Summary
Dette manuskript beskriver en ny direkte planteinfusionsanordning til screening af molekylers effektivitet mod bakterierne (Candidatus Liberibacter asiaticus) eller dens insektvektor (Diaphorina citri, Kuwayama), der i kombination er forbundet med Huanglongbing citrussygdom.
Abstract
Test af terapeutiske forbindelsers funktion i planter er en vigtig bestanddel af landbrugsforskningen. Blad- og jorddrenchmetoder er rutinemæssige, men har ulemper, herunder variabel optagelse og miljømæssig nedbrydning af testede molekyler. Trunkinjektion af træer er veletableret, men de fleste metoder til dette kræver dyrt, proprietært udstyr. For at screene forskellige behandlinger for Huanglongbing er der behov for en simpel, billig metode til at levere disse forbindelser til vaskulært væv af små drivhusdyrkede citrustræer inficeret med den floembegrænsede bakterie Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) eller inficeret med floem-fodring CLas insektvektor Diaphorina citri Kuwayama (D. citri) er nødvendig.
For at opfylde disse screeningskrav blev der designet en direkte planteinfusion (DPI) enhed, der forbinder til plantens bagagerum. Enheden er lavet ved hjælp af et nylonbaseret 3D-printsystem og let tilgængelige hjælpekomponenter. Denne enheds evne til optagelse af forbindelser blev testet i citrusplanter ved hjælp af fluorescerende markør 5,6-carboxyfluorescein-diacetat. Ensartet sammensat fordeling af markøren gennem planterne blev rutinemæssigt observeret.
Desuden blev denne enhed brugt til at levere antimikrobielle og insekticide molekyler for at bestemme deres virkninger på henholdsvis CLas og D. citri. Aminoglycosidantibiotika streptomycin blev leveret til CLas-inficerede citrusplanter ved hjælp af enheden, hvilket resulterede i en reduktion i CLas-titeren fra 2 uger til 4 uger efter behandling. Levering af det neonicotinoid insekticid imidacloprid i D. citri-inficerede citrusplanter resulterede i en signifikant stigning i psylliddødeligheden efter 7 dage. Disse resultater tyder på, at denne DPI-enhed repræsenterer et nyttigt system til levering af molekyler i planter til test og lette forsknings- og screeningsformål.
Introduction
Forvaltningen af planter i kommercielle og landskabsmæssige omgivelser kræver ofte brug af kemiske forbindelser for at optimere plantevækst og sundhed. Hvordan disse molekyler leveres afhænger af typen af molekyle, molekylets funktion, typen af plante og det eksisterende styringssystem. Blad- og jordapplikationer er de nemmeste leveringsstrategier, men begrænsninger i optagelsen af nogle molekyler kræver direkte levering. Et eksempel på disse molekyler er terapeutiske molekyler, der fungerer bedst, når de bevæger sig systemisk i planten, men ikke effektivt kan leveres ved enkle topiske applikationer1. Dette er tilfældet med Huanglongbing (HLB), også kaldet citrusgrønning sygdom. HLB er en sygdom forbundet med en floembegrænset bakterie, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), som ikke kan dyrkes uden for planten, eller dens insektvektor, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
Hvis de formodede terapeutiske molekyler er genprodukter, kan de testes ved at skabe transgene planter, der udtrykker disse forbindelser. Transgen planteproduktion kan imidlertid være tids- og ressourcekrævende, er meget genotypeafhængig og kan hæmmes af genhæmning3. Selv om disse transgene stoffer viser lovende resultater, reducerer lovgivningsmæssige og offentlige opfattelsesbegrænsninger sandsynligheden for deres kommercielle accept 4,5. Den eksogene anvendelse af forbindelser forenkler imidlertid testningen af biologiske og syntetiske molekyler, fordi det ikke kræver produktion af stabile eller forbigående ekspressive transgene planter, hvilket reducerer tid og ressourcer til at teste et molekyles virkninger. En metode til effektiv systemisk planteafgivelse af eksogene forbindelser kan anvendes til en lang række forsknings- og screeningsformål.
En af disse anvendelser er analysen af systemisk molekylebevægelse i en plantes vaskulære system, hvilket kan gøres ved hjælp af sporbare markører, uanset om de er fluorescerende, synlige eller unikke kemiske isotoper 6,7,8,9. En almindeligt anvendt fluorescerende markør er 5,6-carboxyfluorescein-diacetat (CFDA), som er et membrangennemtrængeligt farvestof, der nedbrydes af intracellulære esteraser til 5,6-carboxyfluorescein (CF) og derefter bliver fluorescerende og membranuigennemtrængelig10. CFDA er blevet flittigt brugt til at overvåge floemtransport, synke- og kildeforhold og vaskulaturmønster i plantevæv11,12.
Ud over disse markører kan visse forbindelser direkte ændre plantens fysiologi for at øge produktiviteten eller dræbe planten i tilfælde af herbicider. Både insekticider og antimikrobielle forbindelser er et middel til at øge planteproduktiviteten, især i nærvær af HLB. Et eksempel på et antimikrobielt molekyle, der bruges til at kontrollere CLas, er streptomycin. Streptomycin er et aminoglycosidantibiotikum, der oprindeligt blev isoleret fra Streptomyces griseus og har vist sig at hæmme bakterievækst gennem hæmning af proteinbiosyntese13. Med hensyn til insekticider er hovedmålet for HLB-forskning D. citri, som overfører CLas fra træ til træ14. Til dette formål anvendes neonicotinoider, såsom imidacloprid, almindeligt, da de er guldstandarden til bekæmpelse af skadedyr15. Alle disse forskellige anvendelser er vigtige aspekter af de nuværende planteforvaltningsstrategier, og udviklingen af nye produkter afhænger af effektive screeningsanalyser.
En metode, der anvendes til introduktion af forbindelser i træagtige planter, er direkte injektion i bagagerummet. Der er designet en række systemer, der varierer i deres behov for forborede injektionssteder, og disse systemer bruger enten trykbaseret injektion eller passivt flow16. Selvom trykbaserede systemer giver mulighed for hurtig introduktion af en given forbindelse, skal den potentielle fysiske skade forårsaget af at tvinge væske gennem blokeret eller emboliseret vaskulatur overvejes17. Selv om blad- eller gennemføringsmidler af forbindelser er mindre tidskrævende at gennemføre, reducerer direkte planteinjektion spild af forbindelsen af interesse på grund af tab til luft eller jord og kan også forlænge den tid, forbindelserne er i aktiv tilstand, ved at reducere eksponeringen for det ydre miljø18. Begge disse aspekter er vigtige for at bevare dyre reagenser og sikre konsistens blandt replikater i forskningsmiljøer.
Denne undersøgelse beskriver design, konstruktion og anvendelse af en innovativ DPI-enhed (Direct Plant Infusion), som kan bruges til at vurdere, hvordan forbindelser af interesse påvirker en værtsplante. En standard 3D-printer blev brugt til at fremstille både selve enheden og flere komponenter i forbindelse med dens konstruktion. Denne interne konstruktionsmetode giver forskere mulighed for at ændre enheden og enhedskomponenterne baseret på deres specifikke eksperimentelle behov og reducerer afhængigheden af kommercielt tilgængelige planteinjektionsanordninger. Enhedsopsætningen er enkel og effektiv, og alle hjælpekomponenter er let tilgængelige og billige. Selvom systemet blev designet til brug med en række plantearter, vedrører eksemplerne her pottecitrusplanter. Derudover viser denne undersøgelse, at denne enhed er i stand til effektivt at levere flere typer forbindelser systemisk til unge citrusplanter uden at forårsage dødelighed. De testede forbindelser omfattede CFDA, som blev brugt til at vurdere stoffordelingen i planten, og streptomycin og imidacloprid, som blev brugt til at verificere, at de antimikrobielle og insekticide virkninger af disse forbindelser blev observeret, når de blev leveret via DPI.
Protocol
1. Fremstilling af citrusplanter til injektion af forsøgsforbindelser
- Formere små potte citrustræer fra enten rodfæstede vegetative stiklinger eller frø. Dyrk citruslinjerne i potten under en lys/mørk dagslængde på 16 timer og 8 timer og ved 28 °C.
- Vælg citrusplanter af passende størrelse til forsøget. De beskrevne anvendelser krævede, at planterne var mellem 12 cm og 100 cm høje med stammediametre på 4-14 mm. Hvis der kræves ny skyllevækst, skal du skære planterne tilbage inden forsøget.
2. Tredimensionel udskrivning af DPI-enheden og formkomponenterne
- Påfør et tyndt lag polyvinylacetatbaseret lim på printsengen.
- Læg nylonfilament i 3D-printeren, og forbered printeren i henhold til producentens anvisninger. Importer det ønskede . STL-fil (supplerende fil 1, supplerende fil 2, supplerende fil 3, supplerende fil 4, supplerende fil 5, supplerende fil 6, supplerende fil 7, supplerende fil 8, supplerende fil 9, supplerende fil 10, supplerende fil 11, supplerende fil 12, supplerende fil 13 og supplerende fil 14), opsæt og start udskrivningen.
- Fjern stykket fra printsengen. Skyl den polyvinylacetatbaserede lim fra bunden af den trykte komponent med vand, og fjern eventuelle understøtningsstrukturer.
- Sprøjt DPI-komponenten med to lag klar glansspraymaling.
3. Fremstilling af plastisolringformen
- Saml en formform, der er stor nok til at holde mønsterstykkerne, ved at bygge et rektangulært kabinet ved hjælp af sammenklappelige plastblokke på en base (supplerende figur S1A).
- Bland RTV silikonemonomeren og katalysatoren sammen i forholdet 10:1, og rør rundt uden at indføre bobler i 1 min. Farve ved tilsætning af madfarve (3 dråber/25 ml silikoneblanding) og håndsæbe (1 ml sæbe/25 ml silikoneblanding) (supplerende figur S1B).
- Hæld et tyndt lag silikone i formformen, der er tilstrækkeligt til helt at dække bunden. Tamp for at flade overfladen ud, og vent 24 timer på, at silikonen sætter sig (supplerende figur S1C).
- Hæld et andet lag silikone, som beskrevet ovenfor, der er dybt nok til at dække det midterste hulkernetryk på mønsteret (synlig øverst på mønsteret i supplerende figur S1D). Indsæt mønsteret i den flydende silikone med det midterste hulkernetryk nedad. Sørg for, at ingen bobler er fanget, og at mønstrene er godt adskilt og ikke rører ved (supplerende figur S1E).
- Fastgør mønstrene med enten en tung genstand og/eller tape for at forhindre dem i at flyde ud af silikonen, mens den sætter sig. Vent 24 timer på, at det nyligt hældte lag sætter sig (supplerende figur S1F).
- Hæld yderligere lag silikone, indtil niveauet flugter med toppen af mønsteret. Vent 24 timer med at hærde (supplerende figur S1G).
- Demonter de sammenklappelige plastblokke for at frigøre formen. Fjern mønstrene (supplerende figur S1H). Undersøg formen for tårer eller misdannelser (supplerende figur S1I).
4. Støbning af plastisolringene
- Overtræk det indre af formen, alle kernekomponenterne og O-ringene med madolie (supplerende figur S2A, B). Placer en O-ring omkring hakket i midten af midterstolpekernen, og placer kernen i det midterste hul i plastisolringformen (supplerende figur S2C).
- Indsæt leveringskanalkernen i hullet på siden af plastisolringformen. Vend den V-formede spids for enden af leveringskanalens kerne, så den flugter med O-ringen på midterstolpens kerne (supplerende figur S2D,E).
- Varm plastisol i mikrobølgeovnen i korte 10 s udbrud (supplerende figur S2F, G). Plastisol omrøres forsigtigt for at undgå bobler (supplerende figur S2H). Opvarmningen og omrøringen gentages, indtil opløsningen når en temperatur mellem 160 °C og 170 °C (supplerende figur S2I).
FORSIGTIG: Overophedning af plastisol kan føre til frigivelse af giftige dampe. Udfør proceduren i et godt ventileret område eller stinkhætte. Plastisol må ikke opvarmes til over 170 °C. - Hæld den smeltede plastisol i plastisolringformen nær formens yderkant uden at indføre bobler (supplerende figur S2J). Vent 1 time på, at plastisolringene er afkølet (supplerende figur S2K). Fjern ringene fra formen. Sørg for korrekt pasform med DPI-enheden før brug i eksperimentelle assays (supplerende figur S2L).
5. Fastgørelse af DPI-enheden til anlægget
- Find et glat, sundt sted på bagagerummet til enhedens vedhæftning. Undgå stød eller knuder, da disse kan bidrage til lækage af enheden.
- Brug et bor med en diameter på 2 mm til at bore et hul vandret gennem midten af stilken i en vinkel på 90° med stammens overflade (supplerende figur S3A). Kør boret gennem hullet flere gange for at rengøre og glatte det for at skabe et uhindret hul (supplerende figur S3B).
- Opret en lodret skive i plastisolringen på den modsatte side af den sammensatte tilførselskanal (supplerende figur S3C). Monter ringen rundt om anlægget, og ret leveringskanalen op med det tidligere borede hul (supplerende figur S3D).
BEMÆRK: Ringen skal passe tæt rundt om bagagerummet for at undgå lækager; Kernesamlinger med forskellige diametre kan bruges til at fremstille plastisolringe til plantestængler i forskellige størrelser. - Tilføj DPI-enheden til plastisolringen, og sørg for, at de passer tæt sammen. Juster DPI-enhedens tud med plastisolringens tilførselskanal og borede hul (supplerende figur S3E).
BEMÆRK: Brug af et bor til at justere hullet og DPI-enhedens tud kan være nyttigt. - Pak stramt ind med silikonetape for at holde apparatet på plads (supplerende figur S3F). Undersøg den fuldt monterede og tilsluttede enhed for at sikre korrekt justering og orientering på anlægget.
6. Anvendelse af interesseforbindelsen ved hjælp af DPI-enheden
- Brug en sprøjte eller pipette til at fylde DPI-enheden med den relevante opløsning (supplerende figur S3G). Brug en sprøjte til at trænge ind i silikonebåndet og plastisolringen på den modsatte side af DPI-enheden for at trække luft ud af den indre kanal og undgå indføring af luftbobler i plantens vaskulatur (supplerende figur S3H). Udskift enhver ekstraheret forbindelse tilbage i DPI-enheden.
- Tilføj et ekstra lille plaster silikonetape over hullet skabt af sprøjten for at forstærke området og forhindre tårer. Undersøg apparatet for synlige lækager ved fastgørelsespunktet, og inspicer enhedens reservoir for et stabilt væskeniveau.
BEMÆRK: Vand kan i første omgang bruges til at teste for lækager for at undgå spild af testopløsning. - Dæk den åbne ende af DPI-enheden med voksforseglingsfilm, og træk ned for at danne en tætning og reducere fordampningen af den eksperimentelle forbindelse. Stik et enkelt hul i voksfilmen med en sprøjtespids for at forhindre udvikling af et vakuum, og genopfyld derefter enheden (supplerende figur S3I).
- Kontroller apparatet dagligt for at sikre korrekt justering af komponenterne (supplerende figur S3J), og fyld væsken af med en sprøjte for at undgå, at beholderen løber tør. Gentag denne proces, indtil den ønskede mængde eksperimentel opløsning er indført.
BEMÆRK: Forbindelser kan med succes introduceres fra en given enhed i op til 1 måned. Varigheden af optagelsen af opløsningen, der overskrider denne tidsramme, skal testes empirisk før den eksperimentelle opsætning.
7. Brug af CFDA til at observere vaskulær bevægelse med citrusplanter
- Fastgør DPI-enheden til 25 cm høje citronplanter (Citrus medica L.), påfør en enkelt 2,0 ml behandling af enten 20% DMSO iH2O-kontroleller CFDA på DPI-enheden, og lad den optage i 24 timer. For at følge denne protokol skal du forberede den fungerende CFDA-opløsning ved at tilsætte 1,6 ml H 2 O til 400 μL CFDA-stamopløsning (stamopløsningen indeholder 10 mM CFDA opløst i 100% dimethylsulfoxid [DMSO]) for at generere en endelig CFDA-koncentration på2mM og 20% DMSO.
- Lav tværsnit af forskellige væv i planten, og brug et stereoskop eller sammensat mikroskop med et fluorescerende filter, der inkluderer 498 nm bølgelængden til at visualisere CFDA i plantevævene. Sammenlign billederne med 20% DMSO i H2O-kontrollerne for at tage højde for autofluorescens i vævet.
8. Måling af ændringer i CLas-titeren i bladprøver efter streptomycinbehandling
- Brug 0,75 m høje drivhusdyrkede CLas-inficerede Valencia (Citrus sinensis (L.) Osbeck "Valencia") planter til at samle petiole og midrib af to HLB symptomatiske blade fra hver plante, hugge dem i små sektioner, samle hver vævstype og opbevare dem separat i 2 ml slagfaste prøverør indeholdende en stålkugle på 6,35 mm i diameter.
- Slib prøven ved hjælp af en homogenisator, der er programmeret til to 15 s cyklusser ved 3,4 m / s. Den totale nukleinsyre ekstraheres som beskrevet tidligere19.
- Der udføres qPCR på de CLas-inficerede bladprøver ved hjælp af qPCR-blandingen, der er defineret i tabel 1 , og reaktionsbetingelserne defineret i tabel 2. Brug planter, der viser robuste CLas-infektioner (robust infektion defineres generelt som qPCR-baserede Ct-værdier < 30 for CLas 16S LasLong (LL) primersæt) til yderligere analyse.
BEMÆRK: Bakterietiteren estimeres ved hjælp af CLas 16S Las Long (LL) og citrus dehydrin DNA-primere til at estimere de relative genomækvivalenter, som beskrevet tidligere20. - Udstyr citrusplanterne, der opfylder den mindste infektiontiter, der er beskrevet ovenfor, med DPI-enheder, og udsæt dem for en engangsbehandling af 2,0 ml af entenH2O-opløsningeller streptomycinopløsning ved den ønskede koncentration. For at følge denne undersøgelse skal du bruge en enkelt 2,0 ml behandling af 9,5 mg / ml (19 mg i alt) streptomycin opløst i H2O.
- Saml bladprøver 7 dage, 14 dage og 28 dage efter behandlingen. Assay de samplede blade til CLas-titeren ved hjælp af samme protokol som beskrevet ovenfor.
- 60 dage efter behandlingen tages der fotografier af planterne behandlet med H2O eller streptomycin. Brug visuelle observationer af CLas-infektionen til at score infektionens sværhedsgrad. Se efter <50% af bladene, der viser interveinal klorose og venekorkning sammen med bladskyllevækst som tegn på mild infektion og mere end 50% af bladene med interveinal klorose og venekorkning samt bladabscission og hæmning af plantevæksten som tegn på mere alvorlige infektioner.
9. Måling af dødeligheden af D. citri efter behandling med imidacloprid
- Beskær 0,5 m høje citronplanter (Citrus medica L.) til en højde på 12 cm for at fremme væksten af nye flush.
BEMÆRK: Hastigheden af skyllevækst kan afhænge af plantesundheden og årstiden; Så tag dette i betragtning under eksperimentelt design. - Efter >6 flush, 1-2 cm i længden, har udviklet sig, introducer planterne i bur indeholdende voksen D. citri. Lad planterne stå i burene i 24 timer for at muliggøre afsætning af æg.
- Udfør repræsentative ægtællinger på tre flushskud 1-2 dage efter lægning, og anvend derefter DPI-enhederne. Fyld disse enheder med 2,0 ml enten en vandkontrol eller den ønskede koncentration af imidacloprid (21,8% aktiv ingrediens). For at følge denne protokol skal du bruge 528 μL / L, 52,8 μL / L og 5,28 μL / L imidacloprid.
BEMÆRK: Ægtællinger er en destruktiv foranstaltning, så tællingerne på dette stadium bruges til at estimere antallet af æg på den ikke-tællede skylning af den samme plante og hjælpe med at give en baseline for de efterfølgende nymfefremkomsttællinger, der udføres i slutningen af eksperimentet. - Saml D. citri fremspiringshastigheden på mindst tre af de resterende flush skud. Få repræsentative plantefotografier 7 dage efter sammensat introduktion.
Representative Results
Komponenter til direkte infusionsanordning
Basisversionen af enheden til direkte infusion er 8 cm høj og 3,3 cm bred foran og på siden (figur 1A). Den indeholder et enkelt centralt reservoir, der støder op til tuden, og det samlede volumen, der kan være indeholdt i disse komponenter, er 2,0 ml (figur 1D). Plaskisolringen er 1,8 cm høj og har en diameter på 2,7 cm (figur 1C). Denne ring indeholder også to kanaler: en til at rumme DPI-enhedens tud og en anden med variabel diameter, der passer rundt om stammen af træet, der behandles. Derudover er der en rille omkring den lodrette kanal for at lede overskydende behandling til at omgive træet, hvilket giver mulighed for yderligere sammensat optagelse gennem barken (figur 1F). Når den er monteret korrekt, skal plastisolringen flugte mod DPI-enheden, og tuden skal flugte med hullet boret i træet (figur 1B og figur 1E).
CFDA
For at undersøge effektiviteten af DPI-enheden til introduktion af eksogene kemikalier i citrusplanter blev 2,0 ml 2 mM CFDA infiltreret ved hjælp af enheden. Et fluorescenssignal blev detekteret i vaskulaturen af den behandlede plante (figur 2A), men var fraværende i kontrolanlæggene behandlet med 20% DMSO i H2O (figur 2B). Dette signal blev observeret i alle de dissekerede plantevævstyper, herunder bladmesofyl, petiole vaskulatur, stængelvaskulatur og rodvaskulatur (figur 2C). Dette signal blev observeret i planten inden for 24 timer efter behandlingen og blev fordelt relativt jævnt i vævene.
Streptomycin
For at teste, om de indførte forbindelser havde en terapeutisk virkning på HLB-sygdommen, blev 2,0 ml af en bakteriedræbende forbindelse, streptomycin, indført i CLas-positive Valencia (Citrus sinensis) søde appelsinplanter i en koncentration på 9,5 mg / ml (19 mg i alt). Disse planter blev opretholdt i drivhuspotter, og CLas-titeren (målt ved CLas-genomækvivalenter pr. Citrusgenomækvivalenter) blev overvåget over tid ved hjælp af qPCR (figur 3A). De oprindelige gennemsnitlige DNA CLas-titere for streptomycin- og H2O-behandlede planter var henholdsvis 0,562 CLas-genom/citrusgenom og 0,49 CLas-genom/citrusgenom. Reduktioner i den gennemsnitlige bakterietiter blev påvist ved qPCR 7-28 dage efter streptomycinbehandling sammenlignet medH2O-kontrollernepå samme tidspunkt. Desuden var forskellen mellem tiden 0 og dag 28 gennemsnitlige bakterietitere 0,314 og 0,117 for henholdsvis streptomycinbehandlede planter ogH2O-behandlede planter.
Dette eksperiment var designet til at måle plantens respons på forskellige behandlinger over forskellige tidsperioder. Et tofaktors kvadratisk responsoverfladedesign blev anvendt, hvor tiden blev behandlet som en kvantitativ diskret faktor med fire niveauer (0 dage, 7 dage, 14 dage og 28 dage) og behandling som en kategorisk faktor med to niveauer(H2Oog streptomycin). Der blev anvendt fem replikater til hver af de otte behandlingskombinationer, og CLas-titeren blev målt som responsvariablen. Dataene blev transformeret ved hjælp af log10 baseret på en Box-Cox-plotanalyse. Modelreduktion blev udført ved fremadrettet udvælgelse ved hjælp af Akaikes informationskriterium (AICc)21, hvilket resulterede i fjernelse af både tids- og interaktionseffekter. Den resterende faktor, behandlingen, var signifikant (p = 0,0252), idet streptomycinbehandlede planter viste en lavere gennemsnitlig CLas-titer (0,349) end deH2O-behandlede planter (0,496) over alle tidspunkter tilsammen (figur 3B). Denne reduktion i CLas-titer svarede til lejlighedsvise stigninger i ny sund skyllevækst efter 60 dage i de streptomycinbehandlede planter, som det fremgår af fotografier af repræsentative træer behandlet medH2O(figur 3C) versus 19 mg streptomycin (figur 3D).
Imidacloprid
Imidacloprid blev introduceret i unge asiatiske citruspsyllid (ACP) -inficerede citronplanter ved hjælp af DPI-enheden for at teste dets potentiale som et D. citri insekticidscreeningsassay. En enkelt 2,0 ml behandling af en kommerciel imidacloprid insekticidopløsning blev testet ved tre forskellige koncentrationer (5,28 μL / L, 52,8 μL / L og 528 μL / L) sammen med en vandkontrol. Det gennemsnitlige samlede ægtal pr. tre skylleskud før behandlingen varierede fra 280,5 til 321, og der var ingen signifikante forskelle mellem de planter, der skulle bruges til hver behandlingsgruppe (figur 4A). De gennemsnitlige samlede overlevende nymfer på tre flush skud 7 dage efter behandlingen var henholdsvis 293,75, 268, 97,5 og 2 for vandkontrollen og 5,28 μL / L, 52,8 μL / L og 528 μL / L imidacloprid opløsninger (figur 4B). Dette repræsenterede en signifikant reduktion i psyllidnymfefremkomst ved 52,8 μL / L (p = 0,029) og 528 μL / L (p = 0,002) imidaclopridopløsningsniveauer sammenlignet med vandkontrollen ifølge en envejs ANOVA efterfulgt af en Tukeys post-hoc-analyse. Derudover var denne stigning i psyllidnymfedødeligheden ved det højeste imidaclopridopløsningsniveau visuelt tydelig ved reduktionen i nymfehonningdugproduktionen på de imidaclopridbehandlede linjer (figur 4D) sammenlignet med vandkontrollen (figur 4C).
Figur 1: Den direkte planteinfusionsanordning og plastisolringen. (A) Den intakte direkte planteinfusionsanordning og (C) plastisolring sammen med deres dimensioner. B) Den direkte planteinfusionsanordning og plastisolring, der er forbundet og fastgjort til et citrustræ. Lodrette tværsnit af (D) direkte planteinfusionsanordninger, (F) plastisolring og (E) disse to komponenter forbundet og fastgjort til et citrustræ. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Tværsnit af bladmidribben på en 25 cm citrusplante. Billeder, der viser 24 timer efter behandling med (A) 2 mM CFDA eller (B) 20% DMSO i H2O ved hjælp af den direkte planteinfusionsanordning. C) Tværsnit af forskelligt plantevæv 24 timer efter 2 mM CFDA-behandling, herunder stammen 5 cm over den direkte planteinfusionsanordning (øverst til venstre), stammen 5 cm under den direkte planteinfusionsanordning (midten til venstre), roden (nederst til venstre), bladmidribben (øverst til højre), bladbladet (midterste højre) og bladmesofyl (nederst til højre). Skalastænger = 1 mm. Forkortelser: CFDA = 5,6-carboxyfluorescein-diacetat; DMSO = dimethylsulfoxid. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Overvågning af CLas-titeren (målt ved CLas-genomækvivalenter pr. citrusgenomækvivalent) over tid ved hjælp af qPCR. (A) Tidsforløb, der viser ændringer i CLas-DNA-titeren, der sammenligner de fem planter, der er behandlet med 19 mg streptomycin, med de fem planter, der er behandlet med enH2O-kontrol. Pointene repræsenterer gennemsnittet for en given behandling på et givet tidspunkt. Fejlbjælkerne repræsenterer standardfejlen i middelværdien. B) Søjlediagram, der viser den gennemsnitlige CLas-titer for O- og streptomycinbehandlede planter på tværs af alle tidspunkter. Fejlbjælkerne repræsenterer 95% konfidensintervallet, og stjernerne angiver signifikante forskelle (* = p < 0,05) mellem de gennemsnitlige CLas-titere for streptomycin- ogH2O-behandlede planter ifølge en envejs ANOVA. (C) Repræsentative billeder af citrusplanter 0 måneder og 2 måneder efter direkte planteinfusionsbehandling med enten (C)H2O- eller (D) streptomycin. Planterne behandlet med streptomycin viser ny lysegrøn bladskyllevækst efter 2 måneder, hvilket tyder på en reduktion i CLas-titeren. Forkortelse: CLas = Candidatus Liberibacter asiaticus. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Overvågning af psyllidnymfedødeligheden i unge ACP-inficerede citronplanter. Søjlediagrammer, der viser (A) det estimerede indledende ægtal og (B) de overlevende D. citri nymfer på tre citrusskyl 7 dage efter behandling med vandkontrol og forskellige fortyndinger af imidacloprid. Fejlbjælkerne repræsenterer standardfejlen for middelværdien, og stjernerne angiver signifikante forskelle (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) mellem et givet behandlingsniveau og vandkontrollen i henhold til en envejs ANOVA efterfulgt af en Tukeys post-hoc-analyse. Billeder af D. citri nymfe-inficeret citrusskylning 7 dage efter behandling med enten (C) vandkontrollen eller (D) 528 μL/L imidacloprid ved hjælp af den direkte planteinfusionsanordning. Forkortelser: ACP = asiatisk citruspsyllid; D. citri = Diaphorina citri Kuwayama. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Volumen pr. prøve (μL) | Komponent | |||||
| 12.5 | 2x GoTaq qPCR med BRYT Green Dye Master Mix | |||||
| 5 | DNA-skabelon (20 ng/μL) | |||||
| 0.5 | 10 μM Primer F og R til CLas | CLAS: CTTACCAGCCCTTGACATGTATAGG (fremad); TCCCTATAAAGTACCCAACATCTAGGTAAA (Baglæns) |
||||
| 0.5 | 10 μM Primer F og R til citrus husholdning | Citrus dehydrin: TGAGTACGAGCCGAGTGTTG (fremad); AAAACTTCACCGATCCACCAG (baglæns) |
||||
| 6.5 | H2O | |||||
Tabel 1: qPCR-blandingen, der anvendes til at kvantificere CLas-titeren i streptomycinbehandlede citruslinjer. Sekvensen af 16S Las Long-primere og citrusdehydrinprimere til CLas DNA-kvantificering og citrus-DNA-kvantificering vises.
| Skridt | Temperatur (°C) | Tidspunkt | |
| 1 | Indledende denaturering | 95 | 2 minutter |
| 2 | Denaturering | 95 | 15 sek |
| 3 | Udglødning | 60 | 20 sek. |
| 4 | Forlængelse | 72 | 20 sek. |
| 5 | Gå til trin 2, gentag 39x | ||
| 6 | Smeltekurve | 60 ramping til 95 ved 0,2 °C/s | 3 minutter |
Tabel 2: Reaktionsbetingelser for qPCR anvendt til kvantificering af CLas-titeren i streptomycinbehandlede citruslinjer.
Supplerende figur S1: Billeder, der viser samlingsprocessen for formen for at generere plastisolringen. (A) Sammenklappelige plastblokke blev brugt til at generere det første lag af plastisolringformen. (B) Ensartet blandet opløsning indeholdende silikone RTV-gummi, katalysator, madfarve og sæbe. (C) Jævnt hældt første lag af plastisolringformen. (D) Billede af plastisolringmønstrene med midterste kernetryk øverst. (E) Plastisolringmønstre indsat i det uhærdede andet lag af formen. (F) Afdækningstape og gummihammer, der bruges til at fastgøre mønstrene, når det andet lag hærder. (G) Tredje lag af formen tilsættes, indtil den flugter med toppen af mønstrene. (H) Fjernelse af mønstrene fra formen. (I) Fuldt konstrueret plastisol ringform. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2: Billeder, der viser samleprocessen for plastisolringen i forbindelse med den direkte planteinfusionsanordning. (A) Plastisolringsamlingskomponenter, herunder formen, midterkernen med en O-ring og leveringskanalkernen. (B) Overtræk kernerne i non-stick spraymadolie for at lette fjernelsen af plastisolringen efter hærdning. (C) Indsætning af midterkernen og O-ringen i formen. (D) Indsæt leveringskanalkernen vinkelret på den midterste kerne. (E) Korrekt samling af plastisolringens kernekomponenter i formhulrummet. F) Plastisol, der anvendes til fremstilling af plastisolringen. (G) Opvarmning af plastisol i mikrobølgeovnen. (H) Omrøring af plastisol efter opvarmning. (I) Kontrol af plastisoltemperaturen. (J) Hæld den opvarmede plastisol i den samlede kerne. (K) Tillader afkøling af plastisol omkring den samlede kerne. (L) Fuldt monterede plastisolringe fastgjort til den direkte planteinfusionsanordninger. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S3: Billeder, der viser samleprocessen for den direkte planteinfusionsanordning. (A) Boring af et hul gennem midten af citrusplanten for at skabe en kanal til sammensat levering. B) Set forfra af det borede hul. (C) Skæring gennem plastisolringen med et barberblad modsat den sammensatte tilførselskanal. (D) Anbring plastisolringen tæt omkring stammen på stedet for det tidligere borede hul. (E) Montering af den direkte planteinfusionsanordning på plastisolringen med den sammensatte tilførselsspids på anordningen indsat i plastisolringens kanal. (F) Brug silikonetape til at fastgøre den direkte planteinfusionsanordning til plastisolringen og hold hele apparatet på plads. (G) Fyldning af kammeret med den direkte planteinfusionsanordning med den relevante forbindelse. (H) Brug en sprøjte til at trække luft fra det borede hul i planten og starte strømmen af forbindelsen. (I) Påføring af voksforseglingsfilm på åbningen i kammeret med direkte planteinfusionsanordning og stikning af et hul for at forhindre vakuum. J) Fuldt samlet infusionsanordning direkte til planten på en citrusplante. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 1: Plastisol ringens midterste stolpekerne . STL-fil til et 4 mm træ. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 2: Plastisol ringcenterstolpekernen . STL-fil til et 6 mm træ. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 3: Plastisol ringens midterste stolpekerne. STL-fil til et 8 mm træ. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 4: Plastisol ringens midterste stolpekerne . STL-fil til et 10 mm træ. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 5: Plastisol ringens midterste stolpekerne. STL-fil til et 12 mm træ. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 6: Plastisol ringens midterstolpekerne . STL-fil til et 14 mm træ. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 7: Plastisolringens leveringskanalkerne . STL-fil til et 4 mm træ. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 8: Plastisolringens leveringskanalkerne . STL-fil til et 6 mm træ. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 9: Plastisolringens leveringskanalkerne . STL-fil til et 8 mm træ. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 10: Plastisolringens leveringskanalkerne . STL-fil til et 10 mm træ. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 11: Plastisolringens leveringskanalkerne . STL-fil til et 12 mm træ. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 12: Plastisolringens leveringskanalkerne . STL-fil til et 14 mm træ. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 13: Den direkte planteinfusionsanordning . STL-fil. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende fil 14: Det mønster, der bruges til at skabe formen til plastisolringen. STL-fil. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
For at DPI-enheden kan betragtes som en levedygtig metode til eksogen levering af forbindelser til planter, skal den bidrage til robust og konsistent stofoptagelse i en række vævstyper. Eksperimentet ved hjælp af CFDA viste tydeligt både acropetal og basipetal sammensat bevægelse såvel som i både vaskulærsystemet og mesofylcellerne i bladet. Derudover, og formodentlig fordi det borede hul, der anvendes i denne DPI-enhed, giver en stor mængde overfladeareal til sammensat optagelse, var CFDA til stede i relativt lige store mængder i alle sektioner af stammen, ikke kun i en lille delmængde af vaskulaturen ved siden af enheden, som det er set i tidligere farvestofoptagelsesundersøgelser i planter, der bruger trunkinjektion6. Derudover blev leveringen af grønt fluorescerende protein og blomsterfarvestof testet ved hjælp af DPI-enheden, og en fordeling af disse forbindelser svarende til CFDA blev observeret (data ikke vist). Disse data tyder på, at enheden kan bruges til systemisk at levere en række forbindelser, der varierer i størrelse og molekylær struktur. Det er dog værd at bemærke, at der var forskelle i den sammensatte optagelse baseret på bladudviklingsstadiet, hvor yngre udviklende blade optager mere sammensatte end ældre etablerede blade. Dette kan skyldes ændringerne i vaskens egenskaber i vasken versus kildevævet og bør optimeres til et givet eksperiment.
DPI-enheden viste tilstrækkelig sammensat optagelse til visualisering af CFDA, GFP og blomsterfarvestof, og det tog også nok op til at vise de antibakterielle og insekticide virkninger af henholdsvis streptomycin og imidacloprid. Begge disse forbindelser resulterede i ændringer i målorganismens levedygtighed 1 uge efter en enkelt 2,0 ml behandling. Disse data tyder på, at DPI-enheden kan anvendes i analyser af hele planter til at teste levedygtigheden af en lang række forbindelser til bekæmpelse af mikrobielle og skadedyr. På grund af sin direkte kontakt med vaskulærsystemet kan denne enhed endda give mulighed for at teste forbindelser, der ikke effektivt optages af rødderne eller epidermale celler. Af særlig interesse ville være RNA-interferens (RNAi), da dette kunne bruges til at modulere genekspressionen i værtsplanten, patogenet eller patogenvektoren. Tidligere forskning, der introducerede hårnåle-RNA gennem et boret hul i stammen af æble- og drueplanter, viste, at RNA-molekylerne var begrænset til xylemvævet, hvilket tyder på, at disse molekyler kun kan være effektive mod tygge- og xylemsaftfødende organismer22. I betragtning af at DPI-enheden bruger et lignende leveringssystem til borede huller, er det indlysende, at hårnåle-RNA, der leveres med denne enhed, også kan være begrænset til xylemvævet. Det observerede fald i titeren af den floembegrænsede CLas efter streptomycinbehandling fra DPI-enheden tyder imidlertid stærkt på, at dette antibiotikum var til stede i floem. Derfor er det sandsynligt, at den vaskulære fordeling af de forbindelser, der leveres ved hjælp af DPI-enheden, afhænger af deres størrelse og kemi, og hvert molekyle skal evalueres individuelt.
Selvom der findes en række kommercielt tilgængelige DPI-enheder på markedet, kan den enhed, der beskrives her, fremstilles internt og kan ændres. På denne måde kan forbedringer og ændringer i størrelse foretages baseret på den planteart og det eksperimentelle design, der anvendes, og det er ikke afhængigt af kommercielle produkter. Derudover er enheden semi-permanent fastgjort til planten, hvilket betyder, at flere behandlinger af en given forbindelse kan udføres samtidigt uden at skulle skade planten igen med flere sammensatte injektioner. På en advarsel kan enheden lække, hvis den ikke er installeret korrekt. Som følge heraf går forbindelsen tabt for miljøet i stedet for at blive leveret til anlægget. Derfor skal man sørge for at inspicere enheden for tegn på lækage under opsætningen og de første par dage bagefter. Selvom boring af et hul i træet er potentielt skadeligt, blev denne metode valgt for at sikre robust og ensartet stofoptagelse. Derudover blev der ikke set nogen negative virkninger på plantesundheden fra fastgørelsen af DPI-enheden i disse forsøg. Imidlertid bør ekstra planter inkluderes i forsøgsdesignet for at erstatte dem, der kan miste kraft i løbet af et givet forsøg. Endelig, da denne enhed bruger passiv strømning til at introducere forbindelser, kan det være vanskeligt at forudsige optagelseshastigheden på tværs af forskellige plantearter eller udviklingsstadier af den samme art. Dette kan komplicere eksperimenter, hvis hastigheden af optagelsen af forbindelser er en begrænsende faktor. For de bedste resultater skal eksperimenter planlægges, så der gives tilstrækkelig tid til, at planten fuldt ud absorberer 2,5 ml forbindelse, hvilket kan tage op til 1 uge. Afslutningsvis er denne DPI-enhed et effektivt værktøj til hurtig evaluering af antimikrobielle eller insekticide forbindelsers in planta-aktivitet mod CLas og dens vektor, D. citri, hvilket giver mere information om den systemiske effektivitet og indflydelse på plantens ydeevne end den tidligere præsenterede løsrevne bladanalyse23. Uden tvivl når de mange forskellige applikationer til dette system langt ud over de specifikke anvendelser, der er beskrevet i denne undersøgelse.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter. Brugen af handels-, firma- eller selskabsnavne i denne publikation er til orientering og bekvemmelighed for læseren. En sådan anvendelse udgør ikke en officiel godkendelse eller godkendelse fra United States Department of Agriculture eller Agricultural Research Service af noget produkt eller nogen tjeneste med udelukkelse af andre, der måtte være egnede. Det amerikanske landbrugsministerium (USDA) forbyder diskrimination i alle sine programmer og aktiviteter på grundlag af race, farve, national oprindelse, alder, handicap og, hvor det er relevant, køn, civilstand, familiestatus, forældrestatus, religion, seksuel orientering, genetisk information, politisk overbevisning, repressalier, eller fordi hele eller en del af en persons indkomst stammer fra ethvert offentligt bistandsprogram. Ikke alle forbudte baser gælder for alle programmer. Personer med handicap, der har brug for alternative midler til kommunikation af programinformation (blindskrift, stor skrift, lydbånd osv.), Skal kontakte USDA's TARGET Center på (202) 720-2600 (stemme og TDD). For at indgive en klage over diskrimination skal du skrive til USDA, direktør, Office of Civil Rights, 1400 Independence Avenue, S.W., Washington, DC 20250-9410, eller ring (800) 795-3272 (stemme) eller (202) 720-6382 (TDD). USDA er en udbyder og arbejdsgiver med lige muligheder.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Mant Acon for de planter, der anvendes i denne undersøgelse. Finansieringen blev ydet af US Department of Agriculture (USDA) CRIS-projekt 8062-22410-007-000-D og USDA NIFA-tilskud 2020-70029-33176.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 cm Diameter Steel Balls | Ballistic Products Inc. | #SHT #T | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | Becton Dickinson | 382903029952 | |
| 20 G 1 Syringe Needle | Becton Dickinson | 305175 | |
| 2 mL Screw Cap Tubes | USA Scientific | 1420-9710 | |
| 3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964077 | |
| 3D Printer | Markforged | F-PR-2027 | |
| 3D Printing Software | Markforged | F-SW-FDVX | |
| 3D Printing Software | Markforged | S-FW-OEVX | |
| 5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C195 | |
| 5/64th Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964502 | |
| 96 Well qPCR Machine | Roche | 5815916001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22621408 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | SP-BX43-BI | |
| Fluorescent Microscope Filter | Chroma | 69401-ET | |
| Gloss Clear Spray Paint | Rustoleum | 249117 | |
| Grey Lego Baseplate | Lego | 11024 | |
| Handheld Cordless Drill | Makita | 6349D | |
| Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | |
| Imidacloprid 2F | Quali-Pro | 83080133 | |
| Liquid Plastisol Medium Hardness | Fusion X Fishing Lures | XSOL-505 | |
| Red Silicone 70 Shore A O-Ring | Grainger | Varies by Size | |
| Non-Stick Cooking Spray | PAM | 64144030217 | |
| NucleoSpin Plant II | Macherey-Nagel | 740770.5 | |
| Parafilm | Bemis | HS234526A | |
| Poly Viyl Acetate Based Glue | Elmers | E301 | |
| qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
| qPCR Primers | Integrated DNA Technologies | Varies by DNA sequence | |
| Reverse Transcriptase | Promega | A5003 | |
| Single Edge Razor Blade | Garvey | 40475 | |
| Translucent Silicone RTV Rubber | Aero Marine Products | AM 115T | |
| Transparent Silicone Tape | Maxwell | KE30S | |
| Truncated Oncocin 112 | Genscript | Varies by peptide sequence | |
| White 1 x 6 Lego Piece | Lego | 300901 | |
| White Nylon | Markforged | F-MF-0003 |
References
- Hu, J., Wang, N. Evaluation of the spatiotemporal dynamics of oxytetracycline and its control effect against citrus huanglongbing via trunk injection. Phytopathology. 106 (12), 1495-1503 (2016).
- Bendix, C., Lewis, J. D. The enemy within: Phloem-limited pathogens. Molecular Plant Pathology. 19 (1), 238-254 (2018).
- Keshavareddy, G., Kumar, A. R. V., Ramu, V. S. Methods of plant transformation- A review. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (7), 2656-2668 (2018).
- Qaim, M. Role of new plant breeding technologies for food security and sustainable agricultural development. Applied Economics Perspectives and Policy. 42 (2), 129-150 (2020).
- Siegrist, M., Hartmann, C. Consumer acceptance of novel food technologies. Nature Food. 1 (6), 343-350 (2020).
- Larson, D. W., Doubt, J., Matthes-Sears, U. Radially sectored hydraulic pathways in the xylem of Thuja occidentalis as revealed by the use of dyes. International Journal of Plant Sciences. 155 (5), 569-582 (1994).
- Mehdi, R., et al. Symplasmic phloem unloading and radial post-phloem transport via vascular rays in tuberous roots of Manihot esculenta. Journal of Experimental Botany. 70 (20), 5559-5573 (2019).
- Miller, G. S., Parente, R. M., Santra, S., Gesquiere, A. J. Tracking of fluorescent antibiotic conjugate in planta utilizing fluorescence lifetime imaging. Planta. 253 (2), (2021).
- Treydte, K., Lehmann, M. M., Wyczesany, T., Pfautsch, S. Radial and axial water movement in adult trees recorded by stable isotope tracing. Tree Physiology. 41 (12), 2248-2261 (2021).
- Nie, P. Liping Hu, Haiyan Zhang, Jixiang Zhang, Zhenxian Zhang, Lingyun Zhang, The predominance of the apoplasmic phloem-unloading pathway is interrupted by a symplasmic pathway during Chinese jujube fruit development. Plant and Cell Physiology. 51 (6), 1007-1018 (2010).
- Jiang, M., Deng, Z., White, R. G., Jin, T., Liang, D. Shootward movement of CFDA tracer loaded in the bottom sink tissues of Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59606 (2019).
- Liu, H., Si, C., Shi, C., Wang, S. Zhe Sun, Yanxi Shi, from apoplasmic to symplasmic phloem unloading during storage roots formation and bulking of sweet potato. Crop Science. 59 (2), 675-683 (2019).
- Erdos, T., Ullmann, A. Effect of streptomycin on the incorporation of amino-acids labeled with carbon-14 into ribonucleic acid and protein in a cell-free system of a Mycobacterium. Nature. 183 (4661), 618-619 (1959).
- Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Motaung, T. E. Chloronicotinyl insecticide imidacloprid: Agricultural relevance, pitfalls and emerging opportunities. Crop Protection. 131, 105097 (2020).
- Berger, C., Laurent, F. Trunk injection of plant protection products to protect trees from pests and diseases. Crop Protection. 124, 104831 (2019).
- Archer, L., Crane, J. H., Albrecht, U. Trunk injection as a tool to deliver plant protection materials-An overview of basic principles and practical considerations. Horticulturae. 6 (6), 552 (2022).
- Wise, J. C., et al. Trunk injection: A discriminating delivering system for horticulture crop IPM. Entomology, Ornithology & Herpetology: Current Research. 03 (2), (2014).
- Ammar, E. D., George, J., Sturgeon, K., Stelinski, L. L., Shatters, R. G. Asian citrus psyllid adults inoculate Huanglongbing bacterium more efficiently than nymphs when this bacterium is acquired by early instar nymphs. Scientific Reports. 10 (1), 18244 (2020).
- Stover, E., Mccollum, G., Ramos, J., Shatters, R. G. Growth, health and Liberibacter asiaticus titer in diverse citrus scions on mandarin versus trifoliate hybrid rootstocks in a field planting with severe Huanglongbing. Proceedings of the Florida State Horticultural Society. 127, 53-59 (2014).
- Akaike, H. A new look at the statistical model identification. IEEE Transactions on Automatic Control. 19 (6), 716-723 (1974).
- Dalakouras, A., Jarausch, W., Buchholz, G., Bassler, A., Braun, M., Manthey, T., Krczal, G., Wassenegger, M. Delivery of hairpin RNAs and small RNAs into woods and herbaceous plants by trunk injection and petiole absorption. Frontiers in Plant Science. 9, 1253 (2018).
- Ammar, E. D., Walter, A. J., Hall, D. G. New excised-leaf assay method to test inoculativity of Asian citrus psyllid (Hemiptera: Psyllidae) with Candidatus Liberibacter asiaticus associated with citrus Huanglongbing disease. Journal of Economic Entomology. 106 (1), 25-35 (2013).
