Summary
Detta protokoll beskriver metoder för att utvärdera DNA-skadereparationsproteiner i patient-derived ovarial cancer organoids. Här ingår omfattande pläterings- och färgningsmetoder samt detaljerade, objektiva kvantifieringsförfaranden.
Abstract
Immunofluorescens är en av de mest använda teknikerna för att visualisera målantigener med hög känslighet och specificitet, vilket möjliggör noggrann identifiering och lokalisering av proteiner, glykaner och små molekyler. Medan denna teknik är väletablerad i tvådimensionell (2D) cellodling, är mindre känt om dess användning i tredimensionella (3D) cellmodeller. Äggstockscancerorganoider är 3D-tumörmodeller som rekapitulerar tumörcellklonal heterogenitet, tumörmikromiljön och cell-cell- och cellmatrisinteraktioner. Således är de överlägsna cellinjer för utvärdering av läkemedelskänslighet och funktionella biomarkörer. Därför är förmågan att utnyttja immunofluorescens på primära äggstockscancerorganoider extremt fördelaktigt för att förstå biologin hos denna cancer. Den aktuella studien beskriver tekniken för immunofluorescens för att detektera DNA-skadereparationsproteiner i höggradiga serösa patient-härledda äggstockscancerorganoider (SUB). Efter exponering av SUB: erna för joniserande strålning utförs immunofluorescens på intakta organoider för att utvärdera kärnproteiner som foci. Bilder samlas in med z-stack-avbildning på konfokalmikroskopi och analyseras med hjälp av automatiserad programvara för fociräkning. De beskrivna metoderna möjliggör analys av tidsmässig och speciell rekrytering av DNA-skador, reparationsproteiner och samlokalisering av dessa proteiner med cellcykelmarkörer.
Introduction
Äggstockscancer är den vanligaste dödsorsaken på grund av gynekologisk malignitet. Majoriteten av patienterna behandlas med DNA-skadliga läkemedel som karboplatin, och de med homolog rekombinationsreparation (HRR) -bristfälliga tumörer kan ges poly (ADP-ribos) polymeras (PARP) hämmare 1,2. De flesta patienter utvecklar dock resistens mot dessa terapier och dör inom 5 år efter diagnos. Dysreglering av DNA-skaderesponsen (DDR) har associerats med utvecklingen av äggstockscancer och både kemoterapi och PARP-hämmareresistens3. Således är studier av DDR absolut nödvändiga för att förstå patofysiologin för äggstockscancer, potentiella biomarkörer och nya riktade terapier.
Nuvarande metoder för att utvärdera DDR använder immunofluorescens (IF), eftersom detta möjliggör noggrann identifiering och lokalisering av DNA-skadeproteiner och nukleotidanaloger. När det finns en dubbelsträngad paus (DSB) i DNA, fosforyleras histonproteinet H2AX snabbt och bildar ett fokus där DNA-reparationsproteiner samlas4. Denna fosforylering kan lätt identifieras med hjälp av IF; i själva verket har ɣ-H2AX-analysen vanligtvis använts för att bekräfta induktionen av en DSB 5,6,7,8,9. Ökad DNA-skada har associerats med platinakänslighet och effekt av DNA-skadliga medel 10,11,12, och ɣ-H2AX har föreslagits som en biomarkör associerad med kemoterapisvar i andra cancerbehandlingar 13. Vid en DSB utför en cell som är skicklig i HRR en serie händelser som leder till att BRCA1 och BRCA2 rekryterar RAD51 för att ersätta replikationsprotein A (RPA) och binda till DNA. HRR-reparation använder en DNA-mall för att troget reparera DSB. Men när tumörer har brist på HRR, förlitar de sig på alternativa reparationsvägar såsom icke-homolog ändfogning (NHEJ). NHEJ är känt för att vara felbenägen och skapar en hög mutationsbörda på cellen, som använder 53BP1 som en positiv regulator14. Dessa DNA-skadeproteiner kan alla identifieras exakt som foci med hjälp av IF. Förutom färgning för proteiner kan IF användas för att studera gaffelskydd och enkelsträngad DNA-gapbildning. Förmågan att ha stabila gafflar har korrelerats med platinasvar, och nyligen har gapanalyser visat potentialen att förutsäga svaret på PARP-hämmare 6,15,16,17. Därför är färgning för nukleotidanalogerna efter införande i genomet ett annat sätt att studera DDR.
Hittills har utvärderingen av DDR i äggstockscancer i stor utsträckning begränsats till homogena 2D-cellinjer som inte rekapitulerar den klonala heterogeniteten, mikromiljön eller arkitekturen hos in vivo-tumörer 18,19. Ny forskning tyder på att organoider är överlägsna 2D-cellinjer när det gäller att studera komplexa biologiska processer som DDR-mekanismer6. Den nuvarande metoden utvärderar RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA och geminin i SUB. Dessa metoder bedömer den intakta organoiden och möjliggör studier av DDR-mekanismer i en miljö som mer liknar tumörmikromiljön in vivo. Tillsammans med konfokalmikroskopi och automatiserad foci-räkning kan denna metod hjälpa till att förstå DDR-vägen vid äggstockscancer och anpassa behandlingsplaner för patienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tumörvävnad och ascites erhölls efter att ha erhållit patientens samtycke som en del av ett gynekologiskt onkologibiorepository som godkändes av Washington University i St. Louis Institutional Review Board (IRB). Patienter inkluderades om de hade avancerad stadium av höggradig serös äggstockscancer (HGSOC). Alla procedurer utfördes vid rumstemperatur på bänken om inget annat anges. Alla reagenser bereddes vid rumstemperatur (om inte annat anges) och förvarades vid 4 °C.
1. Organoid generation
- Generera organoiderna enligt den tidigare publicerade rapporten20.
2. Plätering och bestrålning av organoider
- Använd organoider i odling, lossa flikarna på organoiderna från odlingsskålen genom manuell manipulation av en pipettspets. Samla organoiderna i ett 15 ml koniskt rör.
- Centrifugera det koniska röret vid 1,650 x g i 5 min vid 4 °C. Använd en pipett och aspirera försiktigt av supernatanten.
- Tillsätt 1 000 μl av ett rekombinant enzym fritt från animaliskt ursprung till pelleten (se Materialförteckning). Blanda lösningen och inkubera i 15 min vid 37 °C.
- Centrifugera lösningen vid 1,650 x g i 5 min vid 4 °C. Använd en pipett och sug försiktigt av supernatanten.
- Efter centrifugering och aspiration suspenderas pelleten på nytt i 1 000 μl fosfatbuffrad saltlösning.
- Överför 10 μL av lösningen till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör och blanda med 10 μL trypanblått.
- Ta 10 μL av trypanblått celllösning i en cellräkningskammare och sätt in den i cellräkningsmaskinen (se materialtabell).
- Platta 40 000 celler per 20 μL basalmembranextrakt (BME) i en glaskammare med 8 brunnar (se materialtabell). Detta upprätthåller organoiderna i 3-5 dagar så att cellerna kan bilda organoider och växa till en lämplig storlek.
- För att inducera dubbelsträngade DNA-brott, utstråla de pläterade organoiderna med 10 Gray (Gy) av ɣ-bestrålning (se Materialtabell för detaljer om bestrålning).
OBS: Detta kan ta upp till 5-10 min. - Inkubera organoiderna i odlingssubstraten i en befuktad inkubator vid 37 °C och 5 %CO2 i 4 timmar.
3. Färgning av immunofluorescens
OBS: Volymer avser mängden per brunn av 8-brunnskammarglaset (~ 300 μL).
- Efter bestrålning och inkubation av organoiderna, aspirera mediet med en pipett, försiktigt för att inte störa 3D-matrisen. Tvätta med 300 μL PBS.
- Fixera organoiderna i 300 μL 2% paraformaldehyd (PFA) i 10 min.
ANMÄRKNINGAR: Lämna inte för länge, eftersom BME kommer att depolymerisera och kan aspireras bort. - Tvätta organoiderna med 300 μL färgningsbuffert (se materialförteckning). Placera på en shaker i 5 min.
- För permeabilisering, tillsätt försiktigt 300 μL permeabiliseringsbuffert (se materialtabell) och inkubera i 20 minuter. Tvätta med 300 μL färgningsbuffert. Placera på en shaker i 5 min.
- Tillsätt 300 μL färgningsbuffert för att blockera permeabiliseringssteget. Ställ på en shaker i 30 min. Aspirera av färgningsbufferten med en pipett.
- Tillsätt 300 μL primära antikroppar (kanin anti-RAD51, mus anti-Geminin, kanin anti-RPA, mus anti-ɣH2AX, kanin anti-Geminin, mus anti-53BP1; se materialförteckning) utspädd i färgningsbuffert. Inkubera vid 4 °C i 16 timmar.
OBS: Undvik samfärgning med samma värddjur. Lämna locket av för att undvika att antikropparna blandas i närliggande brunnar. - Ta bort den primära antikroppslösningen. Utför tre tvättar med 300 μL färgningsbuffert i 5 minuter vardera på skakapparaten.
- Tillsätt 300 μl sekundär antikropp (getantimus Alexa fluor 488 och getantikanin Alexa fluor 647; se Materialförteckning) lösning utspädd i färgningsbuffert och inkubera i 1 timme i mörker.
OBS: Alla efterföljande steg måste utföras i mörkret. - Aspirera den sekundära antikroppslösningen. Tillsätt 300 μl utspädd DAPI. Placera på en shaker i 5 min.
- Utför tre tvättar med 300 μL färgningsbuffert i 5 minuter vardera på skakapparaten. Ta bort färgningsbufferten och lossa kamrarna med hjälp av borttagningssatsen som medföljer kammarglasen (se Materialförteckning).
Se till att du inte skjuter för långt framåt för att störa 3D-matrisen. - Använd en p200-pipettspets med spetsen avskuren, lägg till monteringsmedium (se materialförteckning) för att täcka varje brunn med en organoidflik (t.ex. 20-30 μL för varje organoidflik).
- Lägg ett täckglas över provet, undvik bubblor.
- Ta klart nagellack och måla det på sidorna av täckglaset för att täta bilden. Låt stelna i 1 timme och placera den vid -20 °C.
OBS: Efter avbildning kan glaset lagras i minst 6 månader med minimal fluorescensförlust.
4. Bildbehandling
- Ta bilder med hjälp av ett konfokalmikroskop (se Materialförteckning) vid 63x objektiv med nedsänkningsolja.
OBS: Om man avbildar kärnproteiner är 63x fördelaktigt, men 40x är också acceptabelt. - Använd DAPI för att lokalisera organoiderna genom okularet. Välj lämpliga filter för mikroskopi baserat på de fluoroforer som används. Ställ in parametrarna för att fånga z-stack-bilderna.
OBS: De fluoroforer som användes i studien var DAPI, 488 och 647. 405-, 488- och 638-lasrarna slogs på för att visualisera färgningen.
OBS: Den rekommenderade z-stacken beror på målets upplösningskraft. - Justera livebilden: ställ in fokus, laserintensitet etc.
OBS: Ju högre laserintensitet, desto mer sannolikt kommer provet att fotobleka. Välj därför en optimal laserintensitet. - Skaffa z-stacken.
OBS: Detta kan ta upp till 5-10 min. - Från bilderna som samlats in i z-stacken, skärmdump minst tre bilder per stapel.
OBS: Se till att få skärmdumpar i hela stacken för att inte duplicera kärnorna vid kvantifiering. - Spara varje fil som en TIFF och fortsätt till analys (steg 5).
5. Bedömning
OBS: Använd JCountPro för all bildanalys enligt den tidigare publicerade rapporten21. För att få denna programvara, referera till tillhörande publikation.
- Under objektanalyspanelen (överst i programmet) på filvalsfliken (längst ner i programmet) väljer du TIFF-filerna .
- Klicka på Lägg till om du vill flytta de markerade filerna till den markerade filgruppen. Välj Visa.
- Under segmenteringsfliken väljer du blå som färg på kärnorna. Välj Automatisk segmentering för att optimera tröskelvärdet för kärnorna.
Om den automatiska segmenteringen inte identifierar objekten korrekt kan användaren justera finjusteringen och råinställningen till bilden eller se användarhandboken för att ytterligare optimera segmenteringen. - Under objektpanelen väljer du Dela upp stora objekt automatiskt och optimera kärnans storlek.
OBS: Kärnorna har vanligtvis en ovillkorlig storlek på 5 000 pixlar, medan den villkorliga storleken är 1 500 pixlar. Se användarhandboken för att ytterligare optimera storleken på objekten. - Välj Identifiera objekt för att testa parametrarna.
OBS: Om dessa parametrar inte är korrekta kan storleken och inställningen justeras tillsammans med andra inställningar. Se användarhandboken för instruktioner om ytterligare optimering. - När du har justerat parametrarna till bilden väljer du Identifiera objekt i alla bilder för att identifiera kärnorna i alla valda bilder .
- Välj panelen Foci-analys (överst i programmet).
- Under fliken Välj filer (längst ned i programmet) väljer du de TIFF-filer som användes för objektanalys och väljer pilknapparna (>>) för att flytta bilderna till bildfilgruppen.
- I kataloggruppen under bildfilerna som flyttades dubbelklickar du på mappen Manuell redigering och väljer att flytta iok-filerna till gruppen för objektsamlingsfiler.
Alla valda TIFF-filer måste ha matchande iok-filer. - Tryck på Välj för att flytta filerna till den valda filgruppen. Välj fliken Foci-räkning längst ner i programmet.
- Optimera parametrarna enligt stegen nedan.
- Index för topphattinställningar: 12.
- Fokuskanal: Välj färg på fokusfokusen (grön: ɣ-H2AX; röd: RAD51).
- H-kupolinställningar: kupolhöjd %: 30; Tröskel %: 28 och 28.
- Inställning av form/storlek: Minsta fokusstorlek, pixlar: 5. Välj Använd form/storlek. Max fokusstorlek (villkorlig): 32. Min rundhet, x100: 96. Max fokus, pixlar: 60.
- Ljudfilter: storlek 1.
OBS: Om du bestämmer om en kärna är positiv för gemininfärgning, välj grön under den andra kanalen och välj intensitet under analys.
- För att testa de inställda parametrarna, välj knapparna nedan i ordning: Top Hat > H-Dome > Foci Count.
Om dessa parametrar inte fungerar kan storleken och inställningen justeras tillsammans med andra inställningar. Se användarmanualen för att lära dig mer om hur bilden kan optimeras ytterligare. - När parametrarna har optimerats för de valda bilderna väljer du Räkna automatiskt för att räkna fokusen i varje bild per kärna. Om den andra kanalen önskas bestämmer programmet intensiteten som kan användas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det presenterade protokollet kan framgångsrikt färga, visualisera och kvantifiera nukleära DNA-skadereparationsproteiner i organoider. Denna teknik användes för att färga och utvärdera SUBs både före och efter bestrålning. SUBs utsattes för 10 Gy strålning och utvärderades för följande biomarkörer: ɣ-H2AX (figur 1), en markör för DNA-skada; RAD51 (figur 2), en markör för HRR; 53BP1, en markör för NHEJ; RPA, en markör för replikeringsstress (figur 3). och geminin, en G2/S-fascellcykelmarkör14. Dosen 10 Gy valdes baserat på tidigare publicerad forskning som studerar DNA-skador vid äggstockscancer 6,22. JCountPro-programvaran användes för att identifiera kärnan och kvantifiera antalet foci i kärnan med illustrerade parametrar13 (figur 4). Programvaran identifierar kärnan (figur 4A, B), sedan kärnfoci (figur 4C) och filtrerar foci från gemininpositiva celler (figur 4D).
Figur 1: ɣ-H2AX-foci i SUB före och efter bestrålning. Representativa bilder av DAPI och ɣ-H2AX foci i SUBs före och efter bestrålning vid 10x med 63x infällningar. Skalstänger: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: RAD51-foci och geminin i SUB före och efter bestrålning. Representativa bilder av DAPI, geminin, RAD51 och samfärgning av geminin/RAD51 foci SUBs före och efter bestrålning vid 10x med 63x infällningar. Skalstänger: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: RPA och 53BP1 i skyddade ursprungsbeteckningar före och efter bestrålning. Representativa bilder av (A) DAPI, RPA; (B) geminin, 53BP1 och samfärgning av geminin/53BP1-foci vid 10x med 63x infällningar. Skalstänger: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Arbetsflödet för kvantifiering av JCountPro-programvaran. (A) Under objektanalysen väljs den blå kanalen för att identifiera de blå objekten, kärnorna, sedan optimeras den automatiskt genom att välja automatisk segmentering (röd pil). (B) Vid automatisk delning anpassas objektstorleken (kärnorna) till bildens storlek och förstoring. Knappen identifiera objekt väljs för att testa parametrarna (1) och knappen identifiera objekt i alla bilder (röd pil) väljs för att identifiera objekt (kärnor) för varje bild. (C) Under fliken foci-analys matas bilderna in och foci-räkningsparametrarna ställs in: först väljs färgen på foci under fokuskanalen, grön; det översta hattindexet är inställt på 12; H-kupolinställningarna är inställda på att ha en kupolhöjdsprocent på 30 och en tröskelprocent på 28; formen och storleken på foci optimeras till bildstorleken med de manuella parametrarna för maximal fokusstorlek pixlar vid 60 och minsta rundhet x 100 vid 96; Slutligen appliceras brusfiltret. Inställningarna testas genom att använda topphatten, H-kupolen och foci-antalet (1-3). För att kvantifiera ɣ-H2AX-foci per cell, tryck på start (röd pil). (D) För RAD51-foci tillämpas inställningarna enligt bilden för ɣ-H2AX-foci, förutom fokuskanalen som ändras till röd; För att identifiera kärnor som är färgade med geminin väljs emellertid den andra kanalen för grön och analysen ändras till intensitet. Parametrarna testas genom att applicera topphatten, H-kupolen och foci-antalet (1-3), sedan trycka på start (röd pil) för att kvantifiera alla RAD51-foci och utvärdera intensiteten av grönt per cell i varje bild. Skalstapel: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
DNA-skadesvaret spelar en integrerad roll i både utvecklingen av äggstockscancer och kemoterapiresistens. Därför är en grundlig förståelse av DNA-reparationsmekanismer absolut nödvändig. Här presenteras en metodik för att studera DNA-skadereparerande proteiner i 3D, intakta organoider. Ett reproducerbart, tillförlitligt protokoll utvecklas med hjälp av kännetecknande antikroppar för att utvärdera DNA-skador, homolog rekombination, icke-homolog ändfogning och replikationsstress. Det är viktigt att dessa metoder valideras med hjälp av genetiskt modifierade kontroller som visar specificiteten och känsligheten hos dessa metoder.
Det mest kritiska steget i detta protokoll är plätering och fixering av organoiderna. Detta protokoll inkuberar specifikt organoider i 2% PFA i 10 minuter med noggrann övervakning av basalmembranextraktet (BME) under fixeringsprocessen. Detta skiljer sig från andra immunofluorescensprotokoll i organoider som föreslår att man använder 4% PFA i 10-60 min23,24,25. Det har visat sig att om flikarna i BME är i en koncentrerad mängd PFA för länge, depolymeriseras flikarna och utsätts för aspiration. Observera att tillverkare av specifika BME ofta erbjuder förslag angående fixering. En annan viktig diskussionspunkt är pläteringen av organoiderna. Färgningsprocessen kan leda till att man förlorar en del eller alla organoider. Därför, ju mer sammanflytande fliken vid pläteringstillfället, desto högre sannolikhet kommer provet framgångsrikt att motstå färgningsstegen.
Styrkorna i detta protokoll inkluderar validering av nukleär antikroppsfärgning, förmågan att utföra immunofluorescens och avbildning av intakta 3D-organoider och protokollets anpassningsförmåga till någon behandling eller molekyl av intresse.
Antikropparna som användes i dessa experiment validerades strikt för specificitet med hjälp av genetiskt modifierade äggstockscancerceller. Metoderna validerades ytterligare för känslighet genom att utsätta PDOs för ökande doser av strålning. Detta resulterade i ökande ɣ-H2AX, RAD51 och RPA-foci i HRR-skickliga SUB. Slutligen underlättar de objektiva kvantifieringsmetoderna reproducerbarheten av denna analys och undviker den subjektiva bias som manuell kvantifiering innebär.
Traditionella metoder för att utforska DDR är genom 2D-odlingsförhållanden som kallas cellinjer, men de har inte förmågan att upprätthålla den genetiska heterogeniteten hos den ursprungliga tumören. Tumörmikromiljön är avgörande för tumörgenes och kemoterapiresistens vid äggstockscancer 26,27,28, därför erbjuder dessa modeller en fördel för 2D-homogena cellkulturer när man studerar DDR. När man studerar DDR är det nödvändigt att kontrollera cellcykeln för att undvika felklassificering av oförmågan att utföra specifika typer av DNA-reparation som är cellcykelspecifika (dvs. HRR). Framtida arbete är inriktat på att studera specifika typer av DNA-lesioner orsakade av platinakemoterapi, poly (ADP-ribos) polymerashämmare eller hydroxiurea.
Slutligen är detta protokoll anpassningsbart för att studera alla antigener som kan modifieras till traditionell immunofluorescens och kan rymma studier av nya läkemedelsbehandlingar. Protokollet som presenteras fokuserar på DDR-proteiner, men med en enkel förändring av antikroppar kan detta protokoll modifieras för att studera andra proteiner, glykaner och små molekyler. Dessutom, eftersom organoiderna är heterogena 3D-modeller odlade in vitro, är all behandling av organoiderna möjlig, inklusive immunterapi, antiangiogen terapi, metabolomikterapi och andra nya terapier som är svåra att utvärdera i homogena cellinjer 29,30,31.
Begränsningar av denna metod inkluderar användning av en BME med inkonsekvent sammansättning och icke-specifik färgning. Eftersom kommersiella BME produceras från cellinjer kan sammansättningen av varje enhet variera enormt. Dessa skillnader kan påverka fixering och färgning, såväl som organoidgenerering. Dessutom, beroende på provet, kan det finnas icke-specifik färgning av BME, vilket kan hindra proteinet av intresse. Icke desto mindre är kärnfärgningen mycket specifik och visar tydliga kärnfokus som lätt kan kvantifieras.
Sammanfattningsvis presenteras ett detaljerat protokoll för att utvärdera DDR-proteiner i organoider. I takt med att tekniken utvecklas förväntas organoider kunna användas för att utvärdera reparation av levande cell-DNA-skador i dessa 3D-modeller. Dessutom, som den mest effektiva metoden för odling, kommer organoiderna att etableras, och mer sofistikerade analyser såsom DNA-fiber och replikationsgapanalyser kommer att vara möjliga32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för vägledningen från Pavel Lobachevsky, PhD vid upprättandet av detta protokoll. Vi vill också erkänna Washington University's School of Medicine i St. Louis's Department of Obstetrics and Gynecology och Division of Gynecologic Oncology, Washington University's Dean's Scholar Program, Gynecologic Oncology Group Foundation och Reproductive Scientist Development Program för deras stöd till detta projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1x phosphate buffered saline with calcium and magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphate buffered saline without calcium and magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ICN1860454 | |
| Ant-53BP1 Antibody | BD Biosciences | 612522 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-Geminin Antibody | Abcam | ab104306 | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Anti-Geminin Antibody | ProteinTech | 10802-1-AP | diluted to 1:400 in staining buffer |
| Anti-RAD51 Antibody | Abcam | ab133534 | diluted to 1:1000 in staining buffer |
| Anti-yH2AX Antibody | Millipore-Sigma | 05-636 | diluted to 1:500 in staining buffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antibody | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | diluted to 1:200 in staining buffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Centrifuge; Sorvall St 16R Centrifuge | Thermo Scientific | 75004240 | |
| Confocal Microscope, Leica SP5 confocal system DMI4000 | Leica | 389584 | |
| Conical Tubes, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automated Cell Counter (Cell Counting Machine) | Thermo Scientific | AMQAF2000 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Thermo Scientific | C10228 | |
| Cover Slip | LA Colors | Any clear nail polish will suffice | |
| Cultrex RGF Basement Membrane Extract, Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | Could probably use Matrigel or other BME Matrix |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Fixed Cell ReadyProbes Reagent, Diluted in 1x PBS |
| Glycine | Fisher Scientific | NC0756056 | |
| JCountPro | JCountPro | For access to the software, Email: jcountpro@gmail.com | |
| Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 07-000-243 | |
| Nail Polish | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyde (PFA), 2% | Electron Microscopy Sciences | 157-4 | Dilute to 4% PFA in PBS++ to obtain 2% PFA |
| Permeabilization Buffer | Made in Lab | 0.2% X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipette Tips | Rainin | 17014967 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Thermo Scientific | P36930 | |
| Staining Buffer | Made in Lab | 0.5% BSA, 0.15% Glycine, 0.1% X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chamber Slide System | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | 11332481001 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Scientific | 15250061 | |
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-Ray Irradiation | X-RAD320 |
References
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M.
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2020).
- Tomasova, K., et al. DNA repair and ovarian carcinogenesis: impact on risk, prognosis and therapy outcome. Cancers. 12 (7), 1713 (2020).
- Mukhopadhyay, A., et al. Development of a functional assay for homologous recombination status in primary cultures of epithelial ovarian tumor and correlation with sensitivity to poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors. Clinical Cancer Research. 16 (8), 2344-2351 (2010).
- Graeser, M., et al. A marker of homologous recombination predicts pathologic complete response to neoadjuvant chemotherapy in primary breast cancer. Clinical Cancer Research. 16 (24), 6159-6168 (2010).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Naipal, K. A. T., et al. Functional ex vivo assay to select homologous recombination-deficient breast tumors for PARP inhibitor treatment. Clinical Cancer Research. 20 (18), 4816-4826 (2014).
- Tumiati, M., et al. A functional homologous recombination assay predicts primary chemotherapy response and long-term survival in ovarian cancer patients. Clinical Cancer Research. 24 (18), 4482-4493 (2018).
- Mukhopadhyay, A., et al. Clinicopathological features of homologous recombination-deficient epithelial ovarian cancers: sensitivity to PARP inhibitors, platinum, and survival. Cancer Research. 72 (22), 5675-5682 (2012).
- Johnson, S. W., Laub, P. B., Beesley, J. S., Ozols, R. F., Hamilton, T. C. Increased platinum-DNA damage tolerance is associated with cisplatin resistance and cross-resistance to various chemotherapeutic agents in unrelated human ovarian cancer cell lines. Cancer Research. 57 (5), 850-856 (1997).
- Stefanou, D. T., et al. Aberrant DNA damage response pathways may predict the outcome of platinum chemotherapy in ovarian cancer. PLoS One. 10 (2), 0117654 (2015).
- Helleday, T., Petermann, E., Lundin, C., Hodgson, B., Sharma, R. A. DNA repair pathways as targets for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 8 (3), 193-204 (2008).
- Ivashkevich, A., Redon, C. E., Nakamura, A. J., Martin, R. F., Martin, O. A. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
- Fuh, K., et al. Homologous recombination deficiency real-time clinical assays, ready or not. Gynecologic Oncology. 159 (3), 877-886 (2020).
- Cong, K., et al. Replication gaps are a key determinant of PARP inhibitor synthetic lethality with BRCA deficiency. Molecular Cell. 81 (15), 3128-3144 (2021).
- Lee, E. K., Matulonis, U. A. PARP inhibitor resistance mechanisms and implications for post-progression combination therapies. Cancers. 12 (8), 2054 (2020).
- Panzarino, N. J., et al. Replication gaps underlie BRCA deficiency and therapy response. Cancer Research. 81 (5), 1388-1397 (2021).
- Yee, C., Dickson, K. A., Muntasir, M. N., Ma, Y., Marsh, D. J. Three-dimensional modelling of ovarian cancer: from cell lines to organoids for discovery and personalized medicine. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 836984 (2022).
- Regan, J. L. Immunofluorescence staining of colorectal cancer patient-derived organoids. Methods Cell Biology. 171, 163-171 (2022).
- Graham, O., et al. Generation and culturing of high-grade serous ovarian cancer patient derived organoids. Journal of Visualized Experiments. (191), (2023).
- Jakl, L., et al. Validation of JCountPro software for efficient assessment of ionizing radiation-induced foci in human lymphocytes. International Journal of Radiation Biology. 92 (12), 766-773 (2016).
- Mullen, M. M., et al. GAS6/AXL inhibition enhances ovarian cancer sensitivity to chemotherapy and PARP inhibition through increased DNA damage and enhanced replication stress. Molecular Cancer Research. 20 (2), 265-279 (2022).
- van Ineveld, R. L., Ariese, H. C. R., Wehrens, E. J., Dekkers, J. F., Rios, A. C. Single-cell resolution three-dimensional imaging of intact organoids. Journal of Visualized Experiments. (160), e60709 (2020).
- Dekkers, J. F., et al. High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids. Nature Protocols. 14 (6), 1756-1771 (2019).
- O'Rourke, K. P., Dow, L. E., Lowe, S. W. Immunofluorescent staining of mouse intestinal stem cells. Bio Protocols. 6 (4), 1732 (2016).
- Nwani, N. G., Sima, L. E., Nieves-Neira, W., Matei, D. Targeting the microenvironment in high grade serous ovarian cancer. Cancers. 10 (8), 266 (2018).
- Ghoneum, A., et al. Exploring the clinical value of tumor microenvironment in platinum-resistant ovarian cancer. Seminars in Cancer Biology. 77, 83-98 (2021).
- Yang, Y., Yang, Y., Yang, J., Zhao, X., Wei, X. Tumor microenvironment in ovarian cancer: function and therapeutic strategy. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 758 (2020).
- van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
- Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
- Drost, J., Clevers, H.
- Cybulla, E., Vindigni, A. Leveraging the replication stress response to optimize cancer therapy. Nature Reviews. , (2022).
