Summary
Denne artikel forklarer, hvordan man bruger simulationsovervåget maskinlæring til analyse af mitokondriermorfologi i fluorescensmikroskopibilleder af faste celler.
Abstract
Den kvantitative analyse af subcellulære organeller såsom mitokondrier i cellefluorescensmikroskopibilleder er en krævende opgave på grund af de iboende udfordringer i segmenteringen af disse små og morfologisk forskellige strukturer. I denne artikel demonstrerer vi brugen af en maskinlæringsstøttet segmenterings- og analysepipeline til kvantificering af mitokondriemorfologi i fluorescensmikroskopibilleder af faste celler. Det deep learning-baserede segmenteringsværktøj er trænet på simulerede billeder og eliminerer kravet om grundlæggende sandhedsannoteringer til overvåget dyb læring. Vi demonstrerer brugen af dette værktøj på fluorescensmikroskopibilleder af faste kardiomyoblaster med et stabilt udtryk for fluorescerende mitokondriemarkører og anvender specifikke cellekulturbetingelser til at inducere ændringer i mitokondriemorfologien.
Introduction
I dette papir demonstrerer vi nytten af et fysikbaseret maskinlæringsværktøj til subcellulær segmentering1 i fluorescensmikroskopibilleder af faste kardiomyoblaster, der udtrykker fluorescerende mitokondriermarkører.
Mitokondrier er de vigtigste energiproducerende organeller i pattedyrceller. Specifikt er mitokondrier meget dynamiske organeller og findes ofte i netværk, der konstant ændrer sig i længde og forgrening. Mitokondriernes form påvirker deres funktion, og celler kan hurtigt ændre deres mitokondriemorfologi for at tilpasse sig en ændring i miljøet2. For at forstå dette fænomen er den morfologiske klassificering af mitokondrier som prikker, stænger eller netværk meget informativ3.
Segmenteringen af mitokondrier er afgørende for analysen af mitokondrie morfologi i celler. Nuværende metoder til at segmentere og analysere fluorescensmikroskopibilleder af mitokondrier er afhængige af manuel segmentering eller konventionelle billedbehandlingsmetoder. Tærskelbaserede tilgange som Otsu4 er mindre nøjagtige på grund af de høje støjniveauer i mikroskopibilleder. Typisk har billeder til morfologisk analyse af mitokondrier et stort antal mitokondrier, hvilket gør manuel segmentering kedelig. Matematiske tilgange som MorphoLibJ5 og semi-overvågede maskinlæringsmetoder som Weka6 er meget krævende og kræver ekspertviden. En gennemgang af billedanalyseteknikkerne for mitokondrier7 viste, at deep learning-baserede teknikker kan være nyttige til opgaven. Faktisk er billedsegmentering i hverdagsbilleder til applikationer som selvkørende blevet revolutioneret med brugen af deep learning-baserede modeller.
Dyb læring er en delmængde af maskinlæring, der giver algoritmer, der lærer af store mængder data. Overvågede deep learning-algoritmer lærer relationer fra store sæt billeder, der er kommenteret med deres GT-etiketter (ground truth). Udfordringerne ved at bruge overvåget dyb læring til segmentering af mitokondrier i fluorescensmikroskopibilleder er todelt. For det første kræver overvåget dyb læring et stort datasæt af træningsbilleder, og i tilfælde af fluorescensmikroskopi ville det være en omfattende opgave at levere dette store datasæt sammenlignet med ved brug af lettere tilgængelige traditionelle kamerabaserede billeder. For det andet kræver fluorescensmikroskopibilleder GT-annoteringer af objekterne af interesse for træningsbillederne, hvilket er en kedelig opgave, der kræver ekspertviden. Denne opgave kan nemt tage timer eller dage af ekspertens tid til et enkelt billede af celler med fluorescerende mærkede subcellulære strukturer. Desuden udgør variationer mellem annotatorer et problem. For at fjerne behovet for manuel annotation og for at kunne udnytte den overlegne ydeevne af dyb læringsteknikker blev der brugt en dyb læringsbaseret segmenteringsmodel her, der blev trænet på simulerede billeder. Fysikbaserede simulatorer giver mulighed for at efterligne og kontrollere processen med billeddannelse i et mikroskop, hvilket gør det muligt at skabe billeder af kendte former. Ved hjælp af en fysikbaseret simulator blev der oprettet et stort datasæt af simulerede fluorescensmikroskopibilleder af mitokondrier til dette formål.
Simuleringen starter med geometrigenereringen ved hjælp af parametriske kurver til formgenerering. Emittere placeres tilfældigt på formens overflade på en ensartet fordelt måde, således at densiteten svarer til de eksperimentelle værdier. En 3D-punktspredningsfunktion (PSF) af mikroskopet beregnes ved hjælp af en beregningseffektiv tilnærmelse8 af Gibson-Lanni-modellen9. For nøje at matche de simulerede billeder med eksperimentelle billeder emuleres både den mørke strøm og skudstøjen for at opnå fotorealisme. Den fysiske GT genereres i form af et binært kort. Koden til generering af datasættet og træning af simuleringsmodellen er tilgængelig10, og trinnet til oprettelse af dette simulerede datasæt er beskrevet i figur 1.
Vi viser nytten af dyb læringsbaseret segmentering, der udelukkende er trænet på et simuleret datasæt ved at analysere konfokale mikroskopibilleder af faste kardiomyoblaster. Disse kardiomyoblaster udtrykte en fluorescerende markør i mitokondriernes ydre membran, hvilket muliggør visualisering af mitokondrierne i fluorescensmikroskopibillederne. Før forsøget blev udført som et eksempel her, blev cellerne frataget glukose og tilpasset galactose i 7 dage i kultur. Udskiftning af glukose i vækstmediet med galactose tvinger cellerne i kultur til at blive mere oxidative og dermed afhængige af deres mitokondrier til energiproduktion11,12. Desuden gør dette cellerne mere følsomme over for mitokondrieskader. Mitokondriemorfologiændringer kan eksperimentelt induceres ved at tilføje et mitokondrieafkoblingsmiddel, såsom carbonylcyanid m-chlorphenylhydrazon (CCCP) til cellekulturmediet13. CCCP fører til tab af mitokondriemembranpotentiale (ΔΨm) og resulterer således i ændringer i mitokondrierne fra en mere rørformet (stanglignende) til en mere kugleformet (priklignende) morfologi14. Derudover har mitokondrier tendens til at svulme under CCCP-behandling15. Vi viser den morfologiske fordeling af mitokondrierændringer, når de galactose-tilpassede kardiomyoblaster blev behandlet med mitokondrieafkoblingen CCCP. Mitokondriernes dybe læringssegmenteringer gjorde det muligt for os at klassificere dem som prikker, stænger eller netværk. Vi afledte derefter kvantitative målinger for at vurdere grenlængderne og overfloden af de forskellige mitokondriefænotyper. Analysens trin er skitseret i figur 2, og detaljerne i cellekulturen, billeddannelsen, oprettelsen af datasæt til dyb læringsbaseret segmentering samt den kvantitative analyse af mitokondrierne er angivet nedenfor.
Protocol
BEMÆRK: Afsnit 1-4 kan udelades, hvis der arbejdes med eksisterende mikroskopibilleder af mitokondrier med kendte eksperimentelle forhold.
1. Cellekultur
- Dyrk H9c2-cellerne i DMEM uden glukose suppleret med 2 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 10 mM galactose, 10% FBS, 1% streptomycin/penicillin og 1 μg/ml puromycin. Lad cellerne tilpasse sig galactose i mindst 7 dage i kultur før forsøgene.
BEMÆRK: H9c2-cellerne, der anvendes her, er blevet genetisk modificeret til at udtrykke fluorescerende mitokondrier og har også erhvervet et puromycinresistensgen. Tilsætningen af dette antibiotikum sikrer væksten af celler med resistensgenet og dermed fluorescerende mitokondrier. - H9c2-cellerne sås til forsøget, når cellesammenløbet når ca. 80% (T75-kulturkolbe, vurderet ved brightfieldmikroskopi). Forvarm mediet og trypsin til 37 °C i mindst 15 minutter, før du fortsætter.
BEMÆRK: Det er muligt at udføre eksperimentet parallelt med to eller flere forskellige cellekulturbetingelser. H9c2-cellesammenløbet bør ikke være over 80% for at forhindre tab af myoblastiske celler. Ved 100% sammenløb danner cellerne myorør og begynder at differentiere. - Forbered dig på såning af cellerne, der fungerer i en steril laminær strømningshætte, ved at placere en # 1.5 glasdæksel for hver eksperimentel tilstand i en brønd på en 12-brøndsplade. Mærk hver betingelse og de eksperimentelle detaljer på 12-brøndspladen.
- Flyt cellekulturkolben fra inkubatoren til arbejdsfladen i emhætten. Medium aspireres ved hjælp af et aspirationssystem eller elektronisk pipette, og vaskes derefter to gange med 5 ml PBS (stuetemperatur).
- Flyt den forvarmede trypsin til arbejdsfladen, og opånd den endelige PBS-vask; Tilsæt derefter den forvarmede trypsin for at løsne cellerne (1 ml til en T75-kulturkolbe). Læg kulturkolben tilbage i inkubatoren i 2-3 minutter ved 37 °C.
- Flyt det forvarmede medium til arbejdsfladen mod slutningen af inkubationen. Kontroller, at cellerne har løsnet sig ved hjælp af et brightfield-mikroskop.
- Hvis alle cellerne ikke har løsnet sig, påføres flere forsigtige, men faste vandhaner på siden af kolben for at løsne de resterende celler.
- Sæt kulturkolben tilbage på arbejdsfladen. Tilsæt 4 ml cellekulturmedium til dyrkningskolben ved hjælp af en elektronisk pipette for at stoppe trypsinvirkningen. Når du tilføjer dyrkningsmedium til kolben, skal du bruge pipetten til gentagne gange at sprede mediet over overfladen for at løsne og samle cellerne i en cellesuspension.
- Cellesuspensionen (5 ml) fra kolben ledes til et 15 ml rør.
- Centrifuger cellerne ved 200 x g i 5 min. Åbn røret i emhætten, fjern supernatanten ved aspiration, og suspender cellepelleten forsigtigt i 5 ml cellekulturmedier.
- Vurder antallet af celler ved at analysere et lille volumen af cellesuspensionen i en automatiseret celletæller. Bemærk antallet af levende celler pr. milliliter kulturmedier.
- Det ønskede volumen (f.eks. 150 μL pr. brønd) af cellesuspensionen, beregnet for en såtæthed på ca. 2 x 104 celler/cm2, flyttes til et præmærket 15 ml centrifugerør. Tilsæt det forvarmede cellekulturmedium til 15 ml centrifugerøret ved et forudberegnet volumen baseret på antallet af brønde. For 12-brøndplader skal du bruge et samlet volumen på 1 ml for hver brønd.
- Sørg for, at den fortyndede cellesuspension blandes korrekt ved at pipettere indholdet af centrifugerøret op og ned flere gange, før det passende volumen dispenseres til hvert hul. Når cellesuspensionen er dispenseret i brønden, skal du ryste pladen på en omhyggeligt kontrolleret måde i hver retning for bedre at fordele cellerne gennem brøndene. Plade med 12 brønde anbringes i inkubatoren ved 37 °C indtil næste dag.
- Kontroller cellerne med et brightfieldmikroskop for at evaluere væksten. Hvis cellerne har opnået tilstrækkelig vækst til ca. 80% sammenløb, fortsæt til de næste trin; Ellers gentages evalueringen dagligt, indtil tilstrækkelig vækst er nået.
2. Eksperimentel procedure
- Beregn de nødvendige mængder af materialerne til eksperimentet i henhold til stamopløsningskoncentrationerne. De frosne materialer optøs (30 mM CCCP-stamopløsning) ved 37 °C, og cellekulturmediet forvarmes ved 37 °C.
- Når den er optøet, oprettes en arbejdsløsning på 10 μM CCCP ved at fortynde stamopløsningen (1:3.000) i cellekulturmediet.
BEMÆRK: Der må ikke pipetteres volumener mindre end 1 μL. - Start de eksperimentelle behandlinger, når alle de nødvendige materialer er forberedt og forvarmet. Cellekulturmediet aspireres fra brøndene i 12-brøndspladen, og påfør derefter hurtigt det friske forvarmede medium på kontrolhullerne og det forvarmede medium med 10 μM CCCP-opløsning på testtilstandsbrøndene.
- Inkuber 12-brøndspladen i 37 ° C celleinkubatoren i 2 timer. I inkubationsperioden skal du forberede fikseringsopløsningen.
- Til fremstilling af fikseringsopløsningen anvendes præfabrikeret 4% paraformaldehyd (PFA) til at fortynde 25% glutaraldehyd (GA) stamopløsning til 0,2% (1:125). Opløsningen forvarmes ved 37 °C. For en 12-brøndsplade er 500 μL tilstrækkelig pr. Brønd.
FORSIGTIG: PFA og GA er giftige kemikalier. Arbejd i en kemisk hætte med beskyttelsesudstyr. Se deres respektive SDS for detaljer. - Når inkubationsperioden er afsluttet, skal du fjerne 12-brøndpladen fra inkubatoren og placere den på arbejdsfladen.
BEMÆRK: Arbejdet kræver ikke længere et sterilt miljø. - Aspirer cellekulturmediet fra brøndene, og påfør den forvarmede fikseringsopløsning. Sæt 12-brøndspladen tilbage til 37 °C inkubatoren i 20 minutter.
- Insurgér fikseringsopløsningen, når inkubationen er afsluttet, og vask hver brønd to gange med stuetemperatur PBS. Det er muligt at sætte eksperimentet på pause på dette stadium af protokollen og fortsætte senere.
- Hvis eksperimentet sættes på pause, tilsættes 1 ml PBS pr. brønd, pladen med 12 brønde forsegles med plastfilm (parafilm) og opbevares ved 4 °C.
3. Farvning og montering af cellerne på dækslerne
- Tø DAPI (nuklear plet) lager, og drej ned i en minicentrifuge inden åbning. Der fremstilles DAPI-farvningsopløsning ved fortynding af DAPI-stammateriale i PBS (1:1.000).
- Pbs aspireres fra 12-brøndspladen, og påfør 1 ml DAPI-farvningsopløsning på hver brønd. Inkuber i mørke ved stuetemperatur i 5 min.
- Aspirer DAPI-farvningsopløsningen. Vask to gange med 2 ml PBS pr. Brønd.
- Forbered frostede glasmikroskopglas (glasglasbilleder) ved at vaske dem i 70% ethanol efterfulgt af tre vaske i PBS. Tør forsigtigt rutsjebanerne af med fnugfri køkkenrulle, og ret dem mod lyset for at kontrollere, om der er tegn på støv eller fedt.
BEMÆRK: Der kræves handsker til dette trin. - Mærk glasbillederne med de eksperimentelle detaljer. Overfør monteringsmediet til et mikrocentrifugerør, og drej ned i en minicentrifuge.
- Forbered dig på montering af dækslikkerne ved at arrangere arbejdsområdet. Hold en 12-brønds plade med dæksler, mærkede glasrutschebaner, monteringsmedium, en pipette, 10 μL pipettespidser, fnugfri papirhåndklæder og pincet klar.
- Påfør 10 μL monteringsmedium (ProLong Glass) på et forberedt glasglas for at montere en dæksel.
- Tag dæksluden op fra 12-brøndspladen ved hjælp af en pincet, og dup fugt af dækslikket ved kort at røre kanten og bagsiden af dækslikket til det forberedte fnugfri papirhåndklæde. Sænk forsigtigt dækslet ned på dråben af monteringsmediet.
- Gentag ovenstående to trin for hver dækslip. Placer monteringsmediedråberne for at give mulighed for mellem en og fire dækslips pr. Glasglas.
- Sørg for, at glasglassene er på en plan overflade for at undgå, at de monterede dæksler bevæger sig. Placer glasgliderne et mørkt sted ved stuetemperatur natten over for at lade monteringsmediet indstille. Prøverne er nu klar til billedbehandling. Eksperimentet kan sættes på pause på dette stadium af protokollen og fortsættes senere.
- Hvis forsøget sættes på pause på dette stadium, skal prøverne efter at have ladet prøverne indstilles natten over ved stuetemperatur dækkes med aluminiumsfolie for at beskytte dem mod lys og opbevares ved 4 °C.
4. Mikroskopi og billeddannelse
- Dæk prøverne i aluminiumsfolie til transport (hvis det ikke allerede er gjort).
- Ved ankomsten til mikroskopianlægget skal du bruge dobbeltdestilleret H2O med mikroskopfilterpapir til at rense PBS-resterne af dækslikkerne på glasglassene. Kontroller, at der ikke er pletter på dækslerne ved at holde glasgliderne mod et stærkt lys.
- Gå gennem opstartsproceduren for mikroskopet. Vælg det relevante mål (Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil M27), og tilføj nedsænkningsmedium.
- Prøven anbringes i prøveholderen. Inden for mikroskopsoftwaren skal du bruge fanen "Find" til at aktivere EGFP-fluorescensbelysningen, og ved hjælp af okularerne skal du manuelt justere z-niveauet for at have prøven i fokus. Sluk for fluorescensbelysningen, når du finder fokus.
- Skift til fanen "Erhverv" i mikroskopsoftwaren. Brug "Smart Setup" til at vælge de fluorescenskanaler, der skal bruges til billeddannelse. Til dette eksperiment blev EGFP- og DAPI-kanalforudindstillingerne valgt.
- Juster hver kanalintensitet fra de indledende indstillinger ved hjælp af intensitetshistogrammet som vejledning til optimeret signalstyrke. Billedbehandling kan nu begynde.
- Til billeddannelse skal du bruge softwarens mulighed for at få billedpositionerne placeret i et array og centrere arrayet midt på dækslippet med 12 samlede positioner, der skal afbildes. Kontrollér, at hver position i matrixen indeholder celler. Hvis der ikke er nogen celler, skal du justere positionen til et område med celler.
- Juster fokus for hver position i arrayet ved hjælp af mikroskopsoftwarens autofokus, og følg dette med en manuel finjustering for at sikre, at så mange mitokondrier som muligt er i fokus.
BEMÆRK: EGFP-kanalen bruges til disse manuelle justeringer. - Hent billederne ved hjælp af denne metode for hver coverslip. Gem billedfilerne, og fortsæt til trinene til morfologisk analyse.
5. Generering af simulerede træningsdata
- Download koden10, og pak indholdet ud. Følg instruktionerne i README.md for at konfigurere det ønskede miljø.
- Naviger til mappen med navnet "src", som er hjemmemappen til dette projekt. De nummererede mapper indeni indeholder koder, der er specifikke for forskellige trin i brugen af værktøjet.
BEMÆRK: Brug kommandoen "cd <>" til at navigere til eventuelle undermapper i koden. For at køre en python-fil skal du bruge kommandoen "python < >.py ". Præsentationen med navnet "Tutorial.pptx" indeholder et komplet sæt instruktioner til brug af segmenteringsmodellen. - Lav en kopi eller brug mappen "2. Mitokondrier Simulation Airy", og omdøb det (Airy bruges her, da det er PSF-funktionen tættest på et konfokalmikroskop, som blev brugt som det nuværende mikroskop). Gå ind i mappen med navnet "simulator".
BEMÆRK: Denne mappe indeholder alle de filer, der er relateret til simuleringen af træningsdataene. Der er tre sæt parametre, der skal indstilles til simuleringen. - For det første for simulatoren i batchkonfigurationsfilen "simulator / batch / bxx.csv" indstilles parametrene for omkring prøven, herunder antallet af mitokondrier, diametrområdet og strukturernes længder, rækkevidden af z-aksen, som strukturen udviser, og tætheden af fluorophorerne.
- Indstil derefter parametrene relateret til det optiske system.
- Dette sæt omfatter typen af mikroskop (som bestemmer, hvilken PSF-model der vælges), den numeriske blænde (NA), forstørrelsen (M), pixelstørrelsen (i μm), fluorophorernes emissionsbølgelængde og baggrundsstøjparameteren osv.
- Indstil de optiske parametre for NA, forstørrelsen og den mindste bølgelængde af datasættet i filen "simulator / microscPSFmod.py".
- Indstil den ønskede værdi for pixelstørrelsen, og indstil emissionsbølgelængden for datasættet som en parameter til funktionen "process_matrix_all_z" i filen "simulator/generate_batch_parallel.py".
- Indstil de sidste tre parametre for funktionen "save_physics_gt" i filen "simulator / generate_batch_parallel.py". Parametrene er pixelstørrelse (i nm), størrelsen på outputbilledet og max_xy.
- Indstil det tredje sæt parametre vedrørende outputdatasættet, såsom størrelsen på outputbillederne, antallet af fliser i hvert billede og antallet af samlede billeder i filen "simulator / generate_batch_parallel.py".
- Kør filen "simulator/generate_batch_parallel.py" for at starte simuleringen.
- For at få billedet i den endelige størrelse skal du lave en kopi af mappen med navnet "5. Dataforberedelse og træning/dataforberedelse" i hjemmemappen, og naviger ind i den.
BEMÆRK: Hvert billede af det syntetiske datasæt dannes ved at oprette en montage af fire simulerede billeder på 128 pixels x 128 pixels, hvilket giver en endelig billedstørrelse på 256 pixels x 256 pixels. Dette genererer først mange individuelle fliser (ca. 12.000) til både mikroskopbillederne (i mappen "output") og jordsandhedssegmenteringer (i mappen "output / physics_gt").- Indstil parametrene for batchnummeret, antallet af billeder pr. batch og støjområdet i "data_generator.py".
- Kør filen "data_generator.py" for at oprette montagebillederne.
- Kopier mapperne med navnet "billede" og "segment" til "5. Mappen Dataforberedelse og træning/datatrain/train" fra mappen "5. Dataforberedelse og træning/dataforberedelse/data".
6. Dyb læringsbaseret segmentering
- Træn segmenteringsmodellen på de simulerede billeder som følger:
- For at træne segmenteringsmodellen til et nyt mikroskop skal du navigere til "5. Mappen Dataforberedelse og træning/træning", og indstil parametrene for batchstørrelsen, rygradsmodellen for segmenteringen, antallet af epoker og læringshastigheden for træning i filen "train_UNet.py".
- Kør "train_UNet.py" for at starte træningen. Træningsprocessen viser metric'en for segmenteringens ydeevne på det simulerede valideringssæt.
BEMÆRK: Når træningen er afsluttet, gemmes modellen som "best_model.h5" i "5. Mappen Dataforberedelse og træning/træning".
- Test modellen på ægte mikroskopbilleder, der er opdelt i en størrelse, der er ønskelig for den trænede model gennem følgende trin.
- Naviger til "6. Forbered testdata", og kopier ". png" format filer af dataene i mappen "png".
- Kør filen "split_1024_256.py" for at opdele billederne i en størrelse, der er ønskelig for den trænede model. Dette opretter 256 pixel x 256 pixel størrelse beskæringer af billederne i mappen "data".
- Kopier den oprettede "data" -mappe til "7. Mappen Test segmentering".
- Naviger til mappen "7. Test segmentering", og indstil navnet på den gemte model, der skal bruges.
- For at segmentere afgrøderne skal du køre filen "segment.py". De segmenterede billeder gemmes i mappen "output".
7. Morfologisk analyse: Analyse af mitokondriemorfologien for de to datagrupper, "Glucose" og "CCCP"
- Arranger de data, der skal analyseres (en mappe for hvert billede, hvor hver mappe indeholder de segmenterede outputafgrøder i et billede).
- Download og placer den supplerende fil med navnet "make_montage.py" i mappen med navnet "7. Test segmentering".
- Kør filen "make_montage.py" for at sy det segmenterede output tilbage til billedets oprindelige størrelse.
- Opret en ny mappe med navnet "9. Morfologisk analyse " inde i mappen "src" .
- Installer Skan16 - og Seaborn Python-pakkerne i miljøet ved hjælp af kommandoen "pip install seaborn[stats] skan".
BEMÆRK: Segmenteringsmaskerne er skeletiseret ved hjælp af biblioteket ved navn Skan for at muliggøre analyse af topologien for hver enkelt mitokondrion. - Placer den supplerende fil " analyze_mitochondria.py " i mappen "9. Morfologisk analyse".
- Arranger billederne af forskellige grupper af eksperimentet i forskellige mapper inde i mappen "7. Test segmentering".
- Indstil parametrene for "pixelstørrelse" og "inputsti" i filen " analyze_mitochondria.py".
- Kør filen " analyze_mitochondria.py" for at køre koden for at skeletere og oprette plots af analysen.
Representative Results
Resultaterne fra deep learning-segmenteringerne af mitokondrier i konfokale billeder af faste kardiomyoblaster, der udtrykker fluorescerende mitokondriermarkører, viser nytten af denne metode. Denne metode er kompatibel med andre celletyper og mikroskopisystemer, der kun kræver omskoling.
Galactose-tilpassede H9c2 cardiomyoblaster med fluorescerende mitokondrier blev behandlet med eller uden CCCP i 2 timer. Cellerne blev derefter fikseret, farvet med et nukleart farvestof og monteret på glasglas til fluorescensmikroskopianalyse. Et konfokalt mikroskop blev brugt til at erhverve billeder af både kontrol- og CCCP-behandlede celler. Vi udførte vores analyse på 12 konfokale billeder med ca. 60 celler pr. Tilstand. Den morfologiske tilstand af mitokondrierne i hvert billede blev derefter bestemt og kvantificeret. Segmenteringsmaskerne opnået fra den trænede model blev skeleteret for at muliggøre analysen af topologien for hver enkelt mitokondrion til dette eksperiment. Grenlængden af de enkelte mitokondrier blev brugt som parameter til klassificering. De enkelte mitokondrier blev klassificeret i morfologiske klasser ved følgende regel. Specifikt blev ethvert mitokondrieskelet med en længde mindre end 1.500 nm betragtet som en prik, og de længere mitokondrier blev yderligere kategoriseret i netværk eller stang. Hvis der var mindst et kryds, hvor to eller flere grene krydsede hinanden, blev dette defineret som et netværk; Ellers blev mitokondriet klassificeret som en stang. Et eksempelbillede med mitokondrieskeletterne mærket med morfologiklasserne er vist i figur 3.
Mitokondriemorfologikategoriseringen i figur 4A viser, at det er muligt at detektere signifikante ændringer, når CCCP anvendes i 2 timer; dette ses tydeligst af stigningen i prikker for de CCCP-behandlede celler.
Den gennemsnitlige grenlængde i figur 4B er en anden mulighed for at illustrere påviselige og signifikante ændringer i morfologi. Både stænger og netværk blev som forventet signifikant reduceret i forhold til kontrol, da cellerne blev behandlet med CCCP. Den betydelige stigning i de gennemsnitlige grenlængder af prikker var også forventet i betragtning af den hævelse, som mitokondrier gennemgår, når de udsættes for CCCP.
Figur 1: Pipeline til simulering af fluorescensmikroskopibilleder. Rørledningen omfatter (i) 3D-geometrigenerering, (ii) emittere og fotokinetikemulering, (iii) 3D PSF-konvolution, (iv) støjtilsætning og (v) binarisering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Trin til maskinlæringsbaseret analyse af mitokondriemorfologi . (1) De billeder, der skal segmenteres, beskæres først i størrelser, der er acceptable for segmenteringsmodellen. (2) Den deep learning-baserede segmentering anvendes på billedbeskæringerne. (3) De segmenterede produktionsafgrøder sys tilbage til deres oprindelige størrelse. (4) De montagede segmenteringer er skeleterede. (6) Morfologisk analyse udføres baseret på topologien fra skeletiseringerne. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Mitokondrieskelet overlejret på segmenteringsoutput af mikroskopibilleder . (A) Segmenteringsoutputtet. (B) Det lige skelettet (euklidisk afstand mellem start- og slutpunkterne for en gren) er overlejret oven på segmenteringsoutputtet. Skeletets farvekodning skildrer klassen af mitokondrier. Netværk er røde, stænger er grønne, og prikker er lilla i farven. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Analyse af mitokondriemorfologi. (A) En oversigt over den relative procentdel af forskellige morfologiske kategorier baseret på den samlede mitokondrielængde. (B) Sammenligning af den gennemsnitlige mitokondriegrenlængde mellem forsøgsbetingelserne og mellem morfologiske kategorier. X-aksen viser de morfologiske kategoriseringer, og y-aksen viser mitokondriernes gennemsnitlige grenlængde i nanometer (nm). Statistisk signifikans i form af p-værdier vises som * p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001 og **** p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Manglende tilfælde af segmentering. En høj tæthed af mitokondrier er et udfordrende scenario for segmenteringsmodellen. Det farvede skelet viser de længste enkelte mitokondrier, der er registreret på billedet. Ved at gennemgå længdemålingerne kan disse scenarier detekteres og arbejdes på for at forbedre segmenteringsresultaterne ved hjælp af den morfologiske operator eroderer (slanker det detekterede skelet). Klik her for at se en større version af denne figur.
Discussion
Vi diskuterer forholdsregler relateret til de kritiske trin i protokollen i afsnittene om "geometrigenerering" og "simulatorparametre". Afsnittet med titlen "overførselslæring" diskuterer ændringer for højere gennemstrømning, når man tilpasser sig flere mikroskoper. Afsnittene om "partikelanalyse" og "generering af andre subcellulære strukturer" henviser til fremtidige anvendelser af denne metode. Afsnittet om "forskellen fra biologisk sandhed" diskuterer de forskellige grunde til, at simuleringerne kan afvige fra reelle data, og om disse grunde påvirker vores anvendelse. Endelig diskuterer vi et udfordrende scenarie for vores metode i afsnittet "tætpakkede strukturer".
Generering af geometri
For at generere mitokondriernes 3D-geometri fungerer en simpel 2D-struktur skabt af b-spline-kurver som skeletter godt til oprettelsen af det syntetiske datasæt. Disse syntetiske former efterligner nøje formerne af mitokondrier observeret i 2D-cellekulturer. I tilfælde af 3D-væv som hjertevæv er formen og arrangementet af mitokondrier imidlertid helt anderledes. I sådanne tilfælde kan segmenteringsmodellens ydeevne forbedres med tilføjelsen af retningsvirkning i de simulerede billeder.
Simulator parametre
Der skal udvises forsigtighed ved indstilling af simulatorens parametre for at sikre, at de matcher dataene til at køre inferensen på, da manglende overholdelse kan føre til lavere ydeevne ved segmentering. En sådan parameter er signal-støj-forholdet (SNR) rækkevidde. Intervallet for SNR for de data, der skal testes, skal svare til værdierne i det simulerede datasæt. Desuden skal den anvendte polyesterfibre svare til måltestdataene. For eksempel bør modeltrænede billeder fra en konfokal polyesterfibre ikke bruges til at teste billeder fra et epifluorescerende mikroskop. En anden parameter at være opmærksom på er brugen af yderligere forstørrelse i testdataene. Hvis der er anvendt yderligere forstørrelse i testdataene, skal simulatoren også indstilles korrekt.
Overfør læring
Overførselslæring er fænomenet med at udnytte en lært model, der er uddannet på en opgave til brug i en anden opgave. Dette fænomen gælder også for vores problem i forhold til forskellige typer mikroskopdata. Vægten af segmenteringsmodellen (forsynet med kildekoden), der er trænet på en type mikroskopidata, kan bruges til at initialisere en segmenteringsmodel, der skal bruges på en anden slags optiske mikroskopdata. Dette giver os mulighed for at træne på en betydeligt mindre delmængde af træningsdatasættet (3.000 billeder sammenlignet med 10.000), hvilket reducerer beregningsomkostningerne ved simulering.
Partikelanalyse
Partikelanalyse kan også udføres på de segmenterede masker. Dette kan give oplysninger om arealet og krumningen m.v. af de enkelte mitokondrier. Disse oplysninger kan også tjene som målinger til kvantitativ sammenligning af mitokondrier (ikke brugt til dette eksperiment). For eksempel definerer vi i øjeblikket prikmorfologien ved hjælp af en tærskel baseret på mitokondriernes længde. Det kan i nogle tilfælde være nyttigt at inkorporere ellipticitet for bedre at adskille små stanglignende mitokondrier fra punkta eller priklignende mitokondrier. Alternativt, hvis visse biologiske forhold får mitokondrierne til at krølle sig sammen, kan krumningskvantificering være af interesse for at analysere mitokondriepopulationen.
Generering af andre subcellulære strukturer
Den fysikbaserede segmentering af subcellulære strukturer er blevet demonstreret for mitokondrier og vesikler1. Selvom vesikler udviser forskellige former, er deres størrelser mindre, og de fremstår som enkle kugler, når de observeres gennem et fluorescensmikroskop. Derfor simuleres vesiklernes geometri ved hjælp af sfæriske strukturer med et passende diameterområde. Dette indebærer en ændring i funktionen genererer geometrien (cylindre i tilfælde af mitokondrier og kugler i tilfælde af vesikler) af strukturerne og de respektive parametre (trin 5.4 i protokolafsnittet). Geometrisk er det endoplasmatiske retikulum og mikrotubuli også blevet simuleret som rørformede strukturer17. Modellering af det endoplasmatiske retikulum med en diameter på 150 nm og mikrotubuli med en gennemsnitlig ydre diameter på 25 nm og et indre hult rør på 15 nm i diameter giver tilnærmelser af formerne på disse strukturer. En anden parameter, der vil variere for hver af disse subcellulære strukturer, er fluorofortætheden. Dette beregnes ud fra fordelingen af biomolekylet, som fluorophorerne binder til, og sandsynligheden for binding.
Forskel fra biologisk grundsandhed
De simulerede data, der anvendes til simulationsovervåget træning af deep learning-modellen, adskiller sig på mange måder fra reelle data. i) Fraværet af ikke-specifik mærkning i de simulerede data adskiller sig fra reelle data, da der ofte er fritsvævende fluorophorer i de reelle data. Dette medfører en højere gennemsnitlig baggrundsværdi i det rigtige billede. Denne forskel afbødes ved at matche SNR og indstille baggrundsværdien, så den matcher de observerede reelle værdier. (ii) Bevægelsen af subcellulære strukturer og fotokinetik er to kilder til dynamik i systemet. Bevægelige strukturer i levende celler (som bevæger sig i området et par millisekunder) forårsager bevægelsessløring. Eksponeringstiden reduceres under reel dataindsamling for at undgå sløringseffekten. På den anden side simulerer vi ikke timelapse og antager ubevægelige strukturer; Denne antagelse er gyldig, når eksponeringstiden i de reelle data er lille. Denne antagelse kan dog medføre en fejl i outputtet, hvis eksponeringstiden for de reelle data er stor nok til at indføre bevægelsessløring. Fotokinetik er derimod i størrelsesordenen nanosekunder til mikrosekunder og kan udelades i simuleringen, da de sædvanlige eksponeringstider for eksperimenter er lange nok (i størrelsesordenen millisekunder) til at gennemsnit virkningerne af fotokinetik. (iii) Støj i mikroskopbilleder har forskellige kilder, og disse kilder har forskellige sandsynlighedstæthedsfunktioner. I stedet for at modellere disse individuelle støjkilder, tilnærmer vi det som en gaussisk støj over en konstant baggrund. Denne forskel ændrer ikke signifikant datafordelingen for betingelserne for lavt signal-til-baggrundsforhold (i området 2-4) og når man beskæftiger sig med makrodensiteten af fluorophorer1. (iv) Artefakter i billeddannelse kan opstå fra afvigelser, drift og systematiske sløringer. Vi antager, at mikroskopet er godt justeret, og at de regioner, der er valgt til analyse i de reelle data, er blottet for disse artefakter. Der er også mulighed for at modellere nogle af disse artefakter i PSF18,19,20.
Tætpakkede strukturer
Vanskelighederne med ikke at kunne skelne overlappende stænger fra netværk er et vedvarende problem i segmenteringen af 2D-mikroskopidata. Et ekstremt udfordrende scenarie er præsenteret i figur 5, hvor mitokondrierne er tæt pakket, hvilket fører til suboptimale resultater i segmenteringsmodellen og den følgende analyse. På trods af denne udfordring kan brug af morfologiske operatører i sådanne situationer til at slanke skeletiseringen hjælpe med at bryde disse alt for forbundne netværk, samtidig med at der stadig kan påvises betydelige ændringer i alle mitokondriemorfologikategorierne. Derudover er brugen af en konfokal snarere end et widefield-mikroskop til billeddannelse en metode til delvist at afbøde dette problem ved at eliminere lys, der ikke er i fokus. Desuden ville det i fremtiden være nyttigt at udføre 3D-segmentering for at differentiere mitokondrier, der skærer (dvs. fysisk danner et netværk) fra stanglignende mitokondrier, hvis fremspring i et enkelt plan overlapper hinanden.
Deep-learning segmentering er et lovende værktøj, der tilbyder at udvide mikroskopibrugernes analysefunktioner og dermed åbne muligheden for automatiseret analyse af komplekse data og store kvantitative datasæt, som tidligere ville have været uhåndterlige.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at der ikke er nogen interessekonflikter relateret til denne artikel.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender diskussionen med Arif Ahmed Sekh. Zambarlal Bhujabal er anerkendt for at hjælpe med at konstruere de stabile H9c2-celler. Vi anerkender følgende finansiering: ERC-startbevilling nr. 804233 (til K.A.), Researcher Project for Scientific Renewal grant nr. 325741 (til D.K.P.), Northern Norway Regional Health Authority grant no. HNF1449-19 (Å.B.B.) og UiT's tematiske finansieringsprojekt VirtualStain with Cristin Project ID 2061348 (D.K.P., Å.B.B., K.A. og A.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12-well plate | FALCON | 353043 | |
| Aqueous Glutaraldehyde EM Grade 25% | Electron Microscopy Sciences | 16200 | |
| Axio Vert.A1 | Zeiss | Brightfield microscope | |
| CCCP | Sigma-Aldrich | C2759 | |
| Computer | n/a | n/a | Must be running Linux/Windows Operating System having an NVIDIA GPU with at least 4GB of memory |
| Coverslips | VWR | 631-0150 | |
| DAPI (stain) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DMEM | gibco | 11966-025 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| Glass Slides (frosted edge) | epredia | AA00000112E01MNZ10 | |
| H9c2 mCherry-EGFP-OMP25 | In-house stable cell line derived from purchased cell line | ||
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51033557 | |
| LSM 800 | Zeiss | Confocal Microscope | |
| Mounting Media (Glass) | Thermo Fisher Scientific | P36980 | |
| Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Thermo Fisher Scientific | J19943-K2 | |
| Plan-Apochromat 63x oil (M27) objective with an NA of 1.4 | Zeiss | 420782-9900-000 | |
| Sterile laminar flow hood | Labogene | SCANLAF MARS | |
| Trypsin | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Vacusafe aspiration system | VACUUBRAND | 20727400 | |
| ZEN 2.6 | Zeiss |
References
- Sekh, A. A., et al. Physics-based machine learning for subcellular segmentation in living cells. Nature Machine Intelligence. 3, 1071-1080 (2021).
- Pernas, L., Scorrano, L. Mito-morphosis: Mitochondrial fusion, fission, and cristae remodeling as key mediators of cellular function. Annual Review of Physiology. 78, 505-531 (2016).
- Li, Y., et al. Imaging of macrophage mitochondria dynamics in vivo reveals cellular activation phenotype for diagnosis. Theranostics. 10 (7), 2897-2917 (2020).
- Xu, X., Xu, S., Jin, L., Song, E. Characteristic analysis of Otsu threshold and its applications. Pattern Recognition Letters. 32 (7), 956-961 (2011).
- Legland, D., Arganda-Carreras, I., Schindelin, J. MorphoLibJ: MorphoLibJ v1.2.0. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org/record/50694#.Y8qfo3bP23A (2016).
- Arganda-Carreras, I., et al. Trainable_Segmentation: Release v3.1.2. Zenodo. , Available from: https://zenodo.org/record/59290#.Y8qf13bP23A (2016).
- Chu, C. H., Tseng, W. W., Hsu, C. M., Wei, A. C. Image analysis of the mitochondrial network morphology with applications in cancer research. Frontiers in Physics. 10, 289 (2022).
- Xue, F., Li, J., Blu, T. Fast and accurate three-dimensional point spread function computation for fluorescence microscopy. Journal of the Optical Society of America A. 34 (6), 1029-1034 (2017).
- Lanni, F., Gibson, S. F. Diffraction by a circular aperture as a model for three-dimensional optical microscopy. Journal of the Optical Society of America A. 6 (9), 1357-1367 (1989).
- Sekh, A. A., et al. Physics based machine learning for sub-cellular segmentation in living cells. Nature Machine Intelligence. 3, 1071-1080 (2021).
- Liu, Y., Song, X. D., Liu, W., Zhang, T. Y., Zuo, J. Glucose deprivation induces mitochondrial dysfunction and oxidative stress in PC12 cell line. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 7 (1), 49-56 (2003).
- Dott, W., Mistry, P., Wright, J., Cain, K., Herbert, K. E. Modulation of mitochondrial bioenergetics in a skeletal muscle cell line model of mitochondrial toxicity. Redox Biology. 2, 224-233 (2014).
- Ishihara, N., Jofuku, A., Eura, Y., Mihara, K. Regulation of mitochondrial morphology by membrane potential, and DRP1-dependent division and FZO1-dependent fusion reaction in mammalian cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 301 (4), 891-898 (2003).
- Miyazono, Y., et al. Uncoupled mitochondria quickly shorten along their long axis to form indented spheroids, instead of rings, in a fission-independent manner. Scientific Reports. 8, 350 (2018).
- Ganote, C. E., Armstrong, S. C. Effects of CCCP-induced mitochondrial uncoupling and cyclosporin A on cell volume, cell injury and preconditioning protection of isolated rabbit cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 35 (7), 749-759 (2003).
- Nunez-Iglesias, J., Blanch, A. J., Looker, O., Dixon, M. W., Tilley, L. A new Python library to analyse skeleton images confirms malaria parasite remodelling of the red blood cell membrane skeleton. PeerJ. 2018, 4312 (2018).
- Sage, D., et al. Super-resolution fight club: Assessment of 2D and 3D single-molecule localization microscopy software. Nature Methods. 16, 387-395 (2019).
- Yin, Z., Kanade, T., Chen, M. Understanding the phase contrast optics to restore artifact-free microscopy images for segmentation. Medical Image Analysis. 16 (5), 1047-1062 (2012).
- Malm, P., Brun, A., Bengtsson, E. Simulation of bright-field microscopy images depicting pap-smear specimen. Cytometry. Part A. 87 (3), 212-226 (2015).
- Bifano, T., Ünlü, S., Lu, Y., Goldberg, B. Aberration compensation in aplanatic solid immersion lens microscopy. Optical Express. 21 (23), 28189-28197 (2013).
