Summary
פרוטוקול זה מפרט את הכנת CLON-G להארכת תוחלת החיים של נויטרופילים ליותר מ-5 ימים ומספק הליך אמין להערכת מוות נויטרופילים באמצעות ציטומטריית זרימה ומיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי.
Abstract
תוחלת החיים הממוצעת של נויטרופילים היא פחות מ-24 שעות, מה שמגביל את המחקר הבסיסי על נויטרופילים ואת היישום של מחקרי נויטרופילים. המחקר הקודם שלנו הצביע על כך שמסלולים מרובים יכולים לתווך את המוות הספונטני של נויטרופילים. קוקטייל פותח על ידי התמקדות בו זמנית במסלולים אלה, עיכוב קספזות-ליזוזומליות של קרום החדירה-חמצון-נקרופטוזיס בתוספת גורם מגרה מושבת גרנולוציטים (CLON-G), אשר האריך את תוחלת החיים של הנויטרופילים ליותר מ -5 ימים מבלי לפגוע באופן משמעותי בתפקוד הנויטרופילים. במקביל פותח גם פרוטוקול אמין ויציב להערכה והערכה של מוות נויטרופילים. בעבודה זו, אנו מראים כי CLON-G יכול להאריך את תוחלת החיים של נויטרופילים במבחנה ליותר מ -5 ימים, ואנו מציגים את התארכות תוחלת החיים של נויטרופילים באמצעות FACS ומיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי. דו"ח זה מציג נהלים להכנת CLON-G ומציג בדיקת מוות ספונטני במבחנה של נויטרופילים, אשר יכולה לשמש לחקר נויטרופילים ולאחר מכן לחקור מוות נויטרופילים, ובכך לספק משאב אמין לקהילת הנויטרופילים.
Introduction
נויטרופילים ידועים כמרכיבים ארסנל של גרגירים ציטופלזמיים בשפע, ניקוטין-אמיד אדנין די-נוקלאוטיד פוספט (NADPH) אוקסידאז, אנזימים אנטי-מיקרוביאליים ואברונים שונים המגנים מפני חיידקים פולשים; בנוסף, הם תנועתיים מאוד והם התאים הראשונים שגויסו לאתר הדלקת, כלומר נויטרופילים הם קו ההגנה הראשון של מערכת החיסון המולדת 1,2. טיפול בעירוי גרנולוציטים הפך לפיכך לטיפול קליני מבטיח לזיהומים הקשורים לנויטרופניה כדי להגביר באופן זמני את חסינות הנויטרופילים 3,4,5. תגליות אחרונות הראו בבירור כי נויטרופילים מתפקדים גם כמשפיעים רב-פנים בתרחישים פיזיולוגיים רבים6. תוחלת החיים הממוצעת של נויטרופיל היא פחות מ -24 שעות, ולכן, מחקר בסיסי על נויטרופילים ויישום של מחקרי נויטרופילים הם קשים מאוד בשל המגבלות הקשורות מניפולציה גנטית יציבה ואחסון לטווח ארוך 7,8,9,10,11 . ישנם כמה קווי תאים שיכולים להציג באופן חלקי כמה פונקציות נויטרופילים, כגון HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1, ותאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים12. קווי תאים אלה יכולים להשיג עריכה גנטית יעילה ושימור בהקפאה; עם זאת, הם עדיין שונים במידה עצומה מנויטרופילים ראשוניים, ולכן אינם יכולים לשחזר נאמנה פונקציות נויטרופילים13. לפיכך, רוב המחקר בתחום זה עדיין מסתמך על נויטרופילים ראשוניים טריים שבודדו. השדה עדיין מסתמך על יצירת עכברים מותנים יקרים וגוזלי זמן כדי לחקור תפקודים גנטיים ספציפיים בנויטרופילים, אך כיום לא קיימים מודלים אנושיים.
לאחר שהשקענו את מאמצינו לחקור את התהליכים ההטרוגניים המעורבים במוות של נויטרופילים ואת המסלולים המרובים המווסתים תהליכים אלה14,15, דווח לאחרונה על טיפול חדש המכונה CLON-G (caspases-lysosomal membrane permebilization-oxidant-necroptosis inhibition plus granulocyte colony-stimulating-stimulating factor) 16. CLON-G מורכב מ-Q-VD-oph (quinolyl-valyl-O-methylaspartyl-[-2,6-difluorophenoxy]-methyl ketone), Hsp70 (חלבון הלם חום 70), DFO (דפרוקסאמין), NAC (N-אצטיל-ציסטאין), Nec-1s (נקרוסטטין-1s) ו-G-CSF (גורם מגרה מושבת גרנולוציטים). מוות ספונטני של נויטרופילים מתווך על ידי מסלולים מרובים, כולל אפופטוזיס, נקרופטוזיס ופירופטוזיס. Q-VD-oph מעכב אפופטוזיס של נויטרופילים כמעכב פאן-קספז על ידי התמקדות בקספז 1, קספז 3, קספז 8 וקספז 917. נקרופטוזיס נויטרופיל תלוי במסלול איתות הכולל חלבון קינאז-1 (RIPK1) וחלבון דמוי תחום קינאז שושלת מעורבת (MLKL)18. כמעכב RIPK1, Nec-1s מעכב את הנקרופטוזיס של נויטרופילים. Hsp70 ו-DFO יכולים לעכב חדירות קרום ליזוזומלי (LMP), מה שעלול לגרום לאפופטוזיסנויטרופילים 19 ולפירופטוזיס20. מיני חמצן תגובתי (ROS) ממלאים תפקידים חיוניים במוות של נויטרופילים על ידי תיווך LMP19 ואפופטוזיס21 ועל ידי עיכוב אותות הישרדות22. כנוגד חמצון שיכול להפחית הצטברות ROS, NAC מעכב מוות של נויטרופילים. כגורם גדילה, G-CSF מפעיל אותות הישרדות נויטרופילים ומעכב אפופטוזיס23,24 המושרה על ידי calpain. על ידי התמקדות בו זמנית במסלולי מוות ספונטניים מרובים של נויטרופילים, ניתן להאריך ביעילות את תוחלת החיים של הנויטרופילים ליותר מ-5 ימים מבלי לפגוע בתפקודם. טיפול CLON-G מרחיב את האפשרויות של שימור נויטרופילים, שינוע ומניפולציה גנטית, אשר יכולים להאיץ את המחקר בקהילת הנויטרופילים. בינתיים, בהתבסס על הידע על מוות נויטרופילים, הפרוטוקולים המאושרים כיום לבדיקות מוות תאי יכולים לגרום נזק בלתי צפוי לנויטרופילים14, ולכן פרוטוקולים אלה שוכללו כך שיתאימו יותר למחקרי נויטרופילים. דו"ח זה מספק פרוטוקולים מפורטים לתרבית נויטרופילים עם CLON-G ובדיקת מוות תאי במבחנה של נויטרופילים בעכברים באמצעות ציטומטריית זרימה והדמיית פלואורסצנטיות. CLON-G יעיל הן על עכברים והן על נויטרופילים אנושיים; עם זאת, דגימות העכבר מודגמות כאן כדי לפשט פרוטוקול זה. הריכוז של NAC הוא 1 מילימטר עבור נויטרופילים של עכברים ו-10 מיקרומטר עבור נויטרופילים אנושיים. Hsp70 הוא ספציפי למין, ולכן יש להשתמש בו בהתאם למקור הנויטרופיל. עבור פרוטוקול זה, אין זה משנה אם נויטרופילים מבודדים מדם היקפי או מח עצם וכיצד הם מבודדים.
במחקר הנוכחי, נויטרופילים בודדו ממח עצם של עכבר כדי להשיג מספיק נויטרופילים לניסויים, שכן ניתן להשיג כ 1 x 10 7-1.5 x 107 נויטרופילים ממח העצם, בעוד שרק 1 x 10 6 נויטרופילים ניתן לבודד מהדם ההיקפי של עכבר יחיד בן 8-12 שבועות C57BL/6 (משני המינים). צנטריפוגה הדרגתית בוצעה כדי למנוע נזק והפעלה אפשריים מהגירוי המכני של מיון FACS או מיון MACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
בית החולים לילדים בבוסטון ומעבדת המפתח הממלכתית להמטולוגיה ניסויית (SKLEH) הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים אישרו ופיקחו על כל הנהלים. איור 1 מתאר תרשים זרימה של תרבית נויטרופילים עם CLON-G ומבחן המוות במבחנה .
1. הארכת תוחלת החיים של נויטרופילים עם CLON-G
הערה: כל הפעולות והחומרים שהוזכרו חייבים להיות סטריליים. ודא שכל הפתרונות מעורבבים היטב ומפוזרים באופן שווה.
- שימור רכיבי CLON-G
- יש להמיס 50 מ"ג של Q-VD-oph (ראו טבלת חומרים) לריכוז סופי של 100 מילימטר על ידי הוספת 973.7 μL של דימתיל סולפוקסיד (DMSO), ולקפט את הנוזל עד שהתערובת מתבהרת. Aliquot 50 μL לכל צינור, ולשמר ב -20 ° C.
אזהרה: DMSO הוא נוזל כימי מזיק. יש ללבוש חלוק מעבדה, משקפי מגן ומסכה כדי למנוע מגע עורי, מגע עין ושאיפה. - הפשירו את Hsp70 (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של 4°C, וסובבו כלפי מטה את התוכן בבקבוקון. Aliquot 1 μL של Hsp70 לכל צינור על קרח, ולשמר ב -80 ° C.
הערה: Hsp70 הוא חלבון; אחסון קר במיוחד נחוץ כדי לשמור על יציבותו. הימנעו ממחזור ההקפאה-הפשרה. - יש להמיס 1 מ"ג DFO (ראה טבלת חומרים) עם 7.61 מ"ל סל"ד 1640 לקבלת מלאי של 200 מיקרומטר. Aliquot 500 μL לכל צינור, ולשמור ב -20 ° C.
- יש להמיס 0.1 גרם של NAC (ראו טבלת חומרים) עם 2.5 מ"ל של סל"ד 1640 בצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, ולהתאים את רמת החומציות ל-7-7.4 עם NaOH. הוסף את RPMI 1640 לנפח סופי של 3.06 מ"ל כדי ליצור מלאי NAC של 200 mM. סנן אותו עם יחידת סינון של 0.2 מיקרומטר. Aliquot 500 μL לכל צינור, ולשמר ב -20 ° C.
הערה: לא קל להמיס NAC בריכוז הגבוה הזה, ומערבולות יכולות לעזור להמיס אותו. פנול אדום בסל"ד 1640 הוא אינדיקציה מושלמת ל- pH; כאשר NAC רק מומס, הצבע צהבהב; התאימו אותו עד שהוא הופך ורדרד. תמיסות NAC יציבות למשך עד חודש אחד בטמפרטורה של -20°C. - יש להמיס 10 מ"ג של Nec-1s (ראו טבלת חומרים) ל-20 מ"ל עם 1.8 מ"ל DMSO, ולפיפטה את התערובת עד שהיא מתבהרת. Aliquot 50 μL לכל צינור, ולשמר ב -20 ° C. יש להגן מפני אור.
- יש להמיס 250 מיקרוגרם של G-CSF (ראה טבלת חומרים) ל-200 מיקרוגרם/מ"ל עם 1.25 מ"ל של סל"ד 1640. Aliquot 50 μL לכל צינור, ולשמר ב 4 °C.
- יש להמיס 50 מ"ג של Q-VD-oph (ראו טבלת חומרים) לריכוז סופי של 100 מילימטר על ידי הוספת 973.7 μL של דימתיל סולפוקסיד (DMSO), ולקפט את הנוזל עד שהתערובת מתבהרת. Aliquot 50 μL לכל צינור, ולשמר ב -20 ° C.
- הכנת 2x מדיום תרבית CLON-G
- הכינו את המדיום הבסיסי. הוסף 39.5 מ"ל של RPMI 1640, 10 מ"ל של נסיוב בקר עוברי (FBS), ו 0.5 מ"ל pen-strep (אנטיביוטיקה) לצינור 50 מ"ל כדי להפוך RPMI 1640 עם 20% FBS ו 1% PS כמדיום בסיסי.
הערה: ריכוז גבוה זה של FBS משמש כדי לספק תרבית ממושכת של נויטרופילים, אשר עשוי להיות גדול מ 5 ימים. אם זמן הטיפוח הוא 1-2 ימים, 10%-15% FBS מספיק. - הפשירו את כל פתרונות המלאי של רכיבי CLON-G על קרח.
- לדלל 1 μL של Hsp70 עד 20 μM על ידי הוספת 606 μL של המדיום הבסיסי. לדלל 1 μL של 200 μg / mL G-CSF ל 20 מיקרוגרם / מ"ל על ידי הוספת 9 μL של המדיום הבסיסי.
- הוסף 976 μL של מדיום בסיסי לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל. הוסף 1 μL של Q-VD-oph (100 mM), 10 μL של DFO (200 μM), 1 μL של Hsp70 (20 μM), 10 μL של NAC (200 mM), 1 μL של Nec-1s (20 mM), ו 1 μL של G-CSF (20 μg / mL) כדי ליצור 1 מ"ל של 2x CLON-G בינוני.
הערה: יש להשתמש בתווך CLON-G 2x מיד לאחר הכנתו. ניתן לאחסן את 2x CLON-G באופן זמני בטמפרטורה של 4°C. יש להשליך שאריות של 20 מיקרומטר Hsp70.
- הכינו את המדיום הבסיסי. הוסף 39.5 מ"ל של RPMI 1640, 10 מ"ל של נסיוב בקר עוברי (FBS), ו 0.5 מ"ל pen-strep (אנטיביוטיקה) לצינור 50 מ"ל כדי להפוך RPMI 1640 עם 20% FBS ו 1% PS כמדיום בסיסי.
- תרבות נויטרופילים
- בידוד נויטרופילים של עכברים על ידי צנטריפוגה הדרגתית בעקבות דו"ח קודם25. השהה מחדש את הנויטרופילים המבודדים של העכבר בתווך הבסיסי (1 מיליון תאים / 100 מיקרוליטר).
הערה: הימנע מהפעלת הנויטרופילים על ידי טיפול עדין בהם. יש להימנע מהקצפה במהלך כל התהליך. - הוסף 500 μL של 2x CLON-G בינוני, 400 μL של התווך הבסיסי, ו 100 μL של תרחיף התא ללוחות תרבית 24 באר שאינם רקמות תרבית (ראה טבלה של חומרים), ופיפטה עדינה שלוש עד ארבע פעמים.
הערה: ריכוזים גבוהים של הרכיבים בתווך CLON-G 2x עלולים לפגוע בנויטרופילים; הימנע מלהוסיף אותם יחד ללא המדיום הבסיסי. צלחת התרבית שאינה רקמה נחוצה כדי למנוע הידבקות נויטרופילים. - מניחים את צלחת התרבית בחממה של 37°C ו-5% CO2 בצורה חלקה.
הערה: אין צורך להחליף את התווך התא תוך 7 ימים. הריכוזים הסופיים של הרכב CLON-G הם 50 μM Q-VD-Oph, 1 μM DFO, 10 pM Hsp70, 1 mM NAC, 10 μM Nec-1 s ו-10 ng/mL G-CSF. - צבעו את הנויטרופילים המתורבתים בכתם תרכובת רייט גימסה (ראו טבלת חומרים), ונתחו בעזרת מיקרוסקופ אור (איור 2A-D). לחלופין, יש להכתים באמצעות נוגדנים APC-CD11b ו-PE-Cy7-Ly6G, ולנתח באמצעות ציטומטריית זרימה (איור 2E-I) כפי שתואר קודם לכן26.
- בידוד נויטרופילים של עכברים על ידי צנטריפוגה הדרגתית בעקבות דו"ח קודם25. השהה מחדש את הנויטרופילים המבודדים של העכבר בתווך הבסיסי (1 מיליון תאים / 100 מיקרוליטר).
2. בדיקת מוות ספונטנית במבחנה של נויטרופילים
- ניתוח ציטומטריית זרימה
- תרבית בודדה נויטרופילים בצפיפות של 1 מיליון תאים/מ"ל בתווך הבסיסי ב-37°C ו-5% CO2. צלחת התרבית בת 24 הבארות אינה תרבית רקמות. מוסיפים 1 מ"ל של תא בינוני לכל באר.
- להמיס 1 גרם של CaCl 2 עם 45 מ"ל של מלוחים כדי להפוך 200 mM CaCl2. סנן אותו עם יחידת סינון של 0.2 מיקרומטר. יש לשמר בטמפרטורה של 4°C.
- מכינים את תערובת הצביעה. הוסף 7 מיקרוליטר מלח לדגימה לצינור של 1.5 מ"ל, והוסף 0.4 מ"ג/מ"ל FITC-Annexin-V, 0.5 מ"ג/מ"ל פרופידיום יודיד (PI) ותמיסת CaCl2 של 200 מ"מ ב-1 מיקרוליטר כל דגימה. מערבבים היטב. השתמש בפתרון מיד לאחר ההכנה.
- פיפטה התא תווך בעדינות חמש עד שבע פעמים כדי לערבב היטב, ולאחר מכן להעביר 100 μL לצינור ציטומטריה זרימה בנקודות הזמן הרצויות.
הערה: יש להימנע מהקצפה במהלך כל התהליך. - מערבולת ספירת חרוזים (ראה טבלת חומרים) כדי לערבב אותם היטב. פיפטה 10 μL של חרוזי ספירה מעורבים היטב לאותו ציטומטריה זרימה כמו בשלב 2.1.4.
- הוסף 10 μL את תערובת הצביעה המוכנה (שלב 2.1.3) לצינור ציטומטריית הזרימה. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות הרחק מהאור.
- מוסיפים 100 μL של מלוחים לצינור, ומערבבים היטב כדי להבטיח פיזור אחיד של חרוזי ספירה ותאים.
- לבצע ניתוח ציטומטריה זרימה של תווך התא. אסוף את התאים בקצב נמוך עם ~400 אירועים לשנייה. שער תאי APC-PE-Cy7- ל- FSC-A ו- SSC-A, ושער התאים השלמים עם עמדות FSC-A ו- SSC-A בינוניות ל- FITC-Annexin-V ו- PE-PI; אוכלוסיית Annexin-V−PI− מסווגת כתאים בריאים.
הערה: המשוואות הבאות קובעות את המספר הכולל של תאים בריאים בכל דגימה ואת יכולת הקיום של הנויטרופילים:
המספר הכולל של תאים בריאים לדגימה27 = (1,000/מספר ספירת חרוזים) × מספר אוכלוסיית Annexin-V−PI− × 10
כדאיות של נויטרופילים = המספר הכולל של תאים בריאים בזמן המצוין / המספר הכולל של תאים בריאים בזמן אפס
- בדיקת תמונה פלואורסצנטית
- תרבית בודדה נויטרופילים בצפיפות של 1 מיליון תאים/מ"ל בתווך הבסיסי ב-37°C ו-5%CO2 בלוח קונפוקלי עם 2 מ"ל של תווך התא לכל צלחת.
הערה: למיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי יש את איכות התמונה הטובה ביותר, אך כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי בעל תעלות 488/561/DIC מספיק כדי לתמוך בניסוי זה. - הוציאו את הצלחת בעדינות בנקודת הזמן שצוינה. הוסף 10 μL כל אחד של 0.4 מ"ג / מ"ל FITC-Annexin-V, 0.5 מ"ג / מ"ל PI, ו 200 mM CaCl2 לצלחת באופן שווה. מכתימים בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
הערה: יש להימנע מרעד במהלך כל התהליך. מוסיפים את חומרי הכתמים באופן אחיד ועדין. - צלם תמונות פלואורסצנטיות בתעלות 488 (annexin-V)/561 (PI)/DIC באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי עם עדשה אובייקטיבית של 20x (ראה טבלת חומרים). הגדר את זמן החשיפה של ערוץ 488 כ- 500 אלפיות השנייה, ערוץ 561 כ- 200 אלפיות השנייה וערוץ ה- DIC כ- 100 אלפיות השנייה. בחר 5-10 אזורים אקראיים עבור כל לוחית. סוגי התאים מוגדרים בדוח14 שפורסם בעבר.
- תרבית בודדה נויטרופילים בצפיפות של 1 מיליון תאים/מ"ל בתווך הבסיסי ב-37°C ו-5%CO2 בלוח קונפוקלי עם 2 מ"ל של תווך התא לכל צלחת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
המורפולוגיה המוכתמת של רייט-גימסה (איור 2A-D) ופנוטיפים של FACS (איור 2E-J) של הנויטרופילים שטופלו ב-CLON-G לא הושפעו. הכדאיות של נויטרופילים שטופלו ב-CLON-G תוך 24 שעות הייתה בערך 90%+ בהתבסס על ניתוח ציטומטריית זרימה (איור 3) ומבחני התמונה הפלואורסצנטית (איור 4). כדאיות נמוכה יותר עלולה לנבוע מאחסון לא תקין, ריכוזים לא תקינים של רכיבי CLON-G או איכות ירודה של הנויטרופילים המבודדים ההתחלתיים. ניתוח ציטומטריית הזרימה של הנויטרופילים הלא מטופלים שגודלו בתרבית עם התווך הבסיסי במשך 24 שעות הראה שלנויטרופילים האלה הייתה אוכלוסייה חיובית של Annexin-V (איור 3B). אובדן אוכלוסייה זו יכול לנבוע מאתילן דיאמין חומצה טטראצטית (EDTA) בתווך התא. התמונות הפלואורסצנטיות של הנויטרופילים בתרבית עם התווך הבסיסי במשך 24 שעות צריכות להכיל תאים נפוחים (חץ לבן באיור 4A). אובדן תאים נפוחים עלול לנבוע מטלטול או פיפטציה של הצלחת הקונפוקלית.
איור 1: תרשים זרימה של תרבית נויטרופילים עם CLON-G ובדיקת המוות במבחנה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: מורפולוגיה ופנוטיפים של סמן פני התא של נויטרופילים עכבריים שטופלו ב-CLON-G. התאים הוכתמו (A-D) בכתם תרכובת רייט-גימסה לאחר תרבית והוערכו במיקרוסקופ באמצעות עדשה אובייקטיבית 40x או (E-I) מוכתמים בנוגדנים APC-CD11b ו-PE-Cy7-Ly6G ונותחו עם ציטומטריית זרימה. (J) היחסים בין תאי CD11b+ ו- Ly6G+ בנקודות הזמן שצוינו נותחו סטטיסטית. סרגל קנה המידה הוא 10 מיקרומטר. הנתונים מוצגים כאמצעים ± SD של שלושה ניסויים. ns = אין הבדל מובהק סטטיסטית בהשוואה לקבוצה המקבילה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: ניתוח ציטומטריית זרימה של נויטרופילים ממח עצם עכבר שטופלו ב-CLON-G . (A) אסטרטגיית גאטינג, (B) תוצאות מייצגות, ו-(C) יכולת הקיום של הנויטרופילים לאחר תרבית במשך 24 שעות. הנתונים מוצגים כאמצעים ± SD של שלושה ניסויים. **P < 0.001 בהשוואה לקבוצה המקבילה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: תוצאות מייצגות למוות נויטרופילים בהתבסס על בדיקת התמונה הפלואורסצנטית. מוות נויטרופילים לאחר תרבית עם (A) מדיום בסיסי במשך 24 שעות או CLON-G במשך (B) 24 שעות, (C) 3 ימים, או (D) 5 ימים. לאחר התרבית, התאים הוכתמו ב-FITC-Annexin-V (ירוק) ו-PI (אדום) והוערכו במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי. סרגל קנה המידה הוא 40 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
נויטרופילים ממלאים תפקידים חיוניים בחסינות מולדת ונרכשת, וההומאוסטזיס שלהם מוסדר היטב. נויטרופילים הם הלויקוציטים הנפוצים ביותר בדם ההיקפי האנושי, ויש להם מחזור חזק ומהיר. מבוגר בריא יכול לשחרר 1 x 109 נויטרופילים / ק"ג מדי יום ממח העצם28. מותם של נויטרופילים הפך אפוא לאחת התעלומות התמוהות של תחום זה, ומאמצים רבים הוקדשו להבנתם הטובה יותר. קספז 29,30,31,32, LMP 33, ROS 21,22,33, נמק 34,35,36,37 ונקרופוטוזיס 18,38 הוכחו כמעורבים בתהליכים הטרוגניים אלה. GM-CSF 24 ו-G-CSF23 יכולים להאריך את תוחלת החיים של נויטרופיליםלכ-24שעות עם פונקציות מדוכאות. CLON-G מכוון לכל מנגנוני המוות הספונטניים הידועים של נויטרופילים. למיטב ידיעתנו, CLON-G מספק כיום את ההתארכות הארוכה ביותר של תוחלת החיים של נויטרופילים במבחנה מבלי לפגוע בתפקוד.
יש לקחת בחשבון מספר אזהרות כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר מגידול נויטרופילים עם CLON-G. בבדיקה הפרמקולוגית הקודמת16 הודגש כי ריכוזים מדויקים של רכיבי CLON-G הם המפתח להצלחה ולכן יש לנסות להימנע מטעויות במהלך ההכנה ולשמר אותן כראוי. לגבי מניפולציה וטיהור נויטרופילים, קל להפעיל ולהרוג את הנויטרופילים; לכן, יש לטפל בהם בעדינות במהלך כל התהליך ולתרבית אותם ברגע שהם מבודדים. הם רגישים לריכוז התא, למצב צלחת התרבית, הטמפרטורה וה- pH; יש להיזהר בעת שינוי פרוטוקול זה. באשר לבדיקת המוות במבחנה , תוצאות קודמות הראו כי נויטרופילים מתים באופן ספונטני מתנפחים לתאים נפוחים שאינם נסבלים לכוח מכני; סיבוב, צנרת ושטיפה יפחיתו את מספר הנויטרופילים, והחלפת חיץ הקישור הסטנדרטי בתמיסת CaCl2 יכולה לפשט תהליך זה ולהבטיח תיאור מדויק של הנויטרופילים14. פערים בין הכפילויות הטכניות באותו ניסוי עלולים לנבוע מקצף במהלך הניתוח. הבדלים בין ניסויים עצמאיים עשויים לנבוע משינויים בטוהר וברעננות של הנויטרופילים39.
CLON-G משלב מסלולים ידועים וכימיקלים מעכבים מתאימים כדי למנוע מוות ספונטני של נויטרופילים. עם זאת, שאלת הליבה של תחום זה נותרה לגבי המסלולים המסובכים המתווכים מוות נויטרופילים, שכן אלה עדיין לא מובנים במלואם. מותם של נויטרופילים שטופלו ב-CLON-G הוא בלתי נמנע. לכן, CLON-G עדיין יש מקום לשיפור. באשר למרכיבים של CLON-G, האפשרויות הטובות ביותר הן תרופות המיושמות קלינית כדי להרחיב את האפשרות של היישום הקליני של נויטרופילים המטופלים ב- CLON-G; עם זאת, Q-VD-oph ו- Rec-1 מיועדים למחקר בלבד, וניסויים קליניים המתמקדים בהם אינם זמינים כעת. לפיכך, תרכובות חלופיות נחוצות ליישום קליני.
על ידי הארכת תוחלת החיים של הנויטרופילים ליותר מ-5 ימים כאשר תפקודיהם שלמים, CLON-G יכול לפתוח אפשרויות אינסופיות לחקר נויטרופילים. עם חלון מורחב זה, ניתן לפתח תצפית, מניפולציה גנטית, אחסון לטווח ארוך, הובלה ושימור בהקפאה על בסיס CLON-G. עלויות העבודה, הזמן והכסף יופחתו באופן משמעותי, מה שיוריד את חסמי הכניסה לחוקרים חדשים. CLON-G יכול גם לקדם יישומים קליניים של נויטרופילים כמו טיפול בעירוי גרנולוציטים. זיהום נויטרופי לאחר כימותרפיה הוא גורם המוות העיקרי לחולים הסובלים מסרטן וממאירויות המטופויטיות 40,41,42,43,44. טיפול בעירוי גרנולוציטים, שיש לו פוטנציאל גדול כטיפול אלטרנטיבי לסייע לחולים אלה, מוגבל מאוד על ידי תוחלת החיים הקצרה של נויטרופילים45. זרימת התהליך הנוכחית לעירוי גרנולוציטים אורכת זמן רב יותר מתוחלת החיים של נויטרופיל, מה שמוביל לכך שנויטרופילים שעברו טרנספוזיה מאבדים את יעילותם כתא חיסוני קו ראשון. טיפול CLON-G מספק מספיק זמן להכנת עירויי גרנולוציטים, שיש להם פוטנציאל להציל אינספור חיים של חולים נגועים בנויטרופנים ולעזור להקל על שימוש יתר באנטיביוטיקה. במקביל, הפרוטוקול הנוכחי לבדיקת מוות נויטרופילים יכול להדגים במדויק את מצב הנויטרופילים ולשפר את יכולת השכפול של תוצאות הניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי המחקר נערך בהיעדר ניגוד עניינים.
Acknowledgments
פרויקט זה נתמך על ידי קרן החדשנות של מעבדת Haihe למערכת אקולוגית של תאים (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), קרן החדשנות של האקדמיה הסינית למדעי הרפואה (CAMS) למדעי הרפואה (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), קרן המחקר המיוחדת לאוניברסיטאות מרכזיות, המכללה הרפואית פקין יוניון (3332022062) ותוכנית התמיכה במדע וטכנולוגיה של מחוז סצ'ואן (NO. 2021YJ0480).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm syringe filter | Pall Corporation | 4612 | Filtrate prepared CLON-G components. |
| 1.5 mL micro centrifuge tube | LABSELECT | MCT-001-150 | Lab consumable. |
| 15 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-15 | Lab consumable. |
| 24 well cell culture plate | Falcon | 351147 | Neutrophil culture plate. |
| 50 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-50 | Lab consumable. |
| BD LSRII | BD | Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death. | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | C4901 | Assitant of Annexin-V binding to phosphatidylserine. |
| Confocal microscope | Perkinelmer | UltraVIEW VOX | Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death. |
| Confocal plate | NEST | 801001-20mm | Lab consumable for fluorescent image assay. |
| Counting beads | Thermo Fisher | C36950 | Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| DFO | Sigma Aldrich | D9533 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| Dimethyl sulfoxide ( DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099141C | Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply. |
| FITC-Annexin-V | BD | 51-65874X | Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel. |
| Hsp70 | Abcam | ab113187 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| NAC | Sigma Aldrich | A9165 | Component of CLON-G. Antioxidant. |
| Nec-1s | EMD Millipore | 852391-15-2 | Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor. |
| Penicillin-Streptomycin Solution (PS) | Gibco | 15070063 | Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination. |
| Propidium Iodide (PI) | BioLegend | 421301 | For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane. |
| Q-VD-oph | Selleck chem | S7311 | Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor. |
| Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) | Chugai Pharma China | GRANOCYTE | Component of CLON-G. Promote neutrophil survival through Akt pathway. |
| Round-Bottom Polystyrene Tubes | Falcon | 100-0102 | Lab consumable for flow cytometry analysis. |
| RPMI1640 | Gibco | C11875500BT | Component of neutrophil culture basic medium. |
| Saline | LEAGENE | R00641 | Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | FENG CHUAN | 13-011-00029 | pH adjustion for NAC. |
| Wright-Giemsa Stain Solution | Solarbio | G1020 | Neutrophil cytospin staining. |
References
- Segal, A. W.
- Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Frontiers in Physiology. 9, 113 (2018).
- Chung, S., Armstrong-Scott, O., Charlewood, R. Therapeutic granulocyte infusion for patients with severe neutropaenia and neutrophilic dysfunction: New Zealand experience. Vox Sanguinis. 117 (2), 220-226 (2021).
- Zhou, B., et al. Clinical outcome of granulocyte transfusion therapy for the treatment of refractory infection in neutropenic patients with hematological diseases. Annals of Hematology. 97 (11), 2061-2070 (2018).
- Covas, D. T., et al. Granulocyte transfusion combined with granulocyte colony stimulating factor in severe infection patients with severe aplastic anemia: A single center experience from China. PLoS One. 9 (2), e88148 (2014).
- Tecchio, C., Cassatella, M. A. Uncovering the multifaceted roles played by neutrophils in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 905-918 (2021).
- Lahoz-Beneytez, J., et al. Human neutrophil kinetics: Modeling of stable isotope labeling data supports short blood neutrophil half-lives. Blood. 127 (26), 3431-3438 (2016).
- Pillay, J., et al. In vivo labeling with 2H2O reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 116 (4), 625-627 (2010).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Tofts, P. S., Chevassut, T., Cutajar, M., Dowell, N. G., Peters, A. M. Doubts concerning the recently reported human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 117 (22), 6050-6052 (2011).
- McDonald, J. U., et al. In vivo functional analysis and genetic modification of in vitro-derived mouse neutrophils. FASEB Journal. 25 (6), 1972-1982 (2011).
- Pedruzzi, E., Fay, M., Elbim, C., Gaudry, M., Gougerot-Pocidalo, M. -A. Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to N-formyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. British Journal of Haematology. 117 (3), 719-726 (2002).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: Cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Teng, Y., Luo, H. R., Kambara, H.
- Luo, H. R., Loison, F. Constitutive neutrophil apoptosis: Mechanisms and regulation. American Journal of Hematology. 83 (4), 288-295 (2008).
- Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
- Caserta, T. M. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis. 8, 345-352 (2003).
- Wang, X., Yousefi, S., Simon, H. U.
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Kambara, H., et al. Gasdermin D exerts anti-inflammatory effects by promoting neutrophil death. Cell Reports. 22 (11), 2924-2936 (2018).
- Zhu, D., et al. Deactivation of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate/Akt signaling mediates neutrophil spontaneous death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14836-14841 (2006).
- Xu, Y., Loison, F., Luo, H. R. Neutrophil spontaneous death is mediated by down-regulation of autocrine signaling through GPCR, PI3Kgamma, ROS, and actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 2950-2955 (2010).
- van Raam, B. J., Drewniak, A., Groenewold, V., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor delays neutrophil apoptosis by inhibition of calpains upstream of caspase-3. Blood. 112 (5), 2046-2054 (2008).
- Klein, J. B., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor delays neutrophil constitutive apoptosis through phosphoinositide 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase pathways. Journal of Immunology. 164 (8), 4286-4291 (2000).
- Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
- Xie, X., et al. Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection. Nature Immunology. 21 (9), 1119-1133 (2020).
- Cosimo, E., et al. Inhibition of NF-kappaB-mediated signaling by the cyclin-dependent kinase inhibitor CR8 overcomes prosurvival stimuli to induce apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells. Clinical Cancer Research. 19 (9), 2393-2405 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Porter, A. G., Jänicke, R. U.
- Scheel-Toellner, D., et al. Clustering of death receptors in lipid rafts initiates neutrophil spontaneous apoptosis. Biochemical Society Transactions. 32, 679-681 (2004).
- Geering, B., Simon, H. U. Peculiarities of cell death mechanisms in neutrophils. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1457-1469 (2011).
- Gabelloni, M. L., Trevani, A. S., Sabatté, J., Geffner, J. Mechanisms regulating neutrophil survival and cell death. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 423-437 (2013).
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
- Zhang, D. -W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325 (5938), 332-336 (2009).
- Wang, X., He, Z., Liu, H., Yousefi, S., Simon, H. -U. Neutrophil necroptosis is triggered by ligation of adhesion molecules following GM-CSF priming. Journal of Immunology. 197 (10), 4090-4100 (2016).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
- George, B., Bhattacharya, S. Infections in hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) patients. Contemporary Bone Marrow Transplantation. Chandy, M., Radhakrishnan, V. S., Sukumaran, R. , Springer. Cham, Switzerland. (2020).
- Lucena, C. M., et al. Pulmonary complications in hematopoietic SCT: A prospective study. Bone Marrow Transplant. 49 (10), 1293-1299 (2014).
- Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: A global perspective. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (10), 1143-1238 (2009).
- Wingard, J. R., Hiemenz, J. W., Jantz, M. A. How I manage pulmonary nodular lesions and nodular infiltrates in patients with hematologic malignancies or undergoing hematopoietic cell transplantation. Blood. 120 (9), 1791-1800 (2012).
- Wingard, J. R., Hsu, J., Hiemenz, J. W. Hematopoietic stem cell transplantation: An overview of infection risks and epidemiology. Infectious Disease Clinics of North America. 24 (2), 257-272 (2010).
- Netelenbos, T., et al. The burden of invasive infections in neutropenic patients: incidence, outcomes, and use of granulocyte transfusions. Transfusion. 59 (1), 160-168 (2019).
