Summary
Dette manuskriptet beskriver en ny direkte planteinfusjonsanordning for screening av molekylers effektivitet mot bakteriene (Candidatus Liberibacter asiaticus) eller dens insektvektor (Diaphorina citri, Kuwayama) som i kombinasjon er assosiert med Huanglongbing sitrussykdom.
Abstract
Testing av funksjonen av terapeutiske forbindelser i planter er en viktig del av landbruksforskningen. Blad- og jorddrenchmetoder er rutinemessige, men har ulemper, inkludert variabelt opptak og miljømessig nedbrytning av testede molekyler. Stammeinjeksjon av trær er veletablert, men de fleste metoder for dette krever dyrt, proprietært utstyr. For å skjerme ulike behandlinger for Huanglongbing, er det nødvendig med en enkel, billig metode for å levere disse forbindelsene til det vaskulære vevet av små drivhusdyrkede sitrustrær infisert med den floembegrensede bakterien Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas) eller infisert med floemmatende CLas insektvektor Diaphorina citri Kuwayama (D. citri).
For å oppfylle disse screeningkravene ble det designet en direkte planteinfusjonsenhet (DPI) som kobles til plantens bagasjerom. Enheten er laget ved hjelp av et nylonbasert 3D-utskriftssystem og lett oppnåelige hjelpekomponenter. Den sammensatte opptakseffekten av denne enheten ble testet i sitrusplanter ved bruk av fluorescerende markør 5,6-karboksyfluorescein-diacetat. Ensartet sammensatt fordeling av markøren gjennom plantene ble rutinemessig observert.
Videre ble denne enheten brukt til å levere antimikrobielle og insekticide molekyler for å bestemme deres effekter på henholdsvis CLas og D. citri. Aminoglykosidantibiotikumet streptomycin ble levert til CLas-infiserte sitrusplanter ved hjelp av enheten, noe som resulterte i en reduksjon i CLas-titeren fra 2 uker til 4 uker etter behandling. Levering av neonicotinoid insekticid imidakloprid i D. citri-infiserte sitrusplanter resulterte i en signifikant økning i psyllid dødelighet etter 7 dager. Disse resultatene tyder på at denne DPI-enheten representerer et nyttig system for å levere molekyler til planter for testing og lette forsknings- og screeningsformål.
Introduction
Forvaltningen av planter i kommersielle og landskapsinnstillinger krever ofte bruk av kjemiske forbindelser for å optimalisere plantevekst og helse. Hvordan disse molekylene leveres avhenger av typen molekyl, molekylets funksjon, type plante og styringssystemet på plass. Blad- og jordapplikasjoner er de enkleste leveringsstrategiene, men begrensninger i opptaket av noen molekyler krever direkte levering. Et eksempel på disse molekylene er terapeutiske molekyler som fungerer best når de beveger seg systemisk i planten, men kan ikke effektivt leveres ved enkle topiske applikasjoner1. Dette er tilfellet med Huanglongbing (HLB), også kalt sitrus greening sykdom. HLB er en sykdom assosiert med en floem-begrenset bakterie, Candidatus Liberibacter asiaticus (CLas), som ikke kan dyrkes utenfor planten, eller dens insektvektor, Diaphorina citri Kuwayama (D. citri)2.
Hvis de antatte terapeutiske molekylene er genprodukter, kan de testes ved å skape transgene planter som uttrykker disse forbindelsene. Transgen planteproduksjon kan imidlertid være tid- og ressurskrevende, er svært genotypeavhengig og kan hemmes ved geninaktivering3. I tillegg, selv om disse transgene viser lovende resultater, reduserer regulatoriske og offentlige oppfatningsbegrensninger sannsynligheten for deres kommersielle aksept 4,5. Den eksogene anvendelsen av forbindelser forenkler imidlertid testingen av biologiske og syntetiske molekyler fordi den ikke krever produksjon av stabile eller forbigående uttrykkende transgene planter, noe som reduserer tiden og ressursene for å teste et molekyls effekter. En metode for effektiv systemisk plantelevering av eksogene forbindelser kan brukes til et bredt spekter av forsknings- og screeningsformål.
En av disse applikasjonene er analysen av systemisk molekylbevegelse i plantens vaskulære system, som kan gjøres ved hjelp av sporbare markører, enten de er fluorescerende, synlige eller unike kjemiske isotoper 6,7,8,9. En vanlig brukt fluorescerende markør er 5,6-karboksyfluorescein-diacetat (CFDA), som er et membranpermeabelt fargestoff som nedbrytes av intracellulære esteraser til 5,6-karboksyfluorescein (CF) og deretter blir fluorescerende og membran-ugjennomtrengelig10. CFDA har blitt mye brukt til å overvåke floemtransport, synke og kildeforhold, og vaskulaturmønster i plantevev11,12.
I tillegg til disse markørene kan visse forbindelser direkte endre plantens fysiologi for å øke produktiviteten eller drepe planten når det gjelder herbicider. Både insektmidler og antimikrobielle forbindelser er et middel til å øke planteproduktiviteten, spesielt i nærvær av HLB. Et eksempel på et antimikrobielt molekyl som brukes til å kontrollere CLas er streptomycin. Streptomycin er et aminoglykosidantibiotikum som opprinnelig ble isolert fra Streptomyces griseus og har vist seg å hemme bakterievekst gjennom hemming av proteinbiosyntese13. Når det gjelder insektmidler, er hovedmålet for HLB-forskning D. citri, som overfører CLas fra tre til tre14. Til dette formål brukes neonicotinoider, som imidakloprid, ofte, da de er gullstandarden for å kontrollere15. Alle disse varierte bruksområdene er viktige aspekter ved dagens anleggsstyringsstrategier, og utviklingen av nye produkter er avhengig av effektive screeninganalyser.
En metode som brukes til innføring av forbindelser i treaktige planter, er direkte injeksjon i bagasjerommet. Det er designet en rekke systemer som varierer i behov for forborede injeksjonssteder, og disse systemene benytter enten trykkbasert injeksjon eller passiv strømning16. Selv om trykkbaserte systemer tillater rask innføring av en gitt forbindelse, må den potensielle fysiske skaden forårsaket av å tvinge væske gjennom blokkert eller embolisert vaskulatur vurderes17. Selv om blad- eller drenchapplikasjon av forbindelser er mindre tidkrevende å implementere, reduserer direkte planteinjeksjon avfall av forbindelsen av interesse på grunn av tap til luft eller jord, og kan også forlenge tiden som forbindelser er i aktiv tilstand ved å redusere eksponeringen for det ytre miljøet18. Begge disse aspektene er viktige for å bevare dyre reagenser og sikre konsistens mellom replikater i forskningsinnstillinger.
Denne studien beskriver design, konstruksjon og bruk av en innovativ direkte planteinfusjonsenhet (DPI), som kan brukes til å vurdere hvordan forbindelser av interesse påvirker en vertsplante. En standard 3D-skriver ble brukt til å produsere både selve enheten og flere komponenter knyttet til konstruksjonen. Denne interne konstruksjonsmetoden gjør det mulig for forskere å modifisere enhetens og enhetens komponenter basert på deres spesifikke eksperimentelle behov og reduserer avhengigheten av kommersielt tilgjengelige planteinjeksjonsenheter. Enhetsoppsettet er enkelt og effektivt, og alle hjelpekomponentene er lett tilgjengelige og rimelige. Selv om systemet ble designet for bruk med en rekke plantearter, gjelder eksemplene som presenteres her pottesitrusplanter. I tillegg viser denne studien at denne enheten er i stand til effektivt å levere flere typer forbindelser systemisk til unge sitrusplanter uten å forårsake dødelighet. De testede forbindelsene inkluderte CFDA, som ble brukt til å vurdere forbindelsesfordelingen i planten, og streptomycin og imidakloprid, som ble brukt til å verifisere at de antimikrobielle og insekticide effektene av disse forbindelsene ble observert når de ble levert via DPI.
Protocol
1. Produksjon av sitrusplanter for eksperimentell sammensatt injeksjon
- Forplante små potte sitrus trær fra enten rotte vegetative stiklinger eller frø. Dyrk pottesitruslinjene under en 16 t / 8 t lys / mørk daglengde og ved 28 ° C.
- Velg sitrusplanter av passende størrelse for forsøket. De beskrevne applikasjonene krevde at plantene skulle være mellom 12 cm og 100 cm i høyden med stammediametre på 4-14 mm. Hvis ny spylevekst er nødvendig, kutt plantene før forsøket.
2. Tredimensjonal utskrift av DPI-enheten og formkomponenter
- Påfør et tynt lag polyvinylacetatbasert lim på utskriftssengen.
- Legg nylonfilamentet i 3D-skriveren, og klargjør skriveren i henhold til produsentens instruksjoner. Importer ønsket . STL-fil (Tilleggsfil 1, Tilleggsfil 2, Tilleggsfil 3, Tilleggsfil 4, Tilleggsfil 5, Tilleggsfil 6, Tilleggsfil 7, Tilleggsfil 8, Tilleggsfil 9, Tilleggsfil 10, Tilleggsfil 11, Tilleggsfil 12, Tilleggsfil 13 og Tilleggsfil 14), konfigureres og starter utskriften.
- Fjern stykket fra utskriftssengen. Skyll det polyvinylacetatbaserte limet fra bunnen av den trykte komponenten med vann, og fjern eventuelle støttestrukturer.
- Spray DPI-komponenten med to strøk klar glansspraymaling.
3. Fabrikasjon av plastisolringformen
- Sett sammen en formform som er stor nok til å holde mønsterstykkene ved å bygge et rektangulært kabinett ved hjelp av sammenkneppede plastblokker på en base (tilleggsfigur S1A).
- Bland RTV silikonmonomeren og katalysatoren sammen i forholdet 10:1, og rør uten å introdusere bobler i 1 min. Farge ved å tilsette konditorfarge (3 dråper/25 ml silikonblanding) og håndsåpe (1 ml såpe/25 ml silikonblanding) (tilleggsfigur S1B).
- Hell et tynt lag silikon i formformen som er tilstrekkelig til å dekke bunnen helt. Tamp for å flate overflaten, og vent i 24 timer til silikonet stivner (tilleggsfigur S1C).
- Hell et andre lag silikon, som beskrevet ovenfor, som er dypt nok til å dekke kjernetrykket i senterhullet på mønsteret (synlig øverst i mønsteret i tilleggsfigur S1D). Sett mønsteret inn i den flytende silikonen med kjernetrykket i senterhullet vendt nedover. Forsikre deg om at ingen bobler er fanget og at mønstrene er godt separert og ikke berører (tilleggsfigur S1E).
- Fest mønstrene med enten en tung gjenstand og/eller tape for å forhindre at de flyter ut av silikonet mens det stivner. Vent i 24 timer til det nylig hellede laget stivner (tilleggsfigur S1F).
- Hell ytterligere lag silikon til nivået er flush med toppen av mønsteret. Vent 24 timer for å kurere (tilleggsfigur S1G).
- Demonter plastblokkene for å frigjøre formen. Fjern mønstrene (tilleggsfigur S1H). Inspiser formen for rifter eller deformiteter (tilleggsfigur S1I).
4. Støping av plastisolringene
- Belegg det indre av formen, alle kjernekomponentene og O-ringene med matolje (tilleggsfigur S2A, B). Plasser en O-ring rundt hakket i midten av senterstolpekjernen, og plasser kjernen i midthullet på plastisolringformen (tilleggsfigur S2C).
- Sett tilførselskanalkjernen inn i hullet på siden av plastisolringsformen. Orienter den V-formede spissen på enden av kjernen i leveringskanalen slik at den justeres med O-ringen på den midtre stolpekjernen (tilleggsfigur S2D,E).
- Varm plastisol i mikrobølgeovnen for korte 10 s utbrudd (tilleggsfigur S2F, G). Rør plastisol forsiktig for å unngå bobler (tilleggsfigur S2H). Gjenta oppvarmingen og omrøringen til oppløsningen når en temperatur mellom 160 °C og 170 °C (tilleggsfigur S2I).
FORSIKTIG: Overoppheting av plastisol kan føre til frigjøring av giftige røyk. Utfør prosedyren i et godt ventilert område eller avtrekkshette. Plastisol skal ikke varmes opp over 170 °C. - Hell den smeltede plastisolen i plastisolringformen nær ytterkanten av formen uten å introdusere bobler (tilleggsfigur S2J). Vent 1 time til plastisolringene er avkjølt (tilleggsfigur S2K). Fjern ringene fra formen. Sørg for riktig tilpasning til DPI-enheten før bruk i eksperimentelle analyser (tilleggsfigur S2L).
5. Festing av DPI-enheten til anlegget
- Finn et jevnt, sunt sted på bagasjerommet for enhetsvedlegget. Unngå støt eller knuter, da disse kan bidra til enhetslekkasje.
- Bruk et bor med diameter på 2 mm til å bore et hull horisontalt gjennom midten av stammen i 90° vinkel med stammens overflate (tilleggsfigur S3A). Kjør borkronen gjennom hullet flere ganger for å rengjøre og glatte den for å skape et uhindret hull (tilleggsfigur S3B).
- Lag en vertikal skive i plastisolringen på motsatt side av den sammensatte leveringskanalen (tilleggsfigur S3C). Monter ringen rundt anlegget, og still leveringskanalen opp med det tidligere borede hullet (tilleggsfigur S3D).
NOTAT: Ringen må passe tett rundt bagasjerommet for å unngå lekkasjer; Kjerneaggregater med forskjellige diametre kan brukes til å lage plastisolringer for plantestengler av forskjellig størrelse. - Legg DPI-enheten til plastisolringen, slik at de passer tett sammen. Juster DPI-enhetens tut med plastisolringens leveringskanal og borede hull (tilleggsfigur S3E).
MERK: Bruk av en borekrone for å stille opp hullet og DPI-enhetens tut kan være nyttig. - Pakk godt inn med silikontape for å holde apparatet på plass (tilleggsfigur S3F). Inspiser den fullt monterte og tilkoblede enheten for å sikre riktig justering og orientering på anlegget.
6. Bruk av sammensatte renter ved hjelp av DPI-enheten
- Bruk en sprøyte eller pipette til å fylle DPI-enheten med løsningen av interesse (tilleggsfigur S3G). Bruk en sprøyte for å trenge inn i silikonbåndet og plastisolringen på motsatt side av DPI-enheten for å trekke luft ut av den indre kanalen og unngå innføring av luftbobler i plantevaskulaturen (tilleggsfigur S3H). Sett ut ekstrahert forbindelse tilbake til DPI-enheten.
- Legg en ekstra liten med silikontape over hullet som sprøyten lager for å forsterke området og forhindre rifter. Inspiser apparatet for synlige lekkasjer ved festepunktet, og inspiser enhetsbeholderen for et stabilt væskenivå.
MERK: Vann kan først brukes til å teste for lekkasjer for å unngå sløsing med testløsningen. - Dekk den åpne enden av DPI-enheten med voksforseglingsfilm, og trekk ned for å danne en tetning og redusere fordampningen av den eksperimentelle forbindelsen. Stikk et enkelt hull i voksfilmen med en sprøytespiss for å forhindre utvikling av vakuum, og fyll deretter på enheten (tilleggsfigur S3I).
- Kontroller apparatet daglig for å sikre riktig justering av komponentene (tilleggsfigur S3J), og fyll på væsken med en sprøyte for å unngå at reservoaret går tørt. Gjenta denne prosessen til ønsket mengde eksperimentell løsning er introdusert.
MERK: Forbindelser kan innføres fra en gitt enhet i opptil 1 måned. Løsningsopptaksvarigheter som overskrider denne tidsrammen, bør testes empirisk før det eksperimentelle oppsettet.
7. Bruk av CFDA for å observere vaskulær bevegelse med sitrusplanter
- Fest DPI-enheten til 25 cm høye citron (Citrus medica L.) planter, bruk en enkelt 2,0 ml behandling av enten 20% DMSO i H2O kontroll eller CFDA til DPI-enheten, og la den ta opp i 24 timer. For å følge denne protokollen, forbered den fungerende CFDA-løsningen ved å legge til 1,6 ml H 2 O til 400 μL CFDA-lagerløsning (stamløsningen inneholder 10 mM CFDA oppløst i 100% dimetylsulfoksid [DMSO]) for å generere en endelig CFDA-konsentrasjon på2mM og 20% DMSO.
- Lag tverrsnitt av forskjellige vev i planten, og bruk et stereoskop eller sammensatt mikroskop med et fluorescerende filter som inkluderer 498 nm bølgelengde for å visualisere CFDA i plantevevet. Sammenlign bildene med 20% DMSO i H2O kontroller for å ta hensyn til autofluorescens i vevet.
8. Måling av endringer i CLAS-titeren i bladprøver etter streptomycinbehandling
- Bruk 0,75 m høye drivhusdyrkede CLas-infiserte Valencia (Citrus sinensis (L.) Osbeck "Valencia") planter, samle petiole og midrib av to HLB symptomatiske blader fra hver plante, hogge dem i små seksjoner, samle hver vevstype og lagre dem separat i 2 ml slagfaste prøverør som inneholder en stålkule på 6,35 mm i diameter.
- Slip prøven ved hjelp av en homogenisator programmert for to 15 s sykluser ved 3,4 m / s. Trekk ut den totale nukleinsyren som beskrevet tidligere19.
- Utfør qPCR på de CLas-infiserte bladprøvene ved bruk av qPCR-blandingen definert i tabell 1 og reaksjonsbetingelsene definert i tabell 2. Bruk planter som viser robuste CLAS-infeksjoner (robust infeksjon er generelt definert som qPCR-baserte Ct-verdier < 30 for CLas 16S LasLong (LL) primersett) for videre analyse.
MERK: Den bakterielle titeren estimeres ved hjelp av CLas 16S Las Long (LL) og sitrus dehydrin DNA primere for å estimere de relative genomekvivalenter, som beskrevet tidligere20. - Utstyr sitrusplantene som oppfyller minimumsinfeksjonstiter som er skissert ovenfor med DPI-enheter, og utsett dem for en engangsbehandling på 2,0 ml av enten H2O-oppløsning eller streptomycinoppløsning ved ønsket konsentrasjon. For å følge denne studien, bruk en enkelt 2,0 ml behandling av 9,5 mg / ml (19 mg totalt) streptomycin oppløst i H2O.
- Samle bladprøver på 7 dager, 14 dager og 28 dager etter behandling. Analyser de samplede bladene for CLAS-titeren ved å bruke samme protokoll som beskrevet ovenfor.
- På 60 dager etter behandling, få fotografier av plantene behandlet med H2O eller streptomycin. Bruk visuelle observasjoner av CLAS-infeksjonen for å skåre infeksjonens alvorlighetsgrad. Se etter <50% av bladene som viser interveinal klorose og venekorking sammen med bladspylevekst som tegn på mild infeksjon og større enn 50% av bladene med interveinal klorose og venekorking samt bladabscission og stunting av planteveksten som tegn på mer alvorlige infeksjoner.
9. Måling av dødelighet av D. citri etter imidaklopridbehandling
- Beskjær 0,5 m høye citron (Citrus medica L.) planter til en høyde på 12 cm for å oppmuntre til vekst av ny flush.
MERK: Hastigheten på spyleveksten kan være avhengig av plantens helse og tid på året; Så ta hensyn til dette under eksperimentell design. - Etter >6 spyling, 1-2 cm i lengde, har utviklet seg, introdusere plantene i bur som inneholder voksen D. citri. La plantene ligge i burene i 24 timer for å tillate avsetning av egg.
- Utfør representative eggtellinger på tre spyleskudd 1-2 dager etter legging, og bruk deretter DPI-enhetene. Fyll disse enhetene med 2,0 ml av enten en vannkontroll eller ønsket konsentrasjon av imidakloprid (21,8% aktiv ingrediens). For å følge denne protokollen, bruk 528 μL / L, 52,8 μL / L og 5,28 μL / L imidakloprid.
MERK: Eggtellinger er et destruktivt tiltak, så tellingene på dette stadiet brukes til å estimere antall egg på den utelte flushen av samme plante og bidra til å gi en grunnlinje for de påfølgende nymfeoppkomsttellingene som utføres på slutten av forsøket. - Samle D. citri emergence rate på minst tre av de gjenværende spyleskuddene. Skaff representative plantefotografier 7 dager etter sammensatt introduksjon.
Representative Results
Komponenter i direkte infusjonsutstyr
Basisversjonen av direkte infusjonsutstyr er 8 cm høy og 3,3 cm bred foran og på siden (figur 1A). Den inneholder et enkelt sentralt reservoar som er sammenhengende med tuten, og det totale volumet som kan finnes i disse komponentene er 2,0 ml (figur 1D). Plastisolringen er 1,8 cm høy og har en diameter på 2,7 cm (figur 1C). Denne ringen inneholder også to kanaler: en for å imøtekomme DPI-enhetens tut og en annen med variabel diameter som passer rundt stammen på treet som behandles. I tillegg er det et spor rundt den vertikale kanalen for å lede overflødig behandling til å omgi treet, noe som muliggjør ytterligere sammensatt opptak gjennom barken (figur 1F). Når den er riktig montert, skal plastisolringen skylles mot DPI-enheten, og tuten skal være på linje med hullet som er boret i treet (figur 1B og figur 1E).
CFDA
For å undersøke effektiviteten til DPI-enheten for å introdusere eksogene kjemikalier i sitrusplanter, ble 2,0 ml 2 mM CFDA infiltrert ved hjelp av enheten. Fluorescenssignal ble påvist i vaskulaturen på den behandlede planten (figur 2A), men manglet i kontrollanleggene behandlet med 20 % DMSO i H2O (figur 2B). Dette signalet ble observert i alle dissekerte plantevevstyper, inkludert bladmesofyll, petiole vaskulatur, stammevaskulatur og rotvaskulatur (figur 2C). Dette signalet ble observert i planten innen 24 timer etter behandling og ble fordelt relativt jevnt gjennom vevet.
Streptomycin
For å teste om de introduserte forbindelsene hadde en terapeutisk effekt på HLB-sykdom, ble 2,0 ml av en bakteriedrepende forbindelse, streptomycin, introdusert i CLas-positive Valencia (Citrus sinensis) søte oransje planter i en konsentrasjon på 9,5 mg / ml (19 mg totalt). Disse plantene ble holdt i drivhuspotter, og CLAS-titeren (målt ved CLas-genomekvivalenter per sitrusgenomekvivalenter) ble overvåket over tid ved bruk av qPCR (figur 3A). De opprinnelige gjennomsnittlige DNA CLAS-titre for streptomycin- og H2O-behandlede planter var henholdsvis 0,562 CLas genom / sitrus genom og 0,49 CLas genom / sitrus genom. Reduksjoner i gjennomsnittlig bakterietiter ble påvist ved qPCR 7-28 dager etter streptomycinbehandling sammenlignet med H2O-kontrollene på samme tidspunkt. I tillegg var forskjellen mellom tid 0 og dag 28 gjennomsnittlige bakterietitere 0,314 og 0,117 for henholdsvis streptomycinbehandlede planter og H2O-behandledeplanter.
Dette eksperimentet ble designet for å måle plantens respons på forskjellige behandlinger over forskjellige tidsperioder. En tofaktor kvadratisk responsoverflatedesign ble brukt, med tid behandlet som en kvantitativ diskret faktor med fire nivåer (0 dager, 7 dager, 14 dager og 28 dager) og behandling som en kategorisk faktor med to nivåer (H2O og streptomycin). Fem replikater ble brukt for hver av de åtte behandlingskombinasjonene, og CLAS-titeren ble målt som responsvariabel. Dataene ble transformert ved hjelp av logg10 basert på en Box-Cox-plottanalyse. Modellreduksjon ble utført ved fremskutt seleksjon ved bruk av Akaikes informasjonskriterium (AICc)21, noe som resulterte i fjerning av både tids- og interaksjonseffekter. Den resterende faktoren, behandling, var signifikant (p = 0,0252), med streptomycinbehandlede planter som viste en lavere gjennomsnittlig CLas-titer (0,349) enn H2O-behandlede planter (0,496) over alle tidspunktene samlet (figur 3B). Denne reduksjonen i CLas-titer korresponderte med sporadiske økninger i ny sunn spylevekst etter 60 dager i streptomycinbehandlede planter, som det fremgår av fotografier av representative trær behandlet med H2O (figur 3C) versus 19 mg streptomycin (figur 3D).
Imidakloprid
Imidakloprid ble introdusert i juvenile asiatiske sitrus psyllid (ACP) -infiserte citron planter ved hjelp av DPI-enheten for å teste potensialet som en D. citri insekticid screening analyse. En enkelt 2,0 ml behandling av en kommersiell imidakloprid insektmiddelløsning ble testet i tre forskjellige konsentrasjoner (5,28 μL/L, 52,8 μL/L og 528 μL/L), sammen med en vannkontroll. Gjennomsnittlig totalt eggantall per tre spyleskudd før behandling varierte fra 280,5 til 321, og det var ingen signifikante forskjeller mellom plantene som skulle brukes for hver behandlingsgruppe (figur 4A). Gjennomsnittlig totalt overlevende nymfer på tre spyleskudd 7 dager etter behandling var 293,75, 268, 97,5 og 2 for vannkontrollen og henholdsvis 5,28 μL/L, 52,8 μL/L og 528 μL/L imidaklopridløsninger (figur 4B). Dette representerte en signifikant reduksjon i psyllid nymfeoppkomst ved 52,8 μL/L (p = 0,029) og 528 μL/L (p =0,002) imidaklopridløsningsnivåer sammenlignet med vannkontrollen i henhold til en enveis ANOVA etterfulgt av en Tukeys post-hoc-analyse. I tillegg var denne økningen i psyllid nymfedødelighet ved høyeste imidaklopridløsningsnivå visuelt tydelig ved reduksjonen i nymfehonningduggproduksjonen på de imidaklopridbehandlede linjene (figur 4D) sammenlignet med vannkontrollen (figur 4C).
Figur 1: Det direkte planteinfusjonsutstyret og plastisolringen. (A) Det intakte direkte planteinfusjonsutstyret og (C) plastisolringen sammen med deres dimensjoner. (B) Det direkte planteinfusjonsutstyret og plastisolringen som er koblet til og festet til et sitrustre. Vertikale tverrsnitt av (D) direkte planteinfusjonsutstyr, (F) plastisolring og (E) disse to komponentene forbundet og festet til et sitrustre. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Tverrsnitt av bladmidribben til en 25 cm sitrusplante. Bilder som viser 24 timer etter behandling med (A) 2 mM CFDA eller (B) 20 % DMSO i H2O ved bruk av direkte planteinfusjonsenhet. (C) Tverrsnitt av forskjellige plantevev 24 timer etter 2 mM CFDA-behandling, inkludert stammen 5 cm over det direkte planteinfusjonsutstyret (øverst til venstre), stammen 5 cm under det direkte planteinfusjonsutstyret (midt til venstre), roten (nederst til venstre), bladmidribben (øverst til høyre), bladbladbladet (midt til høyre) og bladmesofyllet (nederst til høyre). Skalastenger = 1 mm. Forkortelser: CFDA = 5,6-karboksyfluorescein-diacetat; DMSO = dimetylsulfoksid. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Overvåking av CLAS-titeren (målt ved CLas-genomekvivalenter per sitrusgenomekvivalenter) over tid ved bruk av qPCR. (A) Tidsforløp som viser endringer i CLas DNA-titer som sammenligner de fem plantene behandlet med 19 mg streptomycin med de fem plantene behandlet med en H2O-kontroll. Poengene representerer gjennomsnittet for en gitt behandling på et gitt tidspunkt. Feilfeltene representerer standardfeilen til gjennomsnittet. (B) Søylediagram som viser gjennomsnittlig CLAS-titer for H2O- og streptomycinbehandlede planter over alle tidspunkter. Feilfeltene representerer 95 % konfidensintervall, og stjernene angir signifikante forskjeller (* = p < 0,05) mellom gjennomsnittlige CLAS-titere for streptomycin- og H2O-behandlede planter ihenhold til en enveis ANOVA. (C) Representative bilder av sitrusplanter 0 måneder og 2 måneder etter direkte planteinfusjonsbehandling med enten (C)H2Oeller (D) streptomycin. Plantene behandlet med streptomycin viser ny lysegrønn bladspylevekst etter 2 måneder, noe som tyder på en reduksjon i CLAS-titeren. Forkortelse: CLas = Candidatus Liberibacter asiaticus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Overvåking av psyllid nymfedødelighet i unge ACP-infiserte citronplanter. Søylediagrammer som viser (A) de estimerte første eggtellingene og (B) de overlevende D. citri nymfene på tre sitrusspyler 7 dager etter behandling med vannkontroll og ulike fortynninger av imidakloprid. Feilfeltene representerer standardfeilen til gjennomsnittet, og stjernene angir signifikante forskjeller (* = p < 0,05, ** = p < 0,01) mellom et gitt behandlingsnivå og vannkontrollen i henhold til en enveis ANOVA etterfulgt av en Tukeys post-hoc-analyse. Bilder av D. citri nymfeinfisert sitrusspyling 7 dager etter behandling med enten (C) vannkontrollen eller (D) 528 mikrol / l imidakloprid ved bruk av direkte planteinfusjonsutstyr. Forkortelser: ACP = asiatisk sitrus psyllid; D. citri = Diaphorina citri Kuwayama. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Volum per sampling (μL) | Komponent | |||||
| 12.5 | 2x GoTaq qPCR med BRYT Green Dye Master Mix | |||||
| 5 | DNA-mal (20 ng/μL) | |||||
| 0.5 | 10 μM grunning F og R for CLas | Clas: CTTACCAGCCCTTGACATGTATAGG (Forward); TCCCTATAAAGTACCCAACATCTAGGTAAA (revers) |
||||
| 0.5 | 10 μM primer F og R for sitrusrengjøring | Sitrus dehydrin: TGAGTACGAGCCGAGTTG (Fremover); AAAACTTCACCGATCCACCAG (omvendt) |
||||
| 6.5 | H2O | |||||
Tabell 1: qPCR-blandingen som brukes til å kvantifisere CLAS-titeren i streptomycinbehandlede sitruslinjer. Sekvensen av 16S Las Long-primere og sitrusdehydrinprimere for CLas DNA-kvantifisering og sitrus-DNA-kvantifisering er vist.
| Skritt | Temperatur (°C) | Tid | |
| 1 | Innledende denatur | 95 | 2 min |
| 2 | Denatur | 95 | 15 s |
| 3 | Annealing | 60 | 20 s |
| 4 | Forlengelse | 72 | 20 s |
| 5 | Gå til trinn 2, gjenta 39x | ||
| 6 | Smeltekurve | 60 ramping til 95 ved 0,2 °C/s | 3 min |
Tabell 2: Reaksjonsbetingelser for qPCR brukt til å kvantifisere CLAS-titeren i streptomycinbehandlede sitruslinjer.
Tilleggsfigur S1: Bilder som viser monteringsprosessen til formen for å generere plastisolringen. (A) Snap-together plastblokker ble brukt til å generere det første laget av plastisolringsformen. (B) Jevnt blandet oppløsning som inneholder silikon RTV gummi, katalysator, konditorfarge og såpe. (C) Jevnt helles første lag av plastisolringsformen. (D) Bilde av plastisolringmønstrene med midtkjernetrykket øverst. (E) Plastisol ringmønstre satt inn i det uherdede andre laget av formen. (F) Maskeringstape og gummihammer som brukes til å feste mønstrene som det andre laget herder. (G) Tredje lag av formen tilsatt til den er i flukt med toppen av mønstrene. (H) Fjerne mønstrene fra formen. (I) Fullt konstruert plastisol ring mold. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S2: Bilder som viser monteringsprosessen til plastisolringen assosiert med det direkte planteinfusjonsutstyret. (A) Plastisolringmonteringskomponenter, inkludert formen, senterkjernen med en O-ring og leveringskanalkjernen. (B) Belegg kjernene i non-stick spray matolje for å lette fjerningen av plastisolringen etter herding. (C) Innsetting av senterkjernen og O-ringen i formen. (D) Innsetting av leveringskanalkjernen vinkelrett på senterkjernen. (E) Riktig montering av plastisolringkjernekomponentene i formhulen. (F) Plastisol brukt til generering av plastisolringen. (G) Oppvarming av plastisol i mikrobølgeovn. (H) Rør plastisol etter oppvarming. (I) Kontrollere plastisoltemperaturen. (J) Hell den oppvarmede plastisol i den monterte kjernen. (K) Tillater avkjøling av plastisol rundt den monterte kjernen. (L) Fullt monterte plastisolringer festet til det direkte planteinfusjonsutstyret. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfigur S3: Bilder som viser monteringsprosessen til det direkte planteinfusjonsutstyret. (A) Boring av et hull gjennom midten av sitrusplanten for å skape en kanal for sammensatt levering. (B) Frontal visning av det borede hullet. (C) Skjær gjennom plastisolringen med et barberblad motsatt den sammensatte leveringskanalen. (D) Montering av plastisolringen tett rundt stammen på stedet for det tidligere borede hullet. (E) Montering av det direkte planteinfusjonsutstyret på plastisolringen, med den sammensatte tilførselspigot på enheten satt inn i kanalen til plastisolringen. (F) Bruk silikontape for å feste det direkte planteinfusjonsutstyret til plastisolringen og holde hele apparatet på plass. G) Fylle kammeret for direkte planteinfusjonsutstyr med forbindelsen av interesse. (H) Bruk en sprøyte til å trekke luft fra det borede hullet i anlegget og starte strømmen av forbindelsen. (I) Påføring av voksforseglingsfilm på åpningen i kammeret til det direkte planteinfusjonsutstyret og stikk et hull for å forhindre vakuum. (J) Fullt montert direkte planteinfusjonsutstyr på en sitrusplante. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 1: Plastisolringsenteret etter kjernen. STL-fil for et 4 mm tre. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 2: Plastisolringsenteret etter kjernen. STL-fil for et 6 mm tre. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 3: Plastisolringsenteret etter kjernen. STL-fil for et 8 mm tre. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 4: Den plastisol ring senter post core . STL-fil for et 10 mm tre. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 5: Plastisolringsenteret etter kjernen. STL-fil for et 12 mm tre. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 6: Plastisolringsenteret etter kjernen. STL-fil for et 14 mm tre. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 7: Kjernen i plastisolringens leveringskanal. STL-fil for et 4 mm tre. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 8: Kjernen i plastisolringens leveringskanal . STL-fil for et 6 mm tre. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 9: Kjernen i plastisolringens leveringskanal . STL-fil for et 8 mm tre. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 10: Kjernen i plastisolringens leveringskanal . STL-fil for et 10 mm tre. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 11: Kjernen i leveringskanalen for plastisolring. STL-fil for et 12 mm tre. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 12: Kjernen i plastisolringens leveringskanal . STL-fil for et 14 mm tre. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 13: Det direkte planteinfusjonsutstyret . STL-fil. Klikk her for å laste ned denne filen.
Tilleggsfil 14: Mønsteret som brukes til å lage formen til plastisolringen. STL-fil. Klikk her for å laste ned denne filen.
Discussion
For at DPI-enheten skal betraktes som en levedyktig metode for eksogen sammensatt levering i planter, må den bidra til robust og konsistent forbindelsesopptak i en rekke vevstyper. Eksperimentet ved bruk av CFDA viste tydelig både akropetal og basipetal forbindelsesbevegelse, så vel som i både det vaskulære systemet og mesofyllceller i bladet. I tillegg, og antagelig fordi det kjedelige hullet som brukes i denne DPI-enheten gir en stor mengde overflateareal for sammensatt opptak, var CFDA tilstede i relativt like store mengder i alle deler av stammen, ikke bare i en liten delmengde av vaskulaturen ved siden av enheten, som det har blitt sett i tidligere fargestoffopptaksstudier i planter som bruker stammeinjeksjon6. I tillegg ble leveransen av grønt fluorescerende protein og blomsterfargestoff testet ved bruk av DPI-enheten, og en fordeling av disse forbindelsene som ligner CFDA ble observert (data ikke vist). Disse dataene antyder at enheten kan brukes til systematisk å levere en rekke forbindelser som varierer i størrelse og molekylær struktur. Det er imidlertid verdt å merke seg at det var forskjeller i det sammensatte opptaket basert på bladutviklingsstadiet, med yngre utviklende blader som tar opp mer sammensatte enn eldre etablerte blader. Dette kan skyldes endringene i vaskulaturegenskapene som finnes i vask versus kildevev og bør optimaliseres for et gitt eksperiment.
DPI-enheten viste tilstrekkelig sammensatt opptak for visualisering av CFDA, GFP og blomsterfargestoff, og det tok også opp nok til å vise de antibakterielle og insekticide effektene av henholdsvis streptomycin og imidakloprid. Begge disse forbindelsene resulterte i endringer i målorganismens levedyktighet 1 uke etter en enkelt 2,0 ml behandling. Disse dataene tyder på at DPI-enheten kan brukes i helplanteanalyser for å teste levedyktigheten til et bredt utvalg av forbindelser for kontroll av mikrobielle og. Videre, på grunn av sin direkte kontakt med det vaskulære systemet, kan denne enheten til og med gi en mulighet til å teste forbindelser som ikke effektivt tas opp av røttene eller epidermale celler. Av spesiell interesse vil være RNA-interferens (RNAi), da dette kan brukes til å modulere genuttrykket i vertsplanten, patogenet eller patogenvektoren. Tidligere forskning som introduserte hårnåls-RNA gjennom et boret hull i stammen av eple- og drueplanter, viste at RNA-molekylene var begrenset til xylemvevet, noe som tyder på at disse molekylene bare kan være effektive mot tygge og xylem-saftfôrende organismer22. Gitt at DPI-enheten bruker et lignende borehullleveringssystem, er det grunnen til at hårnåls-RNA levert med denne enheten også kan være begrenset til xylemvevet. Den observerte reduksjonen i titer av floem-begrensede CLas etter streptomycinbehandling fra DPI-enheten antyder imidlertid sterkt at dette antibiotika var tilstede i floem. Derfor er det sannsynlig at den vaskulære fordelingen av forbindelsene som leveres ved hjelp av DPI-enheten, er avhengig av deres størrelse og kjemi, og hvert molekyl bør vurderes individuelt.
Selv om det finnes en rekke kommersielt tilgjengelige DPI-enheter tilgjengelig på markedet, kan enheten beskrevet her produseres internt og kan modifiseres. På denne måten kan forbedringer og endringer i størrelse gjøres basert på planteart og eksperimentell design som brukes, og det er ikke avhengig av kommersielle produkter. I tillegg er enheten semi-permanent festet til anlegget, noe som betyr at flere behandlinger av en gitt forbindelse kan utføres samtidig uten å måtte skade planten med flere sammensatte injeksjoner. På en advarsel kan enheten lekke hvis den ikke er riktig installert. Som et resultat går forbindelsen tapt for miljøet i stedet for å bli levert til anlegget. Det bør derfor utvises forsiktighet for å inspisere enheten for tegn på lekkasje under oppsettet og de første dagene etterpå. Selv om boring av et hull i treet er potensielt skadelig, ble denne metoden valgt for å sikre robust og konsistent opptak. I tillegg ble det ikke sett noen negative effekter på plantehelsen fra vedlegget av DPI-enheten i disse forsøkene. Imidlertid bør ekstra planter inkluderes i eksperimentell design for å erstatte de som kan miste kraft i løpet av et gitt eksperiment. Til slutt, siden denne enheten bruker passiv strømning for å introdusere forbindelser, kan det være vanskelig å forutsi opptakshastigheten på tvers av forskjellige plantearter eller utviklingsstadier av samme art. Dette kan komplisere eksperimenter hvis hastigheten på opptaket av forbindelser er en begrensende faktor. For best resultat bør eksperimenter planlegges slik at planten får tilstrekkelig tid til å absorbere 2,5 ml forbindelsen, noe som kan ta opptil 1 uke. Avslutningsvis er denne DPI-enheten et effektivt verktøy for rask evaluering av in planta-aktiviteten til antimikrobielle eller insekticide forbindelser mot CLas og dens vektor, D. citri, og gir dermed mer informasjon om systemisk effektivitet og innflytelse på plantens ytelse enn den tidligere presenterte frittliggende bladanalysen23. Utvilsomt når mangfoldet av applikasjoner for dette systemet langt utover de spesifikke bruksområdene som er beskrevet i denne studien.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter. Bruken av handels-, firma- eller selskapsnavn i denne publikasjonen er til informasjon og bekvemmelighet for leseren. Slik bruk utgjør ikke en offisiell godkjenning eller godkjenning fra USAs Department of Agriculture eller Agricultural Research Service av noe produkt eller tjeneste til utelukkelse av andre som kan være egnet. Det amerikanske landbruksdepartementet (USDA) forbyr diskriminering i alle sine programmer og aktiviteter på grunnlag av rase, farge, nasjonal opprinnelse, alder, funksjonshemming og, der det er aktuelt, kjønn, sivilstand, familiestatus, foreldrestatus, religion, seksuell legning, genetisk informasjon, politisk tro, represalier, eller fordi hele eller deler av en persons inntekt kommer fra et offentlig hjelpeprogram. Ikke alle forbudte baser gjelder for alle programmer. Personer med nedsatt funksjonsevne som trenger alternative midler for kommunikasjon av programinformasjon (blindeskrift, stor skrift, lydbånd, etc.) bør kontakte USDAs TARGET Center på (202) 720-2600 (tale og TDD). For å sende inn en klage om diskriminering, skriv til USDA, direktør, Office of Civil Rights, 1400 Independence Avenue, SW, Washington, DC 20250-9410, eller ring (800) 795-3272 (stemme) eller (202) 720-6382 (TDD). USDA er en likestillingsleverandør og arbeidsgiver.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne takke Mant Acon for plantene som ble brukt i denne studien. Finansieringen ble gitt av US Department of Agriculture (USDA) CRIS prosjekt 8062-22410-007-000-D og USDA NIFA tilskudd 2020-70029-33176.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 cm Diameter Steel Balls | Ballistic Products Inc. | #SHT #T | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe | Becton Dickinson | 382903029952 | |
| 20 G 1 Syringe Needle | Becton Dickinson | 305175 | |
| 2 mL Screw Cap Tubes | USA Scientific | 1420-9710 | |
| 3/32nd Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964077 | |
| 3D Printer | Markforged | F-PR-2027 | |
| 3D Printing Software | Markforged | F-SW-FDVX | |
| 3D Printing Software | Markforged | S-FW-OEVX | |
| 5(6)-CFDA (5-(and-6)-Carboxyfluorescein Diacetate) | Invitrogen | C195 | |
| 5/64th Inch Black Oxide Drill Bit | Sears | 964502 | |
| 96 Well qPCR Machine | Roche | 5815916001 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 22621408 | |
| Fluorescent Microscope | Olympus | SP-BX43-BI | |
| Fluorescent Microscope Filter | Chroma | 69401-ET | |
| Gloss Clear Spray Paint | Rustoleum | 249117 | |
| Grey Lego Baseplate | Lego | 11024 | |
| Handheld Cordless Drill | Makita | 6349D | |
| Homogenizer | Fisher Scientific | 15-340-163 | |
| Imidacloprid 2F | Quali-Pro | 83080133 | |
| Liquid Plastisol Medium Hardness | Fusion X Fishing Lures | XSOL-505 | |
| Red Silicone 70 Shore A O-Ring | Grainger | Varies by Size | |
| Non-Stick Cooking Spray | PAM | 64144030217 | |
| NucleoSpin Plant II | Macherey-Nagel | 740770.5 | |
| Parafilm | Bemis | HS234526A | |
| Poly Viyl Acetate Based Glue | Elmers | E301 | |
| qPCR Master Mix | Promega | A6001 | |
| qPCR Primers | Integrated DNA Technologies | Varies by DNA sequence | |
| Reverse Transcriptase | Promega | A5003 | |
| Single Edge Razor Blade | Garvey | 40475 | |
| Translucent Silicone RTV Rubber | Aero Marine Products | AM 115T | |
| Transparent Silicone Tape | Maxwell | KE30S | |
| Truncated Oncocin 112 | Genscript | Varies by peptide sequence | |
| White 1 x 6 Lego Piece | Lego | 300901 | |
| White Nylon | Markforged | F-MF-0003 |
References
- Hu, J., Wang, N. Evaluation of the spatiotemporal dynamics of oxytetracycline and its control effect against citrus huanglongbing via trunk injection. Phytopathology. 106 (12), 1495-1503 (2016).
- Bendix, C., Lewis, J. D. The enemy within: Phloem-limited pathogens. Molecular Plant Pathology. 19 (1), 238-254 (2018).
- Keshavareddy, G., Kumar, A. R. V., Ramu, V. S. Methods of plant transformation- A review. International Journal of Current Microbiology and Applied Sciences. 7 (7), 2656-2668 (2018).
- Qaim, M. Role of new plant breeding technologies for food security and sustainable agricultural development. Applied Economics Perspectives and Policy. 42 (2), 129-150 (2020).
- Siegrist, M., Hartmann, C. Consumer acceptance of novel food technologies. Nature Food. 1 (6), 343-350 (2020).
- Larson, D. W., Doubt, J., Matthes-Sears, U. Radially sectored hydraulic pathways in the xylem of Thuja occidentalis as revealed by the use of dyes. International Journal of Plant Sciences. 155 (5), 569-582 (1994).
- Mehdi, R., et al. Symplasmic phloem unloading and radial post-phloem transport via vascular rays in tuberous roots of Manihot esculenta. Journal of Experimental Botany. 70 (20), 5559-5573 (2019).
- Miller, G. S., Parente, R. M., Santra, S., Gesquiere, A. J. Tracking of fluorescent antibiotic conjugate in planta utilizing fluorescence lifetime imaging. Planta. 253 (2), (2021).
- Treydte, K., Lehmann, M. M., Wyczesany, T., Pfautsch, S. Radial and axial water movement in adult trees recorded by stable isotope tracing. Tree Physiology. 41 (12), 2248-2261 (2021).
- Nie, P. Liping Hu, Haiyan Zhang, Jixiang Zhang, Zhenxian Zhang, Lingyun Zhang, The predominance of the apoplasmic phloem-unloading pathway is interrupted by a symplasmic pathway during Chinese jujube fruit development. Plant and Cell Physiology. 51 (6), 1007-1018 (2010).
- Jiang, M., Deng, Z., White, R. G., Jin, T., Liang, D. Shootward movement of CFDA tracer loaded in the bottom sink tissues of Arabidopsis. Journal of Visualized Experiments. (147), e59606 (2019).
- Liu, H., Si, C., Shi, C., Wang, S. Zhe Sun, Yanxi Shi, from apoplasmic to symplasmic phloem unloading during storage roots formation and bulking of sweet potato. Crop Science. 59 (2), 675-683 (2019).
- Erdos, T., Ullmann, A. Effect of streptomycin on the incorporation of amino-acids labeled with carbon-14 into ribonucleic acid and protein in a cell-free system of a Mycobacterium. Nature. 183 (4661), 618-619 (1959).
- Bové, J. M. Huanglongbing: A destructive, newly-emerging, century-old disease of citrus. Journal of Plant Pathology. 88 (1), 7-37 (2006).
- Motaung, T. E. Chloronicotinyl insecticide imidacloprid: Agricultural relevance, pitfalls and emerging opportunities. Crop Protection. 131, 105097 (2020).
- Berger, C., Laurent, F. Trunk injection of plant protection products to protect trees from pests and diseases. Crop Protection. 124, 104831 (2019).
- Archer, L., Crane, J. H., Albrecht, U. Trunk injection as a tool to deliver plant protection materials-An overview of basic principles and practical considerations. Horticulturae. 6 (6), 552 (2022).
- Wise, J. C., et al. Trunk injection: A discriminating delivering system for horticulture crop IPM. Entomology, Ornithology & Herpetology: Current Research. 03 (2), (2014).
- Ammar, E. D., George, J., Sturgeon, K., Stelinski, L. L., Shatters, R. G. Asian citrus psyllid adults inoculate Huanglongbing bacterium more efficiently than nymphs when this bacterium is acquired by early instar nymphs. Scientific Reports. 10 (1), 18244 (2020).
- Stover, E., Mccollum, G., Ramos, J., Shatters, R. G. Growth, health and Liberibacter asiaticus titer in diverse citrus scions on mandarin versus trifoliate hybrid rootstocks in a field planting with severe Huanglongbing. Proceedings of the Florida State Horticultural Society. 127, 53-59 (2014).
- Akaike, H. A new look at the statistical model identification. IEEE Transactions on Automatic Control. 19 (6), 716-723 (1974).
- Dalakouras, A., Jarausch, W., Buchholz, G., Bassler, A., Braun, M., Manthey, T., Krczal, G., Wassenegger, M. Delivery of hairpin RNAs and small RNAs into woods and herbaceous plants by trunk injection and petiole absorption. Frontiers in Plant Science. 9, 1253 (2018).
- Ammar, E. D., Walter, A. J., Hall, D. G. New excised-leaf assay method to test inoculativity of Asian citrus psyllid (Hemiptera: Psyllidae) with Candidatus Liberibacter asiaticus associated with citrus Huanglongbing disease. Journal of Economic Entomology. 106 (1), 25-35 (2013).
