Summary
Detta arbete beskriver ett protokoll för friformsinbäddad 3D-utskrift av neurala stamceller inuti självläkande annealable partikel-extracellulära matriskompositer. Protokollet möjliggör programmerbar mönstring av sammankopplade mänskliga neurala vävnadskonstruktioner med hög trohet.
Abstract
Den inbäddade 3D-utskriften av celler inuti ett granulärt stödmedium har uppstått under det senaste decenniet som ett kraftfullt tillvägagångssätt för friformsbiofabricering av mjukvävnadskonstruktioner. Granulära gelformuleringar har dock begränsats till ett begränsat antal biomaterial som möjliggör kostnadseffektiv generering av stora mängder hydrogelmikropartiklar. Därför har granulära gelstödmedier i allmänhet saknat de celladhesiva och cellinstruerande funktionerna som finns i den ursprungliga extracellulära matrisen (ECM).
För att ta itu med detta har en metod utvecklats för generering av självläkande annealable particle-extracellular matrix (SHAPE) kompositer. SHAPE-kompositer består av en granulär fas (mikrogeler) och en kontinuerlig fas (viskös ECM-lösning) som tillsammans möjliggör både programmerbar hifi-utskrift och en justerbar biofunktionell extracellulär miljö. Detta arbete beskriver hur den utvecklade metodiken kan användas för exakt biofabrikation av mänskliga neurala konstruktioner.
Först tillverkas alginatmikropartiklar, som fungerar som den granulära komponenten i SHAPE-kompositerna, och kombineras med en kollagenbaserad kontinuerlig komponent. Därefter trycks mänskliga neurala stamceller inuti stödmaterialet, följt av glödgning av stödet. De tryckta konstruktionerna kan bibehållas i veckor för att möjliggöra differentiering av de tryckta cellerna till neuroner. Samtidigt möjliggör den kollagenkontinuerliga fasen axonal utväxt och sammankoppling av regioner. Slutligen ger detta arbete information om hur man utför fluorescensavbildning med levande celler och immunocytokemi för att karakterisera de 3D-tryckta mänskliga neurala konstruktionerna.
Introduction
Den exakta och programmerbara 3D-utskriften av cellbelastade hydrogelkonstruktioner som efterliknar mjuka vävnader in vitro utgör en stor utmaning. Till exempel är försök baserade på direkt extrudering av mjuka hydrogeler i sig problematiska, eftersom de dåliga mekaniska egenskaperna som krävs för att rekapitulera in vivo-mikromiljön leder till brist på strukturell integritet, deformationer av de fördefinierade egenskaperna eller fullständig kollaps av de tillverkade strukturerna. En konventionell lösning på det här problemet är att skriva ut en stödjande ställning från ett styvare biokompatibelt material som gör att den slutliga konstruktionen kan behålla sin form. Detta tillvägagångssätt begränsar emellertid designmöjligheterna kraftigt och kräver noggrann reologisk finjustering av de intilliggande bläcken.
För att övervinna begränsningarna hos den traditionella lager-för-lager-extruderingsbaserade 3D-utskriften har inbäddad 3D-utskrift dykt upp de senaste åren som ett kraftfullt alternativ för mjuk material- och vävnadstillverkning 1,2,3,4,5,6. Istället för att extrudera bläcket i omgivande luft ovanpå en yta, deponeras bläcket direkt genom en sprutnål inuti ett stödbad som är fast som i vila men reversibelt flyter runt den rörliga nålspetsen för att möjliggöra exakt avsättning av mjukt cellbelastat material. Det deponerade materialet hålls på plats när stödet stelnar i nålens kölvatten. Som sådan möjliggör inbäddad 3D-utskrift högupplöst friformstillverkning av invecklade strukturer från mjuka biomaterial med utökade designmöjligheter 7,8.
Granulära geler har undersökts i stor utsträckning som stödbadmaterial för inbäddad 3D-utskrift, eftersom de kan formuleras för att uppvisa släta, lokaliserade och reversibla övergångar från fast till vätska vid låga avkastningsspänningar 9,10,11. Medan de visar utmärkta reologiska egenskaper för högupplöst utskrift har granulära geler begränsats till en handfull biomaterial12. Bristen på mångfald i granulära gelformuleringar, vilket är särskilt uppenbart om man beaktar det stora utbudet av biomaterial som finns tillgängliga för bulkhydrogelformuleringar, orsakas av behovet av kostnadseffektiv generering av ett stort antal mikrogeler med enkla kemier. På grund av det begränsade biomateriallandskapet för granulära gelstöd utgör inställningen av den extracellulära mikromiljön som tillhandahålls av tryckstödet en utmaning i fältet.
Nyligen har ett modulärt tillvägagångssätt utvecklats för generering av inbäddade 3D-utskriftsstöd, kallade självläkande annealable particle-extracellular matrix (SHAPE) kompositer13. Detta tillvägagångssätt kombinerar de distinkta reologiska egenskaperna hos granulära geler med den biofunktionella mångsidigheten hos bulkhydrogelformuleringar. Det presenterade SHAPE-kompositstödet består av packade alginatmikropartiklar (granulär fas, ~ 70% volymfraktion) med ett ökat interstitiellt utrymme fyllt med en viskös kollagenbaserad ECM-pregellösning (kontinuerlig fas, ~ 30% volymfraktion). Det har vidare visats att SHAPE-stödet underlättar högupplöst deponering av humana neurala stamceller (hNSC) som efter glödgning av stödbadet kan differentieras till neuroner och bibehållas i veckor för att nå funktionell mognad. Inbäddad 3D-utskrift inuti SHAPE-stödbadet övervinner några av de största begränsningarna relaterade till konventionella tekniker för biofabrikation av neural vävnad samtidigt som den ger en mångsidig plattform.
Detta arbete beskriver stegen för inbäddad 3D-utskrift av hNSC inuti SHAPE-stödet och deras efterföljande differentiering till funktionella neuroner (figur 1). Först genereras alginatmikropartiklar via skjuvning under intern gelering. Detta tillvägagångssätt möjliggör enkel generering av stora volymer mikropartiklar utan behov av specialutrustning och cytotoxiska reagens. Dessutom är alginat en allmänt tillgänglig och ekonomisk materialkälla för bildning av biokompatibla hydrogelsubstrat för ett brett spektrum av celltyper. De genererade alginatmikropartiklarna kombineras med en kollagenlösning för att bilda SHAPE-kompositstödmaterialet. Därefter skördas hNSC: erna och laddas i en spruta som ett cellulärt biobläck för 3D-utskrift. En 3D-bioprinter används för extruderingsbaserad inbäddad utskrift av hNSC inuti SHAPE-kompositen. De 3D-utskrivna cellerna differentieras till neuroner för att ge upphov till rumsligt definierade och funktionella mänskliga neurala konstruktioner. Slutligen beskriver protokollet hur de genererade vävnadskonstruktionerna kan karakteriseras med hjälp av levande cellavbildning och immunocytokemi. Dessutom ges tips för optimering och felsökning. I synnerhet kan både komponenterna i de granulära och kontinuerliga faserna bytas ut med andra hydrogelformuleringar för att rymma olika biofunktionella delar, mekaniska egenskaper och tvärbindningsmekanismer, vilket krävs av andra cell- och vävnadstyper utöver neurala applikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av buffertar och reagenser
- Förbered celltillväxtmedium genom att lägga till följande tillskott till DMEM / F12 med L-alanyl-L-glutamindipeptid: 30 mM glukos, 5 μM HEPES, 0,5% w / v lipidrikt bovint serumalbumin, 40 μM L-alanin, 40 μM L-asparaginmonohydrat, 40 μM L-asparaginsyra, 40 μM L-glutaminsyra, 40 μM L-prolin, 1% N2-tillskott, 1% penicillin-streptomycin och 20 ng / L vardera av epidermal tillväxtfaktor (EGF) och fibroblasttillväxtfaktor (FGF). Utför dessa steg i en laminär luftflödesbänk (LAF).
- Bered 1 % vikt/volym-alginatlösning i ultrarent vatten under kraftig omrörning i 4 timmar vid 60 °C. Sterilfiltrera den upplösta, heta alginatlösningen med ett 0,45 μm porfilter i en LAF-bänk. Förvara den vid 4 °C.
OBS: Om alginatlösningens temperatur är under 60 °C är det inte möjligt att leda den genom filtret. - Bered en 37 g/l NaHCO3-lösning i ultrarent vatten. Justera lösningens pH till 9,5 med NaOH och filtersterilisera i en LAF-bänk. Förvara lösningen vid 4 °C.
2. Förberedelse av SHAPE-kompositmaterial
- Alginat mikropartikelgenerering
- Bered en 2 mg/ml CaCO3-lösning i ultrarent vatten i en steril bägare. Blanda den 1:1 med alginatlösningen och rör om i 1 timme vid rumstemperatur med en magnetomrörare.
- Tillsätt ättiksyra i förhållandet 1:500 och låt stå under omrörning över natten vid 650 rpm.
OBS: Alginatlösningen börjar gelning omedelbart. Se till att använda en omrörningsmagnet med samma längd som glasets diameter som används för att säkerställa optimal, homogen omrörning av den bildande gelen. Nästa dag kommer lösningen som genereras genom omrörning under gelering att vara viskös (figur 2A). - Fragmentera den gelade alginatlösningen mekaniskt i mikropartiklar genom homogenisering vid 15 000 varv/min i 10 minuter med en homogenisator placerad i en LAF-bänk (figur 2B).
- Centrifugera mikropartiklarna vid 18 500 × g i 20 minuter (figur 2C) vid rumstemperatur.
- Kassera försiktigt supernatanten inuti LAF-provbänken, återsuspendera partiklarna i DMEM innehållande 2 mM NaOH och 1 % P/S och inkubera över natten vid 4 °C (figur 2D).
OBS: Färgen på upphängningen ska gå tillbaka till rött. Om suspensionen förblir gul, tillsätt NaOH droppvis och blanda tills den blir röd (bild 2E). - Homogenisera partiklarna vid 15 000 rpm i 3 minuter och centrifugera vid 18 500 × g i 10 min vid rumstemperatur.
- Observera pelleten (figur 2F) och ta försiktigt bort supernatanten.
OBS: Pelleten av tätt packade alginatmikropartiklar kan förvaras vid 4 °C tills vidare användning. Om alginatlösningen inte filtersteriliserades ska mikropartiklarna användas inom 1 vecka.
- SHAPE kompositformulering
- Dagen före utskrift, resuspendera alginatmikropartikelpelleten i dubbelt så stor volym tillväxtmedium innehållande 4% HEPES (1 M lager) och 4% NaHCO3-lösning i en LAF-bänk och inkubera den över natten vid rumstemperatur.
- Centrifugera mikrogelsuspensionen vid 18 500 × g i 10 minuter vid rumstemperatur och kassera supernatanten.
- Neutralisera kollagenet som ska blandas med alginatmikropartiklarna i en LAF-bänk. Späd kollagenstamlösningen för att nå en slutlig koncentration på 1 mg/ml och neutralisera den genom att tillsätta 4 % HEPES och 4 % NaHCO3. Till exempel, för 3 ml SHAPE-komposit, blanda 2 ml alginatmikropartiklar med 1 ml neutraliserat kollagen (0,12 ml HEPES, 0,12 ml NaHCO3, 0,16 ml tillväxtmedium och 0,6 ml kollagen).
OBS: Alla material som blandas med kollagen måste hanteras på is för att undvika kollagenpolymerisation. Så snart kollagenet neutraliseras börjar polymerisationen långsamt. - Generera SHAPE-kompositen genom att blanda alginatmikropartikelpelleten med det utspädda och neutraliserade kollagenet i förhållandet 2:1. Blanda gelen noggrant genom att pipettera långsamt upp och ner på is i en LAF-bänk.
OBS: Virvla inte, eftersom detta kommer att införa bubblor i stödmaterialet. - I en LAF-bänk, överför det genererade kompositmaterialet till en kyld mikrobrunnsplatta eller någon lämplig tryckbehållare och använd inom 30 minuter (figur 3E, F).
3. hNSC-kultur och biobläckberedning
- Odla cellerna i en extraktbelagd T75-kolv med källarmembran i odlingsmedium. Passera cellerna minst två gånger efter upptining innan du använder dem för ett 3D-utskriftsexperiment.
- Innan utskrift, dissociera cellerna enzymatiskt med en 0,025% trypsinlösning i 5 minuter vid 37 ° C, neutralisera trypsinet med tillväxtmediet och centrifugera cellsuspensionen vid 400 × g i 5 minuter vid rumstemperatur. Efter centrifugeringen, aspirera supernatanten och suspendera pelleten igen i 2-3 ml tillväxtmedium.
- Utför ett cellantal, centrifugera cellerna vid 400 × g och resuspendera pelleten i tillväxtmedium kompletterat med 0,1% xantangummi (för att förhindra att cellerna sedimenterar) vid en slutlig koncentration av 9 × 106 celler / ml.
- Använd en 21 G trubbig metallnål för att fylla på 100 μl tätt packade alginatmikropartiklar i en spruta (figur 3A).
OBS: Att skapa en plugg med alginatmikropartiklarna tjänar två syften: det hjälper till att upprätthålla extruderingsstabilitet under utskrift och möjliggör fullständig extrudering av det laddade cellulära bläcket (ingen död volym). - Fyll på den beredda cellsuspensionen i sprutan med samma nål (figur 3B).
OBS: Var extra försiktig så att inga luftbubblor införs under sprutladdningsstegen. Luftbubblor orsakar instabilitet under utskrift. - Byt ut laddningsnålen mot en 27 G trubbig metallnål som ska användas för utskrift (figur 3C).
4. Inbäddad 3D-utskrift
- Designa en struktur för utskrift med hjälp av den refererade programvaran (se materialförteckningen).
Se till att justera den ursprungliga höjden på den utskrivna strukturen så att den ligger inom djupet på SHAPE-kompositstödet. Designförslag finns i figur 4A (spiral- och träpålkonstruktioner). - Skapa en G-kod genom att klicka på Generera.
- Sätt in den cellfyllda glassprutan i ett volymetriskt extruderingshuvud på en extruderingsbaserad bioprinter (figur 3D).
- Mät nållängden på den cellfyllda glassprutan genom att klicka på Nållängdsmätning.
- Placera mikrobrunnsplattan eller behållaren laddad med SHAPE-kompositen på skrivaren.
OBS: Håll cellplattan eller behållaren vid 4 °C tills utskrift för att förhindra för tidig tvärbindning av stödet. - Mät ythöjden på en tom brunn inom samma mikrobrunnsplatta eller behållare som SHAPE-gelen laddas i genom att klicka på SHM (ythöjdsmätning).
OBS: Alternativt kan du bestämma ythöjden manuellt genom att mäta brunnens höjd med nålen. - Ställ in extruderingshastigheten på 3,6 μl/min och matningshastigheten på 0,3 mm/s.
Se till att testa profilen innan du skriver ut. Cellsedimentering kan orsaka igensättning av munstycket och kan undvikas genom att förextrudera en liten volym före den faktiska inbäddade utskriften eller genom att lägga till en indragningsvolym till den volymetriska sprutan. I vissa fall måste matningshastigheten hållas under 0,5 mm/s när nålen förs in i eller ut ur SHAPE-gelen för att undvika att bläcket drar sig. - Ladda G-koden i skrivarens användargränssnitt.
OBS: En ny G-kod måste genereras varje gång ändringar görs i den designade strukturen. - Starta utskriftsproceduren genom att klicka på Kör (bild 3G).
- Omedelbart efter utskrift, placera SHAPE-gelen vid 37 °C i en cellodlingsinkubator i 30 minuter för glödgning.
- Tillsätt tillväxtmedium försiktigt ovanpå det glödgade SHAPE-gelstödet.
- Nästa dag ersätts odlingsmediet med differentieringsmedium formulerat enligt följande: DMEM/F12 med L-alanyl-L-glutamindipeptid med 30 mM glukos, 5 μM HEPES, 0,5 % w/v lipidrikt bovint serumalbumin, 40 μM L-alanin, 40 μM L-asparaginmonohydrat, 40 μM L-asparaginsyra, 40 μM L-glutaminsyra, 40 μM L-prolin, 1% N2-tillskott, 1% penicillin-streptomycin, 100 μM dibutyrylcykliskt adenosinmonofosfat (dibutyryl-cAMP), och 2 ng/ml glialcellinjehärledd neurotrofisk faktor (GDNF).
OBS: Se till att inte skada hydrogelen under mediebyten. Luta plattan och ta bort det gamla mediet försiktigt. Tillsätt färskt medium droppvis till väggen i brunnen som innehåller gelén snarare än direkt ovanpå gelén. Använd inte en sugare för att ta bort mediet. - Uppdatera differentieringsmediet varannan dag tills experimentella slutpunkten.
5. Fluorescensavbildning med levande celler
- Ta bort överflödigt medium från gelén.
- Tillsätt en lika stor volym 20 μM Calcein AM (utspädd i differentieringsmedium från stamlösningen) till volymen av stödgelen.
- Inkubera i 40 minuter vid 37 °C.
- Ta bort Calcein AM-lösningen och tillsätt en lämplig volym färskt differentieringsmedium.
- Överför plattan till mikroskopet för avbildning.
6. Immunocytokemi
- Ta bort överflödigt medium från gelén.
- Använd en liten spatel och överför gelen till en större behållare som innehåller DPBS.
- Tvätta tre gånger i 20 minuter varje gång med DPBS och överför plattan till en dragskåp.
- Ta bort DPBS, tillsätt tillräckligt med 4% formaldehydlösning för att täcka gelén och inkubera i 1 timme vid rumstemperatur.
- Tvätta tre gånger med DPBS i 20 minuter varje gång.
- Bered blockerande lösning bestående av 5% åsneserum, 0,25% tvättmedel och 0,02% natriumazid i DPBS.
OBS: Förbered tre gånger den volym som behövs för att täcka gelén; Det kommer senare att användas som grund för de primära och sekundära antikroppslösningarna. - Efter tvättning med DPBS, tillsätt blockeringslösningen till gelén och inkubera i 6 timmar vid rumstemperatur för att förhindra ospecifik bindning. Gunga plattan försiktigt.
- Bered den primära antikroppslösningen genom att späda TUBB3-antikroppen i blockerande lösning i förhållandet 1:1 000.
- Ta bort blockeringslösningen från gelen, tillsätt den primära antikroppslösningen och inkubera i 48 timmar vid 4 °C. Gunga plattan försiktigt.
- Tvätta tre gånger med DPBS i 20 minuter varje gång.
- Bered den sekundära antikroppslösningen genom att späda 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI, 1:1,000) och den sekundära antikroppen (1:200) i blockerande lösning.
- Efter tvättning med DPBS, inkubera gelen i den sekundära antikroppslösningen i 24 timmar vid 4 °C. Gunga plattan försiktigt.
- Tvätta tre gånger med DPBS i 20 minuter varje gång och förvara vid 4 °C tills avbildning.
- Innan du avbildar dig, överför den färgade gelén med en spatel till en skål eller en brunnplatta med en tunn bildbotten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mikrogelberedning av alginat via skjuvförtunning under intern gelering följt av mekanisk fragmentering ger alginatmikrogeler som är polydispergerade i storlek och flingliknande i form, vilket ses i figur 2G. Storleken på dessa oregelbundna partiklar varierar från mindre än 1 μm till cirka 40 μm i diameter. När de är tätt packade bildar mikropartiklarna ett transparent bulkmaterial som bara är något mer ogenomskinligt än motsvarande cellodlingsmedium (figur 2F). Stödmaterialets transparens är en viktig aspekt av plattformen eftersom det möjliggör visualisering av de tryckta strukturerna under odlingsperioden, liksom för högupplöst konfokalmikroskopi av konstruktioner märkta både med levande cellfärger och via immunocytokemi. När den blötläggs i buffrat cellodlingsmedium bör den resulterande pH-justerade gelén ha en röd färg, vilket indikerar fysiologiska förhållanden (figur 2F). Det är viktigt att neutralisera pH hos alginatmikropartiklarna av två skäl. Sura mikropartiklar kan direkt skada cellerna. Dessutom kommer en sur miljö att förhindra framgångsrik glödgning av SHAPE-kompositstödet, eftersom det skulle störa kollagenpolymerisationen.
Utskrift av hNSC-bläcket med de parametrar som beskrivs ovan ger en glödtråd av celler som är ~ 200 μm i diameter (figur 4A). Den programmerade geometrin bevaras både vid utskrift i ett plan och vid utskrift av strukturer ovanpå varandra. Vid flerskiktstryck förblir de tryckta strukturerna intakta, med ett minsta lager-till-lager-avstånd på 200 μm13. Cellernas livskraft bör inte påverkas signifikant under bläckberedning och extrudering. De tryckta strängarna är rika på levande celler som har en rund morfologi (figur 4B, vänster). Luckor i de tryckta strängarna kan uppstå dagen efter utskrift, även om den tillverkade konstruktionen inte visar några deformationer omedelbart efter utskrift. Detta är troligen resultatet av inhomogen blandning av stödet. Eftersom cellerna inte interagerar med alginatmikropartiklarna migrerar de bort från de alginatrika områdena mot de kollagen- och cellrika områdena, vilket orsakar brott i de tryckta strängarna. Dessutom bör SHAPE-stödet vara bubbelfritt, eftersom luftfickor kan störa utskriftsåtergivningen.
Framgångsrik differentiering av hNSC bör ge neuronrika strukturer 30 dagar efter utskrift, med celler som uppvisar neuronal morfologi med små cellkroppar och långa tunna processer (figur 4B, höger). Dessutom, om täta mönster skrivs ut, såsom ett rektangulärt ark av celler, bör det inte finnas några synliga luckor eller aggregat som bildas under differentiering, utan snarare bör ett kontinuerligt lager av celler förbli intakt (figur 4C). I detta protokoll beskrivs en procedur för fluorescensimmunocytokemi av de 3D-utskrivna proverna. Färgning för TUBB3, en cytoplasmatisk neuronal markör, möjliggör direkt visualisering av de genererade neuronala nätverken. Fluorescensmikroskopin av de differentierade utskrifterna bör avslöja strukturer rika på TUBB3 och med bibehållen geometri (figur 4D, vänster). Under differentieringsprocessen migrerar cellerna inte ut ur de tryckta strängarna, vilket kan observeras genom färgning för cellkärnor med DAPI (figur 4D, mitten). Som ett resultat observeras neuronala kroppar inom gränserna för den tryckta geometrin, med axonala projektioner som utgår hundratals mikrometer in i SHAPE-stödet som omger konstruktionen. Den axonala utforskningen av den omgivande volymen indikerar att SHAPE-stödet ger biofunktionella signaler som möjliggör axonal pathfinding. Mer mogna neuronala markörer eller subtypspecifika markörer kan användas i immunocytokemi för att ytterligare karakterisera de genererade neuronala populationerna. Vidare kunde den tryckta neuronala konstruktionen karakteriseras med användning av RT-qPCR eller elektrofysiologi13. Båda tillvägagångssätten skulle emellertid kräva avlägsnande av kollagen med användning av kollagenas, eftersom hydrogelskiktet hindrar både RNA-extraktion och fysisk åtkomst till cellerna med en mikropipett.
Figur 1: Konceptuell illustration av den inbäddade SHAPE-utskriftsmetoden. En kollagenlösning blandas med alginatmikropartiklar för att bilda SHAPE-kompositen. SHAPE-kompositen används som stödmaterial för inbäddad 3D-utskrift av hNSC, som differentieras till neuroner inuti det glödgade stödet. De biofunktionella egenskaperna hos SHAPE-kompositen gör det möjligt för neuronerna att förlänga projektionerna och fylla den tomma delen av stödet med sina axonala projektioner. Denna siffra har modifierats från Kajtez et al.13. Förkortningar: SHAPE = självläkande annealabel partikel-extracellulär matris; hNSCs = humana neurala stamceller. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Beredning av alginatmikropartiklar . a) Alginatlösningen efter gelering över natten. (B) De alginatmikropartiklar som genereras genom homogenisering. c) Partikelpelleten efter centrifugering. d) Pelleten återsuspenderades i DMEM (E) före pH-justeringen och efter pH-justeringen. F) Mikropartiklarna efter inkubation i medium över natten och centrifugering. (G) En ljusfältsbild av de tillverkade alginatmikropartiklarna. Skalstapel = 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Förberedelse för 3D-utskriftsprocessen. (A) En flytgödselplugg (~ 100 μL) laddas i sprutan följt av (B) påfyllning av cellulärt biobläck (här kompletterat med färgade pärlor för visualiseringsändamål). (C) Den koniska plastspetsen (21 G) som används för bläckpåfyllning ersätts med en 27 G trubbig metallnålspets. (D) Sprutan sätts in i 3D-utskriftshuvudet. (E,F) SHAPE-kompositen pipetteras till en brunn på en 48-brunnsplatta. Röret med SHAPE-kompositen hålls på is när det inte hanteras. (G) Nålspetsen förs in i SHAPE-stödet och utskriften av den bana som definieras av datordesignen startas (här visas utskriften av en spiral). Förkortning: SHAPE = självläkande annealabel partikel-extracellulär matris. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: 3D-utskrivna neurala konstruktioner inuti SHAPE-kompositstödet. (A) Brightfield-bilder av tryckta hNSC inuti stödhydrogelen. Spiral (vänster) och trästapel (höger) konstruktioner visas. (B) Levande cellavbildning av en 3D-tryckt konstruktion dagen efter utskrift (vänster) och efter neuronal differentiering (höger). (C) En 3D-tryckt fyrkantig konstruktion avlägsnad från en odlingsbrunn med en spatel visar strukturell integritet. (D) Fluorescenskonfokala bilder av samma kvadratiska konstruktion immunmärkta för en neuronal markör (TUBB3) och med motfärgade kärnor (DAPI) som bekräftar den framgångsrika differentieringen av hNSC inom de 3D-tryckta konstruktionerna. Skalstänger = 500 μm (A, höger); 100 μm (B,D). Panelerna C och D i denna figur har modifierats från Kajtez et al.13. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SHAPE-kompositmaterialmetoden ger en mångsidig väg för formulering av annealbara och biofunktionella stödbad för inbäddad 3D-utskrift av cellulära bläck. Medan detta protokoll ger ett exempel på 3D-utskrift av neurala konstruktioner, kan SHAPE-verktygslådan enkelt anpassas till biofabrikation med andra cellkällor för exakt konstruktion av en rad målvävnadstyper. Utskriftsmetoden skulle också möjliggöra exakt mönstring av flera celltyper för att studera deras interaktion eller för att konstruera vävnader med ett definierat rumsligt arrangemang av cellfacken (t.ex. neuroner och gliaceller). Till skillnad från de traditionella granulära gelerna innehåller SHAPE-kompositen ett expanderat interstitiellt utrymme (~ 30% volymfraktion för formuleringen som presenteras i detta protokoll). Den granulära komponenten fungerar som en reologisk modifierare som ger kompositen gynnsamma materialegenskaper för högupplöst inbäddad utskrift. Detta öppnar en väg mot en rationell design av den cellulära mikromiljön genom att ändra formuleringen av den kontinuerliga komponenten samtidigt som samma granulära komponent behålls. Till exempel kan andra funktionella ECM-molekyler införas i stödbadet (t.ex. hyaluronsyra, lamininer, fibronektin), eller olika tvärbindningsmekanismer kan utnyttjas (t.ex. enzymatisk, ljusbaserad)13. Dessutom kan alginatet i den granulära komponenten ersättas med mikropartiklar från olika hydrogelmaterial (t.ex. gelatin8, polyetylenglykol14,15, agaros 16) eller tillverkas i olika storlekar och former i linje med behoven hos olika vävnadstekniska eller sjukdomsmodelleringsapplikationer. Förhållandet mellan den granulära och kontinuerliga fasen kan justeras efter behoven hos enskilda 3D-utskriftsprojekt, men att öka den kontinuerliga fasen över 30% kan äventyra utskriftskvaliteten och upplösningen.
Under mikrogelproduktionsstegen är det viktigt att omrörningen av alginatlösningen efter tillsats av ättiksyra är effektiv genom hela gelningslösningens volym. Om omrörningshastigheten är för låg eller magnetomröraren är för liten, kan omrörningen inte nå de övre skikten av lösningen, vilket kommer att förvandlas till en stor volym tvärbunden bulkhydrogel, medan de nedre skikten kommer att klippas. Homogeniseringen av en inkonsekvent skjuvad alginathydrogel kommer att resultera i generering av alginatmikropartiklar som är suboptimala för 3D-utskriftsapplikationer. Vidare måste alginatmikropartiklarna blandas noggrant med kollagenlösningen, eftersom en icke-homogen blandning kommer att resultera i fläckar av stödmaterialet som saknar kollagen; Dessa patchar skulle inte glödgas och skulle därför sakna cellinteraktiva funktioner. Det kan också finnas plåster som saknar alginatmikropartiklar och därför inte skulle stödja utskrift. Ett inhomogent blandat tryckstöd skulle därför inte kunna stödja hifi-utskrifter och skulle äventyras strukturellt, eftersom det inte skulle glödgas i hela volymen. Bubblor bör också undvikas, inte för att de kan vara skadliga för cellerna, utan för att luftfickor kan orsaka deformationer under utskrift och störa avbildningen av konstruktionerna. Två vanliga källor till bubblor är virvelning (mikrobubblor i det kalla stödet som expanderar under stödglödgningen vid 37 °C) och kraftig pipettering.
Det sammansatta SHAPE-stödet i detta arbete formulerades inte som ett offermaterial som skulle tas bort efter utskrift utan snarare som ett långsiktigt biofunktionellt stöd för både stamcellsdifferentiering och neuronal tillväxt och funktionell mognad. I jämförelse med granulära geler som inte glödgas efter tryckning ger den strukturella stabiliteten och transparensen hos det glödgade SHAPE-kompositmaterialet en skyddande miljö för känsliga neuronala egenskaper under fixerings- och immunmärkningsprocessen, och som sådan underlättar detta material morfologisk karakterisering via visualisering av antigener. Fluorescensreportrar kan också användas för att spåra förändringar i cellulär morfologi över tid, samt för att övervaka cellulär proliferation och migration inom det glödgade utskriftsstödet. Dessutom kan kalciumavbildningsmetoder användas för att ge information om spontan cellulär aktivitet (t.ex. bränning av åtgärdspotentialer i neuroner eller till och med synkron neuronal nätverksaktivitet). Kemisk stimulering av de konstruerade cellulära konstruktionerna (t.ex. neuronal stimulering med KCl) kan dock vara svår på grund av hydrogelskiktet som omger cellerna, vilket saktar ner diffusionen och förhindrar omedelbar modulering av den cellulära mikromiljön. Optogenetisk stimulering är ett bättre alternativ för kontroll av cellulär aktivitet, eftersom SHAPE-hydrogelerna inte hindrar optisk åtkomst till cellerna.
Syrekänsliga pärlor kan införlivas i biobläcket eller i stödmaterialet (via direkttryck eller dispersion under kompositberedning) för att möjliggöra levande rumslig och tidsmässig kartläggning av syrespänningsnivåerna inuti och runt de tryckta konstruktionerna med hög känslighet13. Denna icke-invasiva 3D-syrekartläggningsmetod baserad på fosforescenslivslängdsmätningar ger en väg mot tekniska vävnadskonstruktioner med förbättrad syresättning och sannolikt också förbättrad näringstillförsel. Dålig syresättning kan leda till bildandet av nekrotiska regioner inom de tryckta konstruktionerna, störa stamcellsdifferentiering och påverka neuronal metabolism. Syrekartläggning ger en avläsning baserad på vilken 3D-utskriftsdesignen kan ändras för att underlätta enhetlig syresättning i hela konstruktionen, finjustering av syrenivåerna för att matcha fysiologiska förhållanden eller generering av syregradienter.
Konstruerade kanaler kan också införlivas i det annealbara utskriftsstödet genom att skriva ut ett offerbläck, såsom gelatin, som stelnar inuti det kalla stödbadet men lätt kan evakueras vid 37 ° C 4,13. Kanaler skulle krävas för att tillföra näringsämnen och syre till vävnadskonstruktioner med hög celldensitet eller dimensioner som överstiger kapaciteten hos en designbaserad syrespänningsmanipulationsmetod. Dessutom kan vaskulära liknande kanaler utnyttjas för att skapa gradienter av små molekyler som driver mönstringen av cellulär identitet, modulerar cellulär aktivitet eller styr kemotaxi.
Sammanfattningsvis erbjuder inbäddad 3D-utskrift inuti SHAPE-kompositen en modulär materialplattform som är lätt att anpassa och har mångsidig potential för funktionell modellering av mekaniskt känsliga vävnader. Protokollet som presenteras här ger en detaljerad förklaring av de nödvändiga stegen och grundläggande principerna som behövs för att generera stödmaterialet och skriva ut cellbläcket med hög trohet. Tillvägagångssättet utnyttjar prisvärda material och tillgänglig utrustning samtidigt som det ger utrymme för anpassning av tillvägagångssättet till enskilda forskares behov och tillämpningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Forskningen finansierades främst av BrainMatTrain European Union Horizon 2020 Programme (No. H2020-MSCA-ITN-2015) under Marie Skłodowska-Curie Initial Training Network och bidragsavtal nr 676408. C.R. och J.U.L. vill tacka Lundbeck Foundation (R250-2017-1425) och Independent Research Fund Denmark (8048-00050) för deras stöd. Vi tar tacksamt emot finansiering för projektet HORIZON-EIC-2021-PATHFINDEROPEN-01 101047177 OpenMIND.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL Gastight Syringe 1001 TLL | Hamilton | 81320 | |
| 3DDiscovery 3D bioprinter | RegenHU | ||
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| AlbuMAX | ThermoFisher | 11020021 | |
| Alexa Fluor 488 secondary antibody | ThermoFisher | A-11001 | Goat anti-Mouse |
| Blunt Needle, Sterican (21 G) | Braun | 9180109 | |
| Blunt Needle (27 G) | Cellink | NZ5270505001 | |
| BioCAD software | SolidWorks | ||
| Calcein AM | ThermoFisher | 65-0853-39 | |
| Calcium carbonate | Sigma-Aldrich | C5929 | |
| Dibutyryl-cAMP sodium salt | Sigma-Aldrich | D0627 | |
| Cultrex Rat Collagen I (5 mg/mL) | R&D Systems | 3440-100-01 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| DMEM/F-12, GlutaMAX | ThermoFisher | 10565018 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| DPBS | ThermoFisher | 14190094 | |
| EGF | R&D Systems | 236-EG | |
| FGF | R&D Systems | 3718-FB | |
| Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9 | Sigma-Aldrich | 100496 | |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD | |
| Geltrex | ThermoFisher | A1569601 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| HEPES Buffer (1 M) | ThermoFisher | 15630080 | |
| L-Alanine | Sigma-Aldrich | 5129 | |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma-Aldrich | A4284 | |
| L-Aspartic acid | Sigma-Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma-Aldrich | G1251 | |
| L-Proline | Sigma-Aldrich | P0380 | |
| Magnetic stirrer RET basic | IKA | 3622000 | |
| N-2 Supplement | ThermoFisher | 17502048 | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140122 | |
| S25N-10G dispersing tool | IKA | 4447100 | |
| Sodium Alginate (80-120 cP) | FUJIFILM Wako | 194-13321 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| T18 Digital ULTRA-TURAX homogenizer | IKA | 3720000 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Trypsin/EDTA Solution | ThermoFisher | R001100 | |
| TUBB3 antibody | BioLegend | 801213 | Mouse |
| Xanthan gum | Sigma-Aldrich | G1253 |
References
- Wu, W., DeConinck, A., Lewis, J. A. Omnidirectional printing of 3D microvascular networks. Advanced Materials. 23 (24), H178-H183 (2011).
- Bhattacharjee, T., et al.
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), e1500758 (2015).
- Skylar-Scott, M. A., et al. Biomanufacturing of organ-specific tissues with high cellular density and embedded vascular channels. Science Advances. 5 (9), (2019).
- Highley, C. B., Rodell, C. B., Burdick, J. A. Direct 3D printing of shear-thinning hydrogels into self-healing hydrogels. Advanced Materials. 27 (34), 5075-5079 (2015).
- Romanazzo, S., et al. Synthetic bone-like structures through omnidirectional ceramic bioprinting in cell suspensions. Advanced Functional Materials. 31 (13), 2008216 (2021).
- Noor, N., et al. 3D printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts. Advanced Science. 6 (11), 1900344 (2019).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- LeBlanc, K. J., et al. Stability of high speed 3D printing in liquid-like solids. ACS Biomaterials Science and Engineering. 2 (10), 1796-1799 (2016).
- Prendergast, M. E., Burdick, J. A. Computational modeling and experimental characterization of extrusion printing into suspension baths. Advanced Healthcare Materials. 11 (7), 2101679 (2022).
- Shapira, A., Noor, N., Oved, H., Dvir, T. Transparent support media for high resolution 3D printing of volumetric cell-containing ECM structures. Biomedical Materials. 15 (4), 45018 (2020).
- McCormack, A., Highley, C. B., Leslie, N. R., Melchels, F. P. W. 3D printing in suspension baths: Keeping the promises of bioprinting afloat. Trends in Biotechnology. 38 (6), 584-593 (2020).
- Kajtez, J., et al. Embedded 3D printing in self-healing annealable composites for precise patterning of functionally mature human neural constructs. Advanced Science. 9 (25), 2201392 (2022).
- Rommel, D., Vedaraman, S., Mork, M., de Laporte, L. Interlinked macroporous 3D scaffolds from microgel rods. Journal of Visualized Experiments. (184), e64010 (2022).
- Griffin, D. R., Weaver, W. M., Scumpia, P. O., di Carlo, D., Segura, T. Accelerated wound healing by injectable microporous gel scaffolds assembled from annealed building blocks. Nature Materials. 14 (7), 737-744 (2015).
- Mirdamadi, E., Muselimyan, N., Koti, P., Asfour, H., Sarvazyan, N. Agarose slurry as a support medium for bioprinting and culturing freestanding cell-laden hydrogel constructs. 3D Printing and Additive Manufacturing. 6 (3), 158-164 (2019).
