Summary
Этот протокол подробно описывает подготовку CLON-G для продления продолжительности жизни нейтрофилов до более чем 5 дней и обеспечивает надежную процедуру оценки гибели нейтрофилов с помощью проточной цитометрии и конфокальной флуоресцентной микроскопии.
Abstract
Средняя продолжительность жизни нейтрофила составляет менее 24 ч, что ограничивает фундаментальные исследования нейтрофилов и применение нейтрофильных исследований. Наши предыдущие исследования показали, что несколько путей могут опосредовать спонтанную гибель нейтрофилов. Коктейль был разработан путем одновременного нацеливания на эти пути, каспазы-лизосомальная мембрана, пермеабилизация-оксидант-некроптоз плюс гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (CLON-G), который продлевал продолжительность жизни нейтрофилов до более чем 5 дней без значительного ущерба для функции нейтрофилов. Одновременно был разработан надежный и стабильный протокол оценки и оценки гибели нейтрофилов. В этой работе мы показываем, что CLON-G может продлевать продолжительность жизни нейтрофилов in vitro до более чем 5 дней, и мы демонстрируем удлинение продолжительности жизни нейтрофилов с помощью FACS и конфокальной флуоресцентной микроскопии. В этом отчете представлены процедуры получения CLON-G и продемонстрирован анализ спонтанной смерти нейтрофилов in vitro , который может быть использован для изучения нейтрофилов и для последующего опроса гибели нейтрофилов, тем самым обеспечивая надежный ресурс для сообщества нейтрофилов.
Introduction
Известно, что нейтрофилы включают в себя арсенал обильных цитоплазматических гранул, никотинамидадениндинуклеотидфосфата (НАДФН) оксидазы, антимикробных ферментов и различных органелл, которые защищают от вторжения микробов; Кроме того, они очень подвижны и являются первыми клетками, привлеченными к месту воспаления, а это означает, что нейтрофилы являются первой линией защиты врожденной иммунной системы 1,2. Таким образом, гранулоцитарная трансфузионная терапия стала перспективным клиническим методом лечения инфекций, связанных с нейтропенией, для временного повышения иммунитета нейтрофилов 3,4,5. Недавние открытия ясно показали, что нейтрофилы также функционируют как многогранные эффекторы во многих физиопатологических сценариях6. Средняя продолжительность жизни нейтрофила составляет менее 24 часов, и, таким образом, фундаментальные исследования нейтрофилов и применение нейтрофильных исследований чрезвычайно затруднены из-за ограничений, связанных со стабильными генетическими манипуляциями и длительным хранением 7,8,9,10,11 . Есть некоторые клеточные линии, которые могут частично демонстрировать некоторые функции нейтрофилов, такие как HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки12. Эти клеточные линии могут обеспечить эффективное редактирование генов и криоконсервацию; Тем не менее, они по-прежнему сильно отличаются от первичных нейтрофилов и, таким образом, не могут точно повторять функции нейтрофилов13. Таким образом, большая часть исследований в этой области по-прежнему опирается на свежевыделенные первичные нейтрофилы. Эта область по-прежнему полагается на создание дорогостоящих и трудоемких условных нокаутированных мышей для исследования специфических функций генов у нейтрофилов, но в настоящее время не существует человеческих моделей.
Приложив усилия к изучению гетерогенных процессов, связанных с гибелью нейтрофилов, и множественных путей, которые регулируют эти процессы 14,15, недавно сообщалось о новом лечении, получившем название CLON-G (пермеабилизация каспаз-лизосомальной мембраны-ингибирование окислителя-некроптоза плюс гранулоцитарный колониестимулирующий фактор)16. CLON-G состоит из Q-VD-oph (хинолил-валил-O-метиласпартил-[-2,6-дифторфенокси]-метилкетона), Hsp70 (белок теплового шока 70), DFO (дефероксамин), NAC (N-ацетилцистеин), Nec-1s (некростатин-1) и G-CSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор). Спонтанная гибель нейтрофилов опосредована несколькими путями, включая апоптоз, некроптоз и пироптоз. Q-VD-oph ингибирует апоптоз нейтрофилов в качестве ингибитора панкаспазы, нацеливаясь на каспазу 1, каспазу 3, каспазу 8 и каспазу 917. Нейтрофильный некроптоз зависит от сигнального пути, включающего взаимодействующую с рецептором протеинкиназу-1 (RIPK1) и доменоподобный белок киназы смешанной линии (MLKL)18. В качестве ингибитора RIPK1 Nec-1s ингибируют некроптоз нейтрофилов. Hsp70 и DFO могут ингибировать пермеабилизацию лизосомальной мембраны (LMP), которая может индуцировать апоптознейтрофилов 19 и пироптоз20. Активные формы кислорода (АФК) играют жизненно важную роль в гибели нейтрофилов, опосредуя LMP19 и апоптоз21 и ингибируя сигналывыживания 22. Как антиоксидант, который может уменьшить накопление АФК, NAC задерживает гибель нейтрофилов. В качестве фактора роста G-CSF активирует сигналы выживания нейтрофилов и ингибирует индуцированный кальпаином апоптоз23,24. Одновременно нацеливаясь на несколько путей спонтанной гибели нейтрофилов, продолжительность жизни нейтрофилов может быть эффективно увеличена до более чем 5 дней без ущерба для их функции. Лечение CLON-G расширяет возможности сохранения, транспортировки и манипулирования генами нейтрофилов, что может ускорить исследования в сообществе нейтрофилов. Между тем, основываясь на знаниях о гибели нейтрофилов, утвержденные в настоящее время протоколы анализов клеточной смерти могут вызвать неожиданное повреждение нейтрофилов14, поэтому эти протоколы были усовершенствованы, чтобы быть более подходящими для исследований нейтрофилов. В этом отчете представлены подробные протоколы культивирования нейтрофилов с помощью CLON-G и анализа in vitro на гибель клеток нейтрофилов мыши с использованием проточной цитометрии и флуоресцентной визуализации. CLON-G эффективен как на мышиных, так и на человеческих нейтрофилах; Тем не менее, образцы мышей демонстрируются здесь, чтобы упростить этот протокол. Концентрация NAC составляет 1 мМ для нейтрофилов мыши и 10 мкМ для нейтрофилов человека. Hsp70 является видоспецифичным и, таким образом, должен использоваться в соответствии с источником нейтрофила. Для этого протокола не имеет значения, выделены ли нейтрофилы из периферической крови или костного мозга и как они выделены.
Для настоящего исследования нейтрофилы были выделены из костного мозга мыши, чтобы получить достаточное количество нейтрофилов для экспериментов, так как из костного мозга можно получить около 1 x 10 7-1,5 x 107 нейтрофилов, в то время как только 1 x 10 6 нейтрофилов может быть выделен из периферической крови одной 8-12-недельной мыши C57BL /6 (любого пола). Градиентное центрифугирование проводили, чтобы избежать возможных повреждений и активации от механического воздействия сортировки FACS или сортировки MACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Бостонская детская больница и Государственная ключевая лаборатория экспериментальной гематологии (SKLEH) Комитет по уходу за животными и их использованию одобрили и контролировали все процедуры. На рисунке 1 показана блок-схема культивирования нейтрофилов с помощью CLON-G и анализа смерти in vitro .
1. Продление продолжительности жизни нейтрофилов с помощью CLON-G
ПРИМЕЧАНИЕ: Все упомянутые операции и материалы должны быть стерильными. Убедитесь, что все растворы хорошо перемешаны и равномерно распределены.
- Сохранение компонентов CLON-G
- Растворите 50 мг Q-VD-oph (см. Таблицу материалов) до конечной концентрации 100 мМ, добавив 973,7 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), и запитывайте жидкость пипеткой до тех пор, пока смесь не станет прозрачной. Аликвот 50 мкл на тюбик и хранить при -20 °C.
ВНИМАНИЕ: ДМСО является вредной химической жидкостью. Наденьте лабораторный халат, защитные очки и маску, чтобы избежать контакта с кожей, попадания в глаза и вдыхания. - Разморозьте Hsp70 (см. Таблицу материалов) при температуре 4 °C и открутите содержимое флакона. Аликвотируйте 1 мкл Hsp70 на тюбик на льду и сохраняйте при -80 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Hsp70 - это белок; Ультрахолодное хранение необходимо для поддержания его стабильности. Избегайте цикла замораживания-оттаивания. - Растворите 1 мг DFO (см. Таблицу материалов) 7,61 мл RPMI 1640 до получения запаса 200 мкМ. Aliquot 500 мкл на пробирку и храните при -20 ° C.
- Растворите 0,1 г NAC (см. Таблицу материалов) с 2,5 мл RPMI 1640 в центрифужной пробирке объемом 15 мл и отрегулируйте рН до 7-7,4 с помощью NaOH. Добавьте RPMI 1640 к конечному объему 3,06 мл, чтобы получить запас NAC 200 мМ. Отфильтруйте его с помощью фильтрующего блока 0,2 мкм. Аликвота 500 мкл на тюбик и консервация при -20 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Растворить NAC в такой высокой концентрации непросто, и вихрь может помочь растворить его. Феноловый красный в RPMI 1640 является идеальным показателем pH; когда NAC только что растворен, цвет желтоватый; Отрегулируйте его, пока он не станет розоватым. Исходные растворы NAC стабильны до 1 месяца при −20 °C. - Растворите 10 мг Nec-1s (см. Таблицу материалов) до 20 мМ с 1,8 мл ДМСО и нанесите смесь пипеткой до тех пор, пока она не станет прозрачной. Аликвот 50 мкл на тюбик и хранить при -20 °C. Беречь от света.
- Растворите 250 мкг G-CSF (см. Таблицу материалов) до 200 мкг / мл с 1,25 мл RPMI 1640. Аликвот 50 мкл на тюбик и хранить при 4 °C.
- Растворите 50 мг Q-VD-oph (см. Таблицу материалов) до конечной концентрации 100 мМ, добавив 973,7 мкл диметилсульфоксида (ДМСО), и запитывайте жидкость пипеткой до тех пор, пока смесь не станет прозрачной. Аликвот 50 мкл на тюбик и хранить при -20 °C.
- Приготовление 2х питательной среды CLON-G
- Подготовьте основное средство. Добавьте 39,5 мл RPMI 1640, 10 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 0,5 мл ручки-стрептококка (антибиотики) в пробирку объемом 50 мл, чтобы получить RPMI 1640 с 20% FBS и 1% PS в качестве основной среды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта высокая концентрация FBS используется для обеспечения длительного культивирования нейтрофилов, которое может превышать 5 дней. Если время культивирования составляет 1-2 дня, достаточно 10%-15% FBS. - Разморозьте на льду все стоковые растворы компонентов CLON-G.
- Разбавьте 1 мкл Hsp70 до 20 мкМ, добавив 606 мкл основной среды. Разбавьте 1 мкл 200 мкг/мл G-CSF до 20 мкг/мл, добавив 9 мкл основной среды.
- Добавьте 976 мкл основной среды в центрифужную пробирку объемом 15 мл. Добавьте 1 мкл Q-VD-oph (100 мМ), 10 мкл DFO (200 мкМ), 1 мкл Hsp70 (20 мкМ), 10 мкл NAC (200 мМ), 1 мкл Nec-1s (20 мМ) и 1 мкл G-CSF (20 мкг / мл), чтобы получить 1 мл среды 2x CLON-G.
ПРИМЕЧАНИЕ: Среду 2x CLON-G следует использовать сразу после ее приготовления. Можно временно хранить 2x CLON-G при температуре 4 °C. Оставшиеся 20 мкМ Hsp70 необходимо выбросить.
- Подготовьте основное средство. Добавьте 39,5 мл RPMI 1640, 10 мл фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 0,5 мл ручки-стрептококка (антибиотики) в пробирку объемом 50 мл, чтобы получить RPMI 1640 с 20% FBS и 1% PS в качестве основной среды.
- Посев нейтрофилов
- Изолировать нейтрофилы мыши путем градиентного центрифугирования в соответствии с предыдущим докладом25. Ресуспендируют изолированные нейтрофилы мыши в основной среде (1 млн клеток/100 мкл).
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте активации нейтрофилов, осторожно обращаясь с ними. Избегайте вспенивания в течение всего процесса. - Добавьте 500 мкл 2x среды CLON-G, 400 мкл основной среды и 100 мкл клеточной суспензии в 24-луночные нетканевые культивируемые культуральные планшеты (см. Таблицу материалов) и осторожно пипеткой три-четыре раза.
ПРИМЕЧАНИЕ: Высокие концентрации компонентов в среде 2x CLON-G могут повредить нейтрофилы; Избегайте сложения их вместе без основного носителя. Нетканевая культивируемая культуральная пластина необходима, чтобы избежать адгезии нейтрофилов. - Поместите культуральную тарелку в инкубатор с температурой 37 °C и 5% CO2 .
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости менять клеточную среду в течение 7 дней. Конечные концентрации композиции CLON-G составляют 50 мкМ Q-Vd-Oph, 1 мкМ DFO, 10 пМ Hsp70, 1 мМ NAC, 10 мкМ Nec-1 s и 10 нг/мл G-CSF. - Окрашивают культивируемые нейтрофилы составным красителем Райта Гимзы (см. Таблицу материалов) и анализируют с помощью светового микроскопа (рис. 2A-D). В качестве альтернативы окрашивают антителами APC-CD11b и PE-Cy7-Ly6G и анализируют с помощью проточной цитометрии (рис. 2E-I), как описано ранее 26.
- Изолировать нейтрофилы мыши путем градиентного центрифугирования в соответствии с предыдущим докладом25. Ресуспендируют изолированные нейтрофилы мыши в основной среде (1 млн клеток/100 мкл).
2. Анализ спонтанной смерти нейтрофилов in vitro
- Анализ проточной цитометрии
- Культуру выделяют нейтрофилы плотностью 1 млн клеток/мл в основной среде при 37 °С и 5%СО2. Культуральная пластина с 24 лунками культивируется не в тканях. Добавьте 1 мл клеточной среды на лунку.
- Растворите 1 г CaCl2 45 мл физиологического раствора, чтобы получить 200 мМ CaCl2. Отфильтруйте его с помощью фильтрующего блока 0,2 мкм. Хранить при температуре 4 °C.
- Приготовьте красящую смесь. Добавьте 7 мкл физиологического раствора на образец в пробирку объемом 1,5 мл и добавьте 0,4 мг/мл FITC-Annexin-V, 0,5 мг/мл йодида пропидия (PI) и 200 мМ раствора CaCl2 по 1 мкл на образец. Хорошо перемешайте. Используйте раствор сразу после приготовления.
- Аккуратно пипеткой аккуратно перемешайте клеточную среду пять-семь раз, чтобы хорошо перемешать, а затем переведите 100 мкл в проточную цитометрическую пробирку в желаемые моменты времени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте вспенивания в течение всего процесса. - Вихревыми счетными бусинами (см. Таблицу материалов), чтобы хорошо их перемешать. Пипетка 10 мкл хорошо перемешанных счетных шариков в ту же проточную цитометрическую пробирку, что и на шаге 2.1.4.
- Добавьте 10 мкл подготовленной красящей смеси (этап 2.1.3) в проточную цитометрическую пробирку. Инкубировать при комнатной температуре в течение 5 минут вдали от света.
- Добавьте 100 мкл физиологического раствора в пробирку и хорошо перемешайте, чтобы обеспечить равномерное распределение счетных шариков и клеток.
- Выполняют проточный цитометрический анализ клеточной среды. Собирайте ячейки с низкой скоростью ~ 400 событий в секунду. Вентиль APC-PE-Cy7-клеток в FSC-A и SSC-A, а интактные ячейки со средними положениями FSC-A и SSC-A в FITC-Annexin-V и PE-PI; популяция аннексина-V-PI− классифицируется как здоровые клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие уравнения определяют общее количество здоровых клеток в образце и жизнеспособность нейтрофилов:
Общее количество здоровых клеток в образце27 = (1,000 / количество счетных шариков) × количество популяции Annexin-V-PI− × 10
Жизнеспособность нейтрофилов = общее количество здоровых клеток в указанное время / общее количество здоровых клеток в нулевое время
- Анализ флуоресцентных изображений
- Культуру выделяли нейтрофилы плотностью 1 млн клеток/мл в основной среде при 37 °С и 5%СО2 в конфокальной пластинке с 2 мл клеточной среды на пластину.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конфокальный флуоресцентный микроскоп имеет наилучшее качество изображения, но для проведения этого эксперимента достаточно любого флуоресцентного микроскопа с 488/561/DIC-каналами. - Осторожно выньте тарелку в указанный момент времени. Равномерно добавьте в планшет по 10 мкл по 0,4 мг/мл FITC-Annexin-V, 0,5 мг/мл PI и 200 мМCaCl2 . Окрашивать при комнатной температуре в течение 5 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте встряхивания в течение всего процесса. Равномерно и аккуратно добавляйте красители. - Получение флуоресцентных изображений в каналах 488 (annexin-V)/561 (PI)/DIC с помощью конфокального флуоресцентного микроскопа с 20-кратным объективом (см. Таблицу материалов). Установите время экспозиции канала 488 как 500 мс, канала 561 как 200 мс и канала DIC как 100 мс. Выберите 5-10 случайных областей для каждой тарелки. Типы клеток определены в нашем ранее опубликованном отчете14.
- Культуру выделяли нейтрофилы плотностью 1 млн клеток/мл в основной среде при 37 °С и 5%СО2 в конфокальной пластинке с 2 мл клеточной среды на пластину.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Морфология нейтрофилов, окрашенных по Райту-Гимзе (рис. 2A-D) и фенотипы FACS (рис. 2E-J) нейтрофилов, обработанных CLON-G, не были затронуты. Жизнеспособность нейтрофилов, обработанных CLON-G, через 24 часа составила около 90%+ на основе анализа проточной цитометрии (рис. 3) и анализов флуоресцентных изображений (рис. 4). Более низкая жизнеспособность может быть результатом неправильного хранения, неправильных концентраций компонентов CLON-G или низкого качества исходных выделенных нейтрофилов. Анализ проточной цитометрии необработанных нейтрофилов, которые культивировали с основной средой в течение 24 ч, показал, что эти нейтрофилы имели Annexin-V-положительную популяцию (рис. 3B). Потеря этой популяции может быть связана с этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА) в клеточной среде. Флуоресцентные изображения нейтрофилов, культивируемых с основной средой в течение 24 ч, должны содержать пухлые клетки (белая стрелка на рисунке 4А). Потеря отдутых клеток может быть результатом встряхивания или пипетки конфокальной пластинки.
Рисунок 1: Блок-схема культивирования нейтрофилов с помощью CLON-G и анализа смерти in vitro. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Морфология и фенотипы маркеров клеточной поверхности нейтрофилов мышей, обработанных CLON-G. Клетки окрашивали (A-D) составным окрашиванием Райта-Гимзы после культивирования и оценивали с помощью микроскопии с использованием 40-кратной линзы объектива или (E-I) окрашивали антителами APC-CD11b и PE-Cy7-Ly6G и анализировали с помощью проточной цитометрии. (J) Были статистически проанализированы соотношения клеток CD11b+ и Ly6G+ в указанные моменты времени. Масштабная линейка составляет 10 мкм. Данные представлены в виде средних ± SD трех экспериментов. ns = нет статистически значимой разницы по сравнению с соответствующей группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Анализ проточной цитометрии нейтрофилов костного мозга мыши, обработанных CLON-G . (A) стратегия стробирования, (B) репрезентативные результаты и (C) жизнеспособность нейтрофилов после культивирования в течение 24 часов. Данные представлены в виде средних ± SD трех экспериментов. **P < 0,001 по сравнению с соответствующей группой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Репрезентативные результаты гибели нейтрофилов на основе анализа флуоресцентного изображения. Гибель нейтрофилов после культивирования с (A) основной средой в течение 24 ч или CLON-G в течение (B) 24 ч, (C) 3 дня или (D) 5 дней. После культивирования клетки окрашивали FITC-Annexin-V (зеленый) и PI (красный) и оценивали с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии. Масштабная линейка составляет 40 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Нейтрофилы играют жизненно важную роль во врожденном и адаптивном иммунитете, и их гомеостаз жестко регулируется. Нейтрофилы являются наиболее распространенными лейкоцитами в периферической крови человека, и они имеют прочный и быстрый оборот. Здоровый взрослый человек может выделять 1 x 109 нейтрофилов / кг ежедневно из костного мозга28. Таким образом, гибель нейтрофилов стала одной из загадочных загадок этой области, и много усилий было направлено на их лучшее понимание. Было доказано, что каспаза 29,30,31,32, LMP 33, ROS21,22,33, некроз 34,35,36,37 и некропотоз 18,38 участвуют в этих гетерогенных процессах. GM-CSF 24 и G-CSF23 могут продлить продолжительность жизни нейтрофилов примерно до24часов с подавленными функциями. CLON-G нацелен на все известные механизмы спонтанной гибели нейтрофилов. Насколько нам известно, CLON-G в настоящее время обеспечивает самое длительное удлинение продолжительности жизни нейтрофилов in vitro без ущерба для функции.
Необходимо учитывать несколько предостережений, чтобы получить наилучшие результаты от культивирования нейтрофилов с помощью CLON-G. В ходе нашего предыдущего фармакологического скрининга16 было подчеркнуто, что точные концентрации компонентов CLON-G являются ключом к успеху и, таким образом, что следует стараться избегать каких-либо ошибок во время приготовления и сохранять их должным образом. Что касается манипуляций с нейтрофилами и их очистки, то нейтрофилы легко активировать и убить; Поэтому их следует осторожно обрабатывать в течение всего процесса и культивировать после их выделения. Они чувствительны к клеточной концентрации, состоянию культуральной пластины, температуре и рН; Нужно быть осторожным при изменении этого протокола. Что касается анализа смерти in vitro , предыдущие результаты показали, что спонтанно мертвые нейтрофилы набухают до пухлых клеток, которые нетерпимы к механической силе; Вращение, пипетирование и промывка уменьшат количество нейтрофилов, а замена стандартного связывающего буфера раствором CaCl2 может упростить этот процесс и обеспечить точное отображение нейтрофилов14. Расхождения между техническими дубликатами в одном и том же эксперименте могут быть результатом вспенивания во время работы. Различия между независимыми экспериментами могут быть связаны с различиями в чистоте и свежести нейтрофилов39.
CLON-G сочетает в себе известные пути и соответствующие ингибирующие химические вещества для предотвращения спонтанной гибели нейтрофилов. Тем не менее, основным вопросом этой области остается вопрос о сложных путях, которые опосредуют гибель нейтрофилов, поскольку они до сих пор до конца не изучены. Гибель нейтрофилов, обработанных CLON-G, неизбежна. Таким образом, у CLON-G все еще есть возможности для улучшения. Что касается компонентов CLON-G, то лучшим выбором являются клинически применяемые препараты для расширения возможности клинического применения нейтрофилов, обработанных CLON-G; однако Q-VD-oph и Rec-1 предназначены только для исследований, и клинические испытания, посвященные им, в настоящее время недоступны. Таким образом, альтернативные соединения необходимы для клинического применения.
Продлевая продолжительность жизни нейтрофилов до более чем 5 дней с сохранением их функций, CLON-G может открыть бесконечные возможности для исследования нейтрофилов. С помощью этого расширенного окна наблюдение, манипуляции с генами, долгосрочное хранение, транспортировка и криоконсервация могут быть разработаны на основе CLON-G. Трудовые, временные и денежные затраты будут существенно сокращены, что снизит входные барьеры для новых исследователей. CLON-G также может способствовать клиническому применению нейтрофилов, таких как трансфузионная терапия гранулоцитами. Нейтропеническая инфекция после химиотерапии является основной причиной смерти пациентов, страдающих раком и злокачественными новообразованиями кроветворения 40,41,42,43,44. Гранулоцитарная трансфузионная терапия, которая имеет большой потенциал в качестве альтернативной терапии для помощи этим пациентам, сильно ограничена короткой продолжительностью жизни нейтрофилов45. Текущий процесс переливания гранулоцитов занимает больше времени, чем продолжительность жизни нейтрофила, что приводит к тому, что перелитые нейтрофилы теряют свою эффективность в качестве иммунной клетки первой линии. Лечение клоном-G дает достаточно времени для подготовки к переливанию гранулоцитов, которые могут спасти бесчисленное количество жизней пациентов с нейтропенией и помочь смягчить чрезмерное использование антибиотиков. В то же время настоящий протокол анализа на смерть нейтрофилов может точно продемонстрировать состояние нейтрофилов и улучшить воспроизводимость экспериментальных результатов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо конфликтов интересов.
Acknowledgments
Этот проект был поддержан Инновационным фондом Haihe Laboratory of Cell Ecosystem Innovation Fund (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), Инновационным фондом медицинских наук Китайской академии медицинских наук (CAMS) (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), Специальным исследовательским фондом центральных университетов, Пекинским союзным медицинским колледжем (3332022062) и Программой поддержки науки и технологий провинции Сычуань (NO. 2021YJ0480).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm syringe filter | Pall Corporation | 4612 | Filtrate prepared CLON-G components. |
| 1.5 mL micro centrifuge tube | LABSELECT | MCT-001-150 | Lab consumable. |
| 15 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-15 | Lab consumable. |
| 24 well cell culture plate | Falcon | 351147 | Neutrophil culture plate. |
| 50 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-50 | Lab consumable. |
| BD LSRII | BD | Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death. | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | C4901 | Assitant of Annexin-V binding to phosphatidylserine. |
| Confocal microscope | Perkinelmer | UltraVIEW VOX | Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death. |
| Confocal plate | NEST | 801001-20mm | Lab consumable for fluorescent image assay. |
| Counting beads | Thermo Fisher | C36950 | Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| DFO | Sigma Aldrich | D9533 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| Dimethyl sulfoxide ( DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099141C | Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply. |
| FITC-Annexin-V | BD | 51-65874X | Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel. |
| Hsp70 | Abcam | ab113187 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| NAC | Sigma Aldrich | A9165 | Component of CLON-G. Antioxidant. |
| Nec-1s | EMD Millipore | 852391-15-2 | Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor. |
| Penicillin-Streptomycin Solution (PS) | Gibco | 15070063 | Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination. |
| Propidium Iodide (PI) | BioLegend | 421301 | For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane. |
| Q-VD-oph | Selleck chem | S7311 | Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor. |
| Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) | Chugai Pharma China | GRANOCYTE | Component of CLON-G. Promote neutrophil survival through Akt pathway. |
| Round-Bottom Polystyrene Tubes | Falcon | 100-0102 | Lab consumable for flow cytometry analysis. |
| RPMI1640 | Gibco | C11875500BT | Component of neutrophil culture basic medium. |
| Saline | LEAGENE | R00641 | Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | FENG CHUAN | 13-011-00029 | pH adjustion for NAC. |
| Wright-Giemsa Stain Solution | Solarbio | G1020 | Neutrophil cytospin staining. |
References
- Segal, A. W.
- Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Frontiers in Physiology. 9, 113 (2018).
- Chung, S., Armstrong-Scott, O., Charlewood, R. Therapeutic granulocyte infusion for patients with severe neutropaenia and neutrophilic dysfunction: New Zealand experience. Vox Sanguinis. 117 (2), 220-226 (2021).
- Zhou, B., et al. Clinical outcome of granulocyte transfusion therapy for the treatment of refractory infection in neutropenic patients with hematological diseases. Annals of Hematology. 97 (11), 2061-2070 (2018).
- Covas, D. T., et al. Granulocyte transfusion combined with granulocyte colony stimulating factor in severe infection patients with severe aplastic anemia: A single center experience from China. PLoS One. 9 (2), e88148 (2014).
- Tecchio, C., Cassatella, M. A. Uncovering the multifaceted roles played by neutrophils in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 905-918 (2021).
- Lahoz-Beneytez, J., et al. Human neutrophil kinetics: Modeling of stable isotope labeling data supports short blood neutrophil half-lives. Blood. 127 (26), 3431-3438 (2016).
- Pillay, J., et al. In vivo labeling with 2H2O reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 116 (4), 625-627 (2010).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Tofts, P. S., Chevassut, T., Cutajar, M., Dowell, N. G., Peters, A. M. Doubts concerning the recently reported human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 117 (22), 6050-6052 (2011).
- McDonald, J. U., et al. In vivo functional analysis and genetic modification of in vitro-derived mouse neutrophils. FASEB Journal. 25 (6), 1972-1982 (2011).
- Pedruzzi, E., Fay, M., Elbim, C., Gaudry, M., Gougerot-Pocidalo, M. -A. Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to N-formyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. British Journal of Haematology. 117 (3), 719-726 (2002).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: Cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Teng, Y., Luo, H. R., Kambara, H.
- Luo, H. R., Loison, F. Constitutive neutrophil apoptosis: Mechanisms and regulation. American Journal of Hematology. 83 (4), 288-295 (2008).
- Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
- Caserta, T. M. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis. 8, 345-352 (2003).
- Wang, X., Yousefi, S., Simon, H. U.
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Kambara, H., et al. Gasdermin D exerts anti-inflammatory effects by promoting neutrophil death. Cell Reports. 22 (11), 2924-2936 (2018).
- Zhu, D., et al. Deactivation of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate/Akt signaling mediates neutrophil spontaneous death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14836-14841 (2006).
- Xu, Y., Loison, F., Luo, H. R. Neutrophil spontaneous death is mediated by down-regulation of autocrine signaling through GPCR, PI3Kgamma, ROS, and actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 2950-2955 (2010).
- van Raam, B. J., Drewniak, A., Groenewold, V., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor delays neutrophil apoptosis by inhibition of calpains upstream of caspase-3. Blood. 112 (5), 2046-2054 (2008).
- Klein, J. B., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor delays neutrophil constitutive apoptosis through phosphoinositide 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase pathways. Journal of Immunology. 164 (8), 4286-4291 (2000).
- Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
- Xie, X., et al. Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection. Nature Immunology. 21 (9), 1119-1133 (2020).
- Cosimo, E., et al. Inhibition of NF-kappaB-mediated signaling by the cyclin-dependent kinase inhibitor CR8 overcomes prosurvival stimuli to induce apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells. Clinical Cancer Research. 19 (9), 2393-2405 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Porter, A. G., Jänicke, R. U.
- Scheel-Toellner, D., et al. Clustering of death receptors in lipid rafts initiates neutrophil spontaneous apoptosis. Biochemical Society Transactions. 32, 679-681 (2004).
- Geering, B., Simon, H. U. Peculiarities of cell death mechanisms in neutrophils. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1457-1469 (2011).
- Gabelloni, M. L., Trevani, A. S., Sabatté, J., Geffner, J. Mechanisms regulating neutrophil survival and cell death. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 423-437 (2013).
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
- Zhang, D. -W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325 (5938), 332-336 (2009).
- Wang, X., He, Z., Liu, H., Yousefi, S., Simon, H. -U. Neutrophil necroptosis is triggered by ligation of adhesion molecules following GM-CSF priming. Journal of Immunology. 197 (10), 4090-4100 (2016).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
- George, B., Bhattacharya, S. Infections in hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) patients. Contemporary Bone Marrow Transplantation. Chandy, M., Radhakrishnan, V. S., Sukumaran, R. , Springer. Cham, Switzerland. (2020).
- Lucena, C. M., et al. Pulmonary complications in hematopoietic SCT: A prospective study. Bone Marrow Transplant. 49 (10), 1293-1299 (2014).
- Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: A global perspective. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (10), 1143-1238 (2009).
- Wingard, J. R., Hiemenz, J. W., Jantz, M. A. How I manage pulmonary nodular lesions and nodular infiltrates in patients with hematologic malignancies or undergoing hematopoietic cell transplantation. Blood. 120 (9), 1791-1800 (2012).
- Wingard, J. R., Hsu, J., Hiemenz, J. W. Hematopoietic stem cell transplantation: An overview of infection risks and epidemiology. Infectious Disease Clinics of North America. 24 (2), 257-272 (2010).
- Netelenbos, T., et al. The burden of invasive infections in neutropenic patients: incidence, outcomes, and use of granulocyte transfusions. Transfusion. 59 (1), 160-168 (2019).
