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Biology

एलसी 3 इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके दो अलग-अलग अग्नाशयी सेल मॉडल में ऑटोफैगी के स्तर का मूल्यांकन करना

Published: April 28, 2023 doi: 10.3791/65005
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 1
1Instituto de Bioquimica y Medicina Molecular Prof Alberto Boveris (IBIMOL), Universidad de Buenos Aires, CONICET, 2Signalling Programme, The Babraham Institute

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एलसी 3 इम्यूनोफ्लोरेसेंस और एलसी 3 डॉट परिमाणीकरण के माध्यम से अग्नाशय ी कैंसर और अग्नाशयी एसिनार कोशिकाओं में ऑटोफैजिक स्तर निर्धारित करना है।

Abstract

ऑटोफैगी एक विशेष अपचय प्रक्रिया है जो प्रोटीन और क्षतिग्रस्त ऑर्गेनेल सहित साइटोप्लाज्मिक घटकों को चुनिंदा रूप से नीचा दिखाती है। ऑटोफैगी कोशिकाओं को शारीरिक रूप से तनाव उत्तेजनाओं का जवाब देने की अनुमति देता है और इस प्रकार, सेलुलर होमियोस्टैसिस को बनाए रखता है। कैंसर कोशिकाएं हाइपोक्सिया, पोषक तत्वों की कमी या कीमोथेरेपी के कारण होने वाली क्षति जैसी प्रतिकूल परिस्थितियों के अनुकूल होने के लिए अपने ऑटोफैगी के स्तर को संशोधित कर सकती हैं। डक्टल अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा कैंसर के सबसे घातक प्रकारों में से एक है। ट्रांसक्रिप्शनल अपरेग्यूलेशन और ऑटोफैगी प्रोटीन के पोस्ट-ट्रांसलेशनल सक्रियण के कारण अग्नाशय ी कैंसर कोशिकाओं में उच्च ऑटोफैगी गतिविधि होती है।

यहां, पैनसी -1 सेल लाइन का उपयोग अग्नाशय ी मानव कैंसर कोशिकाओं के मॉडल के रूप में किया गया था, और एआर 42 जे अग्नाशयी एसीनार सेल लाइन का उपयोग अत्यधिक विभेदित स्तनधारी कोशिकाओं के शारीरिक मॉडल के रूप में किया गया था। इस अध्ययन ने ऑटोफैगी सक्रियण की स्थिति के संकेतक के रूप में सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन लाइट चेन 3 (एलसी 3) के इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग किया। एलसी 3 एक ऑटोफैगी प्रोटीन है, जो बेसल स्थितियों में, साइटोप्लाज्म में वितरण का एक फैलाव पैटर्न दिखाता है (इस स्थिति में एलसी 3-आई के रूप में जाना जाता है)। ऑटोफैगी प्रेरण एलसी 3-2 बनाने के लिए नवगठित ऑटोफैगोसोम की सतह पर एलसी 3 से फॉस्फेटिडिलएथेनॉलमाइन के संयुग्मन को ट्रिगर करता है, एक झिल्ली-बाध्य प्रोटीन जो ऑटोफैगोसोम के गठन और विस्तार में सहायता करता है। लेबल ऑटोफैजिक संरचनाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए, ओपन-सोर्स सॉफ्टवेयर फिजी का उपयोग "3 डी ऑब्जेक्ट्स काउंटर" टूल की सहायता से किया गया था।

शारीरिक स्थितियों और कैंसर कोशिकाओं दोनों में ऑटोफैजिक स्तरों का माप हमें हाइपोक्सिया, कीमोथेरेपी उपचार, या कुछ प्रोटीनों के वध जैसी विविध स्थितियों के तहत ऑटोफैगी के मॉड्यूलेशन का अध्ययन करने की अनुमति देता है।

Introduction

मैक्रोऑटोफैगी (आमतौर पर ऑटोफैगी के रूप में संदर्भित) एक विशेष अपचय प्रक्रिया है जो प्रोटीन और क्षतिग्रस्त ऑर्गेनेल 1,2 सहित साइटोप्लाज्मिक घटकों को चुनिंदा रूप से नीचा दिखाती है। ऑटोफैगी कोशिकाओं को शारीरिक रूप से तनाव उत्तेजनाओं का जवाब देने की अनुमति देता है और इस प्रकार, सेलुलर होमियोस्टैसिस3 को बनाए रखता है। ऑटोफैगी के दौरान, एक डबल झिल्ली पुटिका बनती है: ऑटोफैगोसोम। ऑटोफैगोसोम में कार्गो अणु होते हैं और उन्हें गिरावट के लिए लाइसोसोम में ले जाता है 1,4.

ऑटोफैगोसोम को ऑटोफैजिक प्रोटीन सूक्ष्मनलिका से जुड़े प्रोटीन लाइट चेन 3 (एलसी 3)5 द्वारा सजाया जाता है। जब ऑटोफैगी प्रेरित नहीं होती है, तो एलसी 3 को एलसी 3-आई रचना में साइटोप्लाज्म और नाभिक में फैलाया जाता है। दूसरी ओर, जब ऑटोफैगी को प्रेरित किया जाता है, तो एलसी 3 को ऑटोफैजिक संरचनाओंकी झिल्ली में फॉस्फेटिडिलएथेनॉलमाइन के साथ संयुग्मित किया जाता है। इस नए एलसी 3 रचना को एलसी 3-II1 के रूप में जाना जाता है। एलसी 3 अनुरूपण बदलाव इसके सेलुलर स्थानीयकरण और इसके डोडेसिल सोडियम सल्फेट-पॉलीक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (एसडीएस-पेज) माइग्रेशन में परिवर्तन का कारण बनता है, जिसे इम्यूनोफ्लोरेसेंस और वेस्टर्न ब्लॉट 5,7 जैसी तकनीकों द्वारा पता लगाया जा सकता है। इस तरह, एलसी 3 संयुग्मन ऑटोफैजिक प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण घटना है जिसका उपयोग ऑटोफैजिक गतिविधि को मापने के लिए किया जा सकता है।

अग्नाशयी एसिनार सेल एक अत्यधिक विभेदित कोशिका है, जो स्वस्थ परिस्थितियों में, ऑटोफैगी की कम दर है। हालांकि, विभिन्न शारीरिक स्थितियों में या औषधीय उत्तेजना के तहत, वे ऑटोफैगी को सक्रिय कर सकते हैं। इसलिए, इस सेल लाइन में ऑटोफैजिक स्तरों का निर्धारण ऑटोफैगी 8,9 पर विभिन्न औषधीय या जैविक एजेंटों के संभावित प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष प्रभावों का अध्ययन करने के लिए उपयोगी है।

डक्टल अग्नाशयी एडेनोकार्सिनोमा कैंसर के सबसे घातक प्रकारों में से एक है, इसके देर से निदान और इसके उच्च कीमोथेरेपी प्रतिरोध10 को देखते हुए। ट्रांसक्रिप्शनल अपरेग्यूलेशन और ऑटोफैगी सेसंबंधित प्रोटीन के पोस्ट-ट्रांसलेशनल सक्रियण के कारण अग्नाशय ी कैंसर कोशिकाओं में उच्च ऑटोफैगी गतिविधि होती है। अग्नाशय ी कैंसर कोशिकाएं हाइपोक्सिया, पोषक तत्वों की कमी, या कीमोथेरेपी-प्रेरितक्षति जैसी प्रतिकूल परिस्थितियों के जवाब में अपने ऑटोफैगी के स्तर को समायोजित कर सकती हैं। इसलिए, अग्नाशय ी कैंसर कोशिकाओं में ऑटोफैगी के स्तर का विश्लेषण करने से यह समझने में मदद मिल सकती है कि वे अलग-अलग वातावरण के अनुकूल कैसे होते हैं और ऑटोफैगी-मॉड्यूलेटिंग उपचार की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करते हैं।

यह अध्ययन दो अलग-अलग अग्नाशय ी सेलुलर मॉडल में एलसी 3 इम्यूनोफ्लोरेसेंस करने की एक विधि दिखाता है। पहला मॉडल, पैनसी -1 कोशिकाएं, अग्नाशयी डक्टल एडेनोकार्सिनोमा के लिए एक मॉडल के रूप में कार्य करती हैं। इन कोशिकाओं का इलाज जेमसिटाबाइन के साथ किया गया था, एक कीमोथेरेपी एजेंट जिसे पहले ऑटोफैगी को प्रेरित करने के लिए दिखाया गया था, विशेष रूप से अग्नाशय ी कैंसर कोशिकाओं में ऑन्कोजेनिक कर्स्टन रैट सारकोमा वायरस जीन (केआरएएस) 12,13। दूसरा मॉडल, एआर 42 जे कोशिकाएं, एक्सोक्राइन अग्नाशय ी कोशिकाओं के अधिक शारीरिक मॉडल के रूप में कार्य करती हैं। इन कोशिकाओं को डेक्सामेथासोन के साथ विभेदित किया गया था ताकि वे एसिनार अग्नाशयी कोशिकाओं 14 के समान हो सकें। इन कोशिकाओं में, ऑटोफैगी को पीपी 242 के उपयोग के माध्यम से औषधीय रूप से प्रेरित किया गया था, जो एक शक्तिशाली एमटीओआर अवरोधक15 है। इस अध्ययन में, हम दो अलग-अलग अग्नाशय ी मॉडल के साथ वर्णित प्रोटोकॉल की प्रयोज्यता और कम और उच्च ऑटोफैगी के राज्यों के बीच भेदभाव करने की इसकी क्षमता का प्रदर्शन करते हैं।

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Protocol

1. सेल की तैयारी

  1. पूर्ण इथेनॉल में 12 मिमी गोल कवरलिप्स भिगोएं, और उन्हें 24-वेल प्लेट के कुओं में लंबवत रखें।
  2. कवर को हटा दें, और मल्टी-वेल प्लेट को 15 मिनट के लिए पराबैंगनी विकिरण के संपर्क में लाएं।
  3. कवरलिप्स को क्षैतिज रूप से रखें, और उन्हें डलबेकको के संशोधित ईगल मीडियम (डीएमईएम) से धो लें।
  4. अग्नाशयी कोशिकाओं की कम मार्ग संख्या को बीज दें। निर्धारण16 के दिन 50% -75% प्रवाह प्राप्त करने के लिए राशि को समायोजित किया जाना चाहिए।
    नोट: 3 दिनों के बाद कोशिकाओं को ठीक करने के लिए प्रति कुएं 2.5 × 10 4पैनसी -1 या 4 × 104 एआर 42 जे कोशिकाओं को बीज देने की सिफारिश की जाती है।
  5. डीएमईएम में कोशिकाओं को 5% कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2) के साथ एक ह्यूमिडिफाइड वातावरण के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और 100 μg / mL स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त कल्चर करें।
    नोट: पैनसी -1 कोशिकाओं के लिए, सेल सीडिंग और निम्नलिखित चरणों के बीच 2 दिनों के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करने की सिफारिश की जाती है। इस समय के बाद, कोशिकाओं को स्थानांतरित किया जा सकता है, इलाज किया जा सकता है, या लगाया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल गैर-संक्रमित पैनसी -1 कोशिकाओं में जेमसिटाबाइन के साथ उपचार और गैर-संक्रमित एआर 42 जे कोशिकाओं के लिए भेदभाव और पीपी 242 उपचार का उदाहरण देता है।

2. कोशिकाओं का इलाज

  1. पैनसी -1 कोशिकाओं के लिए जेमसिटाबाईन उपचार
    1. बीज बोने के 2 दिन बाद डीएमईएम में 1 μg/μL जेमसिटाबाईन का घोल तैयार करें। 20 μM के अंतिम कमजोर पड़ने को प्राप्त करने के लिए 1 μg / μL जेमसिटाबाइन समाधान के 2.6 μL के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से इलाज करें।
    2. इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  2. एआर 42 जे भेदभाव और पीपी 242 उपचार
    1. डीएमईएम में 4 μg / mL डेक्सामेथासोन का घोल तैयार करें।
    2. 100 एनएम का अंतिम कमजोर पड़ने के लिए 4 μg / mL डेक्सामेथासोन समाधान के 4.9 μL के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से इलाज करें।
    3. इनक्यूबेटर में 48 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    4. माध्यम को हटा दें, और 1 μM का अंतिम कमजोर पड़ने प्राप्त करने के लिए प्रत्येक को 1 mM PP242 के 0.5 μL के साथ अच्छी तरह से इलाज करें।
    5. इनक्यूबेटर में 2 घंटे के लिए कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।

3. कोशिकाओं को ठीक करना और स्थिर करना।

  1. ठंडे मेथनॉल के साथ 24-वेल प्लेट और कोल्ड फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (पीबीएस; 137 एमएम एनएसीएल, 2.7 एमएम केसीएल, 8 एमएम एनए 2 एचपीओ 4, 2 एमएम केएच2पीओ4) के साथ 6-वेल प्लेट तैयार करें। उन्हें बर्फ पर रखें।
  2. प्रत्येक कवरस्लिप को चिमटी के साथ लें, इसे पीबीएस में दो बार धोएं, और मेथनॉल में 6 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।

4. कोशिकाओं को अवरुद्ध करना

  1. पीबीएस में प्रत्येक कवरस्लिप को दो बार धोएं, और पीबीएस (ब्लॉकिंग समाधान) में 10% भ्रूण गोजातीय सीरम में 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
    नोट: इस चरण में, प्रोटोकॉल रोक दिया जा सकता है। कवरलिप्स को ब्लॉकिंग समाधान में फ्रिज में रात भर संग्रहीत किया जा सकता है, और प्रोटोकॉल को अगले दिन जारी रखा जा सकता है।

5. प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ कवरलिप्स को इंजेक्ट करना।

  1. ब्लॉकिंग समाधान में एंटी-एलसी 3 का 1: 1,000 समाधान तैयार करें, और इसे बर्फ पर बनाए रखें।
  2. मल्टी-वेल ढक्कन के ऊपर प्रयोगशाला सीलिंग फिल्म का एक टुकड़ा रखें।
  3. सीलिंग फिल्म के ऊपर एंटी-एलसी 3 समाधान के प्रति कवरस्लिप में एक बूंद (25 μL) रखें।
  4. प्रत्येक कवरस्लिप को चिमटी के साथ लें, और इसे प्राथमिक एंटीबॉडी ड्रॉप पर रखें, इस बात का ध्यान रखें कि सेल साइड समाधान के संपर्क में है।
  5. एक फ्लैट-बॉटम प्लास्टिक बॉक्स में कागज के एक आर्द्र टुकड़े को रखकर एक आर्द्र कक्ष तैयार करें।
  6. मल्टी-वेल प्लेट को आर्द्रता कक्ष में रखें, इसे पन्नी के साथ कवर करें, और फ्रिज में रात भर इनक्यूबेट करें।

6. द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ कवरलिप्स को इंजेक्ट करना।

  1. आर्द्रता कक्ष से मल्टी-वेल प्लेट को हटा दें, और कवरलिप्स को मल्टी-वेल प्लेट में वापस रखें।
  2. पीबीएस के साथ तीन धोने का काम करें।
  3. ब्लॉकिंग समाधान में 1: 800 के कमजोर पड़ने के साथ फ्लोरोसेंटली लेबल एंटी-खरगोश का एक समाधान तैयार करें, और इसे प्रकाश से सुरक्षित बर्फ पर बनाए रखें।
  4. मल्टी-वेल ढक्कन के ऊपर एक सीलिंग फिल्म का टुकड़ा रखें।
  5. सीलिंग फिल्म के ऊपर एंटी-खरगोश समाधान के प्रति कवरस्लिप में एक बूंद (25 μL) रखें।
  6. प्रत्येक कवरस्लिप को चिमटी के साथ लें, और इसे प्राथमिक एंटीबॉडी ड्रॉप पर रखें, इस बात का ध्यान रखें कि सेल साइड समाधान के संपर्क में है।
  7. प्रकाश से संरक्षित कमरे के तापमान (आरटी) पर 2 घंटे के लिए आर्द्रता कक्ष में मल्टी-वेल प्लेट को इनक्यूबेट करें।

7. 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिन्डोल (डीएपीआई) के साथ कोशिकाओं को धुंधला करना।

  1. आर्द्रता कक्ष से मल्टी-वेल प्लेट को हटा दें, और कवरलिप्स को मल्टी-वेल प्लेट में वापस रखें।
  2. पीबीएस के साथ तीन धोने का काम करें।
  3. पीबीएस (प्रकाश से संरक्षित) में DAPI का 300 nM समाधान तैयार करें।
  4. प्रत्येक कवरस्लिप को 10 मिनट के लिए DAPI समाधान के साथ इनक्यूबेट करें।
  5. पीबीएस के साथ तीन धोने का काम करें। मल्टी-वेल प्लेट को प्रकाश से सुरक्षित रखें।

8. मोंटाज

  1. पानी और कागज के एक टुकड़े के साथ दो बीकर तैयार करें।
  2. एक स्लाइड पर पॉलीविनाइल अल्कोहल-बीआईएस (ट्राइमिथाइलएल्यूमीनियम)-1,4-डायजाबिसाइक्लो[2.2.2] ऑक्टेन जोड़ (पीवीए-डीएबीसीओ) समाधान के प्रति कवरस्लिप में एक बूंद (10 μL) रखें।
    नोट: पीवीए-डीएबीसीओ अल्ट्राप्योर पानी में 0.25 एम डीएबीसीओ, 10% डब्ल्यू / वी पीवीए, 20% ग्लिसरॉल और 50% ट्रिस एचसीएल (1.5 एम, पीएच 8.8) के संयोजन से तैयार किया गया है।
  3. प्रत्येक कवरस्लिप को चिमटी के साथ लें, इसे प्रत्येक पानी के बीकर में धोएं, इसे कागज में सुखाएं, और इसे पीवीए-डीएबीसीओ ड्रॉप (समाधान के संपर्क में कोशिकाओं के साथ) पर रखें।
  4. इसे रात भर सूखने दें, प्रकाश से सुरक्षित रखें।

9. कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी देखने और छवि कैप्चर

  1. लगभग63x17 के उद्देश्य का उपयोग करके एक उल्टे कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप में कवरलिप्स की कल्पना करें।
  2. लेबल किए गए कोशिकाओं की प्रतिनिधि छवियों को कैप्चर करें।

10. एलसी 3 डॉट्स की मात्रा निर्धारित करना

  1. कैप्चर किए गए चैनलों, जैसे ".czi" वाली प्रत्येक छवि फ़ाइल को खोलने के लिए ImageJ (FIJI) स्क्रीन में खींचें और छोड़ें। संवाद बॉक्स में ठीक पर क्लिक करें, और कंसोल विंडो बंद करें।
  2. छवि टैब से, रंग > विभाजित चैनल का चयन करें।
  3. LC3 छवि के अलावा अन्य चैनलों से संबंधित छवियों को बंद करें।
  4. छवि टैब से, रंग संतुलन समायोजित करें > का चयन करें
  5. अधिकतम स्लाइडर को बाईं ओर ले जाएं जब तक कि छवि सेल आकृति की कल्पना करने के लिए संतृप्त न हो जाए।
  6. फ्रीहैंड चयन उपकरण के साथ सेल की रूपरेखा बनाएं।
  7. रंग समायोजन रीसेट करने के लिए रीसेट बटन पर क्लिक करें।
  8. संपादित करें टैब से, चयनित आइटम को काटने के लिए कट का चयन करें.
  9. छवि को सहेजे बिना बंद करें.
  10. संपादन टैब से, पेस्ट का चयन करें.
  11. विश्लेषण मेनू में, उपकरण 3 डी ऑब्जेक्ट्स काउंटर चुनें।
  12. सीमा निर्धारित करें। इस अध्ययन में दिए गए उदाहरण में, सीमा 2,000 पर निर्धारित की गई है।
  13. आकार फ़िल्टर सेट करें। इस अध्ययन में, यह 50 और 500 के बीच सेट किया गया है।
  14. सुनिश्चित करें कि बॉक्स ऑब्जेक्ट ्स और सारांश चिह्नित हैं।
  15. OK पर क्लिक करें। डॉट्स की संख्या को सारांश में खोजी गई वस्तुओं के रूप में वर्णित किया जाएगा।

Figure 1
चित्रा 1: एलसी 3 इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध आरेख। योजनाबद्ध आरेख जो एलसी 3 इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए प्रदान किए गए सामान्य प्रोटोकॉल का प्रतिनिधित्व करता है। BioRender.com के साथ बनाई गई आकृति। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल विभिन्न स्थितियों में ऑटोफैगी के स्तर को निर्धारित करने के लिए अग्नाशयी सेल लाइनों में एलसी 3 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस करता है। इस प्रयोग का परिणाम एलसी 3 और डीएपीआई के अनुरूप लाल और नीले चैनलों से सेलुलर छवियों का अवलोकन था। एलसी 3 छवियां इस प्रोटीन के सेलुलर वितरण को इंगित करती हैं, जबकि डीएपीआई परमाणु स्थानीयकरण को दर्शाती है। चित्रा 2 ए एलसी 3 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस की एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है और बेसल या जेमसिटाबाइन उपचार स्थितियों के तहत पैनसी -1 कोशिकाओं में डीएपीआई धुंधला होने के साथ इसका विलय करता है। फिजी में टूल 3 डी ऑब्जेक्ट्स काउंटर का उपयोग करके एलसी 3 धुंधला होने की छवियों के एक सेट का विश्लेषण किया गया था। इस सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, प्रति सेल एलसी 3 डॉट्स की मात्रा निर्धारित की गई थी। चित्रा 2 बी में बार ग्राफ बेसल बनाम जेमसिटाबाइन उपचार स्थितियों के तहत पैनसी -1 कोशिकाओं में एलसी 3 डॉट परिमाणीकरण के परिणामों को दर्शाता है। इस ग्राफ में, जेमसिटाबाईन उपचार के तहत एलसी 3 डॉट्स में काफी वृद्धि हुई, जिसमें एलसी 3 डॉट्स की संख्या सीधे ऑटोफैजिक गतिविधि का संकेत देती है। हमने पहले यह भी प्रदर्शित किया था कि जेमसिटाबाईन अग्नाशय केकैंसर कोशिकाओं में ऑटोफैगी को ट्रिगर करता है। कुल मिलाकर, इस लेख में प्रस्तुत विधि इन कोशिकाओं में जेमसिटाबाईन द्वारा प्रेरित ऑटोफैगी सक्रियण में वृद्धि के स्तर का पता लगाने की अनुमति देती है।

जबकि यह प्रोटोकॉल अग्नाशय के कैंसर कोशिकाओं में ऑटोफैजिक गतिविधि निर्धारित करने के लिए एलसी 3 इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करने पर केंद्रित है, इसे संभावित रूप से अन्य सेल लाइनों पर लागू किया जा सकता है, जिसमें अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक मॉडल शामिल हैं। शारीरिक प्रतिक्रियाओं का आकलन करने में विधि की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए, एआर 42 जे सेल लाइन का उपयोग किया गया था। यद्यपि ये कोशिकाएं एक चूहे के एक्सोक्राइन अग्न्याशय ट्यूमर से प्राप्त होती हैं, उन्हें ग्लुकोकोर्टिकोइड उत्तेजना के साथ एक्सोक्राइन कोशिकाओं में विभेदित किया जा सकता है, इस प्रकार उन्हें एक उपयुक्त अग्नाशय मॉडल 8,14,18 बनाया जा सकता है। एआर 42 जे कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए 100 एनएम डेक्सामेथासोन उपचार के साथ विभेदित किया गया था, इसके बाद ऑटोफैगी15 को प्रेरित करने के लिए एमटीओआर अवरोधक पीपी 242 के साथ उपचार किया गया था। प्राप्त परिणाम चित्रा 3 में प्रस्तुत किए गए हैं, जो पीपी 242 उपचार के तहत प्रति सेल एलसी 3 डॉट्स की संख्या में उल्लेखनीय वृद्धि दर्शाता है।

इस प्रकार, हमने दिखाया है कि प्रस्तुत विधि कैंसर कोशिकाओं और अधिक शारीरिक मॉडल दोनों में ऑटोफैजिक गतिविधि का आकलन करने के लिए प्रभावी है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि प्रस्तुत प्रोटोकॉल से मामूली विचलन के परिणामस्वरूप अव्याख्याय परिणाम हो सकते हैं।

चित्रा 4 ए एक उप-मानक प्रयोग से एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है जिसमें कवरलिप्स पर बहुत अधिक कोशिकाओं को बीज दिया गया था, और अत्यधिक संगम प्राप्त किया गया था। इस तरह का प्रयोग विभिन्न कारणों से अव्याख्याय हो सकता है। सबसे पहले, इस काम में उल्लिखित सेलुलर प्रकार एक्सोक्राइन अग्न्याशय से प्राप्त होते हैं, जहां कोशिकाओं को एसिनी में समूहीकृत किया जाता है। एक अत्यधिक संगम के तहत, ये कोशिकाएं एक-दूसरे के ऊपर ढेर हो जाती हैं और बढ़ती हैं (जैसे कि चित्रा 4 ए में सेल 1 और सेल 2, जो सेल 3 और सेल 4 से ऊपर हैं)। यह घटना व्यावहारिक रूप से यह जानना असंभव बनाती है कि एलसी 3 डॉट्स किस सेल से संबंधित हैं, इस प्रकार प्रति सेल डॉट्स की संख्या का अनुमान लगाना बहुत मुश्किल हो जाता है। दूसरी ओर, उच्च कंफ्लुएंसी पर कोशिकाओं पर जोर दिया जाता है, जो ऑटोफैगी को ट्रिगर करता है। नतीजतन, पृष्ठभूमि ऑटोफैजिक गतिविधि में वृद्धि के कारण नियंत्रण और उपचारित कोशिकाओं के बीच ऑटोफैजिक स्तरों में अंतर कम हो सकता है।

चित्रा 4 बी में, एक अन्य प्रकार के उप-प्रयोग से एक प्रतिनिधि छवि दिखाई गई है जिसमें कोशिकाओं को मेथनॉल के बजाय पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ तय किया गया था। जबकि यह निर्धारण विधि आम तौर पर विभिन्न प्रकार के प्रोटीन ों को संरक्षित करने के लिए प्रभावी होती है, यह एलसी 3 के लिए उपयुक्त नहीं है, क्योंकि परिणामी छवि इसके वास्तविक वितरण को सटीक रूप से प्रतिबिंबित नहीं करती है। यह तकनीकी गलती निम्न और उच्च ऑटोफैजिक स्तरों के बीच अंतर खोजना असंभव बना सकती है।

आम तौर पर, सेल लाइनों को बीजारोपण के 1 दिन बाद उपचारित, स्थानांतरित या तय किया जा सकता है। फिर भी, यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि, पैनसी -1 कोशिकाओं के मामले में, प्रयोग के बाद के चरणों के साथ आगे बढ़ने से पहले ग्लास कवरलिप के लिए कोशिकाओं के पूर्ण पालन को सुनिश्चित करने के लिए सीडिंग के बाद 2 दिनों तक इंतजार करना आवश्यक है। चित्रा 4 सी एक प्रयोग से एक प्रतिनिधि छवि दिखाता है जिसमें कोशिकाओं को बीज बोने के सिर्फ 1 दिन बाद जेमसिटाबाइन के साथ इलाज किया गया था। आंकड़े से, यह देखा जा सकता है कि इस प्रयोग में कोशिकाओं का एक गोल आकार था। इस आकृति विज्ञान ने साइटोप्लाज्म और नाभिक के बीच संबंध को कम कर दिया, जिससे एलसी 3 के इंट्रासेल्युलर वितरण को समझना और कम और उच्च ऑटोफैजिक स्तरों के बीच भेदभाव करना मुश्किल हो गया। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि एआर 42 जे में यह समस्या नहीं है, और वे सीडिंग के बाद के दिन इलाज या तय होने के लिए तैयार हैं।

मेथनॉल निर्धारण का समय विविध होने पर एक और उप-मानक परिणाम प्राप्त किया जा सकता है। निर्धारण का कम समय अपूर्ण निर्धारण का कारण बन सकता है, जैसा कि चित्रा 4 डी में दर्शाया गया है, जहां कोशिकाओं को 3 मिनट के लिए तय किया गया था। अपूर्ण निर्धारण उचित एलसी 3 इम्यूनोलेबलिंग में हस्तक्षेप कर सकता है, जिससे अस्पष्ट छवियां और उप-परिमाणीकरण हो सकता है।

Figure 2
चित्रा 2: बेसल या जेमसिटाबाइन स्थितियों और एलसी 3 डॉट परिमाणीकरण के तहत पैनसी -1 कोशिकाओं में एलसी 3 इम्यूनोफ्लोरेसेंस। पैनसी -1 कोशिकाओं को या तो 24 घंटे के लिए 20 μM जेमसिटाबाइन के साथ इलाज किया गया था या अनुपचारित छोड़ दिया गया था और फिर एंटी-एलसी 3 के साथ इम्यूनोलेबल किया गया था। (ए) प्रत्येक स्थिति की प्रतिनिधि छवियां दिखाई जाती हैं। स्केल बार: 10 μm. (B) बार ग्राफ प्रत्येक स्थिति के लिए प्रति सेल LC3 डॉट्स के साधनों (SEM) के साधनों और मानक त्रुटियों का प्रतिनिधित्व करता है। एन = तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्रति शर्त 10 कोशिकाएं। एक छात्र के टी-टेस्ट द्वारा पी < 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: बेसल या पीपी 242 स्थितियों और एलसी 3 डॉट परिमाणीकरण के तहत एआर 42 जे कोशिकाओं में एलसी 3 इम्यूनोफ्लोरेसेंस। एआर 42 जे कोशिकाओं को 48 घंटे के लिए 100 एनएम डेक्सामेथासोन के साथ विभेदित किया गया था और फिर या तो 2 घंटे के लिए 1 μM PP242 के साथ इलाज किया गया था या अनुपचारित छोड़ दिया गया था, इसके बाद एंटी-एलसी 3 के साथ इम्यूनोलेबलिंग की गई थी। (ए) प्रत्येक स्थिति की प्रतिनिधि छवियां दिखाई जाती हैं। स्केल बार: 10 μm. (B) बार ग्राफ प्रत्येक स्थिति के लिए प्रति सेल LC3 डॉट्स के साधनों (SEM) के साधनों और मानक त्रुटियों का प्रतिनिधित्व करता है। एन = तीन स्वतंत्र प्रयोगों से प्रति शर्त 10 कोशिकाएं। ** एक छात्र के टी-टेस्ट द्वारा पी < 0.01। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: उप-मानक प्रयोग। उप-मानक प्रयोगों में एलसी 3 इम्यूनोफ्लोरेसेंस की प्रतिनिधि छवियां दिखाई जाती हैं। (ए) अतिरिक्त संगम: 7 ×10 4 पैनसी -1 कोशिकाओं को बीज दिया गया, जेमसिटाबाइन के साथ इलाज किया गया, और एंटी-एलसी 3 के साथ इम्यूनोलेबल किया गया। चार कोशिकाओं को यह दिखाने के लिए चिह्नित किया गया है कि सेल 1 और सेल 2 सेल 3 और सेल 4 से ऊपर हैं। (बी) पीएफए निर्धारण: पैनसी -1 कोशिकाओं को जेमसिटाबाइन के साथ इलाज किया गया था, पीएफए के साथ लगाया गया था, और एंटी-एलसी 3 के साथ इम्यूनोलेबल किया गया था। (सी) अधूरा खिंचाव: पीएएनसी -1 कोशिकाओं को बीज बोने के एक दिन बाद जेमसिटाबाइन के साथ इलाज किया गया और एंटी-एलसी 3 के साथ इम्यूनोलेबल किया गया। (डी) अपूर्ण निर्धारण: पैनसी -1 कोशिकाओं को जेमसिटाबाइन के साथ इलाज किया गया था, 3 मिनट के लिए मेथनॉल के साथ लगाया गया था, और एंटी-एलसी 3 के साथ इम्यूनोलेबल किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधि सेल में अंतर्जात एलसी 3 वितरण की कल्पना करने और विभिन्न परिस्थितियों में ऑटोफैजिक स्तरों को निर्धारित करने की अनुमति देती है। एलसी 3 वितरण का विश्लेषण करने और ऑटोफैगी सक्रियण निर्धारित करने के लिए उपयोग की जाने वाली एक और समान विधि में प्रतिदीप्ति-लेबल एलसी 3 अभिकर्मक (जैसे आरएफपी-एलसी 3)19 शामिल है। आरएफपी-एलसी 3 अभिकर्मक में निर्धारण की आवश्यकता नहीं है (जो लाइव सेल इमेजिंग20 में इस विधि को लागू करने की अनुमति देता है), सस्ता है, और एलसी 3 एंटीबॉडी प्रतिक्रिया पर निर्भर नहीं है। दूसरी ओर, एलसी 3 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस में अंतर्जात एलसी 3 की एक छवि प्रदान करने का लाभ होता है, इस प्रकार एलसी 3 ओवरएक्प्रेशन से संबंधित संभावित मुद्दों से बचा जाता है, जैसे कि प्रोटीन समुच्चय का गठन जो ऑटोफैगी21 से स्वतंत्र हैं। इसके अलावा, यह विधि कोशिकाओं को स्थानांतरित करने की आसानी पर निर्भर नहीं करती है, जिसका अर्थ है कि यह विविध सेल लाइनों पर लागू होता है। हालांकि, उपयोग किए जाने वाले एलसी 3 एंटीबॉडी और इसकी प्रतिक्रिया के आधार पर, कुछ सेलुलर लाइनें हैं जिनमें यह काम नहीं कर सकता है। कुछ एंटीबॉडी कुछ प्रजातियों के लिए अच्छी तरह से काम कर सकते हैं लेकिन दूसरों के लिए नहीं, भले ही वे सैद्धांतिक रूप से विभिन्न प्रजातियों के साथ संगत हों। इस प्रोटोकॉल (LC3B D11) में उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी के मामले में, हमने पाया है कि यह मानव कोशिकाओं (PANC-1, HEK293T, HeLa) और चूहे की कोशिकाओं (AR42J) के लिए पूरी तरह से काम करता है। हालांकि, यह माउस कोशिकाओं (एमईएफ कोशिकाओं) के लिए काम नहीं करता है, क्योंकि हमने निरर्थक परमाणु धुंधलापन देखा है। यह ध्यान देने योग्य है कि एलसी 3 स्पॉट का परिमाणीकरण, चाहे अंतर्जात या अतिरंजित, ऑटोफैगी सक्रियण में परिवर्तन के बीच अंतर करने में सीमाएं हैं, जो एलसी 3-II के बढ़े हुए उत्पादन और एलसी 3-II गिरावट में परिवर्तन का संकेत दे सकता है, जो एक ऑटोफैजिक फ्लक्स स्थिति का संकेत दे सकता है। ऑटोफैगी गतिविधि का व्यापक रूप से आकलन करने के लिए अतिरिक्त तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, आरएफपी-जीएफपी-एलसी 3 अभिव्यक्ति का उपयोग लाइसोसोम22,23 के अंदर या बाहर एलसी 3-II के बीच अंतर करके एक सटीक मूल्यांकन प्रदान कर सकता है।

जैसा कि चित्रा 4 में दिखाया गया है, प्रोटोकॉल में कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं जिन्हें संशोधित नहीं किया जाना चाहिए, यह देखते हुए कि उनके संशोधन से उप-मानक परिणाम हो सकते हैं। सबसे पहले, बीज ति होने वाली कोशिकाओं की सही संख्या निर्धारित करना महत्वपूर्ण है। जब पर्याप्त कोशिकाओं को बीज नहीं दिया जाता है, तो वे अभिकर्मक या उपचार का विरोध नहीं करते हैं और गोल रहते हैं। इसके विपरीत, जब कोशिकाओं को अधिक मात्रा में बीज दिया जाता है, तो वे पड़ोसी कोशिकाओं के शीर्ष पर बढ़ते हैं, जिससे व्यक्तिगत कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित करना और उनके एलसी 3 डॉट्स के बीच अंतर करना चुनौतीपूर्ण हो जाता है। विशेष रूप से, उन स्थितियों में जहां कोशिकाएं निकटता में हैं, लेकिन अतिव्यापी नहीं हैं जैसा कि चित्रा 4 ए में दर्शाया गया है, प्रत्येक सेल24 से संबंधित सकारात्मक मार्करों के बीच अंतर करने के लिए ईजीएफआर जैसे विशिष्ट झिल्ली मार्करों के साथ इम्यूनोस्टेनिंग का उपयोग करना सहायक हो सकता है। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ई-कैडरिन और ईपीकैम जैसे कुछ मार्कर पैनसी -1 कोशिकाओं में उनकी कम झिल्ली अभिव्यक्ति के कारण इस उद्देश्य के लिए उपयुक्त नहीं हैं, जो इस सेल प्रकार25,26,27 से जुड़े विशिष्ट उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण प्रक्रिया के परिणामस्वरूप होता है। दूसरे, विशेष रूप से पैनसी -1 कोशिकाओं के साथ काम करते समय, सीडिंग और प्रयोग के बाद के चरणों के बीच कम से कम 1 दिन इंतजार करना आवश्यक है। इसके विपरीत, जब कोई सही समय की प्रतीक्षा नहीं करता है, तो कोशिकाओं को गोल किया जा सकता है, जिससे परिणामों की व्याख्या करना मुश्किल हो जाता है। तीसरा, निर्धारण इस प्रोटोकॉल में एक महत्वपूर्ण कदम है। जैसा कि हमने दिखाया है, विधि केवल पर्याप्त मेथनॉल निर्धारण के साथ काम करती है। पैराफॉर्मलडिहाइड निर्धारण एलसी 3 इम्यूनोलेबलिंग के लिए सही ढंग से काम नहीं करता है, जबकि मेथनॉल निर्धारण समय को संशोधित नहीं किया जाना चाहिए, यह देखते हुए कि कम समय से अपूर्ण निर्धारण हो सकता है। हमने 1 घंटे तक मेथनॉल निर्धारण समय का परीक्षण किया और एलसी 3 लेबलिंग में अंतर नहीं देखा। फिर भी, हम लंबे समय तक निर्धारण समय के उपयोग के खिलाफ सलाह देते हैं, क्योंकि मेथनॉल निर्धारण से घुलनशील सेलुलर प्रोटीन और मुक्त फ्लोरोसेंट अणुओंका नुकसान हो सकता है। इसलिए, सटीक और भरोसेमंद परिणाम सुनिश्चित करने के लिए मानक निर्धारण समय का पालन करने की सिफारिश की जाती है।

वर्णित प्रोटोकॉल में कुछ संशोधन स्वीकार किए जा सकते हैं। उदाहरण के लिए, 24-वेल प्लेट के बजाय 12-वेल प्लेट का उपयोग किया जा सकता है, साथ ही 12 मिमी कवरलिप्स के बजाय 15 मिमी गोल कवरलिप्स पर कोशिकाओं को बढ़ाया जा सकता है। इस मामले में, यह माना जाना चाहिए कि बीज की जाने वाली कोशिकाओं की संख्या, साथ ही साथ उपयोग किए जाने वाले अभिकर्मकों की मात्रा, इस प्रोटोकॉल में वर्णित लोगों की तुलना में अधिक होगी। इस मामले में, 4 × 10 4 पैनसी -1 और 6.5 × 104 एआर 42 जे को बीज दिया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, उपयोग किए गए ब्लॉकिंग समाधान को पीबीएस में 1% बीएसए की तरह दूसरों के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, और इससे समान परिणाम मिलेंगे। इसी तरह, परिणामों में काफी बदलाव किए बिना ब्लॉकिंग समय को 24 घंटे तक बढ़ाया जा सकता है। एंटीबॉडी इनक्यूबेशन समय और एकाग्रता को समायोजित किया जा सकता है और बदल सकता है, उदाहरण के लिए, यदि एक और एलसी 3 एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है। हालांकि इस अध्ययन में पीवीए-डीएबीसीओ समाधान तैयार किया गया है, वाणिज्यिक मोंटाज समाधान का भी उपयोग किया जा सकता है। दूसरी ओर, परिमाणीकरण विधि को संशोधित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, छवियों पर कुछ फिल्टर या मास्क लागू करना संभव है, और डॉट परिमाणीकरण के लिए एक वैकल्पिक उपकरण का उपयोग किया जा सकता है।

इस काम में, हमने अग्नाशय ी कैंसर कोशिकाओं के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए एलसी 3 के इम्यूनोफ्लोरेसेंस के आवेदन को निर्देशित किया। इन कोशिकाओं में, ऑटोफैगी बेसल रूप से सक्रिय होती है और विभिन्न तनावपूर्ण स्थितियों, जैसे कीमोथेरेपी, हाइपोक्सिया, या पोषक तत्वों की कमी11,12 की प्रतिक्रिया के रूप में संशोधित की जा सकती है। इन कोशिकाओं में ऑटोफैगी का निर्धारण कीमोथेरेपी, रेडियोथेरेपी या अन्य उपचारों के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए लागू हो सकता है जो ऑटोफैगी को नियंत्रित करते हैं। जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, प्रस्तुत विधि को शारीरिक मॉडल में लागू किया जा सकता है। यद्यपि, इस काम में, हमने ऑटोफैजिक स्तरों की मात्रा का ठहराव पर ध्यान केंद्रित किया, एलसी 3 का इम्यूनोफ्लोरेसेंस एलसी 3 और विविध प्रोटीन के बीच कोलोकलाइजेशन के मूल्यांकन की भी अनुमति दे सकता है। उदाहरण के लिए, यह ऑटोफैजिक प्रक्रिया में विभिन्न बिंदुओं पर प्रोटीन को चिह्नित करने के लिए एक यंत्रवत दृष्टिकोण के रूप में काम कर सकता है और मूल्यांकन कर सकता है कि एलसी 3 के साथ कोलोकलाइजेशन कुछ उपचारों या कुछ प्रोटीनों के डाउनरेग्यूलेशन से प्रभावित होता है या नहीं। इस तरह, यह निर्धारित किया जा सकता है, उदाहरण के लिए, क्या कुछ ऑटोफैगी अवरोधक एलसी 3 संयुग्मन से पहले या बाद में ऑटोफैजिक फ्लक्स को बाधित करता है। अंत में, पशु मॉडल या मानव बायोप्सी नमूनों में ऑटोफैगी सक्रियण निर्धारित करने के लिए विधि को ऊतक के नमूनों के लिए भी अनुकूलित किया जा सकता है।

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Disclosures

हितों के टकराव की कोई घोषणा नहीं की गई थी।

Acknowledgments

इस काम को ब्यूनस आयर्स विश्वविद्यालय (यूबीएसीवाईटी 2018-2020 20020170100082बीए), राष्ट्रीय वैज्ञानिक अनुसंधान और प्रौद्योगिकी परिषद (सीओएनआईसीईटी) (पीआईपी 2021-2023 जीआई − 11220200101549सीओ; और पीयूई 22920170100033) और राष्ट्रीय वैज्ञानिक और तकनीकी संवर्धन एजेंसी (पीआईसीटी 2019-0166) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10x Phosphate-Buffered Saline (PBS) Corning 46-013-CM
12 mm round coverslips HDA CBR_OBJ_6467
24 Well- Cell Culture Plate Sorfa 220300
Absolute ethanol Biopack 2207.10.00
Alexa Fluor 594 Donkey anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen R37119
Confocal Laser Scanning Microscope Zeiss LSM 800
Dexamethasone Sigma Aldrich D4902
DMEN Sartorius 01-052-1A
Fetal Bovine Serum NATOCOR  Lintc-634
Gemcitabina Eli Lilly VL7502
LC3B (D11) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology 3868S
Methanol Anedra 6197
Parafilm "M" (Laboratory Sealing Film) Bemis/Curwood PM-996
Pen-Strep Solution Sartorius 03-031-1B
PP242 Santa Cruz Biotechnology SC-301606
Trypsin EDTA Gibco 11570626

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References

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जीव विज्ञान अंक 194
एलसी 3 इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग करके दो अलग-अलग अग्नाशयी सेल मॉडल में ऑटोफैगी के स्तर का मूल्यांकन करना
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Renna, F. J., Herrera Lopez, M.,… More

Renna, F. J., Herrera Lopez, M., Manifava, M., Ktistakis, N. T., Vaccaro, M. I. Evaluating Autophagy Levels in Two Different Pancreatic Cell Models Using LC3 Immunofluorescence. J. Vis. Exp. (194), e65005, doi:10.3791/65005 (2023).

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