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Neuroscience

पृथक माउस मस्तिष्क माइक्रोग्लिया में इंट्रान्यूक्लियर फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके ग्लोबल हिस्टोन पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधनों की मात्रा का ठहराव

Published: September 15, 2023 doi: 10.3791/65080
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Djavad Mowafaghian Centre for Brain Health, University of British Columbia, 2Graduate Program in Neuroscience, Djavad Mowafaghian Centre for Brain Health, University of British Columbia

Summary

यह काम पृथक मस्तिष्क माइक्रोग्लिया में इंट्रान्यूक्लियर प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके वैश्विक हिस्टोन संशोधनों की मात्रा का ठहराव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है। काम में माइक्रोग्लिया अलगाव प्रोटोकॉल भी शामिल है जिसका उपयोग डेटा संग्रह के लिए किया गया था।

Abstract

जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण आंशिक रूप से क्रोमैटिन संरचना में संशोधनों द्वारा होता है, जिसमें हिस्टोन पूंछ के लिए पोस्टट्रांसलेशनल संशोधनों को जोड़ना और हटाना शामिल है। हिस्टोन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन (एचपीटीएम) या तो जीन अभिव्यक्ति या दमन की सुविधा प्रदान कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, हिस्टोन पूंछ लाइसिन अवशेषों का एसिटिलीकरण सकारात्मक चार्ज को बेअसर करता है और पूंछ और नकारात्मक चार्ज डीएनए के बीच बातचीत को कम करता है। हिस्टोन पूंछ-डीएनए इंटरैक्शन में कमी के परिणामस्वरूप अंतर्निहित डीएनए की पहुंच में वृद्धि होती है, जिससे प्रतिलेखन कारक पहुंच में वृद्धि होती है। एसिटिलीकरण चिह्न ब्रोमोडोमेन युक्त ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर के लिए एक मान्यता स्थल के रूप में भी कार्य करता है, जिसके परिणामस्वरूप जीन अभिव्यक्ति में वृद्धि होती है। हिस्टोन के निशान को सेल भेदभाव के दौरान और विभिन्न सेलुलर वातावरण और उत्तेजनाओं के जवाब में गतिशील रूप से विनियमित किया जा सकता है। जबकि अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोणों ने व्यक्तिगत हिस्टोन संशोधनों के लिए जीनोमिक स्थानों को चिह्नित करना शुरू कर दिया है, केवल एक संशोधन की समवर्ती जांच की जा सकती है। यह देखते हुए कि सैकड़ों अलग-अलग एचपीटीएम हैं, हमने वैश्विक एचपीटीएम का एक उच्च थ्रूपुट, मात्रात्मक माप विकसित किया है जिसका उपयोग अधिक व्यापक जीनोम अनुक्रमण दृष्टिकोण आयोजित करने से पहले हिस्टोन संशोधनों को स्क्रीन करने के लिए किया जा सकता है। यह प्रोटोकॉल वैश्विक एचपीटीएम का पता लगाने के लिए एक प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित विधि का वर्णन करता है और विवो ऊतकों में से संस्कृति या पृथक कोशिकाओं में कोशिकाओं का उपयोग करके आयोजित किया जा सकता है। हम पृथक माउस मस्तिष्क माइक्रोग्लिया से उदाहरण डेटा प्रस्तुत करते हैं ताकि बैक्टीरिया-व्युत्पन्न प्रतिरक्षा उत्तेजना (लिपोपॉलेसेकेराइड) के जवाब में एचपीटीएम में वैश्विक बदलावों का पता लगाने के लिए परख की संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया जा सके। यह प्रोटोकॉल एचपीटीएम के तेजी से और मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है और इसे किसी भी ट्रांसक्रिप्शनल या एपिजेनेटिक नियामक पर लागू किया जा सकता है जिसे एंटीबॉडी द्वारा पता लगाया जा सकता है।

Introduction

एपिजेनेटिक्स उन तंत्रों का अध्ययन है जो अंतर्निहित डीएनए अनुक्रम को बदले बिना जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करते हैं। जीन अभिव्यक्ति का एपिजेनेटिक विनियमन कोशिकाओं के भीतर गतिशील है और विभिन्न पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के लिए तेजी से और समन्वित प्रतिक्रियाओं की अनुमति दे सकता है। न्यूक्लियोसोम के स्तर पर क्रोमैटिन संरचना में परिवर्तन के कारण गतिशील विनियमन आंशिक रूप से होता है, जिसमें हिस्टोन प्रोटीन (एच 2 ए, एच 2 बी, एच 3, एच 4) शामिल होते हैं, जो डीएनए1 द्वारा कसकर घाव किए गए ऑक्टेमर कोर में इकट्ठे होते हैं। हिस्टोन प्रोटीन और डीएनए के बीच की बातचीत प्रतिलेखन मशीनरी के लिए डीएनए की पहुंच को नियंत्रित कर सकती है, जो अंततः जीन अभिव्यक्ति और क्रोमैटिन जीव विज्ञानके अन्य पहलुओं को नियंत्रित कर सकती है। हिस्टोन प्रोटीन में असंरचित पूंछ होती है जिसमें सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए अवशेष होते हैं जो नकारात्मक चार्ज डीएनए रीढ़ के साथ इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन बनाते हैं। इन इंटरैक्शन के परिणामस्वरूप डीएनए की तंग पैकिंग होती है और डीएनए पहुंच कम हो जाती है। हिस्टोन पूंछ के लिए सहसंयोजक संशोधनों, हिस्टोन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (एचपीटीएम) कहा जाता है, इन इंटरैक्शन 3,4 को विनियमित कर सकते हैं। सबसे अच्छी तरह से विशेषता एचपीटीएम में से कुछ में हिस्टोन पूंछ एसिटिलेशन और मिथाइलेशन शामिल हैं, जो हिस्टोन पूंछ और डीएनए के बीच इलेक्ट्रोस्टैटिक इंटरैक्शन की आत्मीयता को बदल सकते हैं, जिसके परिणामस्वरूप अंतर्निहित डीएनए में अंतर पहुंच और प्रतिलेखन कारकों की भर्ती होती है जो विशिष्ट साइटों पर इन एचपीटीएम को पहचानते हैं। एचपीटीएम को एंजाइमों के तीन महत्वपूर्ण वर्गों द्वारा नियंत्रित किया जाता है जिन्हें पाठक कहा जाता है- जो पहचानते हैं, लेखक- जो जमा करते हैं, और इरेज़र- जो एचपीटीएम को हटाते हैं। इस प्रकार, पाठक, लेखक, या इरेज़र एंजाइमों की भर्ती या विघटन अंततः एचपीटीएम के परिदृश्य को बदल सकता है और क्रोमैटिन की संरचना और कार्य को नियंत्रित कर सकता है, जिससे सेलुलर जीव विज्ञान और फ़ंक्शन 3,4 को समझने के लिए उनके विनियमन और रीडआउट आवश्यक हो जाते हैं।

केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में कोशिकाएं एपिजेनेटिक रूप से लचीली होती हैं क्योंकि वे पर्यावरणीय उत्तेजनाओं के अनुकूल होने के लिए अपने प्रतिलेख को बदलते हैं। साक्ष्य जमा करने से पता चलता है कि डीएनए मेथिलिकरण, गैर-कोडिंग आरएनए और एचपीटीएम जैसे एपिजेनोम में परिवर्तन, स्मृति गठन और सिनैप्टिक फ़ंक्शन5 में एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं। प्रासंगिक पाठकों, लेखकों, या इरेज़र के हेरफेर के माध्यम से एचपीटीएम गतिशीलता को बाधित करना सहयोगी सीखने और दीर्घकालिक पोटेंशिएशन 6,7,8 को अवरुद्ध या बढ़ा सकता है। माइक्रोग्लिया, सीएनएस के निवासी प्रतिरक्षा कोशिका, तेजी से उनके epigenome 9,10,11 में गतिशील परिवर्तन के माध्यम से प्रतिरक्षा उत्तेजना के जवाब में उनके प्रतिलेख को विनियमित. उनके स्थानीय मस्तिष्क पर्यावरण के लिए अनुकूलन के इस उच्च स्तर उन्हें मुश्किल एक अलग संदर्भ में जांच करने के लिए बनाता है के रूप में अध्ययनों से पता चला है कि epigenome और microglia के प्रतिलेख मस्तिष्क पर्यावरण11 से हटाने के बाद संस्कृति मीडिया में केवल कुछ ही घंटों के बाद बदल जाता है. इसके अलावा, माइक्रोग्लिया केवल मस्तिष्क की कोशिकाओं का 10% बनाने के रूप में, पूरे ऊतक स्तर पर परिवर्तन की जांच उपायों संवेदनशीलता औरविशिष्टता 12,13 की कमी. नतीजतन, एचपीटीएम स्तर, पूर्व विवो जैसे एपिजेनेटिक परिवर्तनों की जांच करने के लिए माइक्रोग्लिया को तेजी से अलग करने की आवश्यकता होती है।

एचपीटीएम की जांच करने के लिए आमतौर पर उपयोग की जाने वाली विधियों में क्रोमैटिन-इम्यूनोप्रिपिटेशन अनुक्रमण (चिप-सीक्यू) और लक्ष्य और टैगमेंटेशन अनुक्रमण (कट और टैग-सीक्यू) 4 के तहत दरार शामिल हैं। इन तकनीकों एक व्यक्ति एचपीटीएम के लिए अत्यधिक विशिष्ट हैं और एक विशिष्ट जीनोमिक संदर्भ के भीतर एचपीटीएम की उपस्थिति को सूचित कर सकते हैं, वे केवल एक ही प्रयोग11,14 के भीतर कई संभव एचपीटीएम में से एक की जांच कर सकते हैं इसलिए, इस तरह के प्रयोगों के साथ आगे बढ़ने से पहले, जो एक महत्वपूर्ण समय और धन निवेश की आवश्यकता होती है, यह पहले वैश्विक में परिवर्तन की जांच करके आगे की जांच के लिए संभावित दिलचस्प एचपीटीएम की सूची को कम करने के लिए बेहद मूल्यवान है एचपीटीएम के स्तर। वैश्विक एचपीटीएम स्तरों की जांच के लिए दो मुख्य दृष्टिकोण इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण हैं, लेकिन दोनों दृष्टिकोण केवल अर्ध-मात्रात्मक, कम-थ्रूपुट हैं, और बड़ी संख्या में ऊतक वर्गों या पृथक कोशिकाओं 15,16की आवश्यकता होती है। इस प्रकार, हमने एक अत्यधिक संवेदनशील, मात्रात्मक विधि विकसित करने का लक्ष्य रखा जिसका उपयोग वैश्विक एचपीटीएम स्तरों की तेजी से और एकल कोशिका स्तर पर जांच करने के लिए किया जा सकता है।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल इंट्रान्यूक्लियर फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके तेजी से वैश्विक एचपीटीएम स्तरों का पता लगाने में सक्षम बनाता है। कैंसर कोशिकाओं में पिछले अध्ययनों एक नैदानिक परिप्रेक्ष्य17,18 से वैश्विक स्तर की जांच के महत्व को उचित ठहराया है. यह भी ब्याज19,20 के विशिष्ट एचपीटीएम के जीनोमिक स्थान का आकलन करने से पहले एक स्क्रीनिंग विधि के रूप में वैश्विक स्तर का उपयोग करने के लिए अध्ययन के लिए आम है. माइक्रोग्लिया के लिए, कम सेल उपज के कारण अलगाव के बाद वैश्विक स्तर का आकलन करना चुनौतीपूर्ण है; पैन एट अल पृथक माइक्रोग्लिया से वैश्विक एचपीटीएम स्तर प्रस्तुत करता है, जिसमें तीन जानवरों से माइक्रोग्लिया को पश्चिमी धब्बा19 द्वारा प्रोटीन स्तर का पता लगाने में सक्षम करने के लिए पूल किया गया था। हमारे प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, हम बहुत कम सेल इनपुट के साथ वैश्विक परिवर्तनों का पता लगाने में सक्षम हैं, प्रति जानवर कई अंकों की स्क्रीनिंग को सक्षम करते हैं और नमूनों को पूल करने की आवश्यकता को समाप्त करते हैं।

यहां, हम पृथक माइक्रोग्लिया में मात्रात्मक इंट्रान्यूक्लियर प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से एचपीटीएम के स्तर का तेजी से पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। जबकि हम संक्षिप्तता के लिए एचपीटीएम परिमाणीकरण पर विशेष रूप से ध्यान केंद्रित करते हैं, इस प्रोटोकॉल का उपयोग पाठक, लेखक और इरेज़र एंजाइमों के वैश्विक स्तर को निर्धारित करने के लिए उसी तरह से किया जा सकता है। प्रोटोकॉल दो भागों में दिया जाता है: पहला, माइक्रोग्लिया के लिए अलगाव विधि और, दूसरा, एचपीटीएम स्तरों को निर्धारित करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित विधि। अलगाव विधि कोशिकाओं का उत्पादन करती है जिनका उपयोग आरएनए अलगाव और एचपीटीएम स्तर मूल्यांकन दोनों के लिए किया जा सकता है जो एक ही नमूने से जीन अभिव्यक्ति और एचपीटीएम स्तरों के मूल्यांकन की अनुमति देता है। इसके अलावा, एचपीटीएम मूल्यांकन के लिए विधि प्रोटोकॉल में संकेत के रूप में अन्य सेल प्रकार पर इस्तेमाल किया जा सकता है.

Protocol

सभी पशु देखभाल प्रोटोकॉल पशु देखभाल दिशानिर्देशों पर कनाडा परिषद के अनुसार ब्रिटिश कोलंबिया के पशु देखभाल समिति विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया.

1. माइक्रोग्लिया अलगाव के लिए मस्तिष्क पाचन

Figure 1
चित्रा 1: प्रोटोकॉल का सरल प्रवाह चार्ट। चूहों को पहले एचबीएसएस के साथ ट्रांसकार्डियली रूप से छिद्रित किया जाता है, और मस्तिष्क को विच्छेदित किया जाता है। मस्तिष्क को तब रासायनिक पाचन और यांत्रिक व्यवधान के माध्यम से अलग किया जाता है जिसके परिणामस्वरूप एकल कोशिका समरूप होती है। प्रतिरक्षा समृद्ध अंश को असंतत घनत्व ढाल के माध्यम से एकत्र किया जाता है, जिसके बाद कोशिकाओं को P2RY12के लिए दाग दिया जाता है। सना हुआ कोशिकाओं या तो 1) फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (एफएसीएस) के माध्यम से क्रमबद्ध आरएनए विश्लेषण या डाउनस्ट्रीम प्रोटीन विश्लेषण और / या 2) फिक्स्ड, पारगम्य, और intranuclear प्रोटीन के लिए दाग दिया जाता है. प्रोटीन स्तर प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा निर्धारित ब्याज के चैनल में औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता द्वारा मात्रा निर्धारित की है. नीले रंग में रंगीन बक्से प्रोटोकॉल चरण 1 का हिस्सा हैं) माइक्रोग्लिया अलगाव के लिए मस्तिष्क पाचन। लाल रंग में रंगे बक्से प्रोटोकॉल चरण 2 का हिस्सा हैं) प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए इंट्रान्यूक्लियर प्रवाह धुंधला हो जाना। BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. अभिकर्मकों की तैयारी
    नोट: यदि एचपीटीएम विश्लेषण के लिए आरएनए और कोशिकाओं दोनों को इकट्ठा करने के लिए निष्कर्षण की योजना बना रहे हैं, तो प्रतिलेखन और अनुवाद अवरोधकों को शामिल करने के लिए संशोधनों के लिए खंड 1.7.1 देखें। हालांकि, यह आवश्यक नहीं है अगर सिर्फ प्रोटीन संकेत का आकलन करें क्योंकि बर्फ पर रखे जाने पर कोशिकाएं काफी हद तक शांत होती हैं।
    1. प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (एफएसीएस) बफर (नमूना 20 एमएल): 2% बीएसए समाधान बनाने के लिए 1x हैंक्स संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) में गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) को भंग करें। 2% बीएसए समाधान में 1 एमएम की अंतिम एकाग्रता के लिए ईडीटीए भंग। फ़िल्टर 0.2 माइक्रोन फ़िल्टर का उपयोग करके स्टरलाइज़ करें और उपयोग करने से पहले 1 सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    2. पाचन बफर (प्रति नमूना 1 एमएल): एचबीएसएस में पपैन की एक शीशी को 0.5 एमएम ईडीटीए के साथ 1 एमएम एल-सिस्टीन में 20 यू/एमएल की अंतिम एकाग्रता में पुनर्गठित करें। कम से कम 10 मिनट के लिए या ऊतक को पचाने के लिए तैयार होने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर सक्रिय करें। उपयोग करने से ठीक पहले, सक्रिय पपैन समाधान में DNase I को 200 U/mL की अंतिम सांद्रता में जोड़ें। प्रयोग के दिन इसे तैयार करें और स्टोर न करें।
    3. आइसोटोनिक घनत्व ढाल समाधान (प्रति नमूना 5.5 एमएल): 1x एचबीएसएस की अंतिम एकाग्रता में ठंडे घनत्व ढाल माध्यम में 10x एचबीएसएस जोड़ें, जिसके परिणामस्वरूप 1.117 ग्राम/एमएल का अंतिम घनत्व होता है। भंवर उपयोग करने से पहले कम से कम 30 एस के लिए मिश्रण करने के लिए। उपयोग होने तक बर्फ पर रखें।
    4. 37% घनत्व ढाल समाधान (4 एमएल प्रति नमूना): 1.043 ग्राम/एमएल के अंतिम घनत्व के साथ 37% की अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए 1x एचबीएसएस में आइसोटोनिक घनत्व ढाल जोड़ें। लेयरिंग के दौरान दृश्य के लिए गुलाबी समाधान बनाने के लिए 37% घनत्व ढाल के प्रत्येक एमएल के लिए फिनोल लाल के 20 माइक्रोन जोड़ें। उपयोग करने से पहले कम से कम 30 एस के लिए भंवर। उपयोग होने तक बर्फ पर रखें।
    5. 70% घनत्व ढाल समाधान (2 एमएल प्रति नमूना): 1.082 ग्राम/एमएल के अंतिम घनत्व के साथ 70% की अंतिम एकाग्रता बनाने के लिए 1x एचबीएसएस में आइसोटोनिक घनत्व ढाल जोड़ें। लेयरिंग के दौरान दृश्य के लिए नीला समाधान बनाने के लिए 70% घनत्व माध्यम के प्रत्येक एमएल के लिए ट्राइपैन ब्लू के 5 माइक्रोन जोड़ें। उपयोग करने से पहले कम से कम 30 एस के लिए भंवर। उपयोग होने तक बर्फ पर रखें।
  2. छिड़काव और मस्तिष्क विच्छेदन
    नोट: छिड़काव प्रोटोकॉल Posel एट अल जो माउस thoracotomy, transcardial छिड़काव के वीडियो चित्रण, और मस्तिष्क हटाने की सुविधा के समान है21. यहां, हम वयस्क C57BL/6J नर और मादा चूहों (10-15 सप्ताह पुराने, 20-30 ग्राम) का उपयोग करते हैं, लेकिन इस प्रोटोकॉल का उपयोग किसी भी माउस के लिए थोरैकोटॉमी करने के लिए किया जा सकता है। प्रयोगों के संचालन से पहले सभी पशु प्रक्रियाओं को संस्थागत नैतिकता समिति द्वारा अनुमोदित किया जाना चाहिए।
    1. माउस संज्ञाहरण: सर्जिकल संज्ञाहरण के विमान तक 100% ऑक्सीजन में 4% Isoflurane के साथ चूहों को बेहोश करें, जिसे पैर की अंगुली चुटकी के साथ पुष्टि की जा सकती है, या माउस के पैर को मजबूती से चुटकी लेने पर पलटा की कमी हो सकती है। माउस को अपनी पीठ पर रखें और मजबूती से अपने चार पंजे को एक प्लास्टिक ट्रे में झुका हुआ सर्जिकल विच्छेदन बोर्ड में पिन करें, यह सुनिश्चित करना कि नाक आइसोफ्लोरेन नाक शंकु में सुरक्षित है। स्थानांतरण के बाद, पशु अभी भी आगे बढ़ने से पहले संज्ञाहरण के शल्य चिकित्सा विमान अतीत है सुनिश्चित करें.
    2. माउस thoracotamy: पकड़ो और संदंश का उपयोग पेट की त्वचा लिफ्ट और त्वचा और पेट की दीवार के माध्यम से एक उथले चीरा बनाने के लिए अवरोही महाधमनी या किसी भी अंतर्निहित अंगों को नुकसान पहुँचाए बिना xyphoid बेनकाब.
    3. संदंश के साथ xyphoid पकड़ो और ribcage नीचे पार्श्व चीरों बनाने के लिए डायाफ्राम और जिगर बेनकाब. ठीक कैंची का उपयोग कर रिब पिंजरे की लंबाई के साथ डायाफ्राम के माध्यम से सावधान उथले कटौती करें और ऊतक कैंची का उपयोग रिबकेज के माध्यम से और माउस के सिर के पास शल्य चिकित्सा स्टेशन के लिए उरोस्थि पिन ट्रांसकार्डियल छिड़काव के लिए दिल और फेफड़ों का पर्दाफाश करने के लिए.
    4. Transcardial छिड़काव: एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला छिड़काव पंप तैयार और टयूबिंग के एक छोर पर एक 26.5G सुई देते हैं. ठंड 1x HBSS की एक शीशी में टयूबिंग के एक छोर डालने और पंप पर स्विच करने के लिए पूरी तरह से 1x HBSS के साथ टयूबिंग भरने के द्वारा प्रक्रिया के लिए टयूबिंग प्रधानमंत्री.
    5. कुंद संदंश के साथ दिल पकड़े जबकि, दिल के बाएं वेंट्रिकल में संलग्न छिड़काव टयूबिंग के साथ एक 26.5G सुई की नोक डालें और सही आलिंद में एक छोटा चीरा बनाते हैं. छिड़काव पंप पर बारी ध्यान से ठंड 1x HBSS के कम से कम 15-20 एमएल के साथ ~ 2-4 एमएल / मिनट की दर से माउस perfuse करने के लिए.
      नोट: एक पूर्ण छिड़काव अक्सर संकेत दिया जाता है जब जिगर रक्त को साफ करने के लिए शुरू होता है और दिल के रूप में एक ही रंग हो जाता है.
    6. मस्तिष्क हटाने: ऊतक विदारक कैंची का उपयोग माउस सिर काटना और गर्दन से नाक तक खोपड़ी में एक midline चीरा बनाने. खोपड़ी को बेनकाब करने के लिए पक्षों को त्वचा फ्लैप छीलें और विदारक कैंची के साथ खोपड़ी के दुम के अंत में अतिरिक्त ऊतक और हड्डियों को हटा दें।
    7. ध्यान से खोपड़ी के नीचे कैंची के एक ब्लेड को फोरामेन मैग्नम में स्लाइड करें, जिसमें तेज पक्ष हड्डी का सामना कर रहा है और ध्यान से नाक की ओर मिडलाइन को काट लें। खोपड़ी के आधार पर और विदारक कैंची का उपयोग कर नाक के पास दोनों पार्श्व कटौती करें. ठीक संदंश का प्रयोग, जीवन खोपड़ी के टुकड़े बंद दरार और मस्तिष्क बेनकाब करने के लिए midline से खोपड़ी जीवन. धीरे एक रंग और विच्छेदन धब्बा कागज पर जगह के साथ मस्तिष्क लिफ्ट.
    8. मस्तिष्क विच्छेदन: विच्छेदन धब्बा कागज बर्फ से भरा एक बंद पेट्री डिश के शीर्ष पर 1x HBSS के साथ गीला कागज के एक टुकड़े पर मस्तिष्क रखें. सेरिबैलम निकालें और एक साफ रेजर ब्लेड का उपयोग करके मस्तिष्क गोलार्द्धों को द्विभाजित करें।
    9. प्रत्येक गोलार्द्ध से ब्रेनस्टेम, स्ट्रिएटम और सफेद पदार्थ निकालें, जबकि हिप्पोकैम्पस और ओवरलेइंग कॉर्टेक्स को बरकरार रखें। पृथक प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस ऊतक युक्त गोलार्द्धों को 15 एमएल ट्यूब में 5 एमएल ठंडे 1x एचबीएसएस के साथ स्थानांतरित करें और बर्फ पर रखें।
      नोट: जितनी जल्दी हो सके विच्छेदन करना महत्वपूर्ण है ताकि ऊतक बर्फ पर 1x HBSS में विच्छेदित ऊतक के कत्ल और अंतिम रखने के बीच 2 मिनट से अधिक न हो। यदि कई जानवरों से माइक्रोग्लिया को अलग किया जाता है, तो पाचन आदि के लिए जानवरों के पूरे समूह को संसाधित करने के साथ आगे बढ़ने से पहले दिमाग को ~ 1 घंटे के लिए 1x एचबीएसएस में बर्फ पर संग्रहीत किया जा सकता है।
  3. मस्तिष्क पाचन और समरूपीकरण
    1. यांत्रिक और रासायनिक पृथक्करण: बर्फ पर अलग-अलग पेट्री व्यंजन में प्रत्येक माउस और पाचन बफर के 1 एमएल से मस्तिष्क के ऊतकों रखें। एक साफ स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग, अच्छी तरह से छोटे टुकड़े (<1 मिमी) में मस्तिष्क काट लें.
    2. एक प्लास्टिक हस्तांतरण विंदुक बंद टिप में कटौती और ध्यान से बर्फ पर एक 24 अच्छी तरह से थाली के भीतर अलग कुओं में कीमा बनाया हुआ दिमाग के प्रत्येक हस्तांतरण. पारदर्शी लचीली फिल्म के साथ प्लेट को कवर करें और 30 मिनट के लिए बर्फ पर इनक्यूबेट करें।
      नोट: जब सही ढंग से कटा हुआ, मस्तिष्क के ऊतकों अच्छी तरह से कीमा बनाया हुआ लहसुन जैसा दिखता है।
    3. Dounce homogenization: प्रत्येक अच्छी तरह से अलग-अलग 7 एमएल ग्लास dounce homogenizers बर्फ पर प्रत्येक ठंड FACS बफर के 5 एमएल के साथ भरा में प्रत्येक अच्छी तरह से पचा मस्तिष्क समाधान स्थानांतरण. प्रत्येक मस्तिष्क को ढीले मूसल (ए) के साथ धीरे से डुबोएं, लगभग 30-40 बार, जब तक कि एक एकल कोशिका निलंबन प्राप्त न हो जाए। ए मूसल के साथ दोहरीकरण के बाद, एकल सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए तंग मूसल (बी) के साथ 3-4 बार धीरे से डुबोएं।
      नोट: होमोजेनाइज़र के तल पर ऊतक को कुचलने से बचने के लिए मूसल को 3/4 से अधिक नीचे न धकेलें। अंतिम समाधान अपारदर्शी और दूधिया होना चाहिए।
      नोट: यदि एक ही प्रयोग में कई दिमागों को पचाना, समय मस्तिष्क के हस्तांतरण को एफएसीएस बफर में पचाता है ताकि प्रत्येक नमूना केवल 30 मिनट के लिए डाइजेस्ट बफर में हो। अति-पाचन के परिणामस्वरूप सतह प्रोटीन का दरार हो सकता है, डाउनस्ट्रीम एंटीबॉडी बाइंडिंग और सिग्नल को कम कर सकता है।
  4. प्रतिरक्षा समृद्ध टुकड़ा प्राप्त करना
    1. घनत्व ढाल की स्थापना: प्रत्येक मस्तिष्क से होमोजेनेट को अलग-अलग 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों में स्थानांतरित करें और 25% घनत्व ढाल की अंतिम एकाग्रता प्राप्त करने के लिए प्रत्येक के लिए एफएसीएस बफर के साथ आइसोटोनिक घनत्व ढाल के 2.125 एमएल और शीर्ष 8.5 एमएल जोड़ें। धीरे अच्छी तरह मिश्रण करने के लिए 15 मिलीलीटर ट्यूबों 20x पलटना.
    2. एक संकीर्ण स्नातक की उपाधि प्राप्त हस्तांतरण विंदुक का प्रयोग, धीरे प्रत्येक ट्यूब के लिए 37% घनत्व ढाल के 4 एमएल underlay, बहुत सावधान रहने के लिए साफ परतों को स्थापित किया जा रहा है. स्थानांतरण पिपेट स्विच करें और धीरे से 70% घनत्व ढाल (चित्रा 2 ए) के 2 एमएल को रेखांकित करें। ब्रेकिंग रैंप शून्य करने के लिए सेट के साथ 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और 500 x ग्राम पर स्पिन करने के लिए ठंडा एक अपकेंद्रित्र करने के लिए स्थानांतरण.
    3. प्रतिरक्षा समृद्ध टुकड़ा इकट्ठा करना: स्वच्छ हस्तांतरण पिपेट का उपयोग करके, धीरे से एक साफ हस्तांतरण विंदुक का उपयोग करके 15 एमएल ट्यूब में मात्रा के शीर्ष से माइलिन को महाप्राण करें और त्यागें। ध्यान से एक हस्तांतरण विंदुक का उपयोग कर एक साफ 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब में घनत्व ढाल के शीर्ष टुकड़ा इकट्ठा.
    4. ध्यान से एक नई 15 एमएल पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूब(चित्रा 2बी)में प्रतिरक्षा समृद्ध टुकड़ा (ऊपर 1.5 एमएल और 1.5 एमएल नीचे जहां 70% और 37% घनत्व ढाल परतें मिलती हैं) इकट्ठा करें। घनत्व ढाल माध्यम को पतला करने के लिए प्रतिरक्षा-समृद्ध नमूने में एफएसीएस बफर के 10 एमएल जोड़ें और अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ट्यूब को धीरे से 20x उल्टा करें।
      नोट: कोशिकाओं ट्यूब के किनारों से चिपके करने के लिए करते हैं के रूप में, धीरे-धीरे तरल इकट्ठा करते समय ट्यूब के किनारों के साथ विंदुक चक्कर द्वारा संग्रह चरणों के दौरान नमूने में सभी कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए सुनिश्चित करें.
    5. डाउनहिल रैंप ब्रेक शून्य पर सेट के साथ 10 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस अपकेंद्रित्र में 15 एमएल ट्यूबों को सेंट्रीफ्यूज करके प्रतिरक्षा-समृद्ध नमूने में कोशिकाओं को गोली दें। स्पिन के अंत में तुरंत सतह पर तैरनेवाला को सावधानी से हटा दें, 15 एमएल ट्यूब में लगभग 300 माइक्रोन तरल छोड़ दें, गोली को परेशान न करने के लिए सावधान रहें (जो दिखाई नहीं दे सकता है)।
    6. एक और 15 एमएल ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला लीजिए सुनिश्चित करने के लिए कि कोशिकाओं स्पिन में गोली मार दी गई थी (resuspended गोली के सेल मायने रखता है के साथ सत्यापन एक बार इस अंश त्यागें). P1000 विंदुक का उपयोग करके 300 माइक्रोन मात्रा में सेल गोली को निलंबित करने के बाद, कुल सेल उपज का अनुमान लगाने के लिए एक हेमासाइटोमीटर के साथ कोशिकाओं की गणना करें।

Figure 2
चित्रा 2: असंतत घनत्व ढाल द्वारा प्रतिरक्षा समृद्ध टुकड़ा प्राप्त करना। (ए) मस्तिष्क समरूप 25% घनत्व माध्यम से बनाया जाता है, फिनोल लाल के माध्यम से 37% घनत्व मध्यम रंग के गुलाबी रंग के 4 एमएल और ट्रिपैन नीले रंग के माध्यम से 70% घनत्व मध्यम रंग के नीले रंग के 2 एमएल को रेखांकित करता है। (बी) अपकेंद्रित्र के बाद, अंश अलग हो गए हैं। माइक्रोग्लिया 37% और 70% घनत्व मीडिया टुकड़ों के इंटरफेस पर टिकी हुई है। माइलिन टुकड़ा 15 एमएल ट्यूब के शीर्ष पर है और इसे त्याग दिया जाएगा। स्पिन विफल होने की स्थिति में शीर्ष टुकड़ा बैक अप के रूप में एकत्र किया जाता है, और कोई कोशिका पुनर्प्राप्त नहीं होती है। यदि ऐसा होता है, तो इस अंश का उपयोग करके ढाल को दोहराया जा सकता है। प्रतिरक्षा समृद्ध अंश नीचे की ओर एकत्र किया जाता है। किसी भी लाल रक्त कोशिकाओं वाला निचला अंश ट्यूब में रहता है और उसे छोड़ दिया जाता है। (सी) पूर्ण परतों को दर्शाने वाली उदाहरण आकृति। BioRender.com के साथ बनाया गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. बाह्य कोशिकीय एंटीबॉडी धुंधला हो जाना
    1. अवरुद्ध: कोशिकाओं को गोली करने के लिए ब्रेक के साथ 500 x ग्राम पर बर्फ और अपकेंद्रित्र पर एक गोल नीचे 96 अच्छी प्लेट में कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। जल्दी से सतह पर तैरनेवाला सतह पर तैरनेवाला हटाने के लिए थाली flicking द्वारा सतह पर तैरनेवाला हटा दें, अच्छी तरह से के तल पर बरकरार सेल गोली छोड़ने.
    2. मोनोसाइट्स या अन्य एफसीआर असर कोशिकाओं के एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बंधन को रोकने के लिए पी 200 पिपेट (अंतिम एकाग्रता 10 माइक्रोग्राम/एमएल, कमजोर पड़ने कारक 1:50) का उपयोग करके एंटी-माउस सीडी 16/32 एफसी-रिसेप्टर अवरुद्ध अभिकर्मक के साथ एफएसीएस बफर के 50 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। बर्फ पर 10 मिनट के लिए सेते हैं.
    3. एंटीबॉडी धुंधला हो जाना: P2RY12- Allophycocyanin (APC; कमजोर पड़ने कारक 1:50, एकाग्रता 2 μg/mL की एक अंतिम अच्छी तरह से एकाग्रता के लिए 1:100, एकाग्रता 2 μg/mL) और बैंगनी 525 जीवित मृत दाग (कमजोर पड़ने कारक 1:50 1:100 की एक अंतिम अच्छी तरह से एकाग्रता के लिए कमजोर पड़ना कारक 1:50) युक्त एक 2x मास्टर मिश्रण की उचित मात्रा तैयार करें. सेल निलंबन (धारा 1.5.1 में अवरुद्ध करने के बाद प्राप्त) में धुंधला मास्टर मिश्रण के 50 माइक्रोन जोड़ें और बर्फ पर अंधेरे में 30 मिनट के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
      नोट: इस प्रोटोकॉल के लिए, हम P2RY12 के साथ कोशिकाओं को धुंधला करते हुए प्रस्तुत करते हैं। सबसे पहले, P2RY12 माइक्रोग्लिया के लिए एक होमोस्टैटिक मार्कर है जिसे कुछ रोग संदर्भों में डाउनरेगुलेट किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, 5XFAD अल्जाइमर मॉडल चूहों ने P2RY12 के स्तर को कम कर दिया है जिससे उन्हें22 की पहचान करना मुश्किल हो सकता है। अलगाव के लिए उपयोग किए जा सकने वाले वैकल्पिक दागों में Tmem119, Cd11b और CD4523 शामिल हैं। दूसरे, संयुग्म फ्लोरोक्रोम एपीसी को एंटीबॉडी के वांछित पैनल के अनुरूप समायोजित किया जा सकता है। हालांकि, एपीसी या पीई जैसे उज्ज्वल फ्लोरोक्रोम का चयन करने से यह सुनिश्चित करने में मदद मिलेगी कि सकारात्मक और नकारात्मक आबादी आसानी से24 को अलग कर सकती है।
    4. धुंधला होने के बाद, कोशिकाओं को धोने के लिए सीधे प्रत्येक अच्छी तरह से एफएसीएस बफर के 200 माइक्रोन जोड़ें। झिलमिलाहट द्वारा सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 x ग्राम पर स्पिन करें। एक P200 विंदुक के साथ FACS बफर के 200 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें, 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 x ग्राम पर स्पिन, और कुओं से बफर को हटाने के लिए झटका प्लेट।
    5. प्रवाह नियंत्रण की तैयारी: धुंधला होने से पहले, आवश्यक प्रवाह नियंत्रण के लिए चरण 1.5.1 में अवरुद्ध करने के बाद प्रत्येक नमूने से कोशिकाओं की आवश्यक मात्रा को अलग करें।
      नोट: फाटकों को स्थापित करने के लिए प्रत्येक प्रयोग के लिए प्रवाह नियंत्रण की आवश्यकता होती है। प्रवाह नियंत्रण एक अतिरिक्त जानवर से या प्रयोगात्मक कुओं में से प्रत्येक के एक अंश से लिया जा सकता है. जब विभाजन कोशिकाओं नियंत्रण के रूप में 10,000-30,000 नियंत्रण प्रति कोशिकाओं आवंटित करने के लिए सुनिश्चित उच्च आत्मविश्वास के साथ द्वार स्थापित करने के लिए आवश्यक है.
      1. तीन प्रासंगिक प्रवाह नियंत्रण हैं: कोई दाग नहीं, जीवित मृत और P2RY12 आइसोटाइप नियंत्रण। कोई दाग नियंत्रण के लिए, कोई एंटीबॉडी न जोड़ें। P2RY12 आइसोटाइप नियंत्रण में, व्यवहार्यता डाई (1:100) और एपीसी (1:100) के लिए संयुग्मित एक आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं का इलाज करें।
      2. जीवित मृत नियंत्रण, विभाज्य कोशिकाओं को एक अलग कुएं में तैयार करने के लिए और सेल वॉल्यूम के आधे हिस्से को 500 माइक्रोन ट्यूब में ले जाएं। 5 मिन के लिए -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में 500 माइक्रोन ट्यूब रखें, कोशिकाओं को मारने के लिए 5 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रखने के बाद। जीवित मृत नियंत्रण में मृत कोशिकाओं के विभाज्य को अच्छी तरह से लौटाएं और मृत कोशिकाओं को चिह्नित करने के लिए वायलेट 525 (कमजोर पड़ने कारक 1:100) पर एक अमाइन बाध्यकारी व्यवहार्यता डाई के साथ दाग दें।
        नोट: प्रोटोकॉल सतह पर तैरनेवाला हटाने के लिए एक झटका विधि के साथ प्लेट धुंधला हो जाना के लिए लिखा गया है। हालांकि, यह सतह पर तैरनेवाला तुरंत स्पिन के पूरा होने के बाद हटा दिया जा करने की आवश्यकता है और झटका जल्दी से गोली परेशान किए बिना सतह पर तैरनेवाला को हटाने के लिए पर्याप्त बल के साथ किया जाना चाहिए. वैकल्पिक रूप से, 1.5 एमएल आरएनए / डीएनएस मुक्त ट्यूबों का उपयोग धुंधला होने के लिए किया जा सकता है, निम्नलिखित संशोधनों के साथ: कोशिकाओं को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 800 x ग्राम पर गोली दें। पिपेट के साथ सतह पर तैरनेवाला एस्पिरेट। युक्ति: गति के लिए, P200 टिप के साथ एक 5 एमएल स्थानांतरण विंदुक जल्दी और सटीक रूप से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण कर सकता है। आकांक्षा करते समय, गोली की जांच करें। यदि गोली दिखाई नहीं दे रही है, तो सतह पर तैरनेवाला के 50 माइक्रोन छोड़ दें और तदनुसार गणना समायोजित करें। एंटीबॉडी को धोते समय, एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने को बढ़ाने के लिए अतिरिक्त एफएसीएस जोड़ें (200 माइक्रोन के बजाय 1000 माइक्रोन) सतह पर तैरनेवाला के अपूर्ण हटाने के लिए खाते में। साइटोमीटर के आधार पर, छँटाई के लिए 1.5 एमएल ट्यूबों का उपयोग करें, आवश्यक आपूर्ति की मात्रा को कम करें।
  2. माइक्रोग्लिया के लिए एफएसीएस छँटाई
    1. तैयारी: P200 पिपेट के साथ FACS बफर के 200 माइक्रोन में प्रत्येक अच्छी तरह से फिर से निलंबित करें और लेबल वाले प्रवाह सॉर्ट ट्यूबों में स्थानांतरित करें और लगभग 5 x 105 घटनाओं प्रति एमएल की एकाग्रता के लिए कुल 500 माइक्रोन में एफएसीएस बफर जोड़ें। विश्लेषण तक अंधेरे में बर्फ पर स्टोर करें। 1.5 एमएल आरएनए मुक्त ट्यूबों में कोशिकाओं के लिए कुशन के रूप में एफएसीएस बफर के 100 माइक्रोन जोड़कर पोस्ट सॉर्ट ट्यूब तैयार करें।
    2. साइटोमीटर सेटिंग्स: 100 माइक्रोन नोजल के साथ स्थापित फ्लो साइटोमेट्री सेल सॉर्टर पर कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें। 18-20 साई का उपयोग करके कक्षों को क्रमबद्ध करें।
    3. गेटिंग: साइटोमीटर पर, साइड-स्कैटर (एसएससी) क्षेत्र बनाम फॉरवर्ड स्कैटर (एफएससी) ऊंचाई का उपयोग करके सेल आकार के लिए गेट मलबे को अलग करने में मदद करने के लिए कोई दाग नियंत्रण नहीं है, एसएससी-ए को एक लॉग अक्ष पर रखें ताकि सेल आबादी की कल्पना की जा सके और कोशिकाओं के लिए चयन करने के लिए बारीकी से गेट (गेट एस 1; चित्र 3)। किसी भी डबल्स को हटाने के लिए, एफएससी-एच बनाम एफएससी-डब्ल्यू और गेट को किसी भी मलबे और डबल्स (गेट एस 2) को हटाने वाली सेल आबादी के चारों ओर बारीकी से गेट प्लॉट करें। P2RY12 आइसोटाइप नियंत्रण का उपयोग करके, APC चैनल में कोशिकाओं की जांच करें और P2RY12+ कोशिकाओं को निर्धारित करने के लिए ऑटोफ्लोरेसेंस के लिए गेट सेट करें। कोई दाग और जीवित मृत नियंत्रण का उपयोग करना, कोशिकाओं है कि जीवित कोशिकाओं के रूप में बैंगनी 525 एनएम पर फ्लोरोसेंट नहीं हैं के लिए गेट.
    4. छँटाई: वायलेट 525 एनएम बनाम एपीसी प्लॉट करें और जनसंख्या का निर्धारण करें जो पी 2 आरवाई 12 + है और एफएमओ (एमजी) द्वारा रहते हैं। लेबल पोस्ट सॉर्ट ट्यूब (चित्रा 3) में उन कोशिकाओं को क्रमबद्ध करें। अंतिम सॉर्ट प्रतिशत कुल घटनाओं का लगभग 50% है, जिसमें अधिकांश घटना कुल नुकसान गेट एस 1 में हटाए गए मलबे के साथ हैं (~ 70% घटनाएं कोशिकाएं हैं; तालिका 1)।
  3. आरएनए अलगाव और विश्लेषण
    1. प्रतिलेखन और अनुवाद अवरोधक: यदि आरएनए निष्कर्षण की योजना बना रहे हैं, तो अलगाव से जुड़े ट्रांसक्रिप्टोमिक हस्ताक्षर के जोखिम को खत्म करने के लिए, बफर चरणों में अनुवाद और प्रतिलेखन के अवरोधक शामिल हैं। मार्श एट अल द्वारा वर्णित अवरोधक कॉकटेल तैयार करें, जिसमें एक्टिनोमाइसिन डी, एनिसोमाइसिन और ट्रिप्टोलाइड25 शामिल हैं।
      1. अवरोधक तैयारी: अवरोधक स्टॉक का पुनर्गठन करें और निम्नानुसार स्टोर करें: एक्टिनोमाइसिन डी को डाइमिथाइलसल्फ़ोक्साइड (डीएमएसओ) में 5 मिलीग्राम / एमएल तक पुनर्गठित करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। डीएमएसओ में ट्रिप्टोलाइड को 10 एमएम तक पुनर्गठित करें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें, प्रकाश से सुरक्षित रखें। डीएमएसओ में अनिसोमाइसिन को 10 मिलीग्राम / एमएल तक पुनर्गठित करें और प्रकाश से संरक्षित 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत करें। पुनर्गठन के बाद 1 महीने से अधिक समय तक सभी अवरोधक स्टॉक स्टोर करें।
      2. बफर संशोधन: प्रोटोकॉल में चार अलग-अलग बफ़र्स में अवरोधकों को निम्नानुसार जोड़ें: ट्रांसकार्डियल परफ्यूजन करते समय, एक्टिनोमाइसिन डी (5 माइक्रोग्राम/एमएल, स्टॉक से 1:1000) और ट्रिप्टोलाइड (10 माइक्रोन, स्टॉक से 1:1000) के साथ एचबीएसएस तैयार करें। छिड़काव के बाद, एचबीएसएस में प्रयोगशाला में मस्तिष्क को परिवहन करता है जिसमें एक्टिनोमाइसिन डी (5 माइक्रोग्राम / एमएल, स्टॉक से 1:1000), ट्रिप्टोलाइड (10 माइक्रोन, स्टॉक से 1:1000) और एनिसोमाइसिन (27.1 माइक्रोग्राम / एमएल, स्टॉक से 1: 368.5) होता है। एक्टिनोमाइसिन डी (5 μg/mL, स्टॉक से 1:1000), ट्रिप्टोलाइड (10 माइक्रोन, स्टॉक से 1:1000) और अनिसोमाइसिन (27.1 μg/mL, स्टॉक से 1:368.5) के साथ FACS बफर तैयार करें। एक्टिनोमाइसिन डी (5 μg/mL, स्टॉक से 1:1000), ट्रिप्टोलाइड (10 μM, स्टॉक से 1:1000) और anisomycin (27.1 μg/mL, स्टॉक से 1:368.5) के साथ पाचन बफर तैयार करें। एचबीएसएस युक्त एक्टिनोमाइसिन डी (5 माइक्रोग्राम / एमएल, स्टॉक से 1: 1000), ट्रिप्टोलाइड (10 माइक्रोन, स्टॉक से 1: 1000) और एनीसोमाइसिन (27.1 माइक्रोग्राम / एमएल, स्टॉक से 1: 368.5) युक्त पोस्ट सॉर्ट वॉश बफर तैयार करें।
        नोट: अवरोधकों को जोड़ते समय, उपयोग करने से तुरंत पहले उन्हें जोड़ना सुनिश्चित करें और उपयोग के दौरान किसी भी तैयार बफ़र्स को प्रकाश से बचाएं। स्टॉक समाधानों के फ्रीज-पिघलना से बचें।
    2. पोस्ट-सॉर्ट वॉश: क्योंकि कोशिकाओं को एफएसीएस बफर में 1.5 एमएल आरएनएसई मुक्त ट्यूबों में क्रमबद्ध किया गया है, जो आरएनए अलगाव में हस्तक्षेप करेगा, कोशिकाओं को धोना आवश्यक है। 5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 1000 x ग्राम पर कोशिकाओं को स्पिन करें और लगभग 50 माइक्रोन तरल छोड़ते हुए, सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    3. एक्टिनोमाइसिन डी (5 माइक्रोग्राम/एमएल, स्टॉक से 1:1000), ट्रिप्टोलाइड (10 माइक्रोन, स्टॉक से 1:1000) और अनिसोमाइसिन (27.1 माइक्रोग्राम/एमएल, स्टॉक से 1:368.5) युक्त 1x एचबीएसएस के 200 माइक्रोन जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं। स्पिन को दोहराएं और 50 माइक्रोन तरल (1 धोएं) छोड़कर सतह पर तैरनेवाला हटा दें। पोस्ट सॉर्ट वॉश बफर के 200 माइक्रोन जोड़ें, अच्छी तरह मिलाएं और स्पिन दोहराएं और 25 माइक्रोन तरल (2 धोएं) छोड़कर सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
    4. आरएनए निष्कर्षण: माइक्रोग्लियल कोशिकाओं से आरएनए अलगाव के लिए, उच्च और सुसंगत आरएनए पैदावार और 9 से ऊपर आरआईएन स्कोर के लिए कम-इनपुट आरएनए अलगाव किट का उपयोग करें (उत्पाद सिफारिशों के लिए नीचे और सामग्री की तालिका देखें)। सेल गोली के लिए, अनुशंसित किट + β-मर्कैप्टोथेनॉल (1:100) से लाइसिस बफर के 350 माइक्रोन जोड़ें और अच्छी तरह मिलाएं।
      नोट: यदि आवश्यक हो, तो प्रोटोकॉल इस बिंदु पर निलंबित किया जा सकता है। आरएनए निष्कर्षण तक नमूने -80 डिग्री सेल्सियस में lysis बफर में संग्रहीत किया जा सकता है. यदि भंडारण के बाद आरएनए निकाल रहे हैं, तो बर्फ पर लाइसेट को पिघलाएं और अलगाव के लिए किट-विशिष्ट निर्देशों के साथ आगे बढ़ें।
    5. स्तंभ आधारित सेल तकलीफ (उत्पाद सिफारिशों के लिए सामग्री की तालिकादेखें ) और 2 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अधिकतम गति पर अपकेंद्रित्र में lysate स्थानांतरण. RNase मुक्त पानी के न्यूनतम 14 माइक्रोन में एल्यूट करें और उपयुक्त एकाग्रता निर्धारित करें। आरएनए का उपयोग इस बिंदु के बाद किसी भी डाउनस्ट्रीम एप्लिकेशन के लिए किया जा सकता है।

Figure 3
चित्रा 3: प्रवाह सॉर्ट के लिए गेटिंग रणनीति। घटनाओं को एसएससी-ए बनाम एफएससी-एच (एस 1) पर सेल आकार के लिए गेटेड किया जाता है। फिर, कोशिकाओं को FSC-H बनाम FSC-W (S2) पर सिंगलेट होने के लिए गेटेड किया जाता है। सिंगलेट कोशिकाओं को लाइव के रूप में सॉर्ट किया जाता है यदि Comp-FL8-A::405-526-52 (वायलेट 525 लाइव डेड स्टेन) पर नकारात्मक और P2RY12+ के रूप में यदि Comp-FL32-A::640-671_30 (P2RY12-APC) पर सकारात्मक P2RY12-isotype नियंत्रण का उपयोग करना। कोशिकाओं को एमजी के रूप में लेबल किया जाता है और यदि दोनों जीवित और पी 2 आरवाई 12 + होते हैं तो क्रमबद्ध किया जाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

गेटेड जनसंख्या माता-पिता की आवृत्ति कुल की आवृत्ति गिनना
एस 1 68.10% 68.10% 162186
एस 2> एस 1 93.59% 63.70% 151707
पी2आरवाई12+ (670+) > एस2 > एस1 83.05% 52.90% 125986
लाइव (525-) > S2 > S1 92.78% 59.10% 140752
एमजी (पी2आरवाई12+ लाइव) >एस2>एस1 78.96% 50.30% 119794

तालिका 1: उदाहरण नमूना वंश तालिका गेटिंग प्रतिशत और अपेक्षित घटना संख्या के साथ।

2. प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए इंट्रान्यूक्लियर प्रवाह धुंधला हो जाना

नोट: इस बिंदु पर अन्य सेल प्रकार शुरू किए जा सकते हैं, इस प्रोटोकॉल का परीक्षण सुसंस्कृत कोशिकाओं के साथ किया जाता है जिसमें HEK293 कोशिकाएं, BV2 माइक्रोग्लिया जैसी कोशिकाएं और मानव IPSC-व्युत्पन्न माइक्रोग्लिया शामिल हैं।

  1. कोशिकाओं का निर्धारण और धुंधला हो जाना
    नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल के लिए, एक इंट्रासेल्युलर धुंधला किट का उपयोग करें जो परमाणु धुंधला के लिए अनुकूलित है। देखना सामग्री की तालिका उत्पाद अनुशंसाओं के लिए।
    1. विभाज्य रूप से 96 अच्छी प्लेट (5 x 10,4- 1 x 10,6 कोशिकाओं) में धारा 1.5.2 से सना हुआ कोशिकाएं। 4 डिग्री सेल्सियस पर 500 x ग्राम पर 5 मिन के लिए स्पिन कोशिकाओं और एफएसीएस बफर को हटाने के लिए फ्लिक।
      नोट: औसत स्तर के उच्च विश्वास के साथ डेटा प्राप्त करने के लिए, अच्छी तरह से प्रति 10,000 कोशिकाओं की एक न्यूनतम इस्तेमाल किया जाना चाहिए. जबकि कोई अनुशंसित अधिकतम नहीं है, यह सुनिश्चित करने के लिए पूरे प्रयोग में कोशिकाओं की संख्या को सुसंगत रखना सबसे अच्छा है कि विविधताओं के विभिन्न गुणांक (सीवी) का कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं है।
    2. निर्धारण और पारगम्यता: 1x फिक्स ध्यान केंद्रित के 200 माइक्रोन जोड़ें और कोशिकाओं को फिर से निलंबित करने के लिए P200 पिपेट के साथ धीरे से मिलाएं। 45-60 मिनट के लिए अंधेरे में सेते हैं. कमरे के तापमान (आरटी) पर 500 x ग्राम पर 5 मिन के लिए अपकेंद्रित्र प्लेट और सतह पर तैरनेवाला त्यागने के लिए झटका।
      नोट: यदि आवश्यक हो, तो प्रोटोकॉल इस बिंदु पर निलंबित किया जा सकता है। सतह पर तैरनेवाला त्यागने के बाद, प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए दीर्घकालिक भंडारण बफर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें (उत्पाद सिफारिशों के लिए सामग्री की तालिकादेखें )। नमूने 12-18 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है, प्रकाश से संरक्षित और बफर वाष्पीकरण की रक्षा के लिए पारदर्शी फिल्म में कवर किया जा सकता है।
    3. मिश्रण करने के लिए एक P200 के साथ प्रत्येक अच्छी तरह से और विंदुक के लिए 1x पारगम्यता बफर के 200 माइक्रोन जोड़ें. आरटी पर 500 x ग्राम पर 5 मिन के लिए अपकेंद्रित्र प्लेट और सतह पर तैरनेवाला को त्यागने के लिए फ्लिक। दोहराएँ permeabilization बफर धोने 3x की कुल है.
    4. प्रवाह नियंत्रण की तैयारी: आवश्यक प्रवाह नियंत्रण के लिए प्रत्येक नमूने से कोशिकाओं की मात्रा विभाजित (नियंत्रण अच्छी तरह से प्रति 10,000-30,000 कोशिकाओं पर्याप्त है).
      1. कोई दाग नियंत्रण तैयार करने के लिए, प्रकार या विभाज्य दाग कोशिकाओं से कोई दाग कोशिकाओं को एक अलग अच्छी तरह से है कि किसी भी एंटीबॉडी प्राप्त नहीं होगा में ठीक.
      2. प्रतिदीप्ति माइनस एक (एफएमओ) नियंत्रण तैयार करने के लिए, उस चैनल में एक को छोड़कर पैनल पर एंटीबॉडी में से प्रत्येक के लिए विभाज्य कोशिकाओं.
      3. प्रासंगिक चैनलों के लिए, गेटिंग के लिए एफएमओ में आइसोटाइप कंट्रोल एंटीबॉडी शामिल करें। उदाहरण के लिए, P2RY12-APC और H3K27Ac-AlexaFluor568 वाले पैनल में - दो FMOS होने चाहिए: (1) APC-FMO जिसमें केवल H3K27Ac-AlexaFluor568 और P2RY12 आइसोटाइप कंट्रोल एंटीबॉडी और (2) 568-FMO जिसमें केवल P2RY12-APC और आइसोटाइप कंट्रोल प्राइमरी और 568 सेकेंडरी शामिल हैं।
        नोट: यह प्रोटोकॉल एक एकल एचपीटीएम का परीक्षण करने के लिए प्रस्तुत किया गया है, हालांकि पैनलों को स्थापित किया जा सकता है जिसमें कई एचपीटीएम विभिन्न फ्लोरोफोर्स से संयुग्मित होते हैं।
    5. प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला हो जाना: प्रत्येक अच्छी तरह से प्राथमिक एंटीबॉडी की उचित एकाग्रता के साथ 1x पारगम्यता बफर के 50 माइक्रोन जोड़ें। अंधेरे में आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं. 1x पारगम्यता बफर के 200 माइक्रोन के साथ 2x धोएं।
      नोट: प्रत्येक एचपीटीएम के लिए उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी की एकाग्रता सामग्री की तालिका में शामिल है। एकाग्रता एक उत्तेजक के साथ इलाज सुसंस्कृत कोशिकाओं पर एंटीबॉडी के विभिन्न सांद्रता का परीक्षण करके निर्धारित की जाती है जो नाटकीय वृद्धि का कारण बनती है, उदाहरण के लिए, एसिटिलेशन के निशान के लिए एक एचडीएसी अवरोधक और यह सुनिश्चित करना कि अनुपचारित और उपचारित कोशिकाएं दोनों पता लगाने की सीमा के भीतर अच्छी तरह से थीं (आइसोटाइप नियंत्रण के ऊपर और साइटोमीटर की अधिकतम पहचान सीमा से नीचे)। एचपीटीएम के लिए इष्टतम एंटीबॉडी एकाग्रता में फ्लोरोफोर चैनल में 5 x 10,4 और 1 x 105 के बीच औसत औसत फ्लोरोसेंट तीव्रता होनी चाहिए।
    6. माध्यमिक एंटीबॉडी धुंधला: आरटी पर 10 मिनट के लिए 2% सामान्य गधा सीरम (एनडीएस) के साथ 1x पारगम्यता बफर के 200 माइक्रोन के साथ ब्लॉक।
    7. 2% एनडीएस के साथ 1x पारगम्यता बफर के 50 माइक्रोन जोड़ें और माध्यमिक एंटीबॉडी की उचित एकाग्रता और अंधेरे में आरटी पर 30 मिन के लिए इनक्यूबेट करें। पतला करने के लिए कुओं में 1x पारगम्यता बफर के 200 माइक्रोन जोड़ें, आरटी पर 500 x ग्राम पर 5 मिन के लिए प्लेट को सेंट्रीफ्यूज करें, और सतह पर तैरनेवाला त्यागने के लिए झटका दें। 1x पारगम्यता बफर के 200 माइक्रोन के साथ कोशिकाओं को 2x धोएं।
      नोट: यदि आवश्यक हो, तो इस बिंदु पर प्रोटोकॉल को निलंबित करें। P200 पिपेट के साथ प्रतिरक्षा कोशिकाओं के लिए दीर्घकालिक भंडारण बफर के 200 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें (सिफारिशों के लिए सामग्री की तालिकादेखें ) और प्रकाश से संरक्षित 12-24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    8. प्रवाह साइटोमेट्री के लिए तैयारी: आरटी पर 500 x ग्राम पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र प्लेट और सतह पर तैरनेवाला त्यागने के लिए झटका। प्रवाह साइटोमेट्री के लिए P200 पिपेट का उपयोग करके FACS बफर के 200 माइक्रोन में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। साइटोमीटर में परिवहन के लिए पारदर्शी फिल्म के साथ सील।
  2. फ्लो साइटोमेट्री
    1. प्रस्तावित एंटीबॉडी पैनल का विश्लेषण करने के लिए, सुनिश्चित करें कि साइटोमीटर बैंगनी (405 एनएम), नीले (488 एनएम), पीले (561 एनएम), और लाल (633 एनएम) सहित कम से कम चार लेजर से लैस है। साइटोमीटर FITC (नीला 525 एनएम), KRO (बैंगनी 525 एनएम), पीई (पीला 585 एनएम), और APC (लाल 660 एनएम) का पता लगाने के लिए फिल्टर की जरूरत है. चुने गए साइटोमीटर के आधार पर अतिरिक्त एंटीबॉडी जोड़ें।
    2. अंशांकन और मानकीकरण: प्रत्येक प्रयोग की शुरुआत में, इंद्रधनुष फ्लोरोसेंट मोती चलाने के लिए और मनका चोटियों पिछले प्रयोगों के लिए चलाए लक्ष्य मूल्यों के लिए तुलनीय हैं जब तक photomultiplier ट्यूब (पीएमटी) वोल्टेज समायोजित. मानकीकरण की यह विधि समय के साथ उपकरण बहाव के आवास की अनुमति देती है।
    3. मुआवजा: प्रयोग के लिए पीएमटी वोल्टेज और लाभ निर्धारित होने के बाद, एंटीबॉडी के पैनल के लिए मुआवजा मैट्रिक्स स्थापित करने के लिए एंटीबॉडी पर कब्जा कर लिया मुआवजा मोतियों का उपयोग करें। यह गणना सुनिश्चित करेगी कि फ्लोरोफोर्स अन्य चैनलों में सिग्नल के परिवर्तनों में योगदान नहीं दे रहे हैं। कई एंटीबॉडी को मल्टीप्लेक्स करते समय यह तेजी से आवश्यक है।
    4. आकार गेटिंग: एक डॉट प्लॉट में, लॉग पर एसएससी-ए बनाम रैखिक पर एफएससी-एच प्लॉट करें। मलबे को गेट करें और S1 गेट का उपयोग करके सेल आकार के लिए चयन करें। FSC-W बनाम FSC-H के डॉट प्लॉट में सिंगलेट सेल के लिए चयन करें और S2 के रूप में गेट करें। (चित्र 4)।
    5. फ्लोरोफोर गेट्स की स्थापना: प्रत्येक फ्लोरोफोर चैनल के लिए प्रासंगिक एफएमओ का उपयोग करके, एकल पैरामीटर हिस्टोग्राम(चित्रा 4)का उपयोग करके प्रत्येक चैनल में सकारात्मक संकेत क्या है, यह निर्धारित करने के लिए फाटकों की स्थापना करें।
    6. नमूनों को मापना: स्थापित गेटिंग रणनीति का उपयोग करके नमूनों को सावधानीपूर्वक रिकॉर्ड करें। P2RY12+ सिग्नल का उपयोग करके माइक्रोग्लिया की पहचान करें, केवल माइक्रोग्लिया के लिए संबंधित चैनलों में प्रोटीन की अभिव्यक्ति का निर्धारण करें।
  3. फ्लो साइटोमेट्री डेटा विश्लेषण
    1. विश्लेषण गेट्स की स्थापना: विश्लेषण सॉफ्टवेयर यूजर इंटरफेस पर साइटोमीटर के लिए उपरोक्त चरणों का उपयोग करके, विश्लेषण के लिए रिकॉर्डिंग के लिए उपयोग किए जाने वाले समान फाटकों का उपयोग करें।
    2. प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके एमएफआई मान प्राप्त करें (सिफारिशों के लिए सामग्री की तालिका देखें): प्रवाह विश्लेषण के लिए साइटोमीटर गेटिंग रणनीति को पुन: व्यवस्थित करें। आंकड़े जोड़ें फ़ंक्शन का उपयोग करके, मुआवजा चैनल ऊंचाई पर ब्याज की आबादी (जैसे, 568+) के लिए माध्यिका का चयन करें। तालिका संपादक का उपयोग करके, सांख्यिकीय विश्लेषण(तालिका 2)के साथ आगे बढ़ने के लिए संबंधित चैनलों के लिए एक स्प्रेडशीट में माध्यिका फ्लोरोसेंट तीव्रता (एमएफआई) मूल्यों का निर्यात करें।
      नोट: पूरक फ़ाइल S1 में lipopolysaccharide (LPS) और फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) इंजेक्शन चूहों और गेटिंग रणनीति और MFI मूल्यों के साथ एक उदाहरण विश्लेषण फ़ाइल से उदाहरण डेटा शामिल है।
    3. प्रोटीन गुना परिवर्तन के लिए एमएफआई मूल्यों का विश्लेषण: एमएफआई मूल्यों को प्राप्त करने के बाद, नियंत्रण या अनुपचारित आबादी (समीकरण 1) के सापेक्ष एमएफआई के गुना परिवर्तन की गणना करें। एमएफआई गुना परिवर्तन प्रोटीन के स्तर में गुना परिवर्तन को प्रतिबिंबित करता है। गुना परिवर्तन मूल्यों का उपयोग करके, अभिव्यक्ति में परिवर्तन का आकलन करें और टी-टेस्ट या एनोवा का उपयोग करके सांख्यिकीय महत्व की गणना करें।
      Equation 1समीकरण 1

Figure 4
चित्रा 4: प्रोटीन एमएफआई मूल्यांकन के लिए गेटिंग रणनीति। घटनाओं SSC-A बनाम FSC-H (S1) पर सेल आकार के लिए पहले gated हैं. कोशिकाओं को तब FSC-H बनाम FSC-W (S2) पर सिंगलेट्स के लिए गेट किया जाता है। सिंगलेट कोशिकाओं को तब पी 2 आरवाई 12-एपीसी सिग्नल (एपीसी +) द्वारा माइक्रोग्लिया के रूप में पहचाना जाता है, जिसमें एपीसी-एफएमओ नियंत्रण में प्रतिदीप्ति के आधार पर स्थापित गेट होता है जिसमें एक आइसोटाइप नियंत्रण एंटीबॉडी होता है। कोशिकाओं तो Comp-FL5-A::Y610-mCherry पर H3K27Ac-AlexaFluor5 संकेत के लिए gated हैं. 610+ कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट तीव्रता प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए प्रॉक्सी के रूप में निर्धारित की जाती है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Representative Results

वयस्क चूहों को ट्रांसकार्डियली रूप से छिद्रित किया गया था और माइक्रोग्लिया अलगाव के लिए बलिदान किया गया था। माइक्रोग्लिया को बर्फ पर अलग किया गया और पी 2 आरवाई 12-एपीसी और वायलेट 525 जीवित मृत एंटीबॉडी के साथ दाग दिया गया। कोशिकाएं जो पी 2 आरवाई 12 के लिए सकारात्मक और वायलेट 525 जीवित मृत दाग के लिए नकारात्मक होने के लिए निर्धारित की गई थीं, उन्हें लाइव माइक्रोग्लिया के रूप में क्रमबद्ध किया गया था। एक विच्छेदित माउस मस्तिष्क से माइक्रोग्लिया की औसत उपज 1.28 x 105 ± 0.05 (मतलब ± मतलब मतलब (एसईएम), एन = 100 की मानक त्रुटि थी। महिला (1.25 x 105 ± 0.09 [मतलब ± SEM, N = 46]) और पुरुष (1.32 x 105 ± 0.07 [मतलब ± SEM, N = 54]) चूहों (t(98) = 0.6365, p=0.526) से माइक्रोग्लिया की उपज में कोई अंतर नहीं है। विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों से अलग करते समय, माउस कॉर्टिस से माइक्रोग्लिया की औसत उपज 8.3 x 104 ± 0.08 (मतलब ± एसईएम, एन = 15) है और माउस हिप्पोकैम्पस से 4.1 x 104 ± 0.02 (मतलब ± एसईएम, एन = 16) है। जैसा कि अपेक्षित था, प्रत्येक मस्तिष्क क्षेत्र (एफ (2, 128) = 25.25, पी <0.0001) से माइक्रोग्लिया की उपज में महत्वपूर्ण अंतर है। माइक्रोग्लिया अलगाव के बाद, आरएनए को कम-इनपुट आरएनए अलगाव किट का उपयोग करके पृथक कोशिकाओं से निकाला गया था। लगातार आरएनए अखंडता स्कोर (आरआईएन) 9.0 (9.62 ± 0.05) से ऊपर था और प्रति सेल आरएनए की औसत उपज 0.25 ± 0.01 पीजी (मतलब ± एसईएम, एन = 32; पूरक फ़ाइल S2)।

वयस्क चूहों intraperitoneally बलिदान से पहले 24 घंटे 1 मिलीग्राम / किग्रा lipopolysaccharide (LPS) के साथ इंजेक्शन थे. चूहों को एचबीएसएस के साथ ट्रांसकार्डियली perfused थे, और माइक्रोग्लिया वर्णित प्रोटोकॉल(चित्रा 5A)के अनुसार पूरे मस्तिष्क से अलग थे। प्रत्येक दाग के लिए, एंटीबॉडी के प्रत्येक पैनल को 20,000-30,000 कोशिकाएं आवंटित की गईं। हिस्टोन 3 लाइसिन 27 एसिटिलीकरण (H3K27Ac) के वैश्विक स्तर का मूल्यांकन प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से पृथक माइक्रोग्लिया में किया गया था। नर और मादा चूहों के लिए, एलपीएस उपचार ने एच 3 के 27 एसी में वृद्धि को प्रेरित किया जब एमएफआई सेक्स के भीतर सामान्यीकृत होता है (टी (6) = 9.676, पी < 0.0001; चित्रा 5 बी)। दाग वाली कोशिकाओं के लिए हिस्टोग्राम की जांच करते समय, आबादी सामान्य रूप से समान भिन्नता के साथ वितरित रहती है; हालांकि, कोशिकाओं को एमएफआई (चित्रा 5सी) में वृद्धि के परिणामस्वरूप बढ़ी हुई प्रतिदीप्ति में स्थानांतरित कर दिया गया है। एक ही उपचार में H3K9Ac की जांच करते समय, H3K9Ac (t(6)=7.299, p=0.0003 में समान वृद्धि होती है; चित्रा 5 डी, ई) हालांकि एच 3 के 9 एसी सिग्नल के पीबीएस के सापेक्ष एलपीएस का गुना परिवर्तन एच 3 के 27 एसी सिग्नल से कम है।

Figure 5
चित्रा 5: पृथक माइक्रोग्लिया में हिस्टोन एसिटिलीकरण में वैश्विक परिवर्तन। (ए) चूहों फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) या 1 मिलीग्राम/किलो lipopolysaccharide (LPS) बलिदान से पहले 24 घंटे के साथ intraperitoneally इंजेक्शन रहे हैं. माइक्रोग्लिया को प्रतिरक्षा समृद्ध अंश से एकत्र किया जाता है और प्रवाह साइटोमेट्री और वैश्विक हिस्टोन पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधन मूल्यांकन के लिए तय किया जाता है। मंझला फ्लोरोसेंट तीव्रता प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में मूल्यांकन किया है. BioRender.com के साथ बनाया गया। (ख) एलपीएस उपचार की प्रतिक्रिया में एच3के27एसी के वैश्विक स्तरों में वृद्धि हुई। प्रयोग और सेक्स के भीतर सामान्यीकृत पीबीएस में गुना परिवर्तन। अयुग्मित दो पूंछ वाले टी-परीक्षण, टी (6) = 9.676, पी <0.0001। बार ग्राफ एसईएम ± माध्य को दर्शाता है। एन = 8 जानवर; 2 स्वतंत्र प्रयोगों में 2 प्रति शर्त। (सी) उदाहरण हिस्टोग्राम एच 3 के 27 एसी फ्लोरोसेंट तीव्रता के बदलाव को दर्शाते हैं। मोडल पीबीएस-इंजेक्शन बनाम एलपीएस-इंजेक्शन चूहों से हिस्टोग्राम को दर्शाता है। (डी) उदाहरण हिस्टोग्राम एच 3 के 9 एसी फ्लोरोसेंट तीव्रता के बदलाव को दर्शाते हैं। मोडल पीबीएस-इंजेक्शन बनाम एलपीएस-इंजेक्शन चूहों से हिस्टोग्राम को दर्शाता है। (ङ) एलपीएस उपचार की प्रतिक्रिया में एच3के9एसी के वैश्विक स्तरों में वृद्धि हुई। प्रयोग और सेक्स के भीतर सामान्यीकृत पीबीएस में गुना परिवर्तन। अयुग्मित दो पूंछ वाले टी-परीक्षण, टी (6) = 7.299, पी = 0.0003। बार ग्राफ एसईएम ± माध्य को दर्शाता है। एन = 8 जानवर; 2 स्वतंत्र प्रयोगों में 2 प्रति शर्त। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

यह पुष्टि करने के लिए कि वर्णित विधि वैश्विक हिस्टोन संशोधन परिमाणीकरण के लिए अन्य पहले इस्तेमाल किए गए तरीकों के बराबर थी, हमने तुलनात्मक उपकरण के रूप में इम्यूनोब्लॉट का उपयोग करने का लक्ष्य रखा। हालांकि, पृथक माइक्रोग्लिया से उपज उचित मूल्यांकन को सक्षम करने के लिए बस बहुत कम है। इसलिए, हमने इंट्रासेल्युलर फ्लो साइटोमेट्री विधि की तुलना वेस्टर्न ब्लॉट (डब्ल्यूबी) से करने के लिए सुसंस्कृत बीवी 2 कोशिकाओं का उपयोग किया। बीवी 2 कोशिकाओं को 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर पूर्ण मीडिया (DMEMF12, 10% एफबीएस, 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टामाइसिन और 1x एल-ग्लूटामाइन) में उगाया गया था। कोशिकाओं को 0.25% ट्रिप्सिन-ईडीटीए के साथ पारित किया गया और 250,000 कोशिकाओं/अच्छी तरह से घनत्व पर चढ़ाया गया और कम सीरम मीडिया (डीएमईएम एफ 12, 2% एफबीएस, 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टामाइसिन, और 1x एल-ग्लूटामाइन) में इलाज किया गया और 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ2 पर 12 घंटे के लिए ठीक होने की अनुमति दी गई। कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 25 एनजी/एमएल एलपीएस के साथ इलाज किया गया था, जैसा कि ऊपर वर्णित है या डब्ल्यूबी लाइसिस बफर के साथ लाइसिस है। H3K27Ac का सिग्नल दोनों तरीकों से किया गया था, जिसमें GAPDH WB के लिए लोडिंग कंट्रोल के रूप में उपयोग किया गया था। पीबीएस नियंत्रण की तुलना में सामान्यीकृत फ्लोरोसेंट तीव्रता का विश्लेषण प्रत्येक समूह(चित्रा 6ए)के लिए निर्धारित किया गया था। WB द्वारा सामान्यीकृत H3K27Ac सिग्नल में परिवर्तन की जांच करते समय, H2O नियंत्रण के सापेक्ष LPS उपचारित स्थिति में 1.527 गुना वृद्धि हुई थी, जिसे अयुग्मित t-परीक्षण (t = 3.024, df = 5; p = 0.0293) द्वारा महत्वपूर्ण माना गया था। प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके परिवर्तन की जांच करते समय, एलपीएस उपचारित स्थिति में 1.482 गुना वृद्धि हुई थी जिसे महत्वपूर्ण (टी = 7.843, डीएफ = 10; पी <0.0001) निर्धारित किया गया था। तरीकों की तुलना करने के लिए एक 2 तरह से एनोवा का प्रयोग, वहाँ उपचार का एक महत्वपूर्ण प्रभाव होने के लिए निर्धारित किया गया था (एफ (1,15) = 45.21, पी <0.0001), लेकिन विधि नहीं (एफ (1,15) = 0.05545, पी = 0.8697) या बातचीत (एफ (1,15) = 0.02785, पी = 0.8697). इसके अलावा, हम यहां सत्यापित करते हैं कि पश्चिमी धब्बा और प्रवाह साइटोमेट्री दोनों द्वारा हिस्टोन एच 3 के स्तर में कोई बदलाव नहीं हुआ है क्योंकि 2-तरफा एनोवा ने एलपीएस उपचार (एफ (1,7) = 0.02170, पी = 0.8870), विधि (एफ (1,7) = 0.01191, पी = 0.9162) या इंटरैक्शन (एफ (1,7 = 0.01191, पी = 0.9162; चित्रा 6 बी)। इस डेटा के लिए उदाहरण धब्बे और हिस्टोग्राम बदलाव के रूप में अच्छी तरह से (चित्रा 6 सी, डी) दिखाया गया है।

Figure 6
चित्रा 6: प्रवाह साइटोमेट्री और पश्चिमी धब्बा के बीच वैश्विक हिस्टोन संशोधन परिवर्तन की मात्रा का ठहराव के लिए विधि तुलना। (ए) बीवी 2 कोशिकाओं को विश्लेषण से पहले 24 घंटे के लिए 25 एनजी / एमएल लिपोपॉलेसेकेराइड (एलपीएस) या एच2ओ के साथ इलाज किया जाता है। H3K27Ac की फ्लोरोसेंट तीव्रता को प्रवाह साइटोमेट्री और पश्चिमी धब्बा दोनों के लिए वाहन नियंत्रण, फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में गुना परिवर्तन के रूप में दर्शाया गया है। 2-वे एनोवा ने एलपीएस उपचार (एफ (1,15) = 45.21, पी <0.0001) के महत्वपूर्ण प्रभाव का खुलासा किया, लेकिन विधि नहीं (एफ (1,15) = 0.05545, पी = 0.8697) या बातचीत (एफ (1,15) = 0.02785, पी = 0.8697)। कई परिकल्पना परीक्षण के लिए टुकी का सुधार अवशिष्टों के लिए लागू किया गया था। * 0.0332 प्रस्तुत करता है, ** 0.0021 प्रस्तुत करता है। (बी) हिस्टोन एच 3 के लिए फ्लोरोसेंट तीव्रता को प्रवाह साइटोमेट्री और पश्चिमी धब्बा दोनों के लिए पीबीएस में गुना परिवर्तन के रूप में दर्शाया गया है। 2-वे एनोवा ने एलपीएस उपचार (एफ (1,7) = 0.02170, पी = 0.8870) या विधि (एफ (1,7) = 0.01191, पी = 0.9162) या इंटरैक्शन (एफ (1,7 = 0.01191, पी = 0.9162) का कोई महत्वपूर्ण प्रभाव नहीं दिखाया। (सी) उदाहरण ब्लॉट्स और (डी) प्रवाह साइटोमेट्री शिफ्ट को चित्रित किया गया है। हिस्टोग्राम आकार फ्लोरोसेंट तीव्रता मोड पर मौजूद कोशिकाओं की संख्या के आधार पर प्रतिशत करने के लिए सामान्यीकृत है. बार ग्राफ मतलब SEM दर्शाया गया है. n = 2 स्वतंत्र प्रयोग, प्रयोग प्रति शर्त 2. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

सभी एक साथ, इन परिणामों से पता चलता है कि इस तकनीक का उपयोग पृथक माइक्रोग्लिया में वैश्विक एचपीटीएम स्तरों का मात्रात्मक आकलन करने के लिए किया जा सकता है। इसके अलावा, विधि को पिछली तकनीकों के बराबर दिखाया गया था लेकिन बहुत कम सेल इनपुट की आवश्यकता थी। इसके अलावा, जबकि उचित मुआवजे के साथ नहीं दिखाया गया है, वर्तमान तकनीक का उपयोग विभिन्न एचपीटीएम का आकलन करने वाले एक ही पैनल पर कई एंटीबॉडी के साथ किया जा सकता है।

पूरक फ़ाइल S1: उदाहरण विश्लेषण फ़ाइलें। इस फ़ाइल में एक wsp विश्लेषण फ़ाइल और 7 fcs फ़ाइलें हैं जिनमें कोई दाग नहीं, P2RY12FMO, 568FMO, दो PBS उपचारित जानवर और H3K27AC से सने दो LPS उपचारित जानवर शामिल हैं। इस फ़ाइल का उद्देश्य एक प्रयोग पर विश्लेषण और गेटिंग का प्रदर्शन करना है जो यह दर्शा सकता है कि एक सफल प्रयोग कैसा दिखता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल S2: अलगाव डेटा। शामिल फ़ाइल में प्रासंगिक डेटा पोस्ट माइक्रोग्लिया सॉर्ट होता है जिसमें वर्णित प्रोटोकॉल से माइक्रोग्लिया और आरएनए उपज होती है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

गेटेड जनसंख्या माता-पिता की आवृत्ति कुल की आवृत्ति गिनना
एस 1 89.00% 89.00% 25672
एस 2> एस 1 88.73% 78.97% 22779
एपीसी + > एस 2 > एस 1 76.61% 60.50% 17452
610+ > एपीसी+ > S2 > S1 99.56% 60.24% 17376

तालिका 2: उदाहरण नमूना वंश चार्ट सटीक प्रोटीन का पता लगाने के लिए आवश्यक प्रतिशत और घटना संख्या को दर्शाता है।

Discussion

प्रस्तुत प्रोटोकॉल प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से वैश्विक एचपीटीएम स्तरों के मात्रात्मक मूल्यांकन को सक्षम बनाता है। जबकि इस प्रोटोकॉल एक उपन्यास विधि प्रस्तुत करता है, पिछले अध्ययनों एक समान दृष्टिकोण26 का उपयोग कर प्रोटीन की मात्रात्मक मूल्यांकन किया है. एचपीटीएम के वैश्विक स्तर का आकलन करने के लिए उपयोग की जाने वाली पिछली विधियों में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री और पश्चिमी धब्बा 16,17,19,20 शामिल हैं। प्रस्तुत प्रवाह साइटोमेट्री-आधारित विधि एक आसानी से मात्रात्मक विधि है, जबकि पश्चिमी धब्बा और इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अर्ध-मात्रात्मक हैं और कम थ्रूपुट हैं। पश्चिमी धब्बा सेल लसीका पर निर्भर करता है और इस प्रकार दोनों प्रोटीन सामान्यीकरण और एक लोड हो रहा है नियंत्रण प्रोटीन है कि प्रयोगात्मक हालत27 द्वारा अपरिवर्तित माना जाता है की आवश्यकता है. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री अर्धमात्रात्मक और बहुत कम थ्रूपुट है क्योंकि एकल कोशिका स्तर16 पर जांच किए बिना प्रोटीन की मात्रा का मात्रात्मक आकलन करना मुश्किल है। इसी तरह, पृथक माइक्रोग्लिया के लिए, सीमित उपज के कारण प्रवाह साइटोमेट्री विधि का उपयोग करने के लिए एक लाभ है क्योंकि पश्चिमी धब्बा को बहुत बड़े प्रोटीन इनपुट19 की आवश्यकता होती है। कम सेल नंबर आवश्यकताओं कई धुंधला पैनलों के लिए एक ही जानवर से चलाया जा करने के लिए अनुमति देते हैं.

हालांकि, किसी भी अन्य विधि के साथ, एंटीबॉडी लागत और उपलब्धता सहित इस तकनीक की सीमाएं हैं, क्योंकि सभी एंटीबॉडी प्रवाह साइटोमेट्री सेटिंग में अच्छी तरह से काम नहीं करते हैं। इसके अलावा, इम्यूनोब्लॉट की तुलना में, आवश्यक एंटीबॉडी की एकाग्रता बहुत अधिक है। जबकि मल्टीप्लेक्सिंग कोशिकाओं के एक ही पैनल पर कई एंटीबॉडी का उपयोग करने की अनुमति देता है, विश्लेषण के बाद कोशिकाओं को एंटीबॉडी से अलग नहीं किया जा सकता है, इस प्रकार सेल उपयोग को प्रति एंटीबॉडी प्रजातियों में से एक तक सीमित किया जा सकता है। यह इम्यूनोब्लॉट से अलग है जिसमें एक ही धब्बा को बार-बार इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, एंटीबॉडी की उपलब्धता और साइटोमीटर पर डिटेक्शन चैनलों की संख्या के आधार पर, एक साथ एक दर्जन अंकों तक की जांच करना संभव होगा।

वर्तमान विधि प्रोटीन अभिव्यक्ति के केवल वैश्विक स्तर को पकड़ती है और विशिष्ट जीनोमिक स्थान को नहीं, और वैश्विक स्तरों में परिवर्तन व्यक्तिगत जीनोमिक लोकी में परिवर्तन को प्रतिबिंबित नहीं कर सकते हैं। इसी तरह, वैश्विक स्तर पर बदलाव की कमी का मतलब यह नहीं हो सकता है कि कोई जीनोमिक लोकी परिवर्तन नहीं हो रहा है, बस यह कि वैश्विक परिवर्तनों में उपचार के बीच कोई अंतर नहीं है। जैसे, इस तकनीक का उपयोग जीनोमिक विश्लेषण के लिए एचपीटीएम की पहचान करने के लिए एक स्क्रीन के रूप में किया जाना है। इसके अलावा, इस विधि को नियंत्रण के लिए एक गुना परिवर्तन के रूप में मूल्यांकन किए जाने के अलावा विभिन्न प्रोटीन चिह्नों में तुलना के लिए अनुमति नहीं देता है। इसलिए, यह प्रोटीन निर्धारण के लिए एलिसा जैसे मानक वक्र-आधारित विधि की तुलना में सीमित है।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल लाइव मस्तिष्क माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए एक रणनीति प्रदान करता है। यह प्रोटोकॉल माइक्रोग्लिया अलगाव के लिए P2RY12 प्रोटीन अभिव्यक्ति पर निर्भर करता है। हालांकि, P2RY12 माइक्रोग्लिया में एक होमोस्टैटिक मार्कर है और इसे 5XFAD22 जैसे रोग मॉडल में डाउनरेगुलेट किया जा सकता है। इसलिए, एक रोग मॉडल जानवर का उपयोग करते समय माइक्रोग्लिया23 के अलगाव में सहायता के लिए TMEM119, सीडी 11 बी, या सीडी 45 जैसे अन्य मार्कर प्रोटीन चुनना सुनिश्चित करें। इसी तरह, हम इस प्रोटोकॉल को हिप्पोकैम्पस और / या प्रांतस्था से अलगाव के रूप में प्रस्तुत करते हैं। यह प्रोटोकॉल सफेद पदार्थ क्षेत्रों सहित अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों से माइक्रोग्लिया को अलग करने के लिए काम करेगा, हालांकि, ब्याज के क्षेत्रों के आकार के आधार पर पर्याप्त माइक्रोग्लिया प्राप्त करने के लिए कई जानवरों की आवश्यकता हो सकती है।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल मजबूती से लाइव, मस्तिष्क microglia अलग कर सकते हैं, लेकिन वहाँ कई कदम हैं, नीचे वर्णित, अलगाव चरण में है कि सेल उपज कम कर सकते हैं अगर गलत तरीके से प्रदर्शन किया.

इस प्रोटोकॉल के लिए छिड़काव प्रतिरक्षा समृद्ध टुकड़े में माइक्रोग्लिया का एक उच्च प्रतिशत में परिणाम जो सॉर्टर पर समय की मात्रा को कम करेगा. हालांकि, छिड़काव की आवश्यकता नहीं है, और यदि आवश्यक हो तो इच्छामृत्यु के अन्य तरीकों का उपयोग किया जा सकता है।

माइक्रोग्लिया अलगाव के दौरान, माइलिन को पूरी तरह से हटा दिया जाना चाहिए। फ्लो साइटोमीटर तीव्र गति से संकीर्ण टयूबिंग के माध्यम से यात्रा करने में सक्षम कोशिकाओं पर भरोसा करते हैं। इसकी चिपचिपाहट और टकराने की प्रवृत्ति के कारण, माइलिन साइटोमीटर के साथ समस्याओं का कारण बनता है, अक्सर मोज़री का कारण बनता है जो उपकरण को नुकसान पहुंचा सकता है और नमूने को नष्ट कर सकता है, उपज को काफी कम कर सकता है। नीचे की ओर मुद्दों से बचने के लिए प्रतिरक्षा-समृद्ध टुकड़ों के संग्रह के दौरान सभी माइलिन को हटाने के लिए सतर्क रहें।

प्लेट धुंधला बनाम ट्यूब धुंधला: इस प्रोटोकॉल में, हम या तो 1.5 एमएल ट्यूबों या एक 96 अच्छी तरह से थाली में कोशिकाओं धुंधला के लिए दो विकल्प का वर्णन. प्रत्येक के लिए उपयोग का मामला प्रयोग पर निर्भर करता है; हालांकि, आम तौर पर ट्यूब धुंधला प्लेट धुंधला हो जाना की तुलना में उपज को प्रभावित करने के लिए कम जोखिम है क्योंकि झटका गलत तरीके से किए जाने पर कोशिकाओं के नुकसान का जोखिम उठाता है। प्लेट धुंधला हो जाना बहुत तेज है क्योंकि प्रत्येक ट्यूब के लिए सतह पर तैरनेवाला की महाप्राण समय लेने वाली है। निर्धारण से पहले (छँटाई, आदि के लिए), उपज को अधिकतम करने और नुकसान के जोखिम को कम करने के लिए ट्यूब धुंधला हो जाना का उपयोग करें। हालांकि, एचपीटीएम विश्लेषण के लिए, एक बार कोशिकाओं को इंट्रान्यूक्लियर धुंधला होने के लिए तय किया जाता है, गोली अधिक स्थिर होती है, और फ्लिकिंग के साथ नुकसान का जोखिम कम होता है।

असंतत घनत्व ढाल की स्थापना: लेयरिंग स्थापित करते समय, प्रतिरक्षा समृद्ध अंश प्राप्त करने के लिए परतों को ठीक से स्थापित करना आवश्यक है। यदि परतें परेशान या मिश्रित होती हैं और बादल दिखाई देती हैं, तो कोशिकाएं अपने वांछित स्थान पर नहीं छाँटेंगी, और प्रतिरक्षा-समृद्ध सेल अंश प्राप्त करने में कठिनाई होगी। यदि ऐसा होता है, तो माइलिन को हटाने के लिए घनत्व माध्यम के साथ स्पिन करें और फिर पूरे शेष अंशों को इकट्ठा करें, एफएसीएस बफर के 3 एमएल के साथ घनत्व माध्यम के 1 एमएल तक पतला करें और अच्छी तरह मिलाएं (इसके लिए कई ट्यूबों की आवश्यकता होगी)। 0 पर ब्रेक के साथ 10 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर स्पिन करें। सतह पर तैरनेवाला त्यागें, केवल ~ 300 माइक्रोन समाधान छोड़कर. पूरे नमूने और दाग ले लीजिए। यह कम सॉर्ट प्रतिशत और साइटोमीटर पर बिताए गए समय की अधिक मात्रा में उपज देगा, लेकिन उपज अभी भी तुलनीय हो सकती है।

अलगाव विधि का उपयोग करते समय, आरएनए के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करने और एक ही माउस मस्तिष्क से एचपीटीएम मूल्यांकन के लिए सक्षम होना फायदेमंद होता है। इस स्थिति में, लाइव माइक्रोग्लिया को छाँटने के बाद, कोशिकाओं को आरएनए मूल्यांकन के लिए एक हिस्सा आवंटित करने के लिए विभाजित किया जा सकता है (एक सभ्य आरएनए उपज प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं की न्यूनतम इनपुट संख्या 75,000 कोशिकाएं हैं) और आगे प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए एक हिस्सा (एमएफआई के अच्छे निर्धारण के लिए न्यूनतम 10,000 कोशिकाएं प्रति कुआं)। इस मामले में, फ्लो साइटोमीटर सॉर्टिंग की आवश्यकता होती है। हालांकि, जब केवल एचपीटीएम विश्लेषण के लिए कोशिकाओं का उपयोग करने की योजना बना रहे हैं, तो छँटाई की आवश्यकता नहीं होती है, और प्रतिरक्षा अंश को पी 2 आरवाई 12 एंटीबॉडी और एचपीटीएम एंटीबॉडी के साथ दाग दिया जा सकता है। साइटोमीटर पर गेटिंग को तब P2RY12+ माइक्रोग्लिया के लिए सेट किया जा सकता है, जैसा कि फ्लो सॉर्टिंग के लिए किया जाएगा, माइक्रोग्लिया के भीतर केवल HPTM सिग्नल का विश्लेषण करने के लिए। छँटाई को खत्म करने से प्रोटोकॉल तेज और अधिक लागत प्रभावी हो सकता है। इसके अलावा, यदि सुसंस्कृत कोशिकाओं से एचपीटीएम का मूल्यांकन किया जाता है, तो धुंधला प्रोटोकॉल पर शुरू करना पर्याप्त है और चित्रा 6में दिखाए गए अनुसार कोई सेल मार्कर एंटीबॉडी की आवश्यकता नहीं है। एचपीटीएम मूल्यांकन प्रोटोकॉल का उपयोग सुसंस्कृत, प्राथमिक और आईपीएससी व्युत्पन्न कोशिकाओं सहित कई सेल प्रकारों के लिए किया जा सकता है।

अंत में, जबकि हमने अलगाव के नीचे की ओर माइक्रोग्लिया के केवल दो संभावित उपयोग प्रस्तुत किए हैं, ऐसे ChIP, CUT &Tag और CUT &RUN जैसे एपिजेनेटिक तकनीकों सहित कई अन्य हैं। जीनोमिक एपिजेनेटिक तकनीकों के मामले में, जहां विशिष्ट लोकी में परिवर्तन की विशेषता रुचि है, लेखकों और क्रोमेटिन के इरेज़र के लिए विशिष्ट अवरोधकों का चयन करें11 प्रयोगों के अनुरूप यह सुनिश्चित करने के लिए कि किसी भी माइक्रोग्लियल एपिजेनेटिक संशोधनों को प्रोफाइल किया गया है, एंजाइमी पाचन जैसे अलगाव प्रक्रिया में किसी भी कदम से तकनीकी कलाकृतियां नहीं हैं। एपिजेनेटिक चिह्नों के वैश्विक स्तर में परिवर्तन का आकलन करते समय, जैसे मात्रात्मक प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके, किसी भी प्रक्रिया-प्रेरित परिवर्तन के इतने बड़े होने की उम्मीद नहीं है कि वे वैश्विक स्तर पर पाए जाते हैं।

कुल मिलाकर, चर्चा की गई विधियां प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा हिस्टोन संशोधनों और अन्य एपिजेनेटिक परिवर्तनों के वैश्विक स्तर को निर्धारित करने के लिए एक उपन्यास, एकल कोशिका विधि प्रदान करती हैं। हमने प्रदर्शित किया कि यह विधि विवो में एलपीएस के जवाब में माइक्रोग्लिया में एन्हांसर मार्कर H3K27ac में वैश्विक परिवर्तनों का पता लगाने के लिए पर्याप्त रूप से संवेदनशील है। यह एलपीएस उत्तेजना के बाद H3K27ac के पिछले ChIP-अनुक्रमण के अनुरूप है, जो LPS28 के प्रति उत्तरदायी एन्हांसर्स के नाटकीय रीमॉडेलिंग को दर्शाता है। इस विधि के अनुप्रयोगों विकास और रोग में विभिन्न मस्तिष्क कोशिका प्रकार भर में वैश्विक epigenetic परिवर्तन की परीक्षा के लिए अनुमति देगा.

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

चित्रा 5 में इम्यूनोब्लॉट के साथ मदद करने के लिए यानयांग बाई के लिए धन्यवाद। इस काम को कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थानों [सीआरसी-आरएस 950-232402 से एसी] द्वारा समर्थित किया गया था; कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद [RGPIN-2019-04450, DGECR-2019-00069 से AC]; स्कॉटिश राइट चैरिटेबल फाउंडेशन [21103 से एसी] और ब्रेन कनाडा फाउंडेशन [AWD-023132 से एसी]; ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय आदिवासी स्नातक फैलोशिप (6481 से एमटी); ब्रिटिश कोलंबिया ग्रेजुएट स्कॉलरशिप (6768 से एमटी); कैनेडियन ओपन न्यूरोसाइंस प्लेटफॉर्म स्टूडेंट स्कॉलर अवार्ड (10901 से जेके); ब्रिटिश कोलंबिया विश्वविद्यालय चार वर्षीय डॉक्टरेट फैलोशिप (6569 से जेके)। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और विश्लेषण, प्रकाशन के निर्णय या पांडुलिपि की तैयारी में फंडर्स की कोई भूमिका नहीं थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5M EDTA Invitrogen AM9260G
15 mL Falcon Centrifuge Tubes, Polypropylene, Sterile  Falcon 352196
24-well Clear Not Treated Plates Costar 3738
2-Mercaptoethanol Gibco 21985023
96 Well Clear Polystyrene Microplate, clear round bottom, non treated surface Corning 3788
Acetyl Histone 3 K9 (C5B11) Cell Signalling Technology 9649S Dilution: 1:100
Acetyl Histone H4 K8 (2594) Cell Signalling Technology 2594S Dilution: 1:100
Acetyl-Histone H3 K27 (D5E4) Cell Signalling Technology 8173S Dilution: 1:100
Acetyl-Histone H3 Lys27 (MA523516) Invitrogen MA523516 Dilution: 1:100
Actinomycin D New England Biolabs 15021S
Anisomycin New England Biolabs 2222S
Anti-Histone H3 (tri methyl K4)  Abcam ab213224 Dilution: 1:100
Anti-Lactyl-Histone H4 (Lys 12) Rabbit mAb PTM Biolabs PTM-1411RM Dilution: 1:250
Anti-L-Lactyllysine Rabbit pAb PRM Biolabs PTM-1401RM Dilution: 1:250
Apc anti-P2RY12 Antibody, Clone: S16007D BioLegend 848006
BSA Tocris 5217
Cyto-Last Buffer BioLegend 422501
dimethylsulfoxide, sterile Cell Signalling Technology 12611S
DNAse I STEMCELL Technologies 07900
Donkey Anti Mouse AlexaFluor488 Jackson ImmunoResearch 715-546-150 Dilution: 1:500
Donkey Anti Rabbit AlexaFluor488 ABclonal AS035 Dilution: 1:500
Donkey Anti Rabbit AlexaFluor568 Invitrogen A10042 Dilution: 1:500
Donkey Anti Rabbit Brilliant Violet 421 BioLegend 406410 Dilution: 1:500
Fisherbrand Disposable Graduated Transfer Pipettes Fisherbrand 13-711-9AM
Fisherbrand Disposable PES Filter Unit, 250mL  Fisherbrand FB12566502
H3K18ac Polyclonal Antibody Invitrogen 720095 Dilution: 1:100
HBSS (10X), no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14185052
HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14175103
Histone 3 Trimethyl K27 (ab6002) Abcam ab6002 Dilution: 1:100
KONTES Dounce Tissue Grinders 125mm 7mL  VWR 885300-0007
Lactyl-Histone H3 (Lys 18) Rabbit mAb PTM BIolabs PTM-1406RM Dilution: 1:250
Lipopolysacharide  Sigma-Aldrich L5418
Normal Donkey Serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
OneComp eBeads Compensation Beads Invitrogen 01-1111-41
PDS Kit, Papain Vial - Worthington Biochemical Cedarlane LK003178
Percoll Sigma-Aldrich GE17-0891-02
Phenol Red VWR RC57004
QIAshredder Qiagen  79656
Rainbow Fluorescent Particles, 1 peak (3.0-3.4 uM - Mid Range Intensity BioLegend 422905
RNase-free Microfuge Tubes, 1.5 mL Invitrogen AM12400
Rneasy Plus Micro Kit Qiagen  74034
Round Bottom Polypropylene Tubes with Caps, 5 mL Corning 352063
Triptolide New England Biolabs 97539
True Nuclear Transcription Factor Buffer Set BioLegend 424401
TruStain FcX PLUS (anti-mouse CD16/32) Antibody BioLegend 156604
Trypan Blue VWR 97063-702
Zombie Aqua Fixable Viability Kit BioLegend 423102

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References

  1. Miller, J. L., Grant, P. A. The Role of DNA Methylation and Histone Modifications in Transcriptional Regulation in Humans. Epigenetics: Development and Disease. 61, 289-317 (2013).
  2. Kouzarides, T. Chromatin Modifications and Their Function. Cell. 128 (4), 693-705 (2007).
  3. Bannister, A. J., Kouzarides, T. Regulation of chromatin by histone modifications. Cell Research. 21 (3), 381-395 (2011).
  4. Barski, A., et al. High-resolution profiling of histone methylations in the human genome. Cell. 129 (4), 823-837 (2007).
  5. Vogel Ciernia, A., LaSalle, J. The landscape of DNA methylation amid a perfect storm of autism aetiologies. Nature Reviews. Neuroscience. 17 (7), 411-423 (2016).
  6. Keiser, A. A., et al. Systemic HDAC3 inhibition ameliorates impairments in synaptic plasticity caused by simulated galactic cosmic radiation exposure in male mice. Neurobiology of Learning and Memory. 178, 107367 (2021).
  7. McQuown, S. C., et al. HDAC3 is a critical negative regulator of long-term memory formation. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 31 (2), 764-774 (2011).
  8. Barrett, R. M., et al. Hippocampal Focal Knockout of CBP Affects Specific Histone Modifications, Long-Term Potentiation, and Long-Term Memory. Neuropsychopharmacology. 36 (8), 1545-1556 (2011).
  9. Datta, M., et al. Histone Deacetylases 1 and 2 Regulate Microglia Function during Development, Homeostasis, and Neurodegeneration in a Context-Dependent Manner. Immunity. 48 (3), 514.e6-529.e6 (2018).
  10. Belhocine, S., et al. Context-dependent transcriptional regulation of microglial proliferation. Glia. 70 (3), 572-589 (2022).
  11. Gosselin, D., et al. An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity. Science (New York, N.Y.). 356 (6344), eaal3222 (2017).
  12. Kettenmann, H., Hanisch, U. -K., Noda, M., Verkhratsky, A. Physiology of Microglia. Physiological Reviews. 91 (2), 461-553 (2011).
  13. Sullivan, O., Ciernia, A. V. Work hard, play hard: how sexually differentiated microglia work to shape social play and reproductive behavior. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 989011 (2022).
  14. Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. BioTechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
  15. Mahmood, T., Yang, P. C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American Journal of Medical Sciences. 4 (9), 429-434 (2012).
  16. Crowe, A., Yue, W. Semi-quantitative Determination of Protein Expression Using Immunohistochemistry Staining and Analysis: An Integrated Protocol. BIO-PROTOCOL. 9 (24), (2019).
  17. Seligson, D. B., et al. Global histone modification patterns predict risk of prostate cancer recurrence. Nature. 435 (7046), 1262-1266 (2005).
  18. Liu, B., et al. Global Histone Modification Patterns as Prognostic Markers to Classify Glioma Patients. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 19 (11), 2888-2896 (2010).
  19. Pan, R. Y., et al. Positive feedback regulation of microglial glucose metabolism by histone H4 lysine 12 lactylation in Alzheimer's disease. Cell Metabolism. 34 (4), 634.e6-648.e6 (2022).
  20. Zhang, D., et al. Metabolic regulation of gene expression by histone lactylation. Nature. 574 (7779), 575-580 (2019).
  21. Pösel, C., Möller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. Isolation and Flow Cytometric Analysis of Immune Cells from the Ischemic Mouse Brain. Journal of Visualized Experiments. (108), 53658 (2016).
  22. Oblak, A. L., et al. Comprehensive Evaluation of the 5XFAD Mouse Model for Preclinical Testing Applications: A MODEL-AD Study. Frontiers in Aging Neuroscience. 13, 713726 (2021).
  23. Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L. Isolation and Culture of Microglia. Current Protocols in Immunology. 125 (1), e70 (2019).
  24. McKinnon, K. M. Multiparameter Conventional Flow Cytometry. Flow Cytometry Protocols. 1678, 139-150 (2018).
  25. Marsh, S. E., et al. Dissection of artifactual and confounding glial signatures by single-cell sequencing of mouse and human brain. Nature Neuroscience. 25 (3), 306-316 (2022).
  26. Wang, L., Gaigalas, A. K., Marti, G., Abbasi, F., Hoffman, R. A. Toward quantitative fluorescence measurements with multicolor flow cytometry. Cytometry Part A. 73A (4), 279-288 (2008).
  27. Rumbaugh, G., Miller, C. A. Epigenetic changes in the brain: measuring global histone modifications. Methods in Molecular Biology (Clifton, N.J). 670, 263-274 (2011).
  28. Xavier, A. M., et al. Systematic delineation of signaling and epigenomic mechanisms underlying microglia inflammatory activity in acute and chronic brain pathologies. BioRvix. , (2022).

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परिमाणीकरण ग्लोबल हिस्टोन पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन इंट्रान्यूक्लियर फ्लो साइटोमेट्री पृथक माउस ब्रेन माइक्रोग्लिया जीन अभिव्यक्ति नियंत्रण क्रोमैटिन संरचना पोस्टट्रांसलेशनल संशोधन हिस्टोन टेल्स एसिटिलेशन लाइसिन अवशेष डीएनए इंटरैक्शन ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर एक्सेस ब्रोमोडोमेन-युक्त ट्रांसक्रिप्शनल एक्टिवेटर्स एन्हांस्ड जीन एक्सप्रेशन डायनेमिक रेगुलेशन सेल भेदभाव सेलुलर वातावरण उत्तेजना अगली पीढ़ी के अनुक्रमण दृष्टिकोण उच्च थ्रूपुट मात्रात्मक माप
पृथक माउस मस्तिष्क माइक्रोग्लिया में इंट्रान्यूक्लियर फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके ग्लोबल हिस्टोन पोस्ट ट्रांसलेशनल संशोधनों की मात्रा का ठहराव
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Towriss, M., Kim, J., Vogel Ciernia, … More

Towriss, M., Kim, J., Vogel Ciernia, A. Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia. J. Vis. Exp. (199), e65080, doi:10.3791/65080 (2023).

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