescita delle cellule con il gene di resistenza e, quindi, i mitocondri fluorescenti.
2. Seminare le cellule H9c2 per l'esperimento quando la confluenza cellulare raggiunge circa l'80% (pallone di coltura T75, valutato mediante microscopia a campo chiaro). Preriscaldare il fluido e la tripsina a 37°C per almeno 15 minuti prima di procedere.
   NOTA: È possibile eseguire l'esperimento in parallelo con due o più diverse condizioni di coltura cellulare. La confluenza delle cellule H9c2 non deve essere superiore all'80% per prevenire la perdita di cellule mioblastiche. Al 100% di confluenza, le cellule formano miotubi e iniziano a differenziarsi.
3. Prepararsi per la semina delle cellule, operando in una cappa a flusso laminare sterile, posizionando un coprivetro # 1.5 per ogni condizione sperimentale in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti. Etichettare ogni condizione e i dettagli sperimentali sulla piastra a 12 pozzetti.
4. Spostare il pallone di coltura cellulare dall'incubatore al piano di lavoro nella cappa. Aspirare il fluido utilizzando un sistema di aspirazione o una pipetta elettronica, quindi lavare due volte con 5 ml di PBS (temperatura ambiente).
5. Spostare la tripsina preriscaldata sul piano di lavoro e aspirare il lavaggio finale PBS; quindi, aggiungere la tripsina preriscaldata per staccare le cellule (1 mL per un matraccio di coltura T75). Riporre il matraccio di coltura nell'incubatore per 2-3 minuti a 37°C.
6. Spostare il mezzo preriscaldato sul piano di lavoro verso la fine dell'incubazione. Verificare che le cellule si siano staccate utilizzando un microscopio a campo chiaro.
   1. Se tutte le celle non si sono staccate, applicare alcuni colpetti attenti ma fermi sul lato del pallone per staccare le celle rimanenti.
7. Riportare il pallone di coltura sul piano di lavoro. Aggiungere 4 mL di terreno di coltura cellulare al pallone di coltura utilizzando una pipetta elettronica per arrestare l'azione della tripsina. Quando si aggiunge terreno di coltura al pallone, utilizzare la pipetta per disperdere ripetutamente il terreno sulla superficie per staccare e raccogliere le cellule in una sospensione cellulare.
8. Pipettare la sospensione cellulare (5 ml) dal matraccio in una provetta da 15 ml.
9. Centrifugare le celle a 200 x g per 5 minuti. Aprire il tubo nella cappa, rimuovere il surnatante mediante aspirazione e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 5 ml di terreno di coltura cellulare.
10. Valutare il numero di celle analizzando un piccolo volume della sospensione cellulare in un contatore automatico delle celle. Si noti il numero di cellule vive per millilitro di terreno di coltura.
11. Spostare il volume desiderato (ad esempio, 150 μL per pozzetto) della sospensione cellulare, calcolata per una densità di semina di circa 2 x 10⁴ celle/cm², in una provetta da centrifuga pre-marcata da 15 ml. Aggiungere il terreno di coltura cellulare preriscaldato alla provetta da centrifuga da 15 mL ad un volume precalcolato in base al numero di pozzetti. Per piastre a 12 pozzetti, utilizzare un volume totale di 1 mL per ciascun pozzetto.
12. Assicurarsi che la sospensione della cella diluita sia correttamente miscelata pipettando il contenuto della provetta della centrifuga su e giù più volte prima di erogare il volume appropriato a ciascun pozzetto. Una volta erogata la sospensione cellulare nel pozzetto, agitare la piastra in modo attentamente controllato in ogni direzione per distribuire meglio le celle in tutti i pozzetti. Inserire la piastra a 12 pozzetti nell'incubatore a 37°C fino al giorno successivo.
13. Controllare le cellule con un microscopio a campo chiaro per valutare la crescita. Se le cellule hanno raggiunto una crescita sufficiente a circa l'80% di confluenza, procedere ai passaggi successivi; In caso contrario, ripetere la valutazione ogni giorno fino a raggiungere una crescita sufficiente.

2. Procedura sperimentale

1. Calcolare le quantità necessarie dei materiali per l'esperimento in base alle concentrazioni della soluzione madre. Scongelare i materiali congelati (30 mM di soluzione madre CCCP) a 37 °C e impostare il terreno di coltura cellulare per preriscaldare a 37 °C.
2. Una volta scongelata, creare una soluzione di lavoro di CCCP da 10 μM diluendo la soluzione madre (1:3.000) in terreno di coltura cellulare.
   NOTA: non pipettare volumi inferiori a 1 μL.
3. Iniziare i trattamenti sperimentali una volta che tutti i materiali necessari sono stati preparati e preriscaldati. Aspirare il terreno di coltura cellulare dai pozzetti della piastra a 12 pozzetti, quindi applicare rapidamente il mezzo fresco preriscaldato ai pozzetti di controllo e il mezzo preriscaldato con soluzione CCCP da 10 μM ai pozzetti delle condizioni di prova.
4. Incubare la piastra a 12 pozzetti nell'incubatore cellulare a 37°C per 2 ore. Durante il periodo di incubazione, preparare la soluzione di fissazione.
5. Per la preparazione della soluzione di fissazione, utilizzare paraformaldeide (PFA) prefabbricata al 4% per diluire la soluzione madre di glutaraldeide (GA) al 25% allo 0,2% (1:125). Preriscaldare la soluzione a 37°C. Per una piastra a 12 pozzetti, 500 μL sono sufficienti per pozzetto.
   ATTENZIONE: PFA e GA sono sostanze chimiche tossiche. Lavora in un cappuccio chimico con equipaggiamento protettivo. Vedere le rispettive SDS per i dettagli.
6. Al termine del periodo di incubazione, rimuovere la piastra a 12 pozzetti dall'incubatore e posizionarla sul piano di lavoro.
   NOTA: il lavoro non richiede più un ambiente sterile.
7. Aspirare il terreno di coltura cellulare dai pozzetti e applicare la soluzione di fissazione preriscaldata. Riportare la piastra a 12 pozzetti nell'incubatore a 37°C per 20 minuti.
8. Aspirare la soluzione di fissazione al termine dell'incubazione e lavare ogni pozzetto due volte con PBS a temperatura ambiente. È possibile mettere in pausa l'esperimento in questa fase del protocollo e continuare in seguito.
   1. Se l'esperimento è in pausa, aggiungere 1 mL di PBS per pozzetto, sigillare la piastra a 12 pozzetti con pellicola di plastica (parafilm) e conservare a 4°C.

3. Colorazione e montaggio delle celle sui vetrini

1. Scongelare il materiale DAPI (macchia nucleare) e centrifugare in una mini centrifuga prima dell'apertura. Preparare la soluzione di colorazione DAPI diluendo il brodo DAPI in PBS (1:1.000).
2. Aspirare il PBS dalla piastra a 12 pozzetti e applicare 1 mL di soluzione colorante DAPI a ciascun pozzetto. Incubare al buio a temperatura ambiente per 5 min.
3. Aspirare la soluzione colorante DAPI. Lavare due volte con 2 ml di PBS per pozzetto.
4. Preparare vetrini da microscopio in vetro smerigliato (vetrini) lavandoli in etanolo al 70%, seguiti da tre lavaggi in PBS. Asciugare accuratamente i vetrini con tovaglioli di carta privi di lanugine e dirigerli verso la luce per verificare la presenza di segni di polvere o grasso.
   NOTA: I guanti sono necessari per questo passaggio.
5. Etichetta i vetrini con i dettagli sperimentali. Trasferire il mezzo di montaggio in un tubo di microcentrifuga e ruotare verso il basso in una mini centrifuga.
6. Preparatevi al montaggio delle copertine organizzando lo spazio di lavoro. Tenere a portata di mano una piastra a 12 pozzetti con vetrini di copertura, vetrini etichettati, supporto di montaggio, una pipetta, punte per pipette da 10 μL, tovaglioli di carta privi di lanugine e pinzette.
7. Applicare 10 μL di mezzo di montaggio (ProLong Glass) su un vetrino preparato per montare un vetrino.
8. Raccogliere il coprislip dalla piastra a 12 pozzetti usando una pinzetta e tamponare l'umidità dal coprislip toccando brevemente il bordo e il retro del coprislip sul tovagliolo di carta privo di lanugine preparato. Abbassare delicatamente il coperchio sulla goccia del supporto di montaggio.
9. Ripetere i due passaggi precedenti per ogni copertina. Posizionare le goccioline del mezzo di montaggio per consentire da uno a quattro vetrini per vetrino.
10. Assicurarsi che i vetrini siano su una superficie piana per evitare che i vetrini montati si muovono. Posizionare i vetrini in un luogo buio a temperatura ambiente durante la notte per consentire al supporto di montaggio di fissarsi. I campioni sono ora pronti per l'imaging. L'esperimento può essere messo in pausa in questa fase del protocollo e continuato in seguito.
11. Se l'esperimento viene messo in pausa in questa fase, dopo aver lasciato che i campioni si posino per una notte a temperatura ambiente, coprirli con un foglio di alluminio per proteggerli dalla luce e conservarli a 4°C.

4. Microscopia e imaging

1. Coprire i campioni in un foglio di alluminio per il trasporto (se non già fatto).
2. All'arrivo presso l'impianto di microscopia, utilizzare H₂O a doppia distillazione con carta da filtro per microscopio per pulire i residui di PBS dai vetrini di copertura. Controllare che non ci siano macchie sui vetrini tenendo i vetrini verso una luce intensa.
3. Passare attraverso la procedura di avvio per il microscopio. Selezionare l'obiettivo appropriato (Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil M27) e aggiungere il mezzo di immersione.
4. Posizionare il campione nel portacampioni. All'interno del software del microscopio, utilizzare la scheda "Localizza" per attivare l'illuminazione a fluorescenza EGFP e, utilizzando gli oculari, regolare manualmente il livello z per mettere a fuoco il campione. Spegnere l'illuminazione a fluorescenza quando si trova la messa a fuoco.
5. Passare alla scheda "Acquisisci" all'interno del software del microscopio. Utilizzare "Smart Setup" per selezionare i canali di fluorescenza da utilizzare per l'imaging. Per questo esperimento, sono stati selezionati i preset di canale EGFP e DAPI.
6. Regola l'intensità di ciascun canale dalle impostazioni iniziali utilizzando l'istogramma dell'intensità come guida per ottimizzare la potenza del segnale. L'imaging può ora iniziare.
7. Per l'imaging, utilizzare l'opzione del software per posizionare le posizioni di imaging in un array e centrare l'array al centro della copertina con 12 posizioni totali da visualizzare. Verificare che ogni posizione nella matrice contenga celle. Se non sono presenti celle, regolare la posizione in un'area con celle.
8. Regolare la messa a fuoco di ogni posizione nell'array utilizzando l'autofocus del software del microscopio e seguire questo con una regolazione fine manuale per garantire che il maggior numero possibile di mitocondri sia a fuoco.
   NOTA: il canale EGFP viene utilizzato per queste regolazioni manuali.
9. Ottenere le immagini utilizzando questo metodo per ogni copertina. Salvare i file di immagine e procedere con i passaggi per l'analisi morfologica.

5. Generazione di dati di addestramento simulati

1. Scarica il codice¹⁰ e decomprimi il contenuto. Seguire le istruzioni riportate in README.md per configurare l'ambiente richiesto.
2. Passare alla cartella denominata "src", che è la home directory per questo progetto. Le cartelle numerate all'interno contengono codici specifici per i diversi passaggi dell'utilizzo dello strumento.
   Nota : utilizzare il comando "cd <>" per passare a qualsiasi sottocartella del codice. Per eseguire qualsiasi file python, utilizzare il comando "python <>.py". La presentazione denominata "Tutorial.pptx" contiene un set completo di istruzioni per l'utilizzo del modello di segmentazione.
3. Fai una copia o usa la cartella "2. Mitochondria Simulation Airy", e rinominarlo (Airy è usato qui in quanto è la funzione PSF più vicina a un microscopio confocale, che è stato usato come microscopio attuale). Vai nella cartella denominata "simulatore".
   NOTA: questa cartella contiene tutti i file relativi alla simulazione dei dati di addestramento. Ci sono tre serie di parametri da impostare per la simulazione.
4. Innanzitutto, per il simulatore nel file di configurazione batch "simulator/batch/bxx.csv", impostare i parametri per circa il campione, incluso il numero di mitocondri, la gamma di diametri e lunghezze delle strutture, l'intervallo dell'asse z che la struttura mostra e la densità dei fluorofori.
5. Quindi, impostare i parametri relativi al sistema ottico.
   1. Questo set include il tipo di microscopio (che determina quale modello di PSF è selezionato), l'apertura numerica (N.A.), l'ingrandimento (M), la dimensione dei pixel (in μm), la lunghezza d'onda di emissione dei fluorofori e il parametro del rumore di fondo, ecc.
   2. Impostare i parametri ottici di N.A., l'ingrandimento e la lunghezza d'onda minima del dataset nel file "simulator/microscPSFmod.py".
   3. Impostare il valore desiderato per la dimensione dei pixel e impostare la lunghezza d'onda di emissione del set di dati come parametro per la funzione "process_matrix_all_z" nel file "simulatore/generate_batch_parallel.py".
   4. Impostare gli ultimi tre parametri della funzione "save_physics_gt" nel file "simulatore/generate_batch_parallel.py". I parametri sono la dimensione dei pixel (in nm), la dimensione dell'immagine di output e max_xy.
6. Impostare il terzo set di parametri relativi al set di dati di output, ad esempio la dimensione delle immagini di output, il numero di riquadri in ogni immagine e il numero di immagini totali, nel file "simulatore/generate_batch_parallel.py".
7. Eseguire il file "simulatore/generate_batch_parallel.py" per avviare la simulazione.
8. Per ottenere l'immagine finale, creare una copia della cartella denominata "5. Data Preparation and Training/data preparation" nella home directory, e navigare al suo interno.
   NOTA: ogni immagine del set di dati sintetico è formata creando un montaggio di quattro immagini simulate di 128 pixel x 128 pixel, che fornisce una dimensione finale dell'immagine di 256 pixel x 256 pixel. Questo genera prima molte tessere singole (circa 12.000) sia per le immagini del microscopio (nella cartella "output") che per le segmentazioni della verità di base (nella cartella "output/physics_gt").
   1. Impostare i parametri del numero di lotto, il numero di immagini per batch e l'intervallo di rumore in "data_generator.py".
   2. Eseguire il file "data_generator.py" per creare le immagini di montaggio.
   3. Copiare le cartelle denominate "image" e "segment" in "5. Data Preparation and Training/datatrain/train" dalla cartella "5. Preparazione e formazione dei dati/preparazione dei dati/dati".

6. Segmentazione basata sul deep learning

1. Eseguire il training del modello di segmentazione sulle immagini simulate come segue:
   1. Per addestrare il modello di segmentazione per un nuovo microscopio, passare al "5. Data Preparation and Training/train" e impostare i parametri della dimensione del batch, il modello backbone per la segmentazione, il numero di epoche e il tasso di apprendimento per l'addestramento nel file "train_UNet.py".
   2. Esegui "train_UNet.py" per iniziare l'allenamento. Il processo di addestramento visualizza la metrica per le prestazioni della segmentazione sul set di convalida simulato.
      NOTA: al termine dell'addestramento, il modello viene salvato come "best_model.h5" nella sezione "5. Preparazione dati e formazione/formazione".
2. Testare il modello su immagini di microscopio reali suddivise in una dimensione desiderabile per il modello addestrato attraverso i seguenti passaggi.
   1. Passare a "6. Prepare Test Data" e copiare il file ". png" dei dati nella cartella "png".
   2. Eseguite il file "split_1024_256.py" per suddividere le immagini in una dimensione desiderabile per il modello sottoposto a training. Questo crea ritagli di dimensioni 256 pixel x 256 pixel delle immagini nella cartella "dati".
   3. Copiare la cartella "data" creata nella cartella "7. Test Segmentation".
   4. Passare alla cartella "7. Test Segmentation" e impostare il nome del modello salvato da utilizzare.
   5. Per segmentare le colture, eseguire il file "segment.py". Le immagini segmentate vengono salvate nella cartella "output".

7. Analisi morfologica: Analisi della morfologia mitocondriale dei due gruppi di dati, "Glucosio" e "CCCP"

1. Disporre i dati da analizzare (una cartella per ogni immagine, con ogni cartella contenente i ritagli di output segmentati di un'immagine).
2. Scaricare e inserire il file supplementare denominato "make_montage.py" nella cartella denominata "7. Segmentazione dei test".
3. Eseguite il file "make_montage.py" per ricucire l'output segmentato alle dimensioni originali dell'immagine.
4. Creare una nuova cartella denominata "9. Analisi morfologica" all'interno della cartella "src".
5. Installare i pacchetti Skan¹⁶ e Seaborn Python nell'ambiente usando il comando "pip install seaborn[stats] skan".
   NOTA: le maschere di segmentazione sono scheletrate utilizzando la libreria denominata Skan per consentire l'analisi della topologia di ogni singolo mitocondrio.
6. Inserire il file supplementare " analyze_mitochondria.py " nella cartella "9. Analisi morfologica".
7. Disporre le immagini di diversi gruppi dell'esperimento in diverse cartelle all'interno della cartella "7. Segmentazione dei test".
8. Imposta i parametri di "dimensione pixel" e "percorso di input" nel file "analyze_mitochondria.py".
9. Eseguire il file " analyze_mitochondria.py" per eseguire il codice per eseguire l'ossatura e creare grafici dell'analisi.

I risultati delle segmentazioni di deep learning dei mitocondri in immagini confocali di cardiomioblasti fissi che esprimono marcatori mitocondriali fluorescenti mostrano l'utilità di questo metodo. Questo metodo è compatibile con altri tipi di cellule e sistemi di microscopia, che richiedono solo la riqualificazione.

I cardiomioblasti H9c2 adattati al galattosio con mitocondri fluorescenti sono stati trattati con o senza CCCP per 2 ore. Le cellule sono state quindi fissate, colorate con un colorante nucleare e montate su vetrini per l'analisi al microscopio a fluorescenza. Un microscopio confocale è stato utilizzato per acquisire immagini sia delle cellule di controllo che di quelle trattate con CCCP. Abbiamo eseguito la nostra analisi su 12 immagini confocali, con circa 60 cellule per condizione. Lo stato morfologico dei mitocondri in ciascuna immagine è stato quindi determinato e quantificato. Le maschere di segmentazione ottenute dal modello addestrato sono state scheletrate per consentire l'analisi della topologia di ogni singolo mitocondrio per questo esperimento. La lunghezza del ramo dei singoli mitocondri è stata utilizzata come parametro per la classificazione. I singoli mitocondri sono stati classificati in classi morfologiche dalla seguente regola. In particolare, qualsiasi scheletro mitocondriale con una lunghezza inferiore a 1.500 nm è stato considerato un punto, e i mitocondri più lunghi sono stati ulteriormente classificati in rete o bastoncello. Se c'era almeno un incrocio in cui due o più rami si intersecavano, questo era definito come una rete; Altrimenti, il mitocondrio è stato classificato come un'asta. Un'immagine di esempio con gli scheletri mitocondriali etichettati con le classi morfologiche è mostrata nella Figura 3.

La categorizzazione della morfologia mitocondriale nella Figura 4A mostra che è possibile rilevare cambiamenti significativi quando il CCCP viene applicato per 2 ore; ciò è dimostrato più chiaramente dall'aumento dei punti per le cellule trattate con CCCP.

La lunghezza media dei rami nella Figura 4B è un'altra via per illustrare cambiamenti rilevabili e significativi nella morfologia. Sia i bastoncelli che le reti erano, come previsto, significativamente ridotti rispetto al controllo quando le cellule sono state trattate con CCCP. Ci si aspettava anche un aumento significativo delle lunghezze medie dei rami dei punti, dato il gonfiore che i mitocondri subiscono quando esposti al CCCP.

Figura 1: Pipeline per la simulazione di immagini al microscopio a fluorescenza. La pipeline include (i) generazione di geometria 3D, (ii) emettitori ed emulazione fotocinetica, (iii) convoluzione PSF 3D, (iv) aggiunta di rumore e (v) binarizzazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Fasi dell'analisi della morfologia mitocondriale basata sull'apprendimento automatico . (1) Le immagini da segmentare vengono prima ritagliate in dimensioni accettabili per il modello di segmentazione. (2) La segmentazione basata sul deep learning viene applicata ai ritagli di immagini. (3) Le colture segmentate in uscita sono ricucite alla loro dimensione originale. (4) Le segmentazioni montate sono scheletrizzate. (6) L'analisi morfologica è condotta sulla base della topologia delle scheletrature. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Scheletro mitocondriale sovrapposto all'output di segmentazione delle immagini di microscopia. (A) L'output della segmentazione. (B) Lo scheletro rettilineo (distanza euclidea tra i punti iniziale e finale di un ramo) è sovrapposto all'output della segmentazione. La codifica a colori dello scheletro raffigura la classe dei mitocondri. Le reti sono rosse, le aste sono verdi e i punti sono di colore viola. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Analisi della morfologia mitocondriale. (A) Una panoramica della percentuale relativa delle diverse categorie morfologiche basata sulla lunghezza mitocondriale totale. (B) Confronto della lunghezza media del ramo mitocondriale tra le condizioni sperimentali e tra le categorie morfologiche. L'asse x visualizza le categorizzazioni morfologiche e l'asse y visualizza la lunghezza media dei rami dei mitocondri in nanometri (nm). La significatività statistica sotto forma di valori p è indicata come * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 e **** p < 0,0001. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Caso di fallimento della segmentazione. Un'alta densità di mitocondri è uno scenario impegnativo per il modello di segmentazione. Lo scheletro colorato mostra i mitocondri singoli più lunghi rilevati nell'immagine. Passando attraverso le misurazioni della lunghezza, questi scenari possono essere rilevati e lavorati per migliorare i risultati della segmentazione utilizzando l'erode dell'operatore morfologico (riduce lo scheletro rilevato). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Gli autori dichiarano che non ci sono conflitti di interesse relativi a questo articolo.